CN104178469B - 一种环丙烷甲酸酯水解酶、基因、突变体及其应用 - Google Patents

一种环丙烷甲酸酯水解酶、基因、突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种环丙烷甲酸酯水解酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达载体及重组表达转化体，该重组酶的制备方法，以及该重组酶用于拆分制备(S)‑2，2‑二甲基环丙烷甲酸的方法。与现有技术相比，本发明的环丙烷甲酸酯水解酶具有较好的热稳定性，使用该酶催化制备(S)‑2，2‑二甲基环丙烷甲酸具有催化剂用量少、底物浓度高、对映选择性好、反应条件温和等优点，因此在肾脱氢二肽酶抑制剂西司他汀中间体的生产中具有很好的工业应用前景。

Description

一种环丙烷甲酸酯水解酶、基因、突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种环丙烷甲酸酯水解酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达载体及重组表达转化体，该重组环丙烷甲酸酯水解酶的制备方法，以及该环丙烷甲酸酯水解酶用于拆分制备(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法。
背景技术
(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸[(S）-(+)-2，2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid，(S）-(+)-DmCpCa]，分子式：C6H10O2，分子量：114.14，沸点：100℃/12mmHg，CAS号为14590-53-5。（S）-(+)-DmCpCa是药物西司他汀的重要手性中间体。西司他汀(Cilsatatin)是一种由美国默克(Merck)公司开发的肾脱氢二肽酶抑制剂，其本身并无抗菌效果，仅仅是一种特异性的酶抑制剂，与药物亚胺培南组合使用；亚胺培南(Imipenem)是一种β-内酰胺类抗生素，具备高效的抗菌活性，但易于被肾脱氢二肽酶所破坏。临床试验证明，当亚胺培南单独给药时，经肾小球过滤、分泌作用后，位于近端的肾小管上皮细胞中的肾脱氢二肽酶会催化其水解而使其活力损失约60～95％，从而导致活性药物浓度的降低。当西司他汀与亚胺培南两者组合使用后，西司他汀可以抑制肾脱氢二肽酶的活力，进而有效地降低肾脱氢二肽酶对亚胺培南的水解作用，使得亚胺培南的AUC(24h内稳态血药浓度-时间曲线下的面积)增加20％，在尿液中回收的活性药物高达70％。因此市售的药物是由西司他汀与亚胺培南按1∶1的比例制成的复合制剂一泰能(Tienam)。泰能是第一个成功应用于临床的新型碳青霉烯类抗生素，特别适用于由多种病原体所致疾病以及需氧/厌氧菌共同引起的混合感染，这些病原体/细菌通常对氨基糖甙类、头孢菌素类以及青霉素类抗生素产生耐药性，而对碳青霉烯类抗生素比较敏感。目前泰能是用于重症感染的首选药物，同时也是全球畅销药物之一。
(S）-(+)-DmCpCa的生产方法包括两大类：化学不对称合成法和外消旋体拆分法，其中拆分法又包括化学法拆分与生物法拆分两种。与化学法相比，生物拆分法具有反应条件温和、环境友好、产物光学纯度高等优点，更适合于工业应用。
采用生物拆分法制备(S）-(+)-DmCpCa及其衍生物，一般采用的是水解酶。根据不同类型的水解酶催化底物的结构差异，用于拆分的底物可分为三类：2，2-二甲基环丙烷甲腈、2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和2，2-二甲基环丙烷甲酸酯。王梅祥等应用Rhodococcussp.AJ270催化2，2-二甲基环丙烷甲腈非对映选择性水合生成酰胺，后者可被进一步对映选择性水解，生成(S)-(+)-DmCpCa。当底物2，2-二甲基环丙烷甲腈浓度为20mM时，30℃反应3h后获得(S）-(+)-DmCpCa的ee值为82％，产率为39％(J.Mol.Catal.B：Enzymatic2002，18：267-272)。瑞士Lonza公司以2，2-二甲基环丙烷甲腈为拆分底物，底物浓度为300mM，先由含有腈水合酶的整细胞催化2，2-二甲基环丙烷甲腈水合生成2，2-二甲基环丙烷甲酰胺(欧洲专利，公开号EP 0524604；美国专利，公开号US 5427934)，后者又进一步地被细胞内的酰胺酶选择性的水解，最终产物为(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和(R)-DmCpCa。该方法中产物(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺最终得率为35％，ee值大于98％。这两种方法均以腈为底物，反应的绿色安全性较低。郑裕国等从土壤中筛选得到两株产(R)-酰胺酶的微生物菌株，一株为Delftia tsuruhatensis CCTCC205114，细胞经固定化后，催化10mM的2，2-二甲基环丙烷甲酰胺水解，在pH8.5、35℃条件下反应40min，得到(R)-(-)-DmCpCa的产率为49.5％，ee值＞99％，剩余(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的得率＞49％，ee值为97.7％(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2010，37：503-510)；另一株为Brevibacteriumepidermidis CCTCC207076，使用整细胞作催化剂，在底物浓度10mM，pH7.4、35℃下反应70min，剩余(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的得率为41.1％，ee值＞99％(J.Appl.Microbiol.2008，105：1150-1157)。