KR20200029477A

KR20200029477A - 유전자 조작된 박테리아

Info

Publication number: KR20200029477A
Application number: KR1020207001684A
Authority: KR
Inventors: 위지에 차이; 진빈 리우; 티안전 시옹; 옌루이 딩; 예쥔 바이; 샤오후이 정
Original assignee: 지앙난대학교
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2020-03-18
Also published as: JP7044860B2; DE112017007667T5; CN107586752A; KR102321136B1; JP2020528745A; US20190136269A1; WO2019024309A1; US11371065B2; CN107586752B

Abstract

본 발명은 유전자 조작된 박테리아에 관한 것이고, 생물공정 기술분야에 속한다. 본 발명의 유전자 조작된 박테리아는 L-아미노산산화효소 유전자, α-케토산탈카르복시효소 유전자, 알코올탈수소효소 유전자, NAD(P)를 NAD(P)H로 환원 가능한 효소 유전자를 도입한다. 본 발명은 또한 재조합 대장균 유전자 조작된 박테리아의 제조 방법과 응용을 공개한다. 본 발명의 방법은 페닐에타노이드류 화합물을 생물학적으로 합성하는데 응용되며, 조작이 간편하고 원가가 낮으며, 생산물 합성효율이 높고, 광학 순도가 높은 특징을 가지며, 훌륭한 산업화 전망이 있다.

Description

유전자 조작된 박테리아

본 발명은 유전자 조작된 박테리아에 관한 것으로서, 생물공정 기술분야에 속한다.

페닐에타노이드류 화합물(Phenylethanoids)에는 주로 2-페닐에탄올(2-Phenylethanol, β-Phenylethanol), 티로솔(P-히드록시페닐에틸알코올, Tyrosol, 4-hydroxyphenylethanol, 2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol), 히드록시티로솔(3,4-디히드록시페네틸알코올, Hydroxytyrosol, 3,4-Dihydroxyphenylethanol, 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethanol)의 세 가지 구조적 유사체가 있으며, 전부 L-α-방향족아미노산 유도체이다. 2-페닐에탄올은 은은한 장미향이 나는 방향족알코올로, 식품, 약품, 화장품, 담배와 일용화학품에 널리 쓰이고 있으며, 모든 장미향기의 기본 성분일 뿐만 아니라 시너지 효과 및 상승 효과를 가지며, 다양한 향형 조제법에 필요한 성분이다. 티로솔은 살리드로사이드 분자의 핵심으로, 항산화성이 뛰어나고 중요한 의약 중간체이도 하며, 주로 심혈관약인 메토프롤롤, 베탁소롤 등을 합성하는데 쓰인다. 히드록시티로솔은 가장 강력한 항산화제의 하나로 간주되며, 체내 유리기를 제거하고 인체의 장부 장기의 건강상태를 회복시켜 뇌 노화를 방지하고 노화를 지연시킨다.

현재 식물 추출, 화학적 합성, 미생물 등 방법으로 이 화합물들을 생산한다. 화학적 방법으로 이미 2-페닐에탄올, 티로솔과 히드록시티로솔을 성공적으로 합성할 수 있으나(중국 특허 200880002426.3, 201310183569.1, 200910098983.6), 이 화합물들이 중요한 식품 또는 보건품 원료이기에 화학적으로 합성된 제품은 사람들의 선호를 받지 못한다. 현재 출시된 이 제품들은 주로 식물에서 추출하여 얻는다. 예를 들어, 중국 발명특허 201510625623.2는 장미꽃잎에서 고순도 2-페닐에탄올을 추출하는 방법을 공개하였고, 중국 발명특허 201410743409.2는 대화홍경천에서 고순도 티로솔을 제조하는 방법을 공개하였으며, 중국 발명특허 201710195462.7은 감람잎에서 히드록시티로솔을 추출하는 방법을 공개하였다. 식물 자원 및 그 함량의 제한으로 이 제품들은 가격이 비싸기에 미생물법에 의한 생산이 널리 주목을 받고 있다.

L-페닐알라닌, L-타이로신, L-도파는 탈아미노화, 탈카르복실화, 알데히드기 환원을 거쳐 2-페닐에탄올, 티로솔, 히드록시티로솔이 생성될 수 있어야 한다. 이 대사 원리에 기초하여, 수종의 미생물 생산 방법이 개발되었다.

효모는 2-페닐에탄올을 드 노보 합성하는 대사 경로를 가지며, 아미노산 분해 대사 경로를 통해 L-페닐알라닌을 직접 2-페닐에탄올로 형질전환할 수도 있다. 일찍 1907년에 Ehrlich는 효모 배지에 L-페닐알라닌을 첨가하여 2-페닐에탄올의 생산량을 대폭 제고시켰다(Ber Dtsch Chem Ges,1907.40:1027-1047). 중국 특허 02137575.5, 200710066884.0, 200810071807.9, 200910049170.8, 200910049565.8, 201310243384.5, 201410661174.2와 201610256845.6은 효모를 이용하여 L-페닐알라닌을 형질전환함으로써 2-페닐에탄올을 생산하는 균종과 방법을 균일하게 공개하였다. Romagnoli는 효모를 제거한 방향족아미노산 아미노기전이효소를 개발하였는데, 포도당을 기질로 2-페닐에탄올을 생산하고, 생산량은 약 3mM이며, 동시에 소량의 티로솔을 생성한다(Deletion of the Saccharomyces Cerevisiae Aro8 Gene, Encoding an Aromatic Amino Acid Transaminase, Enhances Phenylethanol Production from Glucose. Yeast,2015,32(1): 29-45). 효모는 생장이 느리고 형질전환 과정에 부분적인 L-페닐알라닌을 소모하기에, 2-페닐에탄올의 생산성은 낮고 원가는 높다.

이 밖에 Enterobacter sp. 균(De-Novo Synthesis of 2-Phenylethanol by Enterobacter Sp Cgmcc 5087. BMC Biotechnology, 2014,14)을 이용하거나 우장지 버섯 심부발효 기술을 이용하여 2-페닐에탄올을 제조하는 방법도 있으나(중국 발명특허 201410041209.2), 이들의 효율성은 균일하게 효모보다 낮다.

