TW202020148A - 編碼改良之轉胺酶蛋白質之核酸 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於具有改良的ω-轉胺酶(ω-TA)活性之蛋白質、編碼具有改良ω-TA活性之個別蛋白質的核酸分子,以及用於立體選擇性合成對掌胺和胺基酸或增加鏡像異構物混合物中對掌胺異構物的方法。
Description
本發明係關於具有改良的ω-轉胺酶(ω-TA)活性之蛋白質、編碼具有改良ω-TA活性之個別蛋白質的核酸分子,以及用於立體選擇性合成對掌胺和胺基酸或增加鏡像異構物混合物中對掌胺異構物的方法。
生物催化可以天然可取得的酵素為基礎。通常更希望產生一特定的產物創造對特定酵素的需求,其能應付經濟可行的大規模製造該所欲產物。酵素工程為對經濟性生產特定產物最佳化酵素的一選項。
胺和胺基酸普遍存在於天然界中,不僅為蛋白質和核酸的一部份亦具有作為神經傳導物(例如腎上腺素和組織胺)、輔酶(例如輔酶A之半胱胺)或複合脂質(例如磷脂醯乙醇胺之乙醇胺)之前驅物的至關重要性。特言之,在醫藥上歸類為生物鹼之較高取代的胺展現大量各種的結構以及在生命各種形式中所見到的生物效應。胺的生物活性,例如抗生性、鎮痛性或神經毒性提升了其作為醫藥的的潛在性且因此使其成為新藥研發上非常有希望的候選者。對掌胺之立體中心的絕對組態為與生物分子相互作用之關鍵,且因此亦為生物系統上有效類型的關鍵。就製造所欲的目標分子,產生正確的對掌性常常是一項挑戰(Schaetzle,2011,Inaugural Dissertation,Ernst-Moritz-Arndt-University of Greifswald,Germany,“Identification,characterization and application of novel(R)-selective amine transaminases”)。
在醫藥公司運籌中的許多活性化合物為對掌性。光學活性胺屬於供合成許多活性醫藥和農藥產品之重要化合物種類。例如,L-苯丙胺酸為動物飼料中一重要的添加物。對於可取得的鏡像異構上純的胺基酸之
化學合成,市面上並無可行的方法。然而,外消旋胺基酸的化學合成仍為重要的,因為在某些情況下將外消旋混合物藉由生物催化方法解析成純的異構物為可能的(Breuer et al.,2004,Angewandte Chemie International Edition 43,788-824)。
胺轉胺酶或ω-轉胺酶(ω-TA)為用於製造對掌性初級胺之至關重要的生物催化劑。利用吡哆醛(pyridoxal)-5'-磷酸鹽(PLP)作為輔因子,ω-TA催化了將一胺基基團從胺基供體轉移到羰基團。因此,反應混合物係由二種胺(胺供體和產物)和二種羰基化合物(酮基質和副產物)所組成。已發現有(S)-選擇性和(R)-選擇性轉胺酶二者且至目前已有完整描述。酵素為高立體-選擇性且因此具有直接不對稱胺化作用之高度可能性,其中係直接從非對掌酮使用低廉的胺供體產生具有高鏡像異構物超越值之對掌胺(Fesko et al.,2013,J.Molecular Catalysis B,Enzymatic 96,103-110)。
轉胺酶在廣泛各類的對掌胺和胺基酸之生物催化合成上已引起關注。轉胺酶可應用於外消旋胺基酸之動力解析(從一混合物中移除一異構物)或從對應的前-掌性酮-基質開始的不對稱合成。由轉胺酶所催化的反應可視為一氧化還原反應,其中供體的氧化去胺作用係與受體的還原胺化作用結合(Rudat et al.,2012,AMB Express 2:11)。
Cann等人(2012,Org.Process Res.Dev.16,1953-1966)揭示了成功使用ω-轉胺酶供立體選擇性製造α-胺酯,一種用於製造偏頭痛醫藥的前驅物。
US 4,950,606描述了用於製造光學活性胺類之方法。在此方法中,來自巨桿菌(Bacillus megaterium)和螢光假單胞菌(Pseudomonas putida)的ω-轉胺酶轉,藉由從胺基供體對掌體選擇性轉移胺基基團,將前-對掌酮或酮酸變成胺。可得到胺的(R)-和(S)-組態。
Park等人(2013,Organic & Biomolecular Chemistry 11,6929-6933),藉由使用異丙胺和各種其他的化合物作為胺供體,揭示了在來自酮酸的非天然胺酸之對掌體選擇性合成中,不同的轉胺酶行為。
Park等人(2013,ChemCatChem 5,1734-1738),藉由於一鍋反應中使用外消旋芳烷基胺作為胺基供體,演示了使用(R)-或(S)-選擇性ω-
轉胺酶進行熱力學上有利的前-掌性烷酮之不對稱胺化作用的可行性。此反應不需要添加過量的胺基供體或移除共產物(co-products)。
使用2-丙基胺、1-丙基胺和外消旋-2-丁基胺作為胺基供體的ω-轉胺酶催化反應,相較於其中使用丙胺酸做為胺基供體之反應,已顯示產生高達3倍的轉化。胺基酸β-丙胺酸和天門冬醯胺酸為拙劣的胺基供體。就某些含有一芳香殘基之甲基酮類,當使用過量的2-丁基胺或1-苯乙基胺作為胺基供體時,得到高產率的光學純胺類。不需要移動平衡的另外步驟(Fesko et al.,2013,J.Molecular Catalysis B,Enzymatic 96,103-110)。
Shin & Kim(2001,Biosci.Biotechno.Biochem.65(8),1782-1788)揭示了使用芳基胺,包括(S)-α-甲基苯甲基胺((S)-α-MBA)、1-甲基-3-苯丙基-胺、1-胺基四氫萘或1-胺基二氫茚作為胺基供體,分離ω-轉胺酶。發現酮酸類丙酮酸和乙醛酸(glyoxylate)或醛類丙醛和丁醛為優良的胺基受體。
US 6,133,018揭示了藉由讓甲氧基丙酮和對掌胺基供體2-胺基丙烷與ω-轉胺酶接觸,製造(S)-1-甲氧基-2-胺基丙烷。
藉由以D-胺基酸胺基移轉酶(轉胺酶)催化,使用D-丙胺酸做為胺基供體將酮酸轉變為個別的D-胺基酸來製造D-胺基酸之四酵素系統係描述於Galkin et al.(1997,J.Fermentation and Bioengeneering 83(3),299-300)中。為了將反應平衡驅向D-胺基酸方向,進一步的反應係結合D-胺基酸轉胺酶。藉由丙胺酸去氫酶丙酮酸和氨轉變成L-丙胺酸同時將NADH還原成NAD。藉由丙胺酸外消旋酶將L-丙胺酸轉變成D-丙胺酸。藉由甲酸去氫酶催化從甲酸形成二氧化碳將NADH從NAD回收。藉由D-胺基酸轉胺酶反應從丙胺酸回收丙酮酸。可製造高產率的麩胺酸、白胺酸、正白胺酸和甲硫胺酸的D-鏡像異構物,而D-苯丙胺酸和D-酪胺酸的合成則產率低,D-正纈胺酸僅產生接近30%而胺基丁酸則僅產生外消旋混合物。
WO 2010/089171 A2揭示了以具有轉胺酶活性的酵素所催化的反應在一包括至少一酮基團的多環系中將至少一酮基基團胺化成胺基基團的方法。
WO 2015/195707 A1(US2015361468 A1)揭示了藉由基因轉殖細菌製造五碳聚合物建構元件。細菌的生物合成路徑係藉由導入多種酵素(包括ω-轉胺酶)來操作。ω-轉胺酶顯現催化戊二酸半醛至5-胺基戊酸以及逆反應、5-胺基戊醇至5-側氧基戊醇、屍胺(cadaverine)至5-胺基戊醛、N5-乙醯基l-1,5-二胺基戊烷至N5-乙醯基-5-胺基戊醛之反應。分別係使用L-麩胺酸/2-側氧基戊二酸或L-丙胺酸/丙酮酸作為胺基供體/受體。
KR 20030072067揭示了分離嗜熱芽孢桿菌屬(thermophyllic Bacillus sp.)T30菌株,包括L-選擇性芳香胺基酸胺基酸移轉酶(轉胺酶)和使用此菌株作為生物催化劑用於在高反應溫度藉此增加酮酸受質的溶解度,製造芳香L-胺基酸。
Koszelewski等人(2010,ChemCat Chem 2(1),73-77,包括「補充資料」)揭示了使用整個細胞催化劑從對應的前-掌性胺合成鏡像異構上純的胺以及解析外消旋胺。來自巨桿菌(Bacillus megaterium)SC6394、反硝化產鹼菌(Alcaligenes denitrificans)Y2k-2、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)DSM30191、弗式弧菌(Vibrio fluvialis)的ω-轉胺酶之W57G突變體和稱為CNB05-01的突變體、源自節桿菌(Arthrobacter)的不同ω-轉胺酶係表現在大腸桿菌(Escherichia coli)細胞中。使用凍乾的大腸桿菌細胞進行動力解析及立體選擇性胺化反應。
可使用轉胺酶的產物範圍受限於多數的天然生成ω-轉胺酶之特性不被接受比在酮相鄰位置之乙基基團更巨大的受質(Savile et al.,2010,Science 329,305-309,including“Supporting Information”)。Park等人(2014,Adv.Synth,Catal.356,212-220)從脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)發現了一種(S)-選擇性ω-轉胺酶,其接受帶有至高正丁基基團取代基(亦即2-側氧己酸正己酯)之受質,但不接受支鏈的α-酮酸。一來自脱氮副球菌的(S)-選擇性ω-轉胺酶之變體(V153A)顯示了趨向直鏈酮酸(S)-1-苯丁基胺之提升的活性,但不接受支鏈酮酸。
在作為胺基供體之異丙基胺的存在下,從經取代的四氫萘酮製造經取代(S)-胺基四氫萘的反應中,相較於個別野生型序列的胺基酸序列,包括17個胺基酸取代的嗜溫性檸檬節桿菌(Arthrobacter citreus)ω-轉胺酶
之變體,顯現提升的熱穩定性和明顯提高的特定活性(Martin et al.,2007,Biochemical Engineering Joumal 37,246-255)。
Savile等人(2010,Science 329,305-309,包括「補充資料」)揭示了藉由涉及ω-轉胺酶之生物催化方法製造複合抗糖尿病醫藥西格列汀(sitagliptin)。製造節桿菌屬(R)-選擇性ω-轉胺酶(ATA-117)的各種變體。此等酵素顯現廣泛的基質範圍,對異丙胺和有機溶劑的耐受性增加。各種經三氟甲基取代的胺和苯胺可藉由這些酵素來製造。一相較於野生型酵素含有27個胺基酸取代的節桿菌屬(R)-選擇性ω-轉胺酶(ATA-117)之最適化變體,係在異丙胺作為胺供體的存在下藉由原西格列汀酮(prositagliptin ketone)的胺化作用,用來製造西格列汀。
WO 2006/06339(US 7,247,460)揭示了熱穩定之檸檬節桿菌(Arthrobacter citerus)ω-轉胺酶變體,當相較於個別的野生型酵素時,具有增加的反應速率和對高的胺供體濃度之耐受性。
雖然目前已達成數項轉胺酶之改良,但在胺的不對稱合成或外消旋胺解析期間所造成的限制,例如不利的平衡、受質和產物抑制、拙劣的熱穩定性、不充分的受質專一性和有時低的轉胺酶鏡像選擇性仍必須克服,以便在工業規模上高效的製造廣泛範圍的胺。
因此需要進一步改良ω-轉胺酶。特別是有關製造所欲的胺化、鏡像異構上富集或純的產物,較佳地在特定及/或經濟上可行的製造方法下須要進一步改良的ω-轉胺酶。
本發明係提供在其胺基酸序列中包含修飾之ω-轉胺酶(ω-TA)變體或在其胺基酸序列中包含額外修飾之進一步修飾的ω-轉胺酶(ω-TA)變體,這些變體和包含另外胺基酸修飾之另外的變體,相較於個別的野生型ω-TA,係具有提升的反應動力學、提升的基質接受性和提升的專一活性。因此本發明變體和包括另外的胺基酸修飾之變體能開發具經濟效益的生產方法於生產新胺化產物或使用個別ω-TA野生型無法達到的個別產物前驅物之方法中供胺化產物。