如果以2，2-二甲基环丙烷甲酸酯为底物，操作步骤简单，而且成本较低。王普采用固定化脂肪酶Novozyme435对映选择性水解2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯(DmCpCe)制备(S）-(+)-DmCpCa，当酶量为16g/L时，转化65mM底物需要64h，产物得率为45.6％，ee值为99.2％。而后他们利用亲水性离子液体作为反应介质虽可将底物浓度提高至100mM，反应时间缩短12h，但由于商品化的Novozyme435价格偏高，并且酶的活力相对较低，重复使用后酶的活性及选择性也有所下降，因此难以满足工业要求(Chin.J.Catal.2010，31：651-655；中国发明专利，公开号CN102559833 B)。刘朝红以2，2-二甲基环丙烷甲酸酯为底物进行野生菌的筛选，发现Rhodococcus sp.ECU1013能够选择性地水解底物生成(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸，两相反应中底物浓度为400mM，反应120h，最终产物的收率为38％，eep为99％(Appl Microbiol Biotechnol.2013，97：7659-7667；中国发明专利，授权公开号CN 102757924 B)。
与传统化学合成法相比，生物催化制备(S）-(+)-DmCpCa的方法具有环境友好、反应条件温和、操作简单等优点，但是目前以上方法仅限于实验室规模，且存在酶自身活力低，产物浓度不高，反应时间较长等缺陷，不适合工业化生产。因此，需要筛选活力高、稳定性好、选择性高且能在较短反应时间获得较高浓度产物的酶，以满足工业化生产西司他汀中间体(S）-(+)-DmCpCa的需求。
发明内容
本发明针对酶法拆分制备(S）-(+)-2，2-DmCpCa中现有技术上的不足，提供了一种催化活力高、对映选择性好、底物耐受性好的环丙烷甲酸酯水解酶及其突变体，含有该酶及突变体基因的重组表达载体及重组表达转化体，该重组酶的制备方法，以及该环丙烷甲酸酯水解酶用于拆分制备(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明采用的技术方案之一：
一种环丙烷甲酸酯水解酶，其是如下的蛋白质(a)或蛋白质(b)：
蛋白质(a)：由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
蛋白质(b)：由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有2，2-二甲基环丙烷甲酸酯水解活性的衍生蛋白质。
所述蛋白质(a)的制备方法较佳的为：从红球菌Rhodococcus sp.ECU1013中分离获得，或者从重组表达该环丙烷甲酸酯水解酶的转化体中分离获得，也可以人工合成。
所述红球菌Rhodococcus sp.ECU1013保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年3月15日，编号为CGMCC5911(见授权公开号为CN102757924 B的中国专利)，该菌株的细胞破碎粗酶液可以催化2，2-二甲基环丙烷甲酸甲酯对映选择性水解，水解产物(S）-DmCpCa的光学纯度高于99％。采用鸟枪法对该菌株的环丙烷甲酸酯水解酶进行了克隆，获得一个具有较高活性和对映选择性的环丙烷甲酸酯水解酶，命名为RhEst1，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
所述蛋白质(b)是在蛋白质(a)的基础上经过一个或多个氨基酸的替换、缺失或添加得到的具有环丙烷甲酸酯水解活性的衍生蛋白质。在通过筛选获得高活性及高选择性酶RhEst1的基础上，对野生型RhEst1进行蛋白质改造，以进一步提高该酶的活性。通过易错PCR技术对RhEst1进行定向进化以及对RhEst1的活性口袋和底物通道附近的氨基酸残基进行半理性设计，发现在SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基础上对第147位的丙氨酸残基、第148位的缬氨酸残基和第254位的甘氨酸残基进行单点替换或组合替换后，仍具有环丙烷甲酸酯水解活性，在此基础上，通过精心设计、筛选获得了酶活性显著提高的突变体。
其中，将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第147位的丙氨酸残基替换为缬氨酸残基，同时第254位的甘氨酸残基替换为丙氨酸残基获得的突变体蛋白RhEst1A147V/G254A对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的水解活性提高了3-4倍。
将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第147位的丙氨酸残基替换为异亮氨酸残基，同时第148位的缬氨酸残基替换为苯丙氨酸残基，同时第254位的甘氨酸残基突变为丙氨酸残基获得的突变体蛋白RhEst1A147I/V148F/G254A对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的水解活性提高了4-5倍。
本发明采用的技术方案之二：
一种分离的核酸，所述核酸是编码如技术方案一所述环丙烷甲酸酯水解酶的核酸。
作为优选，所述的核酸是如下(1)或(2)的核酸：
(1)由序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成的核酸；
(2)编码蛋白质RhEst1，或RhEst1A147V/G254A，或RhEst1A147I/V148F/G254A的核酸。