대장균은 생장속도가 빨라 유전자 조작된 박테리아의 좋은 선택이다. 중국 특허 201210276491.3은 L-페닐알라닌 고수율 대장균에서 페닐피루베이트탈카르복시효소 및 에탄올탈수소효소를 과발현하여 2-페닐에탄올의 고수율을 달성할 수 있지만, 과발현된 2개 효소가 포도당에 의해 드 노보 합성 생장하는 대장균의 대사를 교란하기에, 그 생산량은 130mg/L에 불과하다. 중국 발명특허 201510650028.4는 대장균에서 방향족아미노산 아미노기전이효소 및 외인성 페닐피루베이트탈카르복시효소, 페닐에탄올탈수소효소, 글루탐산탈수소효소 등 네 가지 효소를 공동발현하여, 전세포를 L-페닐알라닌으로 형질전환하고 2-페닐에탄올을 생산하는데 사용한다. 균체 내부의 α-케토글루타르산 농도가 낮고, 충분한 암모니아의 수용체를 제공하기 어렵기에, 형질전환 시스템에 α-케토글루타르산을 첨가하면 최고 생산량을 얻을 수 있으며, 글루탐산을 첨가하여도 생산량을 크게 제고할 수 있다. 기타 화합물의 첨가는 형질전환 비용을 증가하고 형질전환 및 정제 작업의 복잡성을 높일 것이 분명하다. 중국 발명특허 201610464256.7은 비-세포생합성방법을 공개하였는데, 단독으로 발현하는 아미노기전이효소, 페닐피루베이트탈카르복시효소와 알코올탈수소효소를 함께 고정하거나 용액 부피에서 L-페닐알라닌을 형질전환하여 2-페닐에탄올을 생산한다. 공개된 문서로부터 당해 시스템에 충분한 암모니아의 수용체 및 NADH가 결핍함을 발견할 수 있으며, 따라서 당해 과정은 생산을 달성하기 어렵다.

중국 발명특허 201710256900.6은 페닐알라닌탈수소효소, 2-케토산탈카르복시효소와 알코올탈수소효소를 각각 발현하는 세 가지 대장균 습균체를 혼합하여 조효소 TPP와 NAD를 첨가하고, 온도와 pH를 제어하여 L-페닐알라닌을 형질전환하는 방법을 공개하였다. 당해 방법에서 NAD와 TPP는 가격이 비싸고, 일정한 시간 반응하면 분해가 효력을 상실하며, 또한 세 가지 효소를 각각 배양하여 얻어야 하므로, 반응 비용을 크게 증가하고, 독립된 세포도 NAD가 세포 사이에서 이동하여 조효소 재생을 실현하는 것을 영향 주기에, 당해 형질전환 반응은 지속적인 진행이 어렵다.

중국 발명특허 201310133238.7은 대장균에서 과발현하는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 4-히드록시페닐탈카르복시효소를 공개하였으며, 페닐아세트알데히드탈수소효소 유전자를 제거하고, 타이로신 또는 포도당에서 티로솔을 생산하는 방법을 구현하였다. 그러나, 타이로신을 기질로 하는 경우, 당해 균은 효과적인 탈암모니아시스템이 결핍하고, 포도당으로 드 노보 합성하는 경우, 티로솔이 균체에 대해 독성이 있어 균체의 생장 및 생산물의 합성을 영향 주기에, 당해 균은 티로솔의 효과적인 생산을 달성하기 어렵다. 201510242626.8은 대장균에서 과발현하는 대장균 유래의 모노옥시게나아제 유전자 클러스터 HpaBC를 공개하여 포도당으로 히드록시티로솔을 드 노보 합성하였다. 당해 방안의 주된 단점은 히드록시티로솔이 균체에 대해 독성이 있고, HpaBC 발현량이 낮기에 히드록시티로솔을 생산하는 효율이 제고되기 어렵다는 점이다. 중국 발명특허 201710091999.9는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 피루브산탈카르복시효소와 방향아미노산 아미노기전이효소를 과발현하는 대장균을 공개하였고, 당해 균 전세포로 L-타이로신을 형질전환하여 티로솔을 생산한다. 당해 균은 충분한 암모니아 수용체 및 양호한 알데히드 환원 시스템이 부족하기에 생산율이 낮은 것이 명백하다. Chung 등은 대장균에서 식물 유래 방향알데히드 합성효소(aromatic aldehyde synthases)를 과발현하여, 원-스텝으로 L-타이로신을 P-히드록시페닐아세트알데히드로 변화시킨 다음, 대장균 내부의 환원시스템에 의해 티로솔을 생성하였다. 또한 HpaBC를 과발현하여 히드록시티로솔을 실현하였다. 그러나, 대장균 내에서 식물 유전자의 낮은 발현 효율은 전세포 형질전환 효과에 영향을 주었다(Production of Three Phenylethanoids, Tyrosol, Hydroxytyrosol, and Salidroside, Using Plant Genes Expressing in Escherichia Coli. Scientific Reports, 2017).

현재 다효소 직렬된 전세포가 단순 전구체를 촉매화하여 고부가치 생성물을 생성하는 것이 이미 널리 응용되었고(Constructing Biocatalytic Cascades: In Vitro and in Vivo Approaches to de Novo Multi-Enzyme Pathways, ACS Catal., 2017, 7(1), 710-724), 전세포는 저가 기질에 대한 고효율적 형질전환을 달성하였으며, 때로 포도당으로 드 노보 합성하는 것보다 더욱 경제적이고 효과적이다.

현재 다양한 방법의 결함에 기초하여, 본 발명은 다효소 공동발현의 대장균을 제조하여, 방향족 L-α-아미노산의 전세포 촉매화 형질전환을 실현하였으며, L-페닐알라닌, L-타이로신, L-도파를 각각 촉매하여 2-페닐에탄올, 티로솔, 히드록시티로솔을 생성할 수 있다.