文中所述的ω-TA之變體或另外的經修飾變體具有優於已知野生型和其他已知ω-TA之優點。特言之,文中所述之經修飾或變異的ω-TA具有其可產生鏡像異構物富集或幾乎為純的鏡像異構物或純化合物之優點,例如無法以個別野生型ω-轉胺酶製造的支鏈或芳香胺基酸。文中所述之進一步修飾的ω-TA變體具有可產生磷酸化-胺基酸之鏡像異構物富集或幾乎純的或純化合物之優點。
SEQ ID NO 3中位置1至477係代表來可衍生自GenPept(PDB)登錄號5G09_A來自巨桿菌的野生型ω-轉胺酶(ω-TA)之胺基酸序列。
SEQ ID NO 6中位置1至479係代表可衍生自GenPept(PDB)登錄號No 5G2P_A來自節桿菌的野生型ω-TA之胺基酸序列。
SEQ ID NO 9中位置1至476係代表可衍生自GenPept(PDB)登錄號KRF52528.1來自桿菌屬(soil 76801D1的野生型ω-TA之胺基酸序列。
SEQ ID NO 12中位置1至476係代表可衍生自WO 2006/06336 A2之SEQ ID NO 16來自節桿菌屬的ω-TA變體之胺基酸序列。
SEQ ID NO 15中位置1至476係代表可衍生自WO 2006/06336 A2之SEQ ID NO 2來自節桿菌屬的野生型ω-TA之胺基酸序列。
文中所述為具有ω-TA活性之蛋白質,其中這些蛋白質的胺基酸序列係代表具有ω-TA活性的已知蛋白質之變體。特言之,文中所述之具有ω-TA活性的蛋白質之胺基酸序列係代表SEQ ID NO 3中從位置1至477的胺基酸所表示及/或SEQ ID NO 6中從位置1至479的胺基酸所表示,及/或SEQ ID NO 9中從位置1至476的胺基酸所表示,及/或SEQ ID NO 12中從位置1至476的胺基酸所表示,及/或SEQ ID NO 15中從位置1至476的胺基酸所表示之胺基酸序列的變體,其中在SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 15所示的各胺基酸序列中至少在位置25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410和414的胺基酸係與該等分別在SEQ ID NO 3、
SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 15所示的各序列中個別的胺基酸位置所給予的胺基酸不同。
文中使用縮寫「ω-TA」且係指「ω-轉胺酶」。
術語「變體」如文中所用係指不同於本項技術中已知標的之標的。就有關核酸分子和蛋白質變體請了解係分別包括核酸序列或胺基酸序列,其係異於相應已知的序列,但編碼具有相同功能或催化相同反應之蛋白質,例如編碼具有ω-TA活性之蛋白質的功能。異於已知核酸序列和蛋白質序列之核酸分子序列和胺基酸序列係指相較於相應已知的核酸序列或胺基酸序列,此等序列係分別包括取代(置換)及/或刪除及/或插入的核苷酸或胺基酸。
圖1:質體圖,係顯示用於表現具有DAAO、ω-TA和來自單一操縱子做為三-順反子RNA(tri-cistronic RNA)之催化酶(catalase)活性的蛋白質遺傳因子。涉及三順反子RNA之轉錄和轉譯的調控遺傳因子之縮寫說明:
lac操縱子:Ullmann,2001,Encyclopedia of Life Sciences,John Wiley & Sons,Ltd,ISBN:9780470015902;Ullmann,2009,Encyclopedia of Life Sciences(ELS),John Wiley & Sons,Ltd:Chichester.DOI:10.1002/9780470015902.a0000849.pub2;由SEQ ID NO 26所示的核酸序列所組成。
Trc啟動子:由大腸桿菌trp和lacUV5啟動子所衍生的合成啟動子(Brosius et al.,1985,J Biol Chem 260,3539-3541);由SEQ ID NO 27所示的核酸序列所組成。
rrnB:RhoI-獨立的轉錄終止訊號(Pfeiffer & Hartmann,1997,J Mol Biol.265(4)385-393;Orosz et al.,1991,Eur J Biochem.201(3),653-659);由SEQ ID NO 28所示的核酸序列所組成。
t7增強子:來自t7基因之轉錄增強序列(所用的序列:ttaacttta)。
RBS1:核醣體結合位(序列:gaggt)。
順反子:轉錄終止序列;由SEQ ID NO 29所示的核酸序列所組成。
RBS2:核醣體結合位(所用的序列:aaggag)。
boxA:轉錄抗終止序列(所用的序列:tgctctttaacaa)。
順反子:由SEQ ID NO 29所示的核酸序列所組成之合成順反子。
rrnB終止子:轉錄終止訊號;由SEQ ID NO 30所示的核酸序列所組成。
T2終止子:轉錄終止訊號(Orosz et al.,1991,Eur J Biochem.201(3),653-659)。
圖2:顯示由來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列,或來自巨桿菌具有SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列的野生型ω-TA蛋白質,相較於具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體所催化的2-側氧基戊酸胺化作用,製造(S)-正纈胺酸。
圖3:顯示由來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列,或來自巨桿菌具有SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列的野生型ω-TA蛋白質,相較於具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體所催化的4-甲基-2-側氧-戊酸之胺化作用,製造(S)-白胺酸。
圖4:顯示由來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列,或來自巨桿菌具有SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列的野生型ω-TA蛋白質,相較於具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體所催化的苯丙酮酸之胺化作用,製造(S)-苯丙胺酸。
圖5:係顯示由來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列,或來自巨桿菌具有SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列的野生型ω-TA蛋白質,相較於具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體所催化的對-羥基苯丙酮酸之胺化作用,製造(S)-酪胺酸。
本發明之第一實施例係關於具有ω-TA活性之蛋白質,其中該等蛋白質係選自由下列組成之群組:
a)包括如SEQ ID NO 3所示從位置1至477之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置
88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;
b)包括如SEQ ID NO 6所示從位置1至479之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為T,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;
c)包括如SEQ ID NO 9所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;
d)包括如SEQ ID NO 12所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸和位置187
的胺基酸不為S,不為E,在位置197的胺基酸不為T,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;
e)包括如SEQ ID NO 15所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸和在位置187的胺基酸不為S,不為E,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;
f)與a)、b)、c)、d)、e)或f)所示的任何胺基酸序列具有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過在各情況下對應位置25的胺基酸不為F,對應位置64的胺基酸不為L,對應位置88的胺基酸不為T,對應位置157的胺基酸不為T,對應位置165的胺基酸不為R,對應位置169的胺基酸不為V,對應位置174的胺基酸不為E,對應位置187的胺基酸不為S,對應位置197的胺基酸不為T或M,對應位置239的胺基酸不為S,對應位置327的胺基酸不為S,對應位置328的胺基酸不為V,對應位置384的胺基酸不為Y,對應位置389的胺基酸不為I,對應位置391的胺基酸不為D,對應位置396的胺基酸不為K,對應位置410的胺基酸不為H,對應位置414的胺基酸不為P。
胺基酸縮寫A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y之意義可由下文中副標題「序列說明」段落的表4導出。
第一胺基酸序列中「對應位置x之胺基酸」(例如,SEQ ID NO 3中的位置64)在文中係指,在第一胺基酸序列與第二胺基酸序列的逐對序列比對下,如果第二胺基酸序列的胺基酸編號與第一胺基酸序列的胺基酸編號不同,當相較於第一胺基酸序列時,顯示在第一胺基酸序列位置x的第二胺基酸序列的胺基酸。
在本發明內容中,術語「相同性」就序列相同性或相同序列而言,請了解係指在整個序列長度中第一核酸或胺基酸序列分別與另外的(第二)核酸或胺基酸序列所享有之相同胺基酸或核苷酸數目,其係以百分比表示。
「序列相同性」可使用包括在例如已知軟體如GAP或BESTFIT或Emboss程式「Needle」中之全域或區域比對演算法,藉由二個胺基酸序列或二個核苷酸之比對來測定。這些軟體係使用Needleman和Wunsch全域比對演算法,在其整個長度內,最大化配對數及最小化空位數來比對二個序列。一般而言,係使用預設參數,空位建立罰分=10而空位延伸罰分=0.5(就核苷酸和蛋白質比對二者)。就核苷酸,所用的預設給分矩陣為DNAFULL而蛋白質的預設給分矩陣為Blosum62(Henikoff & Henikoff,1992,PNAS 89,10915-10919)。就序列相同性百分比之序列比對和給分可例如使用軟體,例如可由EBI的全球資訊網(ebi.ac.uk/Tools/emboss/)取得的EMBOSS來測定。另一種選擇,序列類似性和相同性可藉由搜尋資料庫(例如EMBL,GenBank)藉由使用俗知的運算法和輸出格式例如FASTA、BLAST等來測定,但較佳地應點擊檢索及逐對比對用以最終測定序列相同性。