本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1的核酸分子；或通过基因克隆技术获得编码环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1及其突变体的基因核酸分子，或通过人工全序列合成的方法得到编码环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1及其突变体的核酸分子。
本发明所述通过基因克隆技术获得编码环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1及其突变体的基因核酸分子的方法为：以正向引物5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTCTATTCGTGAAGCCGTC-3’，反向引物5’-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTACCGAGGCTCGAGATGAA-3’，利用聚合酶链式反应技术对技术方案1中获得的RhEst1及其突变体RhEst1A147V/G254A和RhEst1A147I/v148F/G254A的基因DNA序列进行扩增。
PCR体系(50μL)：rTaq0.25μL，10×Buffer5μL，dNTP Mix4μL，模板质粒约100ng，Primer F2μL，Primer R2μL，MnCl2(10mM)0.5μL，diH2O补足至50μL。
PCR反应程序：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性30sec，(3)55℃退火30s，(4)72℃延伸1min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保藏产物。
本发明采用的技术方案之三：
一种包含本发明环丙烷甲酸酯水解酶的核酸序列及突变体核酸序列的重组表达载体。
其可通过本领域常规方法将本发明的环丙烷甲酸酯水解酶基因的核酸序列或突变体核酸序列连接于各种合适载体上构建而成。所述载体优选质粒，更优选质粒pET28a。所述环丙烷甲酸酯水解酶基因可以操作性地连接于适合表达的调控序列的下游，以实现所述环丙烷甲酸酯水解酶的组成型或诱导型表达。
本发明采用的技术方案之四：
一种包含本发明环丙烷甲酸酯水解酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。
其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中来制得所述重组表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达载体稳定地自行复制，且其所携带的环丙烷甲酸酯水解酶基因可被有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠杆菌(E.coli)DH5α。
本发明采用的技术方案之五：
一种重组环丙烷甲酸酯水解酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组环丙烷甲酸酯水解酶。其中，培养所述重组表达转化体所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是可使转化体生长并产生本发明的环丙烷甲酸酯水解酶。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。
由上述技术方案构建的含环丙烷甲酸酯水解酶的重组大肠杆菌，接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于10mLpH8.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组酶的粗酶液，粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组蛋白在细胞中以部分可溶的形式存在，另外有部分蛋白存在于细胞碎片中。
本发明中的蛋白质在N端含有组氨酸标签，故采用镍柱进行蛋白纯化。以下为缓冲液配方：A液：Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.0)，含有0.5M NaCl、20mM咪唑和10％(w/v)甘油；B液：Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.0)，含有0.5M NaCl、500mM咪唑和10％(w/v)甘油。将表达的重组蛋白质上样到镍柱上，首先用A液洗脱杂蛋白，随后用B液洗脱目标蛋白，根据SDS-PAGE检测的结果收集纯化的蛋白质，加入终浓度为20％(w/v)的甘油，于-20℃保存。
本发明采用的技术方案之六：
将本发明的环丙烷甲酸酯水解酶应用于环丙烷甲酸酯的酶法水解以制备光学活性的(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。
不对称拆分反应的底物为2，2-二甲基环丙烷甲酸酯，包括2，2-二甲基环丙烷甲酸甲酯、2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯和2，2-二甲基环丙烷甲酸氯乙酯。反应条件如反应温度、底物浓度、pH、缓冲液组成、酶用量等可按本领域此类反应的常规条件进行选择。野生型RhEst1在20～65℃、pH3.0～10.0的环境中具有较高活性。
在不同温度(20～65℃)下，以磷酸钾(100mM，pH8.0)为缓冲液，10mM对硝基苯酚丙酸酯为测活底物，根据分光光度计405nm处吸光值的变化考察了环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1的活性。结果如表1所示，RhEst1在60℃时催化活性最高。当温度继续升高后，酶活性开始下降。