현재 다양한 방법의 결함에 기초하여, 본 발명은 저비용으로 페닐에타노이드류(Phenylethanoids) 화합물을 생산할 수 있는 재조합 대장균을 제공하였다. 아울러 본 발명은 당해 균주의 제조와 응용의 기술문제를 해결하고자 한다.

본 발명의 첫 번째 목적은, 페닐에타노이드류(Phenylethanoids) 화합물을 저비용으로 생산할 수 있는 재조합 대장균을 제공하는 것으로서, 상기 재조합 대장균은 4종 효소를 동시에 발현할 수 있으며, 각각 L-아미노산산화효소, α-케토산탈카르복시효소, 알코올탈수소효소, NAD(P)를 NAD(P)H로 환원 가능한 효소이다.

일 실시양태에서, 상기 L-아미노산산화효소는 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906 또는 코센자에아 믹소파시엔스 ATCC 19692에서 유래한다.

일 실시양태에서, 상기 L-아미노산산화효소는 그 아미노산 서열이 NCBI에서 수탁번호가 WP_004244224.1, OAT30925.1인 서열이다.

일 실시양태에서, 상기 L-아미노산산화효소는, 그 뉴클레오티드 서열이 NCBI에서 수탁번호가 NZ_GG668576 REGION: 1350390..1351805, LXEN01000066 REGION: 20563..21963인 서열이다.

일 실시양태에서, 상기 α-케토산탈카르복시효소는 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906 또는 락토코커스 락티스 ATCC 19435에서 유래한다.

일 실시양태에서, 상기 α-케토산탈카르복시효소는, 그 아미노산 서열이 NCBI에서 수탁번호가 WP_004247067.1, Wp_025016816.1인 서열이다.

일 실시양태에서, 상기 α-케토산탈카르복시효소는, 그 뉴클레오티드 서열이 NCBI에서 수탁번호가 NZ_GG668593 REGION: 50463..52112, NZ_LKLC01000008 REGION: 208327..209973인 서열이다.

일 실시양태에서, 상기 알코올탈수소효소는 에스케리치아 콜라이 BL21(DE3)에서 유래한다.

일 실시양태에서, 상기 알코올탈수소효소는, 그 아미노산 서열이 NCBI에서 수탁번호가 WP_001318460.1, WP_000692754.1인 서열이다.

일 실시양태에서, 상기 알코올탈수소효소는 그 뉴클레오티드 서열이 NCBI에서 수탁번호가 NC_012892 REGION: 4406777..4407796, NC_012892 REGION: 312506..313555인 서열이다.

일 실시양태에서, 상기 NAD(P)를 NAD(P)H로 환원 가능한 효소는 포름산탈수소효소, 포도당탈수소효소 또는 아인산염탈수소효소이다.

일 실시양태에서, 상기 NAD(P)를 NAD(P)H로 환원 가능한 효소는 코마가타엘라 파피이 ATCC 76273에서 유래한 포름산탈수소효소, 바실루스 서브틸리스 ATCC 13952에서 유래한 포도당탈수소효소 또는 슈도모나스 아비에타니필라 ATCC 700689에서 유래한 아인산염탈수소효소이다.

일 실시양태에서, NAD(P)를 환원 가능한 효소의 아미노산 서열은 NCBI에서 수탁번호가 AOA63544.1, Wp_013351020.1 또는 Wp_003118429.1인 서열이다.

일 실시양태에서, NAD(P)를 환원 가능한 효소는, 그 뉴클레오티드 서열이 NCBI에서 수탁번호가 CP014710 REGION: 1836993..1838090, NZ_CP009748 REGION: 386154..38693, NZ_FNCO01000027 REGION: 29475..30485인 서열이다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 대장균은 pRSFDuet-1과 pETDuet-1의 이중 플라스미드를 이용하여 4개 효소의 유전자를 공동발현하고 인코딩하며, pRSFDuet-1은 L-아미노산산화효소 유전자와 α-케토산탈카르복시효소 유전자를 탑재하고, pETDuet-1은 알코올탈수소효소와 NAD(P)를 환원 가능한 효소 유전자를 탑재한다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 대장균은 2개의 공동발현 재조합 플라스미드를 숙주 에스케리치아 콜라이 B21로 형질전환하여 얻은 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 페닐에타노이드류(Phenylethanoids) 화합물을 생산하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 본 발명의 재조합 대장균을 이용한다.

일 실시양태에서, 상기 페닐에타노이드류 화합물은 2-페닐에탄올, 티로솔 및 히드록시티로솔 중 어느 하나이다.

일 실시양태에서, 상기 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는데 사용되는 기질은 L-페닐알라닌, L-타이로신 및 L-도파 중 적어도 하나이다.

일 실시양태에서, 상기 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는 것은 전세포 형질전환 생산을 진행하는 것이다.

일 실시양태에서, 상기 전세포 형질전환 생산 시스템은, 신선한 세포 습중량이 10 내지 200g/L이고, 기질 농도가 0.5 내지 20g/L이며, 수소 공여체 농도가 1 내지 20g/L이고, pH가 4.0 내지 8.0이며, 15 내지 40℃에서 반응하고, 시간이 0.5 내지 48시간인 것을 포함한다.

일 실시양태에서, 상기 세포의 획득방법은, 재조합 대장균을 LB 발효 배지에 이식하고, 세포 OD₆₀₀이 0.6 내지 0.8에 도달하면 IPTG를 가하여 발현을 유도하고, 발현 유도가 완료되면 원심분리하여 세포를 수집한다.

일 실시양태에서, 제조된 세 효소 공동발현 플라스미드에 포도당탈수소효소가 함유되면 수소 공여체는 포도당이고, 제조된 세 효소 공동발현 플라스미드에 포름산탈수소효소가 함유되면 수소 공여체는 포름산나트륨이며, 제조된 세 효소 공동발현 플라스미드에 아인산염탈수소효소가 함유되면 수소 공여체는 아인산이다.