較佳地,有關具有ω-TA活性之蛋白質的相同性係藉由與SEQ ID NO 18所給予的胺基酸序列相比較來測定,而有關編碼具有ω-TA活性之蛋白質的核酸分子相同性係藉由將SEQ ID NO 16或17所給予的核酸序列,在電腦程式的幫助下分別與其他的蛋白質或核酸分子相比較來測定。若彼此相比較的序列長度不同,則相同性係分別藉由測定較短序列與較長序列享有的胺基酸或核苷酸數目之相同性百分比來測定。較佳地,相同性係使用已知的和公開可取得的電腦程式ClustalW來測定(Thompson et
al.,Nucleic Acids Research 22(1994),4673-4680)。ClustalW係由Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE),European Molecular Biology Laboratory,Meyerhofstrasse 1,D 69117 Heidelberg,Germany公開發布。ClustalW可從各個不同的網頁下載,其中包括IGBMC(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire,B.P,163,67404 Illkirch Cedex,France;ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)及EBI的所有鏡像網頁(European Bioinformatics Institute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SD,UK)。
較佳地,係使用1.8版的ClustalW電腦程式來測定本發明內文中所述的蛋白質和其他蛋白質之間的相同性。本處,參數必須如下設定:KTUPLE=1,TOPDIAG=5,WTNDOW=5,PAIRGAP=3,GAPOPEN=10,GAPEXTEND=0.05,GAPDIST=8,MAXDIV=40,MATRIX=GONNET,ENDGAPS(OFF),NOPGAP,NOHGAP。
較佳地,係使用1.8版的ClustalW電腦程式來測定例如本發明內文中所述的核酸分子之核苷酸序列和其他核酸分子之核苷酸序列間的相同性。本處,參數必須如下設定:KTUPLE=2,TOPDIAGS=4,PAIRGAP=5,DNAMATRIX:IUB,GAPOPEN=10,GAPEXT=5,MAXDIV=40,TRANSITIONS:非加權。
相同性再者係指所提及之核酸分子或由其所編碼的蛋白質之間具有功能及/或結構相等性。功能相等係指核酸分子序列或胺基酸序列編碼一具有ω-TA活性的蛋白質。與上述分子同源及代表這些分子之衍生物的核酸分子一般為這些分子的變體,其係代表具有相同生物功能或催化相同反應,亦即編碼具有ω-TA活性的蛋白質之修飾。其可為天然生成的變體,例如來自其他物種的序列,或突變,其中這些突變可能已以自然的方式發生或藉由靶定突變導入。再者,變體可為合成產生的序列。等位基因變體可為天然生成的變體或合成產生的變體或由重組DNA技術所產生的變體。然而,就本發明而言,決定性的為該等變體係編碼具有ω-TA活
性及包括文中所述有關本發明蛋白質的胺基酸取代(置換)、刪除或插入之蛋白質。
一特定類型的衍生物為,例如由於基因碼簡併,與本發明內文中所述的核酸分子不相同之核酸分子。
根據NC-IUBMB(國際生物化學與分子生物學聯盟命名委員會)轉胺酶(TA)係屬於移轉酶類別(EC 2)。移轉酶為將一基團,例如甲基基團或糖苷基基團從一化合物(一般視為供體)轉移至另一化合物(一般視為受體)之酵素。移轉酶的群族係包括轉移氮基團之酵素(EC 2.6)。由TA所催化的反應形式上可視為根據通式(I),藉由將-NH2基團和-H轉移至含有羰基的化合物交換該基團的=O,帶有(胺)供體之氧化性脫胺作用結合羰基受體之還原性胺化作用的氧化還原反應R1-CH(-NH2)-R2+R3-CO-R4 → R1-CO-R2+R3-CH(-NH2)-R4。
同樣由TA所催化的逆反應形式上可根據通式(Ia)來描述R1-CO-R2+R3-CH(-NH2)-R4 → R1-CH(-NH2)-R2+R3-CO-R4。
TA為吡哆醛5'-磷酸(PLP)-依賴的酵素。TA催化反應之獨特的特質為轉移胺基基團(藉由一涉及共價基質-輔酶中間物之完整建立的機制),其合理地將這些移轉酶間的酵素分配至一稱為轉胺酶或胺基移轉酶(EC 2.6.1)的特別亞類。
TA在本項技術中一般係進一步分類為α-TA和ω-TA。此命名係以由個別TA所轉移的胺基酸之胺基基團的相對位置為基準。就胺而言羧酸α-TA僅催化α-碳的胺基基團之轉胺作用,其中ω-TA亦作用在非-α-胺上並轉移個別基質的遠端胺基(Shin et al.,2003,Appl Microbiol Biotechnol 61,463-471)。然而,在本項技術中已知某些ω-TA能催化不帶有羧基基團的(初級)胺化合物的轉胺作用(Rudat et al.,2012,AMB Express 2(11);Shin et al.,2003,Appl Microbiol Biotechnol 61,463-471)。
若一蛋白質具有TA活性,特別是一ω-TA可以本項技術中已知的方法偵測及描述。Hwang & Kim開發出以CuSO4/MeOH將α-胺基酸染成藍色為基準之用於偵測ω-TA活性的分析(2004,Enzyme and Microbiol Technology 34(5),429-436)。Truppo等人(2009,Org.Biomol.Chem.7,
395-398)描述了以多酵素級聯pH-指示劑分析為基準之用於高通量篩選的分析及另外揭示了一習知的HPLC分析。
使用哪一種方法來偵測根據本發明之蛋白質是否具有ω-TA活性並非決定性的。較佳地,針對本發明,係使用「通用方法」第4項所描述的方法來偵測根據本發明之蛋白質是否具有ω-TA活性,特言之,係使用此方法來偵測根據本發明之ω-TA變體是否具有ω-TA活性。
有關包括另外的胺基酸修飾之ω-TA變體,較佳地係使用「通用方法」第7項所描述的方法來偵測本發明之蛋白質是否具有ω-TA活性。
在本發明一較佳的實施例中,本發明之蛋白質為一(S)-選擇性ω-TA。
針對本發明,術語「(S)-選擇性」係指根據通式(I)之(胺)受體的還原性胺化作用產生(S)-鏡相異構物之鏡相異構物超越值優於(R)-鏡相異構物。
由(S)-選擇性ω-TA所催化的反應形式上可根據通式(II)來描述R1-CH(-NH2)-R2+R3-CO-R4 → R1-CO-R2+R3-CH((S)-NH2)-R4。
相較於上文有關SEQ ID No 3、6、9、12或15所示的胺基酸序列所描述的胺基酸序列,根據本發明之ω-TA變體蛋白質可展現另外的胺基酸修飾(胺基酸取代、刪除或插入)。
除了上文a)或c)項所描述的ω-TA變體,SEQ ID NO 3從位置1至477所示的胺基酸序列或SEQ ID NO 9從位置1至477所示的胺基酸序列,分別在位置2及/或48及/或164及/或242及/或245及/或311及/或353及/或424可具有另外的胺基酸取代,及/或SEQ ID NO 3所示的胺基酸序列在位置202及/或205及/或359及/或475及/或476可具有另外的胺基酸取代,及/或在位置477可具有胺基酸刪除,及/或SEQ ID NO 9所示的胺基酸序列在位置69及/或90及/或268及/或318及/或322及/或452可具有另外的胺基酸取代。
除了上文b)和d)項所描述的ω-TA變體,SEQ ID NO 6從位置1至479所示的各胺基酸序列或SEQ ID NO 12從位置1至476所示的胺基酸序列,分及/在位置46及/或60及/或185及/或186及/或195及/或205及/或252及/或268及/或409及/或436可具有另外的胺基酸取代,及/或在SEQ ID NO 6所示的胺基酸序列中在位置477及/或478及/或479的胺基酸可經刪除。
除了上文e)項所描述的ω-TA變體,SEQ ID NO 15從位置1至476所示的胺基酸序列在位置48及/或164及/或242及/或245及/或255及/或424可具有另外的胺基酸取代。
本發明另一實施例因此係關於包括另外的胺基酸修飾之本發明蛋白質,較佳地該等實施例為具有ω-TA活性之蛋白質,其中該蛋白質係選自由下列組成之群組:
a)包括如SEQ ID NO 3所示從位置1至477之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P,以及在位置2的胺基酸不為S,在位置48的胺基酸不為D,在位置164的胺基酸不為Y,在位置202的胺基酸不為D,在位置205的胺基酸不為L,在位置242的胺基酸不為A,在位置245的胺基酸不為A,在位置311的胺基酸不為L,在位置353的胺基酸不為F,在位置359的胺基酸不為D,在位置424的胺基酸不為K,在位置475的胺基酸不為A,在位置476的胺基酸不為L,而在位置477的胺基酸係經刪除;
b)包括如SEQ ID NO 6所示從位置1至479之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置
88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為T,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P,以及在位置60的胺基酸不為C,在位置185的胺基酸不為C,在位置186的胺基酸不為S,在位置195的胺基酸不為S,在位置205的胺基酸不為Y,在位置252的胺基酸不為V,在位置268的胺基酸不為S,在位置409的胺基酸不為S,在位置436的胺基酸不為A,在位置477、478和479的胺基酸係經刪除;
c)包括如SEQ ID NO 9所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P,以及在位置2的胺基酸不為S,在位置48的胺基酸不為D,在位置69的胺基酸不為P,在位置90的胺基酸不為S,在位置164的胺基酸不為Y,在位置242的胺基酸不為A,在位置245的胺基酸不為A,在位置268的胺基酸不為T,在位置311的胺基酸不為L,在位置318的胺基酸不為E,在位置322的胺基酸不為R,在位置353的胺基酸不為S,在位置424的胺基酸不為K,在位置452的胺基酸不為E;
d)包括如SEQ ID NO 12所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基
酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為T,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P,以及在位置46的胺基酸不為T,在位置60的胺基酸不為C,在位置185的胺基酸不為C,在位置186的胺基酸不為C,在位置195的胺基酸不為S,在位置205的胺基酸不為Y,在位置252的胺基酸不為V,在位置268的胺基酸不為S,在位置409的胺基酸不為R,在位置436的胺基酸不為A;
e)包括如SEQ ID NO 15所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P,以及在位置48的胺基酸不為D,在位置164的胺基酸不為Y,在位置242的胺基酸不為A,在位置245的胺基酸不為A,在位置255的胺基酸不為F,在位置424的胺基酸不為K;