表1环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1在不同温度下的活性
反应温度为30℃时，以10mM对硝基苯酚丙酸酯为测活底物，根据分光光度计405nm处吸光值的变化，考察了RhEst1在不同pH值缓冲液中的活性。所用的缓冲液体系为：柠檬酸钠缓冲液(pH5.0-6.0)；磷酸钠缓冲液(pH6.0-8.0)；Tris-HCl缓冲液(pH8.0-9.0)和Na2CO3-NaHCO3缓冲液(9.0-10.0)。结果如表2所示，RhEst1的最适pH在8.5左右。
表2(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1在不同pH缓冲液中的活性
典型的酶促2，2-二甲基环丙烷甲酸酯水解拆分反应的条件如下：100mg重组RhEst1粗酶粉，溶解于100mL磷酸钾缓冲液(200mM，pH8.0)中，加入底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯至终浓度为100-1000mM。反应在30℃下进行，200rpm机械搅拌，通过补充1.0MNaOH将pH控制在8.0，直至底物转化率接近50％。反应结束后先用二氯甲烷萃取除去剩余的2，2-二甲基环丙烷甲酸酯底物，剩余水相用20％浓硫酸调pH至酸性，然后用二氯甲烷萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。
本发明的积极进步效果在于：本发明环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1及其突变体具有高效对映选择性拆分2，2-二甲基环丙烷甲酸酯，制备光学活性(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的功能。在底物浓度高达1.0mol/L(约140g/L)时，产物的光学纯度高于98％。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，光学纯度好，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1基因的克隆
将菌株Rhodococcus sp.ECU1013在LB培养基中进行培养，采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取高纯度、大片段的基因组总DNA。将适量Rhodococcus sp.ECU1013菌体加入液氮冷冻，研磨成粉，加入适量2×CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％(w/v)CTAB，40mmol/L巯基乙醇)，65℃保温10分钟，间歇摇动。随后加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000rpm离心10min，将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温，12000rpm离心10分钟。将上层水相转入新的离心管中，加入等体积异丙醇混匀，室温放置30分钟。4000rpm离心10分钟，移去上清液，用70％乙醇漂洗，风干后加入20μl的TE缓冲液(100mM Tris-HCl，10mM EDTA pH8.0，)溶解DNA，-20℃保存备用。采用Sau3AI对总DNA进行部分酶切，酶切后的DNA片段通过电泳进行纯化，采用胶回收纯化试剂盒回收大约2～6kb的片段，回收的DNA溶解于10mmol/L的Tris·HCl(pH8.0)中，置于-20℃保藏。
按如下反应体系与载体pUC118进行连接：
16℃温育12小时，取10μL酶连产物转化200μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa，Code：D9057)，采用三丁酸甘油酯平板进行筛选，挑取产生透明圈的单菌落进行复筛。具体方法参照奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》(P23)。涂布含有50μg/mL硫酸卡那霉素的三丁酸甘油酯平板，培养24h后挑选产生透明圈的克隆子。将阳性克隆子委托上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，根据该核苷酸序列所推测的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，将该序列表达的环丙烷甲酸酯水解酶命名为RhEst1。
实施例2
重组RhEst1的质粒以及重组菌、重组酶的制备
以正向引物5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTCTATTCGTGAAGCC GTC-3’，反向引物5’-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTACCGAGGCTCGAGAT GAA-3’，利用聚合酶链式反应技术对实施例1中获得的RhEst1的核苷酸序列进行扩增，将获得的含有RhEst1序列的DNA片段分别用NdeI和HindIII双酶切，随后与同样经过NdeI和HindIII双酶切的质粒pET28a进行连接，获得质粒pET28a-RhEst1。
将获得的质粒pET28a-RhEst1转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建的含环丙烷甲酸酯水解酶RhEst1的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到1.2时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.0)中，高压匀浆机破碎，冷冻干燥即得RhEst1重组酶。