본 발명은 신규한 네 효소 공동발현 유전자 조작 대장균을 제조하였으며, 당해 균은 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는데 응용된다. 본 발명에서 선택한 L-아미노산산화효소, α-케토산탈카르복시효소, 알코올탈수소효소는 전부 기질 특이성이 차하고, 활성이 강한 특점이 있기에, 동일한 주의 유전자 조작된 박테리아가 방향 L-α-아미노산을 이용하는 경우 다양한 페닐에타노이드류 화합물을 생산할 수 있으며, 기타 아미노산을 생산하는 유도체화 알코올을 사용할 수도 있다. 당해 생산과정은 간단하고 원료를 구하기 쉬우며, 훌륭한 산업상 이용 전망이 있다.

본 발명의 대장균의 기능적 핵심은, L-아미노산산화효소, α-케토산탈카르복시효소, 알코올탈수소효소, NAD(P)를 NAD(P)H로 환원 가능한 효소의 4종 효소를 동시에 발현하는 것이다. 그 원리는 다음과 같다. 유전자 조작된 박테리아의 전세포 내에서 L-아미노산산화효소는 L-페닐알라닌, L-타이로신, L-도파를 대응하는 페닐피루브산, P-히드록시페닐피루브산, 3,4-디히드록시페닐피루브산으로 산화하고, 이어서 α-케토산탈카르복시효소 작용을 거쳐 페닐아세트알데히드, P-히드록시페닐아세트알데히드, 3,4-디히드록시페네틸알코올을 생성한다. 알코올탈수소효소는 NAD(P)를 NAD(P)H로 환원하는 효소와 함께 NAD 조효소 순환재생시스템을 이루며, 알코올탈수소효소는 알데히드를 환원함으로써, 전세포 네 효소 직렬 원-스텝법을 구현하여 L-페닐알라닌, L-타이로신, L-도파를 각각 2-페닐에탄올, 티로솔, 히드록시티로솔로 형질전환한다. 상술한 기술적 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 이하 기술 방안을 채택한다.

1. 본 발명과 관련되는 균주 및 플라스미드

미국 균종보존센터 ATCC에서 구입한 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906, 코센자에아 믹소파시엔스 ATCC 19692, 락토코커스 락티스 ATCC 19435, 코마가타엘라 파피이 ATCC 76273, 바실루스 서브틸리스 ATCC 13952와 슈도모나스 아비에타니필라 ATCC 700689.

Novagen사에서 구입한 pRSFDuet-1 플라스미드, pETDuet-1 플라스미드, 에스케리치아 콜라이 BL21(DE3), 에스케리치아 콜라이 BL21 DH5α.

2. 효소의 선택

(1) L-아미노산산화효소의 선택

L-아미노산산화효소는 세균, 진균, 포유동물 세포, 뱀독, 곤충 독소 및 조류에 광범위하게 존재한다(L-amino acid oxidase as biocatalyst: a dream too far? Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97:9323-41). L-아미노산산화효소는 α-아미노기와 C^α상의 수소를 FAD에 전이시키며, 대부분은 분자 산소를 이용하여 환원형 FAD를 직접 산화하고, 산화형 FAD를 재생함과 동시에 과산화수소를 생성하며, 이 과정에 반드시 별도로 과산화수소 효소를 첨가하여 과산화수소의 독성을 제거해야 한다. 이밖에 또 한 종류의 L-아미노산산화효소는 세포막 상의 전자 전달 사슬과 관련되는 것으로, 전자는 호흡 사슬을 경과하여 사이토크롬산화효소에 전달되어 분자 산소가 물로 환원되도록 함으로써 과산화수소를 생성하지 않는다. 이 효소류는 주로 프로테우스 속(Proteus sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 모르가넬라 속(Morganella sp.) 등 세균에 존재한다(Crystal structure of a membrane-bound l-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. J. Struct. Biol. 2016, 195:306-15). 본 발명은 과산화수소를 생산하지 않는 두 가지 L-아미노산산화효소를 선택하여 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906과 코센자에아 믹소파시엔스 ATCC 19692에서 각각 pmaao와 cmaao를 복제해 얻으며, 그 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 수탁번호가 NZ_GG668576 REGION: 1350390..1351805와 LXEN01000066 REGION: 20563..21963이고, 그 아미노산 서열은 각각 Wp_004244224.1과 OAT30925.1에 표시된 바와 같으며, 이 효소들은 기질이 광범위하고 활성이 강한 특점을 가진다.

(2) α-케토산탈카르복시효소의 선택

문헌 보도에 따라 세균 유래의, 방향족 케토산에 대해 강한 활성을 갖는 α-케토산탈카르복시효소를 선택하는데, 기타 특허에서 효모 또는 식물 유래의 효소를 선택하는 것에 비해 대장균에서 더 잘 발현하는 특성을 갖고 있다. 본 발명은 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906과 락토코커스 락티스 ATCC 19435에서 각각 α-케토산탈카르복시효소 유전자 pmkdc와 llkdc를 복제해 얻으며, 그 아미노산 서열은 NCBI에서 수탁번호가 WP_004247067.1, Wp_025016816.1인 서열이고, 그 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 수탁번호가 NZ_GG668593 REGION: 50463..52112, NZ_LKLC01000008 REGION: 208327..209973인 서열이다.

(3) 알코올탈수소효소의 선택

알코올탈수소효소는 각종 세균에 널리 존재하며, 보도에 따르면 대장균 자체에도 기질이 광범위한 알코올탈수소효소가 다양하게 함유되어 있다(Production of aromatic compounds by metabolically engineered Escherichia Coli with an expanded shikimate pathway, Appl. Environ. Microbiol. 2012 78(17),6203-6216). 따라서, 에스케리치아 콜라이 BL21(DE3)로부터 직접 2개의 알코올탈수소효소 ecadh1과 ecadh2를 복제해 얻는다. 상기 알코올탈수소효소는 그 아미노산 서열이 NCBI에서 수탁번호가 WP_001318460.1, Wp_000692754.1인 서열이고, 그 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 수탁번호가 NC_012892 REGION: 4406777..4407796, NC_012892 REGION: 312506..313555인 서열로서, 알코올탈수소효소가 대장균에서의 과발현에 유리하다.