f)具有與a)中所定義的任何胺基酸序列(如SEQ ID NO 3所示從位置1至477之胺基酸序列)至少為60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同之胺基酸序列的蛋白質,不過對應位置25的胺基酸不為F,對應位置64的胺基酸不為L,對應位置88的胺基酸不為T,對應位置157的胺基酸不為T,對應位置165的胺基酸不為R,對應位置169的胺基酸不為V,對應位置174的胺基酸不為E,對應位置187的胺基酸不為
S,在位置197的胺基酸不為M,對應位置239的胺基酸不為S,對應位置327的胺基酸不為S,對應位置328的胺基酸不為V,對應位置384的胺基酸不為Y,對應位置389的胺基酸不為I,對應位置391的胺基酸不為D,對應位置396的胺基酸不為K,對應位置410的胺基酸不為H,對應位置414的胺基酸不為P,以及對應位置2的胺基酸不為S,對應位置48的胺基酸不為D,對應位置164的胺基酸不為Y,對應位置202的胺基酸不為D,對應位置205的胺基酸不為L,對應位置242的胺基酸不為A,對應位置245的胺基酸不為A,對應位置311的胺基酸不為L,對應位置353的胺基酸不為F,對應位置359的胺基酸不為D,對應位置424的胺基酸不為K,對應位置475的胺基酸不為A,對應位置476的胺基酸不為L,而對應位置477的胺基酸係經刪除;
g)具有與b)中所定義的任何胺基酸序列(如SEQ ID NO 6所示從位置1至476)有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過對應位置25的胺基酸不為F,對應位置64的胺基酸不為L,對應位置88的胺基酸不為T,對應位置157的胺基酸不為T,對應位置165的胺基酸不為R,對應位置169的胺基酸不為V,對應位置174的胺基酸不為E,對應位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為T,對應位置239的胺基酸不為S,對應位置327的胺基酸不為S,對應位置328的胺基酸不為V,對應位置384的胺基酸不為Y,對應位置389的胺基酸不為I,對應位置391的胺基酸不為D,對應位置396的胺基酸不為K,對應位置410的胺基酸不為H,對應位置414的胺基酸不為P,以及在位置46的胺基酸不為T,對應位置60的胺基酸不為C,對應位置185的胺基酸不為C,對應位置186的胺基酸不為S,對應位置195的胺基酸不為S,對應位置205的胺基酸不為Y,對應位置252的胺基酸不為V,對應位置268的胺基酸不為S,對應位置409的胺基酸不為R,對應位置436的胺基酸不為A而對應位置477、478和479的胺基酸係經刪除;
h)具有與c)中所定義的任何胺基酸序列(如SEQ ID NO 9所示從位置1至
479)有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過對應位置25的胺基酸不為F,對應位置64的胺基酸不為L,對應位置88的胺基酸不為T,對應位置157的胺基酸不為T,對應位置165的胺基酸不為R,對應位置169的胺基酸不為V,對應位置174的胺基酸不為E,對應位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,對應位置239的胺基酸不為S,對應位置327的胺基酸不為S,對應位置328的胺基酸不為V,對應位置384的胺基酸不為Y,對應位置389的胺基酸不為I,對應位置391的胺基酸不為D,對應位置396的胺基酸不為K,對應位置410的胺基酸不為H,對應位置414的胺基酸不為P,以及對應位置2的胺基酸不為S,對應位置48的胺基酸不為D,對應位置69的胺基酸不為P,對應位置90的胺基酸不為S,對應位置164的胺基酸不為Y,對應位置242的胺基酸不為A,對應位置245的胺基酸不為A,對應位置268的胺基酸不為T,對應位置311的胺基酸不為L,對應位置318的胺基酸不為E,對應位置322的胺基酸不為R,對應位置353的胺基酸不為S,對應位置424的胺基酸不為K,對應位置452的胺基酸不為E;
i)具有與d)中所定義的任何胺基酸序列(如SEQ ID NO 12所示從位置1至476)有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過對應位置25的胺基酸不為F,對應位置64的胺基酸不為L,對應位置88的胺基酸不為T,對應位置157的胺基酸不為T,對應位置165的胺基酸不為R,對應位置169的胺基酸不為V,對應位置174的胺基酸不為E,對應位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為T,對應位置239的胺基酸不為S,對應位置327的胺基酸不為S,對應位置328的胺基酸不為V,對應位置384的胺基酸不為Y,對應位置389的胺基酸不為I,對應位置391的胺基酸不為D,對應位置396的胺基酸不為K,對應位置410的胺基酸不為H,對應位置414的胺基酸不為P,以及對應位置46的胺基酸不為T,對應位置
60的胺基酸不為C,對應位置185的胺基酸不為C,對應位置186的胺基酸不為C,對應位置195的胺基酸不為S,對應位置205的胺基酸不為Y,對應位置252的胺基酸不為V,對應位置268的胺基酸不為S,對應位置409的胺基酸不為R,對應位置436的胺基酸不為A;
j)具有與e)中所定義的任何合胺基酸序列(如SEQ ID NO 15所示從位置1至476)有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過對應位置25的胺基酸不為F,對應位置64的胺基酸不為L,對應位置88的胺基酸不為T,對應位置157的胺基酸不為T,對應位置165的胺基酸不為R,對應位置169的胺基酸不為V,對應位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,對應位置239的胺基酸不為S,對應位置327的胺基酸不為S,對應位置328的胺基酸不為V,對應位置384的胺基酸不為Y,對應位置389的胺基酸不為I,對應位置391的胺基酸不為D,對應位置396的胺基酸不為K,對應位置410的胺基酸不為H,對應位置414的胺基酸不為P,以及在位置48的胺基酸不為D,在位置164的胺基酸不為Y,在位置242的胺基酸不為A,在位置245的胺基酸不為A,在位置255的胺基酸不為F,在位置424的胺基酸不為K。
SEQ ID NO 18之位置1至476代表包括所有上文所述的胺基酸修飾之ω-TA變體蛋白質的胺基酸序列,與各個如SEQ ID NO 3(從位置1至477)、SEQ ID NO 6(從位置1至479)、SEQ ID NO 9(從位置1至476)、SEQ ID NO 12(從位置1至476)和SEQ ID NO 15(從位置1至476)所示的胺基酸序列之比較。
表1係彙整存在本發明ω-TA變體蛋白質之胺基酸序列中的修飾(SEQ ID NO 18之位置1至476)與各個野生型ω-TA胺基酸序列(SEQ ID NO 3之位置1至477或SEQ ID NO 6之位置1至479或SEQ ID NO 9之位置1至476或SEQ ID NO 15之位置1至476)之比較,以及與來自節桿菌之經修ω-TA(SEQ ID NO 12之位置1至476)的比較。
因此本發明一較佳的實施例係關於具有ω-TA活性之本發明蛋白質,其係選自由下列組成之群組:
a)包括如SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質;
b)具有與SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過在SEQ ID NO 18中各個對應位置25、64、88、157、165、169、174、187、197239、327、328、384、389、391、396、410和414的胺基酸係代表該等在SEQ ID NO 18下所示的胺基酸中於個別位置所顯示的胺基酸;
c)具有與SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過在SEQ ID NO 18中各個對應位置2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475和476的胺基酸係代表該等在SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列中於個別位置所顯示的胺基酸。
在最佳的實施例中根據本發明編碼ω-TA之蛋白質為包括如SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸的蛋白質。
到目前上文所述的蛋白質在文中通稱為ω-TA變體或本發明之蛋白質變體。
已發現將另外的胺基酸修飾導入本發明之蛋白質變體中進一步提升ω-TA變體的活性,特言之,關於其基質專一性係指這些進一步修飾的ω-TA變體,相較於上文所述的ω-TA變體,更適於製造鏡像異構物富集或幾乎純的產物。相較於上文所述為本發明蛋白質之ω-TA變體,包括進一步修飾的ω-TA係經進一步修飾。包括進一步修飾的ω-TA變體特別適合用於製造鏡像異構物富集或鏡像異構上幾乎純的磷酸-胺基酸且在文中係指包括進一步胺基酸修飾之ω-TA變體或包括進一步胺基酸修飾之本發明蛋白質。
有關具有進一步胺基酸修飾之ω-TA變體,用於顯示一蛋白質係具有ω-TA活性之較佳方法係例如描述於WO 2017/151573中,用於展現具有進一步胺基酸修飾之ω-TA變體的特佳方法係描述於本文「通用方法」第7項。
「鏡像異構物富集的」文中係指二種鏡像異構物之一比另一種鏡像異構以更高量存在組成物中,較佳地組合物中存有至少60%的一種鏡像異構物,更佳地組合物中存有至少65%的一種鏡像異構物,又更佳地組合物中存有至少70%的一種鏡像異構物,甚佳地組合物中存有至少75%的一種鏡像異構物,又甚佳地組合物中存有至少80%的一種鏡像異構物,特佳地組合物中存有至少85%的一種鏡像異構物,最佳地組合物中存有至少90%的一種鏡像異構物或特佳地組合物中存有至少94%的一種鏡像異構物。
「鏡像異構上幾乎純的」文中係指二種鏡像異構物之一係以至少95.0%之量存在組成物中,較佳地二種鏡像異構物之一係以至少95.5%之量存在組成物中,更佳地二種鏡像異構物之一係以至少96.0%之量存在組成物中,又更佳地二種鏡像異構物之一係以至少96.5%之量存在組成物中,甚佳地二種鏡像異構物之一係以至少97.0%之量存在組成物中,又甚佳地二種鏡像異構物之一係以至少98.0%之量存在組成物中,特佳地二種鏡像異構物之一係以至少98.5%之量存在組成物中,最佳地二種鏡像異構物之一係以至少99.0%之量存在組成物中,或特佳地二種鏡像異構物之一係以至少99.5%之量存在組成物中。
本發明另外的實施例因此係關於具有ω-TA變體活性之本發明蛋白質變體,其中本發明之胺基酸序列,相較於本發明蛋白質係包括進一步的胺基酸修飾。
較佳地,本發明另外的實施例有關具有包括進一步胺基酸修飾之本發明ω-TA活性(ω-TA變體)之蛋白質的胺基酸序列因此為具有ω-TA活性的本發明蛋白質,其係選自由下列組成之群組:
a)根據本發明之蛋白質,不過位置166的胺基酸為G及位置327的胺基酸為Q;
b)根據本發明之蛋白質,不過位置327的胺基酸為Q及位置384的胺基酸為S;
c)根據本發明之蛋白質,不過位置326的胺基酸為Q及位置327的胺基酸為Q;
d)根據本發明之蛋白質,不過位置327的胺基酸為Q;
e)根據本發明之蛋白質,不過位置326的胺基酸為F及位置327的胺基酸為Q;
f)根據本發明之蛋白質,不過位置327的胺基酸為C;
g)根據本發明之蛋白質,不過位置327的胺基酸為I;