实施例3
突变体RhEst1A147V/G254A的获得
突变体RhEst1A147V/G254A为随机突变体，通过易错PCR技术建立RhEst1的随机突变体库，利用酚红指示剂在不同pH环境下颜色的变化作为高通量筛选的手段。首先设计两端引物：正向引物5’-CCGGAATTCATGTCTATTCGTGAAGCCGTC-3’，反向引物5’-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTACCGAGGCTCGAGATGAA-3’，以质粒pET28a-RhEst1作为模板进行扩增。聚合酶链式反应PCR体系(50μL)：rTaq0.25μL，10×Buffer5μL，dNTP Mix4μL，模板质粒约100ng，Primer F2μL，Primer R2μL，MnCl2(10mM)0.5μL，diH2O补足至50μL。
PCR程序为：98℃3min，98℃30s，55℃30s，72℃1min，循环30次，72℃10min。PCR片段4℃保存。
含有随机突变位点的PCR片段经EcoRI和HindIII酶切后与具有相同酶切位点的pET28a(+)质粒连接后转入E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆至深孔板进行培养及诱导表达。根据pH指示剂显色的方法进行突变库的活力筛选得到活性提高的突变体，送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件与环丙烷甲酸酯水解酶基因(rhest1)序列进行比对，147位丙氨酸突变为缬氨酸，254位甘氨酸突变为丙氨酸。获得的突变体命名为RhEst1A147V/G254A。
实施例4
突变体RhEst1A147V/G254A的质粒以及重组菌、重组酶的制备
提取如实施例3中所获得的质粒pET28a-RhEst1A147V/G254A，将其转化到大肠杆菌E.coli BL21中，接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到1.2时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.0)中，高压匀浆机破碎，冷冻干燥即得突变体RhEstlA147V/G254A重组酶。
实施例5
突变体RhEstlA147I/V148F/G254A的获得
对RhEst1A147V/G254A进行组合饱和突变。采用II Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene，Catalog#200522)所述方案进行操作。
首先设计含有突变点的简并引物，5’-TGCGTAGCNDTNDTCCCGGCGCGATGTCCG-3’，5’-GCCGGGAHNAHNGCTACGCATCGCCGAGCC-3’。
其中N代表A、T、C、G四种碱基的混合；D代表A、G、T三种碱基的混合。
PCR反应体系(50μl)：模板0.5～20ng，5μl10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的KOD酶(TOYOBO CO.，LTD.，Osaka，Japan)，加灭菌蒸馏水至50μl。
其中所述的模板为实施例3获得环丙烷甲酸酯水解酶突变体质粒pET28a-RhEst1A147V/G254A。
PCR反应程序：(1)94℃变性5min；(2)94℃变性30sec，(3)55℃退火1min，(4)68℃延伸7min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后68℃延伸10min，4℃保藏产物。
扩增得到的PCR产物在37℃经内切酶DpnI消化2h后转化E.coliBL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆200株至深孔板进行培养及诱导表达。根据pH指示剂显色的方法进行突变库的活力筛选，得到的活力提高的突变体，送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件与环丙烷甲酸酯水解酶基因(rhest1-1)序列进行比对，147位突变为异亮氨酸，148位突变为苯丙氨酸，254位突变为丙氨酸。得到的突变体命名为RhEst1A147I/V148F/G254A。
实施例6
突变体RhEst1A147I/V148F/G254A的质粒以及重组菌、重组酶的制备
提取如实施例5中所获得的质粒pET28a-RhEst1A147I/V148F/G254A，将其转化到大肠杆菌E.coli BL21中，接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到1.2时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.0)中，高压匀浆机破碎，冷冻干燥即得突变体RhEst1A147I/v148F/G254A重组酶。
实施例7-9
重组酶RhESt1催化不同2，2-二甲基环丙烷甲酸酯水解拆分
重组RhEst1可以催化多种2，2-二甲基环丙烷甲酸酯的对映选择性水解，生成高光学纯度的(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。分别考察了RhEst1对2，2-二甲基环丙烷甲酸甲酯、2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯和2，2-二甲基环丙烷甲酸氯乙酯的活性以及水解产物的光学纯度，结果见表3。
表3 RhEst1对不同2，2-二甲基环丙烷甲酸酯的活性和产物光学纯度
实施例10-13
重组酶RhEst1催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯水解拆分