(4) NAD(P)를 환원 가능한 효소의 선택

생물학적 형질전환 반응에서, 알코올탈수소효소는 NADH와 NADPH 중 적어도 하나를 조효소로 필요로 하며, 본 발명은 코마가타엘라 파피이 ATCC 76273으로부터 포름산탈수소효소 유전자 kpfdh를 얻고, 바실루스 서브틸리스 ATCC 13952로부터 포도당탈수소효소 유전자 bsgdh를 얻으며, 슈도모나스 아비에타니필라 ATCC 700689로부터 아인산염탈수소효소 유전자 papdh를 얻는다. 그 아미노산 서열은 NCBI에서 수탁번호가 AOA63544.1, WP_013351020.1 또는 Wp_003118429.1인 서열이고, 그 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 수탁번호가 CP014710 REGION: 1836993..1838090, NZ_CP009748 REGION: 386154..38693, NZ_FNCO01000027 REGION: 29475..30485인 서열이다.

3. 네 효소 공동발현 시스템의 구축

위에서 선택한 L-아미노산산화효소, α-케토산탈카르복시효소, 알코올탈수소효소, NAD(P)를 환원 가능한 효소에서 종류별로 어느 하나의 효소를 선택하여 네 효소 조합 공동발현을 진행한다. 현재 대장균 다유전자가 공동발현하는 방법은 다양한 것으로(대장균 다유전자 공동발현 전략, 중국 생물공정 잡지, 2012, 32(4):117-122), 본 발명은 pRSFDuet-1과 pETDuet-1의 이중 플라스미드를 이용하여 네 개 유전자를 공동발현하며, pRSFDuet-1은 L-아미노산산화효소 유전자와 α-케토산탈카르복시효소 유전자를 탑재하고, pETDuet-1은 알코올탈수소효소와 NAD(P)를 환원 가능한 효소 유전자를 탑재한다.

공동발현 재조합 플라스미드를 얻은 다음, 두 가지 플라스미드로 대장균 에스케리치아 콜라이 B21을 형질전환하는데, 암피실린(Ampicillin)과 카나마이신(kanamycin)을 이용한 플레이트 선별로 양성 형질전환체, 즉 재조합 대장균을 얻는다.

4. 전세포를 페닐에타노이드류 화합물로 형질전환

세포의 준비: 전형적인 재조합 대장균 배양 및 발현 유도 방안에 따라, 재조합 대장균을 부피비가 2%인 양으로 LB 발효 배지(펩톤 10g/L, 효모 가루 5g/L, NaCl 10g/L)에 이식하고, 세포 OD₆₀₀이 0.6 내지 0.8에 도달하면, 최종 농도가 0.4mM인 IPTG를 가하고, 20℃에서 발현을 유도하고 8시간 동안 배양한다. 발현 유도 완료 후, 20℃, 8000rpm, 20분간 원심분리하여 세포를 수집한다.

전세포 형질전환 시스템은, 서로 다른 기질의 용해도에 따라, 기질 농도는 0.5 내지 20g/L로 제어하고, 제조된 서로 다른 플라스미드의 성질에 따라 가하는 수소 공여체의 농도는 1 내지 20g/L이며, pH는 4.0 내지 8.0으로 조절하고, 신선한 습균체 양은 10 내지 200g/L이다. 다음 15 내지 40℃에서 0.5 내지 48시간 동안 형질전환한다. 형질전환 완료 후 액체크로마토그래피로 생산량 및 선광성을 측정한다. 제조된 네 효소 공동발현 플라스미드에 포도당탈수소효소가 함유되면 수소 공여체는 포도당이다. 제조된 네 효소 공동발현 플라스미드에 포름산탈수소효소가 함유되면 수소 공여체는 포름산나트륨이다. 제조된 네 효소 공동발현 플라스미드에 아인산염탈수소효소가 함유되면 수소 공여체는 아인산이다.

전세포 형질전환 시스템에서, 기질은 L-페닐알라닌, L-타이로신 및 L-도파 중 어느 하나이다.

이 기질들은 상응한 전세포 형질전환을 거쳐, 대응하게 2-페닐에탄올, 티로솔, 히드록시티로솔을 생성할 수 있다.

5. 시료의 측정 분석

정량분석: PerkinElmer Series 200 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 형질전환액을 측정 분석한다. 크로마토그래피 조건은, 이동상이 메탄올-0.1% 포름산 수용액(40:60)이고, Hanbon사 C18 컬럼(4.6x250mm, 5μm)을 이용하며, 유속은 1mL/min이고, 컬럼 온도는 30℃이며, 주입 부피는 20μL 이고, 측정 파장은 210nm이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 문제, 기술 방안 및 유익한 효과를 보다 잘 이해할 수 있도록, 아래에 실시예를 결합하여 본 발명을 상세하게 설명하도록 한다. 여기서 기술되는 구체적인 실시예는 단지 본 발명을 해석하는데 사용되며, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 할 것이다.

실시예 1

네 유전자 공동발현 시스템의 구축

(1) 프라이머 설계

PCR 증폭에 사용되는 프라이머를 설계한다.

(2) PCR 증폭

생산업체에서 제공한 사용설명서에 따라, Genomic DNA Purification Kit(Takara)를 사용하여 대수성장기에 처한 균주의 유전체 DNA를 추출하고, 표 1의 프라이머를 사용하여 각각 대응하는 균주에서 PCR 증폭을 진행한다. 증폭 시스템은, PrimeSTARHS DNA Polymerase(2.55U/μL) 0.5μL, 10xPrime STAR Buffer 10μL, dNTP Mixture(2.5mM each) 4μL, 템플릿 DNA 1μL, Up 프라이머(20μM) 1μL, Down 프라이머(20μM) 1μL, ddH2O를 50μL까지 보충한다. 증폭 프로그램은, 94℃, 10min; 94℃, 30sec; 55℃, 30sec; 72℃, 2min, 총 30개 사이클; 72℃, 10min이다. PCR 생산물은 BGI에 보내어 유전자 염기서열 분석을 진행한다.