h)根據本發明之蛋白質,不過位置327的胺基酸為M;
i)根據本發明之蛋白質,不過位置164的胺基酸為Y;
j)根據本發明之蛋白質,不過位置164的胺基酸為S;
k)根據本發明之蛋白質,不過位置327的胺基酸為V;
l)根據本發明之蛋白質,不過位置409的胺基酸為R;
m)根據本發明之蛋白質,不過位置327的胺基酸為S;
n)根據本發明之蛋白質,不過位置271的胺基酸為I;
o)根據本發明之蛋白質,不過位置329的胺基酸為G;
p)根據本發明之蛋白質,不過位置409的胺基酸為P;
q)根據本發明之蛋白質,不過位置414的胺基酸為M;
r)根據本發明之蛋白質,不過位置165的胺基酸為K;
s)根據本發明之蛋白質,不過位置414的胺基酸為R;
t)根據本發明之蛋白質,不過位置414的胺基酸為H;
u)根據本發明之蛋白質,不過位置165的胺基酸為C;
v)根據本發明之蛋白質,不過位置327的胺基酸為V;
w)根據本發明之蛋白質,不過位置164的胺基酸為C;
x)根據本發明之蛋白質,不過位置409的胺基酸為K。
本發明一更佳的實施例有關具有包括進一步胺基酸修飾之ω-TA活性的蛋白質之胺基酸序列係關於具有ω-TA活性的蛋白質,其係選自由下列組成之群組:
a)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置166的胺基酸S係經G取代及在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代;
b)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代及在SEQ ID NO 18中位置384的胺基酸C係經S取代;
c)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置326的胺基酸E係經Q取代及在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代;
d)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代;
e)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置326的胺基酸E係經F取代及在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代;
f)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經C取代;
g)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經I取代;
h)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經M取代;
i)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置164的胺基酸F係經Y取代;
j)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置164的胺基酸F係經S取代;
k)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經V取代;
l)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置409的胺基酸T係經R取代;
m)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經S取代;
n)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置271的胺基酸V係經I取代;
o)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置329的胺基酸S係經G取代;
p)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置409的胺基酸T係經P取代;
q)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置414的胺基酸L係經M取代;
r)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置165的胺基酸Q係經K取代;
s)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置414的胺基酸L係經R取代;
t)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置414的胺基酸L係經H取代;
u)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置165的胺基酸Q係經C取代;
v)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經V取代;
w)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置164的胺基酸F係經C取代;
x)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置409的胺基酸T係經K取代;
y)具有與a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定義的任何胺基酸序列有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚
佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過如a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義的各胺基酸位置分別亦存在與各a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義之任何胺基酸序列具有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之蛋白質序列的胺基酸序列中的對應胺基酸位置。
作為本發明之實施例,包括進一步胺酸修飾之具有ω-TA變體活性的較佳蛋白質為該等a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)和p)項下所定義的蛋白質,更佳的為該等上述a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)和h)項下所定義的蛋白質,而最佳的為該等上述a)、b)和c)下所定義的蛋白質。
表2係彙整存在包括進一步胺基酸修飾之ω-TA胺基酸序列中之另外的胺基酸修飾與SEQ ID NO 18(從位置1至476)所示的胺基酸相比較。
本發明一另外的實施例係關於編碼本發明蛋白質之核酸分子。
本發明之核酸分子可為任何種類的核酸,只要該核酸編碼本發明之蛋白質即可。核酸可為核醣核酸分子(例如RNA、mRNA)或去氧核醣核酸分子(DNA,可包括或不包括內含子之基因體DNA和編碼DNA)。
本發明特別關注的為編碼包括如SEQ ID NO 18從位置1至476所示的胺基酸序列具有ω-TA活性的蛋白質之核酸分子。
本發明因此亦關於編碼具有ω-TA活性之蛋白質的核酸分子,其係選自由下列組成之群組:
a)包括SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子;
b)編碼包括SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質之核酸分子;
c)具有與SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性的核酸分子,不過對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置589至591之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152之密碼子係具有tgy核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242之密碼子係具有ytn核苷
酸序列;
d)具有與SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性的核酸分子,不過對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置4至6之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 7中核苷酸位置73至75之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置136至138之密碼子係具有atg核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置142至144之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置178至180之密碼子係具tay有核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置205至207之密碼子係具有car核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置268至270之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置467至471之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492之密碼子係具有tty核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495之密碼子係具有car核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置553至555之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置556至558之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置583至585之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置589至591之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置604至606之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置613至615之密碼子係具有tgy核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置724至726之密
碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置733至735之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置754至756之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置763至765之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置802至804之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置931至933之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置952至954之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置964至966之密碼子係具有aar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1057至1059之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1075至1077之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1270至1272之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1306至1308之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1354至1356之密碼子係具有ggn核苷酸序列;
e)與a)、b)、c)或d)所定義的核酸分子之互補股雜交之核酸分子,不過對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471之密
碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152之密碼子係具有tgy核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242之密碼子係具有ytn核苷酸序列;
f)與a)、b)、c)或d)所定義的核酸分子之互補股雜交之核酸分子,不過對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置4至6之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置136至138之密碼子係具有atg核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置142至144之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置178至180之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置205至207之密碼子係具有car核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置268至270之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492之密碼子係具有tty核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495之密碼子係具有car核苷酸
序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置553至555之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置556至558之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置583至585之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置589至591之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置604至606之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置613至615之密碼子係具有tgy核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置724至726之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置733至735之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置754至756之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置763至765之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置802至804之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置931至933之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置952至954之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置964至966之密碼子係具有aar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1057至1059之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1075至1077之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188之密碼子係具有gar核苷酸序列,
對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1270至1272之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1306至1308之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1354至1356之密碼子係具有ggn核苷酸序列;
g)由於基因碼簡併從a)、b)、c)、d)、e)或f)所定義的核酸分子衍生的核酸分子;
h)編碼與如SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列具有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性的蛋白質之核酸分子,不過對應SEQ ID NO 18之位置25、64、88、157、165、169、174、187、239、327、328、384、389、391、396、410和414的胺基酸係代表該等在SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列中個別位置所顯示的胺基酸;
i)編碼與如SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列具有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之蛋白質的核酸序列,不過對應SEQ ID NO 18之位置2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475和476的胺基酸係代表該等在SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列中個別位置所顯示的胺基酸;
j)包括如SEQ ID NO 16所示的核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子。
SEQ ID NO 16係表示藉由具有如SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的蛋白質回轉譯(back-translation)所得到的核苷酸序列,其中反映基因碼簡併。
SEQ ID NO 17為因SEQ ID NO 16中基因碼可變的核苷酸簡併性藉由被特定核苷酸取代所得到的合成核酸分子。SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17二者係編碼具有如SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列具有ω-TA活性之蛋白質。
在本發明內文中,術語「與....雜交」係指於習知的雜交條件下雜交,較佳地於嚴格的條件下,例如Sambrook等人(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.ISBN:0879695773)或Ausubel等人(Short Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons;5th edition(2002),ISBN:0471250929)中所述。其中特佳的,「雜交」係指於下列條件下雜交:雜交緩衝液:2xSSC;10xDenhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA;比率1:1:1);0.1% SDS;5mM EDTA;50mM Na2HPO4;250μg/ml的鯡魚精子DNA;50μg/ml的tRNA;或25M磷酸鈉緩衝液pH 7.2;1mM EDTA;7% SDS雜交溫度:T=65至68℃清洗緩衝液:0.1xSSC;0.1% SDS清洗溫度:T=65至68℃。
與編碼具有ω-TA活性之蛋白質的核酸分子雜交之核酸,可源自任何生物;因此,其可源自細菌、真菌、動物、人類、植物或病毒。
與編碼具有ω-TA活性之蛋白質的核酸分子雜交之核酸分子,較佳地係源自微生物,更佳地源自真菌或細菌,最佳地源自細菌。
與編碼與所提及的分子雜交之核酸分子,可例如分離自基因體或cDNA庫。此等核酸分子可使用文中所述的核酸分子來鑑別及分離,或其可使用部分此等分子或此等分子之反向互補來鑑別及分離,例如根據標準方法之雜交(參見,例如Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.ISBN:0879695773;Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular
Biology,John Wiley & Sons;5th edition(2002),ISBN:0471250929)或使用PCR增幅。
可使用,例如具有恰好是(exactly)或基本上SEQ ID NO 2所述從位置1至1431之核酸序列,或基本上SEQ ID NO 5所述從位置1至1437之核酸序列,或基本上SEQ ID NO 8所述的核酸序列,或基本上SEQ ID NO 11所述的核酸序列,或基本上SEQ ID NO 14所述的核酸序列,或基本上SEQ ID NO 17所述的核酸序列,或這些核酸序列的片段之核酸分子,作為分離編碼具有ω-TA活性之蛋白質的核酸序列之雜交樣本。
用作為雜交樣本的片段亦可為使用習知之合成技術所製備的合成片段或寡核苷酸,其序列基本上係與本發明內文中所述的核酸分子相同。一旦辨識和分離出與本發明內文中所述的核酸序列雜交之基因,則應測定該序列且應分析由此序列所編碼的蛋白質之性質用以測定彼等是否為具有ω-TA活性之蛋白質。如何測定一蛋白質是否具有ω-TA活性之蛋白質活性的方法已為熟習本項技術者所知且已於上文中提及。