将100mg重组RhEst1粗酶粉溶解于10mL磷酸钾缓冲液(200mM，pH8.0)中，加入底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯至终浓度为100-1000mM。反应在30℃下进行，通过补充1.0MNaOH将pH控制在8.0，直至底物完全转化。反应结束后用20％浓硫酸调pH至酸性，反应液用乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定转化率和水解产物的ee值。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度250℃，检测器温度280℃，初始柱温80℃，10℃/min至180℃。结果见表4。
表4.重组酶RhEst1催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称拆分的结果
实施例14-16
RhEst1及其突变体催化2，2-二甲基环丙烷甲酸酯水解拆分
实施例3获得的野生型RhEst1、实施例4获得的突变体RhEst1A147V/G254A与实施例5获得的突变体RhEst1A147I/V148F/G254A分别催化(s)-2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯水解反应。称取50mg重组RhEst1或突变体粗酶粉，溶解于10mL磷酸钾缓冲液(200mM，pH8.0)中，加入底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯至终浓度为100mM，反应在30℃下进行。从反应情况看(如表5)，突变体转化率达到50％左右所需的时间明显减少。
表5.重组酶RhEst1及其突变体催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称拆分的结果
实施例17
(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的十克级制备
反应在1L三口烧瓶中进行，加入800mL Tris-HCl缓冲液，4g如实施例5制备的RhEst1A147I/V148F/G254A粗酶粉以及58.7g消旋2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，在30℃，200rpm机械搅拌下反应，流加1M NaOH控制反应液pH维持在8.0。反应16h后，转化率达到44.1％，此时产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的光学纯度为98.6％。停止反应，加入800mL二氯甲烷萃取除去剩余2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，剩余水相中加入20％(w/v)的硫酸调节pH至2左右，加入800mL二氯甲烷进行萃取，重复两次，合并萃取液，旋转蒸发除去溶剂，获得(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸18.9g，收率为40.2％，GC纯度为97.0％，光学纯度为98.4％ee。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种环丙烷甲酸酯水解酶，其特征在于，其是如下的蛋白质(a)、蛋白质(b)或蛋白质(c)：
蛋白质(a)：由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
蛋白质(b)：SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第147位丙氨酸残基替换为缬氨酸残基，同时第254位甘氨酸残基替换为丙氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质；
蛋白质(c)：SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第147位丙氨酸残基替换为异亮氨酸残基，同时第148位的缬氨酸残基替换为苯丙氨酸残基，同时第254位甘氨酸残基替换为丙氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸编码如权利要求1所述的环丙烷甲酸酯水解酶。
3.根据权利要求2所述的一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸为如序列表中SEQID No.1所示核苷酸序列组成的核酸。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求3所述的核酸。
5.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种重组环丙烷甲酸酯水解酶的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：培养如权利要求5所述的重组表达转化体，获得重组表达的环丙烷甲酸酯水解酶。
7.使用如权利要求1所述的环丙烷甲酸酯水解酶或如权利要求6所述方法获得的重组环丙烷甲酸酯水解酶催化2,2-二甲基环丙烷甲酸酯对映选择性水解制备(S)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的方法；
所述的2,2-二甲基环丙烷甲酸酯是2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯，或者是2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，或者是2,2-二甲基环丙烷甲酸氯乙酯。
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