다음, 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906, 코센자에아 믹소파시엔스 ATCC로부터 L-아미노산산화효소 유전자 pmaao, cmaao를 각각 복제해 얻고, 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906, 락토코커스 락티스 ATCC 19435로부터 각각 α-케토산탈카르복시효소 유전자 pmkdc, llkdc를 얻으며, 에스케리치아 콜라이 균주 Bl21로부터 에탄올탈수소효소 유전자 ecadh1, ecadh2를 얻고, 코마가타엘라 파피이 ATCC 7627, 바실루스 서브틸리스 ATCC 13952, 슈도모나스 아비에타니필라 ATCC 70068로부터 각각 NAD(P)를 환원 가능한 효소 유전자 kpfdh, bsgdh, papdh를 얻는다.

(3) pRSFDuet-1과 pETDuet-1 단일 유전자 플라스미드의 제조

pRSFDuet-1과 pETDuet-1 벡터 플라스미드, 그리고 절차 (2)에서 cmaao, pmaao, ecadh1, ecadh2의 PCR 생산물을 37℃ 수조에서 1시간 동안 2개의 서로 다른 제한효소로 절단한다. 제한효소 절단 시스템은, 10x cut buffer 5μL, DNA 10μL, 제한효소 SacⅠ과 제한효소 HindⅢ 각각 1μL, 무균수 33μL이다.

그리고 나서, 제한효소 절단 생산물을 각각 회수하고, 16℃ 수조에서 12 내지 16시간 동안 연결한다. pRSFDuet-1은 각각 cmaao, pmaao와 연결하고, pETDuet-1은 각각 ecadh1, ecadh2와 연결한다. 연결 시스템은, 10xDNA ligase buffer 2.5μL, DNA 단편 8μL, 벡터 DNA 2μL, T4 DNA ligase 1μL, 무균수 11.5μL 총 25μL이다.

그다음, 연결 시스템에 100μL의 DH5-알파 셀을 가하고 가볍게 섞어 30분간 얼음에 방치한다. 예열된 42℃ 수조에 넣고 90초 동안 방치하여 열 충격을 준다. 즉시 2분간 얼음에 방치한다. 항생제가 함유되지 않은 LB 배양액을 1mL 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하여 균체가 회복되도록 한다. 마지막에 pRSFDuet-1과 cmaao, pmaao 각각의 연결 균체를 카나마이신이 함유된 LB 플레이트에 균일하게 도포하고, pETDuet-1과 ecadh1, ecadh2 각각의 연결 균체를 암피실린이 함유된 LB 플레이트에 균일하게 도포한 다음, 단일 집락을 골라 12시간 동안 배양한다. 그다음 플라스미드를 추출하고, 그 정확성을 2개의 서로 다른 제한효소 절단으로 검증한다. 동시에 DNA 염기서열 분석을 진행하여 그 정확성을 보장하고, 최종 정확한 형질전환체를 저장하고, 이하 플라스미드, L-아미노산산화효소 유전자가 함유된 pRSFDuet-cmaao, pRSFDuet-pmaao; 에탄올탈수소효소 유전자가 함유된 pETDuet-ecadh1, pETDuet-ecadh2를 얻는다.

(4) L-아미노산산화효소 유전자, α-케토산탈카르복시효소 유전자 pRSFDuet-1 공동발현 플라스미드와 에탄올탈수소효소 유전자, NAD(P)를 환원 가능한 효소 유전자 pETDuet-1 공동발현 플라스미드의 제조

제한효소 절단 시스템은, 10x cut buffer 5μL, DNA 10μL, 제한효소 SacⅠ과 제한효소 HindⅢ 각각 1μL, 무균수 33μL이다. 절차 (3)에서 제조한 단일 유전자 플라스미드와 절차 (2)에서 제조한 pmkdc, llkdc, kpfdh, bsgdh, papdh의 PCR 생산물을 37℃ 수조에서 1시간 동안 2개의 서로 다른 제한효소로 절단한다.

유전자 각각의 제한효소 위치가 다르기에 아래와 같은 두 가지 경우가 있다.

pRSFDuet-cmaao, pRSFDuet-pmaao, pmkdc, llkdc는 EcoRⅤ와 KpnⅠ의 2개의 서로 다른 제한효소로 절단한다.

pETDuet-ecadh1, pETDuet-ecadh2, kpfdh, bsgdh, papdh는 BglⅡ과 XhoⅠ의 2개의 서로 다른 제한효소로 절단한다.

그리고 나서, 상술한 두 가지 경우의 제한효소 절단 생산물을 각각 회수하고, 16℃ 수조에서 12 내지 16시간 동안 연결하되, pRSFDuet-cmaao, pRSFDuet-pmaao는 각각 pmkdc, llkdc와 연결하고, pETDuet-ecadh1, pETDuet-ecadh2는 각각 kpfdh, bsgdh, papdh와 연결한다. 연결 시스템은, 10xDNA ligase buffer 2.5μL, DNA 단편 8μL, 벡터 DNA 2μL, T4 DNA ligase 1μL, 무균수 11.5μL 총 25μL이다.

그다음, 연결 시스템에 100μL의 에스케리치아 DH5-알파 셀을 가하고 가볍게 섞어 30분간 얼음에 방치한다. 예열된 42℃ 수조에 넣고, 90초 동안 방치하여 열 충격을 준다. 즉시 2분간 얼음에 방치한다. 항생제가 함유되지 않은 LB 배양액을 1mL 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하여 균체가 회복되도록 한다. 마지막에 pRSFDuet-cmaao, pRSFDuet-pmaao와 pmkdc, llkdc 각각의 연결 균체를 카나마이신이 함유된 LB 플레이트에 균일하게 도포하고, pETDuet-ecadh1, pETDuet-ecadh2와 kpfdh, bsgdh, papdh 각각의 연결 균체를 암피실린이 함유된 LB 플레이트에 균일하게 도포한 다음, 단일 집락을 골라 12시간 동안 배양한다. 그다음, DNA 염기서열 분석을 진행하여 그 정확성을 보장하고, 최종 정확한 형질전환체를 저장하고 이하 플라스미드를 얻는다.