與本發明內文中所述的核酸分子雜交之分子係包括特別是所提及之核酸分子的片段、衍生物和等位基因變體。在本發明內文中,術語「衍生物」係指在一或多個位置與上述核酸分子之序列不同且與這些序列高相同度之分子序列。與上述核酸分子之差異可,例如,係由於刪除、加入、取代、插入或重組所致。
有關編碼包括進一步胺基酸修飾具有ω-TA活性的核酸分子,另外的本發明實施例係關於編碼具有ω-TA活性之蛋白質的本發明核酸分子,其係選自由下列組成之群組:
a)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置496至498的密碼子係具有ggn核苷酸序列,及在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;
b)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17
中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列,及在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密碼子係具有wsn核苷酸序列;
c)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置976至978的密碼子係具有car核苷酸序列,及在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;
d)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;
e)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置976至978的密碼子係具有tty核苷酸序列,及在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;
f)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;
g)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有ath核苷酸序列;
h)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有atg核苷酸序列;
i)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密碼子係具有tay核苷酸序列;
j)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密碼子係具有wsn核苷酸序列;
k)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有gtn核苷酸序列;
l)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密碼子係具有mgn核苷酸序列;
m)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有wsn核苷酸序列;
n)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置811至813的密碼子係具有ath核苷酸序列;
o)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置985至987的密碼子係具有ggn核苷酸序列;
p)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密碼子係具有ccn核苷酸序列;
q)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密碼子係具有atg核苷酸序列;
r)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密碼子係具有aar核苷酸序列;
s)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO
17中核苷酸位置1240至1242的密碼子係具有mgn核苷酸序列;
t)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密碼子係具有cay核苷酸序列;
u)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密碼子係具有tgy核苷酸序列;
v)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有gtn核苷酸序列;
w)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密碼子係具有tgy核苷酸序列;
x)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密碼子係具有aar核苷酸序列;
y)具有與a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義的任何核酸序列有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之核酸序列的核酸分子,不過各a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義的密碼子核苷酸序列分別亦存在與各a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義的任何核酸序列具有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之核酸序列中對應的密碼子核苷酸位置。
較佳的本發明核酸為該等上述a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)和p)項所定義的核酸分子,更佳的為該等上
述a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)和h)項所定義的核酸分子,而最佳的為該等上述a)、b)和c)項所定義的核酸分子。
核苷酸縮寫a、c、g、t和該等用於簡併核苷酸r、y、s、w、k、m、b、d、h、v、n縮寫的意義可從下文副標題「序列說明」段落的表3中引出。由包括簡併核苷酸之密碼子所編碼的胺基酸可從下文副標題「序列說明」段落的表5中衍生出。
再者,本發明係關於包括本發明核酸分子之重組的核酸分子。
結合本發明,術語「重組的核酸分子」請了解係指含有除了本發明核酸分子以外的另外序列之核酸分子,其並非天然生成的而且其係發生在本發明之重組核酸中。本處,上文所提的另外序列可為任何序列,較佳地其為功能或調節序列(啟動子、終止訊號、增強子、核醣體結合位置(rbs)、增強轉錄、轉譯或RNA安定性之前導序列、次細胞靶向序列等),特佳地其為在微生物中具活性的功能或調節序列,及特定特佳地其為在真菌中,特別是酵母菌或在細菌中具活性的功能或調節序列。用於製造本發明之重組核酸的方法已為熟習本項技術者所知,並包括基因方法,例如藉由綁紮結合核酸分子、基因重組或新合成核酸分子。該等方法係描述於,例如Sambrok等人(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd edition(2001)Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NY.ISBN:0879695773)或Ausubel等人(Short Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons;5th edition(2002),ISBN:0471250929)。
在另一實施例中,本發明之重組核酸係包括與在原核或真核細胞中啟動轉錄之調節序列連接的本發明核酸分子。
在細胞中啟動轉錄的調節序列亦稱為啟動子。
有關調節序列和質體的資訊已為熟習本項技術者所熟知且係描於,例如The International Genetically Engineered Machine(iGEM)Foundation(One Kendall Square,Suite B6104,Cambridge,MA 02139,USA)所支持的The Registry of Standard Biological Parts之全球資訊網中(http://parts.igem.org/Catalog)。
在原核生物,例如大腸桿菌及在真核生物中啟動轉錄的調節序列在文獻中已有充份描述,特別是描述了表現在酵母菌中,例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。用於不同宿主生物中表現蛋白質的各種系統可參見,例如Methods in Enzymology 153(1987),383-516和Bitter等人(Methods in Enzymology 153(1987),516-544)或Gomes等人(2016,Advances in Animal and Veterinary Sciences,4(4),346)及Baghban等人(2018,Current Pharmaceutical Biotechnology,19(6))。常見的酵母菌啟動子有pAOX1、pHIS4、pGAL、pScADH2(參見上文Baghban et al.,2018)。常見的細菌啟動子有T5、T7、鼠李糖-誘發的、阿拉伯糖-誘發的、PhoA、Marschall等人(2017,Appl Microbiol Biotechnol 101,501-512)及Tegel等人(2011,FEBS Joumal 278,729-739)所描述的人工trc(trp-lac)啟動子。
另一本發明重組核酸分子的實施例為包括本發明核酸之載體或質體。
「載體」在分子生物的領域中為普遍理解的且在文中係代表一包括用於將遺傳物質(DNA或RNA)轉移到一目標細胞之核酸序列的核酸序列或媒介。載體可為質體,例如用於產生基因轉殖植物之T-DNA或二元載體,用於宿主細胞中表現核酸序列的表現載體、得以在不同宿主中繁衍的穿梭載體,或宿主可為經修飾用於將外來遺傳物質傳遞給宿主的病毒顆粒或噬菌體。
「質體」在分子生物的領域中為普遍理解的且在文中係代表一自主性自我複製、通常為環狀DNA分子,當存在宿主細胞中時其係從染色體DNA分離出。
本發明之核酸分子、本發明之重組核酸分子、本發明之載體或質體,例如可藉由將本發明之核酸表現在宿主細胞中,用於製造本發明蛋白質。
本發明另外的實施例係關於包括或表現本發明核酸分子或包括本發明蛋白質或包括本發明之重組核酸分子或包括本發明載體或包括本發明質體之宿主或宿主細胞。
編碼具有ω-TA活性之蛋白質的本發明核酸分子可表現在宿主細胞中,供例如增殖或供製造本發明之蛋白質。就宿主細胞中的表現,本發明核酸分子可包括在載體或質體上或其可穩定地整合至個別宿主細胞的基因體中。本發明核酸分子亦可包括在支持其導入宿主細胞的載體中。
本發明另一實施例係關於包括本發明核酸分子或包括本發明之重組核酸分子或包括本發明載體或包括本發明質體,以及在各情況下包括本發明蛋白質之本發明宿主或宿主細胞。