L-아미노산산화효소 유전자, α-케토산탈카르복시효소 유전자를 함유한 pRSFDuet-cmaao-pmkdc, pRSFDuet-cmaao-llkdc, pRSFDuet-pmaao-pmkdc, pRSFDuet-pmaao-llkdc.

에탄올탈수소효소 유전자, NAD(P)를 환원 가능한 효소 유전자를 함유한 pETDuet-ecadh1-kpfdh, pETDuet-ecadh1-bsgdh, pETDuet-ecadh1-papdh, pETDuet-ecadh2-kpfdh, pETDuet-ecadh2-bsgdh, pETDuet-ecadh2-papdh.

(5) pRSFDuet-1과 pETDuet-1 이중 플라스미드 네 유전자 공동발현 시스템의 구축

생산업체에서 제공한 사용설명서에 따라, TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0을 이용하여 절차 (4)에서 얻은 pRSFDuet-cmaao-pmkdc, pRSFDuet-cmaao-llkdc, pRSFDuet-pmaao-pmkdc, pRSFDuet-pmaao-llkdc 플라스미드 DNA1과 pETDuet-ecadh1-kpfdh, pETDuet-ecadh1-bsgdh, pETDuet-ecadh1-papdh, pETDuet-ecadh2-kpfdh, pETDuet-ecadh2-bsgdh, pETDuet-ecadh2-papdh 플라스미드 DNA2를 추출한 다음, 상술한 플라스미드 DNA1과 플라스미드 DNA2를 각각 1μL 취하여 100μL 대장균 에스케리치아 콜라이(BL21) 수용성 세포를 가하고, 가볍게 섞어서 30분간 얼음에 방치한다. 예열된 42℃ 수조에 넣고 90초 동안 방치하여 열 충격을 준다. 즉시 2분간 얼음에 방치한다. 항생제가 함유되지 않은 LB 배양액을 1mL 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하여 균체가 회복되도록 한다. 마지막에 균체를 암피실린과 카나마이신이 함유된 LB 플레이트에 균일하게 도포하고, 단일 집락을 골라 12시간 동안 배양한 다음, 4개 유전자가 성공적으로 에스케리치아 콜라이(BL21)에 들어갔음을 PCR로 검증하며, 이와 동시에 DNA 염기서열 분석을 진행하여 그 정확성을 확보하고, 균주를 보관하여 사용에 비치한다.

본 실시예는 최종적으로 이하 8주의 유전자 조작된 박테리아, 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc, pETDuet-bsgdh-ecadh1), 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc, pETDuet-bsgdh-ecadh2), 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc, pETDuet-bsgdh-ecadh2), 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc, pETDuet-papdh-ecadh1), 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc, pETDuet-kpfdh-ecadh2), 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc, pETDuet-bsgdh-ecadh1), 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc, pETDuet-kpfdh-ecadh2), 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc, pETDuet-papdh-ecadh1)을 제조하였으며, 재조합균 번호는 각각 A, B, C, D, E, F, G, H이다.

실시예 2

실시예 1에서 획득한 유전자 조작된 박테리아의 유도 발현.

제조된 유전자 조작된 박테리아 단일 집락 10mL를 LB 배지(0.1g/L 암피실린 함유)에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 배양하며, 2%의 부피비를 LB 배지(1000mL 플라스크 배지 200mL, 0.1g/L 암피실린 함유)에 접종하여 세균 대수성장기(OD₆₀₀ 0.6 내지 0.8 도달)까지 37℃에서 2.5시간 동안 계속 배양하고, IPTG를 가하여 농도가 0.4mM이 되도록 하며, 20℃, 200rmp 조건에서 8시간 동안 배양한다. 발현 유도 완료 후, 20℃, 8000rpm, 20분간 원심분리하여 세포를 수집한다. 형질전환에 필요한 균체량에 따라, 플라스크 수량을 증가하여 충분한 균체를 얻을 수 있다.

실시예 3

실시예 2의 상기 발현 유도 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 번호가 A, B, C, D, E, F, G, H인 재조합균이 각각 발현 유도 완료 후 균체를 수집하여, 100mL 반응 부피에서 서로 다른 기질이 각각 전세포와 혼합한 후의 형질전환 상황을 관찰한다. 기질의 최종 농도는 0.5g/L이고, 포도당 농도는 10g/L이며, pH는 8.0으로 조절하고, 첨가한 신선한 전세포 중량은 20g(습중량)이며, 온도는 30℃이고, 24시간 동안 형질전환 후 측정 결과, 각 종류 기질의 반응 상황은 이하 표에 표시된 것과 같다.

그 중, 기질은 각각 L-페닐알라닌, L-타이로신, L-도파이고, 각각 생산물 2-페닐에탄올, 티로솔, 히드록시티로솔에 대응한다.

[표 1]

재조합균이 서로 다른 기질에 대한 형질전환 상황

실시예 4

실시예 2의 상기 발현 유도 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc, pETDuet-bsgdh-ecadh2)이 발현 유도 완료 후 균체를 수집한다. 100mL 반응 부피에서, L-페닐알라닌 농도는 20g/L이고, 포도당 농도는 20g/L이며, pH는 8.0으로 조절하고, 첨가한 신선한 전세포 중량은 20g(습중량)이며, 온도는 20℃이고, 48시간 동안 형질전환 후 측정 결과, 2-페닐에탄올을 생성하고, 농도는 18g/L이다.

실시예 5

실시예 2의 상기 발현 유도 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc, pETDuet-papdh-ecadh1)이 발현 유도 완료 후 균체를 수집한다. 100mL 반응 부피에서, L-도파 농도는 1g/L이고, 아인산 농도는 1g/L이며, pH는 4.0으로 조절하고, 첨가한 신선한 전세포 중량은 10g(습중량)이며, 온도는 35℃이고, 0.5시간 동안 형질전환 후 측정 결과, 히드록시티로솔을 생성하고, 농도는 52mg/L이다.

실시예 6

실시예 2의 상기 발현 유도 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc, pETDuet-kpfdh-ecadh2)이 발현 유도 완료 후 균체를 수집한다. 100mL 반응 부피에서, L-타이로신 농도는 0.5g/L이고, 포름산나트륨 농도는 20g/L이며, pH는 6.0으로 조절하고, 첨가한 신선한 전세포 중량은 1g(습중량)이며, 온도는 30℃이고, 12시간 동안 형질전환 후 측정 결과, 티로솔을 생성하고, 농도는 104mg/L이다.

실시예 7

실시예 2의 상기 발현 유도 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc,pETDuet-kpfdh-ecadh2)이 발현 유도 완료 후 균체를 수집한다. 100mL 반응 부피에서, L-류신 농도는 0.5g/L이고, 포름산나트륨 농도는 1g/L이며, pH는 7.0으로 조절하고, 첨가한 신선한 전세포 중량은 20g(습중량)이며, 온도는 30℃이고, 48시간 형질전환 후 측정 결과, 이소아밀알코올을 생성하고, 농도는 320mg/L이다.

실시예 8

실시예 2의 상기 발현 유도 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc, pETDuet-bsgdh-ecadh1)이 발현 유도 완료 후 균체를 수집한다. 100mL 반응 부피에서, L-페닐알라닌 농도는 0.5g/L이고, 포도당 농도는 1g/L이며, pH는 8.0으로 조절하고, 첨가한 신선한 전세포 중량은 1g(습중량)이며, 온도는 40℃이고, 36시간 형질전환 후 측정 결과, 2-페닐에탄올을 생성하고, 농도는 155mg/L이다.

실시예 9

실시예 2의 상기 발현 유도 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc, pETDuet-kpfdh-ecadh2)이 발현 유도 완료 후 균체를 수집한다. 100mL 반응 부피에서, L-타이로신 농도는 0.5g/L이고, 포름산나트륨 농도는 20 g/L이며, pH는 5.0으로 조절하고, 첨가한 신선한 전세포 중량은 15 g(습중량)이며, 온도는 30℃이고, 48시간 형질전환 후 측정 결과, 티로솔을 생성하고, 농도는 398 mg/L이다.

실시예 10

실시예 2의 상기 발현 유도 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 에스케리치아 BL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc, pETDuet-papdh-ecadh1)이 발현 유도 완료 후 균체를 수집한다. 100mL 반응 부피에서, L-타이로신 농도는 0.5g/L이고, 아인산 농도는 5g/L이며, pH는 7.0으로 조절하고, 첨가한 신선한 전세포 중량은 5g(습중량)이며, 온도는 25℃이고, 6시간 동안 형질전환 후 측정 결과, 티로솔을 생성하고, 농도는 210mg/L이다.

위에서 서술한 L-아미노산산화효소, α-케토산탈카르복시효소, 알코올탈수소효소, NAD(P)를 환원 가능한 효소 및 그 공동발현 유전자 조작된 박테리아의 제조, 균체의 배지 조성 및 배양 방법과 전세포 생물학적 형질전환은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과한 것으로, 본 발명을 한정하는데 사용되지 않는다. 본 발명의 원칙과 사상 내에서 발생하는 어떠한 수정, 균등치환과 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위에 포함되어야 할 것이다.

Claims

페닐에타노이드류 화합물을 저비용으로 생산할 수 있는 재조합 대장균으로서, 상기 재조합 대장균은 4종 효소를 동시에 발현하되, 각각 L-아미노산산화효소, α-케토산탈카르복시효소, 알코올탈수소효소와 NAD(P)를 NAD(P)H로 환원 가능한 효소인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항에 있어서,
상기 L-아미노산산화효소는 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906 또는 코센자에아 믹소파시엔스 ATCC 19692에서 유래하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항에 있어서,
상기 α-케토산탈카르복시효소는 프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906 또는 락토코커스 락티스 ATCC 19435에서 유래하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항에 있어서,
상기 알코올탈수소효소는 에스케리치아 콜라이 BL21(DE3)에서 유래하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항에 있어서,
상기 NAD(P)를 NAD(P)H로 환원 가능한 효소는 포름산탈수소효소, 포도당탈수소효소 또는 아인산염탈수소효소인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제5항에 있어서,
상기 NAD(P)를 NAD(P)H로 환원 가능한 효소는 코마가타엘라 파피이 ATCC 76273에서 유래하는 포름산탈수소효소, 바실루스 서브틸리스 ATCC 13952에서 유래하는 포도당탈수소효소 또는 슈도모나스 아비에타니필라 ATCC 700689에서 유래하는 아인산염탈수소효소인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항에 있어서,
상기 재조합 대장균은 pRSFDuet-1과 pETDuet-1의 이중 플라스미드를 이용하여 4개 효소의 유전자를 공동발현하고 인코딩하되, pRSFDuet-1은 L-아미노산산화효소 유전자와 α-케토산탈카르복시효소 유전자를 탑재하고, pETDuet-1은 알코올탈수소효소와 NAD(P)를 환원 가능한 효소 유전자를 탑재하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제7항에 있어서,
상기 재조합 대장균은 2개의 공동발현 재조합 플라스미드를 숙주 에스케리치아 콜라이 B21로 형질전환하여 얻은 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 대장균을 이용하는 것을 특징으로 하는 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 페닐에타노이드류 화합물은 2-페닐에탄올, 티로솔 및 히드록시티로솔 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는데 사용되는 기질은 L-페닐알라닌, L-타이로신 및 L-도파 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는 것은 전세포 형질전환 생산을 진행하는 것을 특징으로 하는 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 전세포 형질전환 생산 시스템은, 신선한 세포 습중량이 10 내지 200g/L이고, 기질 농도가 0.5 내지 20g/L이고, 수소 공여체 농도가 1 내지 20g/L이고, pH가 4.0 내지 8.0이고, 15 내지 40℃에서 반응하고, 시간이 0.5 내지 48시간인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 페닐에타노이드류 화합물을 생산하는 방법.