本發明另外的實施例係關於包括本發明核酸分子或包括本發明之重組核酸分子或包括本發明載體或包括本發明質體,以及在各情況下表現本發明蛋白質之本發明宿主或宿主細胞。
本發明另外的實施例係關於包括本發明核酸分子或包括本發明之重組核酸分子或包括本發明載體或包括本發明質體,以及在各情況下表現一蛋白質,其中該蛋白質係具有ω-轉胺酶活性之本發明宿主或宿主細胞。
「表現核酸分子」在文中應了解係指若該核酸分子為RNA或mRNA,則該核酸分子係轉譯成蛋白質,較佳地轉譯成具有ω-TA活性之蛋白質,或若該核酸分子為DNA或cDNA則其係轉錄(且若是處理含有內含子的基因體DNA)成mRNA,較佳地轉錄成編碼具有ω-TA活性之蛋白質的mRNA及後續轉譯成蛋白質,較佳地轉譯成具有ω-TA活性之蛋白質。
宿主中特定核酸分子之轉錄可藉由熟習本項技術者已知的方法來驗證,例如,藉由北方墨點分析或RT-PCR偵測外來核酸分子之特異性轉錄(mRNA)。
宿主或宿主細胞是否包括一特定蛋白質或包括一衍生自表現核酸分子之蛋白質可藉由熟習本項技術者已知的方法來測定,例如藉由免疫學方法,例如西方墨點分析、ELISA(酵素連結免疫吸附分析)或RIA(放射免疫分析)。熟習本項技術者熟悉用於製備與特定蛋白質專一性反應,亦即專一與特定蛋白質結合之抗體的方法(參見,例如Lottspeich and Zorbas(eds.),1998,Bioanalytik,Spektrum akad,Verlag,Heidelberg,Berlin,ISBN
3-8274-0041-4)。某些公司(Thermo Fisher Scientific,168 Third Avenue,Waltham,MA USA 0245;GenScript,60 Centennial Ave.,Piscataway,NJ 08854,USA)提供製備此等抗體之訂購服務。
再者,熟習本項技術者可藉由在個別的宿主細胞中偵測具有ω-TA活性之蛋白質的(另外)活性,檢測一宿主或宿主細胞是否包括本發明蛋白質。較佳地在個別的宿主細胞中具有另外的ω-TA活性之蛋白質活性係藉由將本發明宿主細胞的ω-TA活性與不包括本發明蛋白質之個別的宿主細胞活性相比較來偵測。
檢測一蛋白質是否具有ω-TA活性可如上文中所述來進行。
本發明之宿主或宿主細胞可由熟習本項技術者藉由已知用於基因改造或轉化生物的方法來製造。
因此本發明另一主體為本發明宿主或宿主細胞,特別是經本發明核酸分子或經本發明之重組核酸分子或經本發明載體或經本發明質體基因改造(或轉化)之原核或真核宿主或宿主細胞。較佳地本發明之基因改造(轉化)宿主或宿主細胞係表現具有ω-轉胺酶活性之蛋白質,更佳地,本發明之基因改造(轉化)宿主或宿主細胞係表現本發明之蛋白質。
「經核酸分子基因改造」或「經核酸分子轉化」在文中應了解係指藉由技術及/或非天然生成的方法將核酸分子導入宿主或宿主細胞中,較佳地藉由分子生物、生物科技或基因改造領域的技術方法。
本發明宿主或宿主細胞的子代亦為本發明之實施例,較佳地這些子代係包括本發明核酸分子或包括本發明之重組核酸分子或包括本發明載體或包括本發明質體或包括本發明蛋白質,更佳地這些子代係包括本發明核酸分子或包括本發明之重組核酸分子或包括本發明載體或包括本發明質體,以及表現一蛋白質,其中該蛋白質係具有ω-TA活性,甚佳地這些子代係包括本發明核酸分子或包括本發明之重組核酸分子或包括本發明載體或包括本發明質體,以及在各情況表現一蛋白質,其中該蛋白質係具有本發明ω-TA活性。
本發明宿主或宿主細胞可為來自任何原核或真核生物的宿主或宿主細胞。該等宿主或宿主細胞可為細菌或細菌細胞(例如大腸桿菌,芽胞桿菌屬的細菌,特別是枯草桿菌(Bacillus subtilis),農桿菌(Agrobacterium),特別是根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或根毛農桿菌(Agrobacterium rhizogenes),假單胞菌(Pseudomonas),特別是螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens),放線菌屬(Streptomyces spp),紅球菌屬(Rhodococcus spp),特別是紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous),需鈉弧菌(Vibrio natrigens),棒狀桿菌(Corynebacterium),特別是麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum))或真菌或真菌細胞(例如傘菌(Agaricus),特別是洋菇(Agaricus bisporus),麴菌(Aspergillus),木黴菌(Trichoderma)或酵母菌,特別是釀酒酵母(S.cerevisiae),畢赤酵母屬(Pichia ssp.)如嗜甲醇酵母(P.pastoris))以及植物或植物細胞或其可為動物或動物細胞。
較佳地本發明宿主細胞為微生物的細胞。在本專利申請案的架構中,請了解係包括所有的細菌和所有的原生生物(例如真菌,特別是酵母菌和藻類),例如,其係如Schlegel "General Microbiology"(Georg Thieme Publishing House(1985),1-2)中所定義。
關於微生物,本發明之宿主或宿主細胞較佳地為細菌/細菌細胞或酵母菌/酵母菌細胞,最佳地其為細菌/細菌細胞。有關細菌/細菌細胞,本發明之宿主或宿主細胞較佳地為芽孢桿菌屬/芽孢桿菌屬細胞或大腸桿菌細胞/大腸桿菌細胞,最佳地大腸桿菌細胞/大腸桿菌細胞。
另一種選擇,本發明之宿主或宿主細胞可為假單孢菌,特別是螢光假單孢菌,放線菌屬,紅球菌屬,特別是紫紅紅球菌,弧菌屬,特別是需鈉弧菌,棒狀桿菌,特別是麩胺酸棒狀桿菌或其他。
本發明一較佳的實施例係關於包括本發明核酸分子之本發明宿主或宿主細胞,其中本發明之核酸分子其特徵在於該核酸分子的密碼子係經改變使得其能適用於個別的宿主或宿主細胞之密碼子的使用頻率。
本發明之宿主細胞可用於製造本發明蛋白質。本發明蛋白質可用於在胺(供體)的存在下從羰基(受體)製造鏡像異構物富集或幾乎鏡像異構上純的胺之方法中。
藉由本發明蛋白質製造鏡像異構物富集或近乎鏡像異構上純的胺之方法中,催化反應形式上可以上文通用公式(I)來描述。
本發明另外的實施例因此係關於製造胺之方法,其係包括下列步驟:
a)提供胺受體分子;
b)提供胺供體分子;
c)將步驟a)中所提供的胺受體和步驟b)中所提供的胺供體與本發明蛋白質接觸;
d)視需要,得到胺。
用於製造胺之本發明方法的一較佳實施例為用於製造脂族胺(包括但不限於直鏈、支鏈或環狀烷胺、烯胺、炔胺)之方法或用於製造芳基胺之方法或用於製造胺基酸之方法,更佳地用於製造α-胺基酸之方法,又更佳地用於製造支鏈α-胺基酸、芳香系α-胺基酸或包括經取代苯基基團之芳香α-胺基酸的方法,最佳地用於製造胺基酸正纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸之方法。
就包括進一步胺基酸修飾之本發明ω-TA變體而言,用於製造胺之本發明方法較佳地係為用於製造包括磷之脂族胺(包括但不限於包括磷之直鏈、支鏈或環狀烷胺、烯胺、炔胺)之方法,或用於製造包括磷之芳基胺的方法或用於製造包括磷之胺基酸的方法,更佳地用於製造包括磷之α-胺基酸的方法,又更佳地用於製造包括磷之支鏈α-胺基酸、包括磷之芳香系α-胺基酸或包括磷之包括經取代苯基基團之芳香α-胺基酸的方法,甚佳地用於製造包括磷之α-胺基酸的方法,又甚佳地用於製造包括經甲基取代磷之α-胺基酸的方法,最佳地用於製造固殺草(glufosinate)之方法。
用於製造胺之本發明方法步驟a)中的胺受體分子為包括羰基的分子,其係接受來自胺供體分子的胺基基團,由此受體分子的羰基基團變成胺。
較佳地,根據本發明用於製造胺之方法步驟a)中的胺受體分子為脂肪系酮(包括但不限於直鏈、支鏈或環狀烷酮、烯酮、炔酮)或為芳基酮或為酮酸,更佳地其為酮酸,又更佳地其為α-酮酸,最佳地胺受體分
子係選自由下列組成之群組:2-側氧基戊酸、4-甲基-2-側氧基戊酸、苯丙酮酸或4-羥基苯丙酮酸。
就包括進一步胺基酸修飾之本發明蛋白質ω-TA變體而言,根據本發明用於製造胺之方法步驟a)中的胺受體分子較佳地為含磷的脂族酮(包括但不限於直鏈、支鏈或環狀烷酮、烯酮、炔酮)或含磷的芳基酮或含磷的酮酸,更佳地此胺受體分子為含磷的酮酸,又更佳地此胺受體分子為含磷的α-酮酸,甚佳地含經甲基取代磷的α-酮酸,最佳地步驟a)中的胺受體分子為4-[羥基(甲基)磷氧基]-2-側氧基丁酸。
較佳地,根據本發明用於製造胺之方法步驟a)中的胺受體分子係以介於30g/l(每公升之克數)至300g/l,更佳地介於30g/l至250g/l,甚佳地介於40g/l至250g/l,又更佳地介於50g/l至250g/l之量來提供。
根據本發明用於製造胺之方法步驟b)中的胺供體分子為貢獻胺基團給胺受體分子之包括胺基團的分子,由此胺供體的胺基團變成羰基基團。
根據本發明用於製造胺之方法步驟b)中的胺供體分子可為對掌、前-掌性或非對掌胺,較佳地此胺供體分子分別為對掌、前-掌性或非對掌、烷基-或芳基或芳烷基-胺,更佳地此胺供體分子為胺基酸或烷胺。
就烷基或芳基胺而言,根據本發明用於製造胺之方法步驟b)中的較佳胺基供體分子為β-丙胺酸、1-丙胺、(外消旋-)2-丁胺、6-胺基己酸、異丙基胺、苯甲基胺、甲基苯甲基胺、1-胺基氫茚、1-甲基-3-苯基丙基胺。
若該胺基供體為非對掌胺基酸,則甘胺酸為根據本發明用於製造胺之方法步驟b)中所提供的較佳胺基供體分子。若根據本發明用於製造胺之方法步驟b)中的胺基供體為對掌胺基酸,則此胺基酸較佳地係以其(S)-鏡像異構物代表。根據本發明用於製造胺之方法步驟b)中具有(S)-組態的胺基酸供體分子有(S)-甲基苯甲基胺、(S)-1-胺基氫茚、(S)-1-甲基-3-苯基丙基胺、(S)-天門冬胺酸、(S)-天門冬醯胺酸、(S)-丙胺酸、(S)-麩醯胺酸、(S)-麩胺酸、(S)-鳥胺酸、(S)-磷酸絲胺酸、(S)-苯丙胺酸、(S)-白胺酸、(S)-酪胺酸、(S)-正纈胺酸。
根據本發明用於製造胺之方法步驟b)中所提供的最佳胺基供體分子為異丙基胺。
當用作本發明方法中之胺基供體分子時,異丙基胺係藉由ω-TA之作用轉變成丙酮。丙酮為一揮發性化合物具有在相當低溫蒸發的優點。此項使得在反應進行期間藉由ω-TA從反應混合物所製造的丙酮之移除產生有利的效應,使反應的平衡朝向由本發明製造胺之方法所產生的胺移動。此項由於缺乏一反應夥伴,由ω-TA所催化的逆反應減低,而得以獲得高量所欲的胺。
較佳地,用於製造胺之本發明方法步驟b)中的胺供體分子係以介於10g/l(每公升之克數)至250g/l,更佳地介於15g/l至200g/l,又更佳地介於17g/l至180g/l之量來提供。
根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中,步驟a)中所提供的胺受體分子和步驟b)中所提供的胺供體分子較佳地係在溶液中與本發明蛋白質接觸。溶液可為僅包括水之水溶液但其亦可為包括水和有機溶劑之溶液。若根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中本發明蛋白質與步驟a)中所提供的胺受體分子和步驟a)中所提供的胺供體分子係在包括有機溶液的水溶液中接觸,則該有機溶劑較佳的係選自DMSO(二-甲基亞碸)、DMAc(二甲基乙醯胺)、DMF(二甲基甲醯胺)、乙腈、甲苯、第三丁基甲基醚、己烷、庚烷。最佳的為DMSO、DMAc和甲苯。
較佳地包括有機溶劑之水溶液係包含至高10%,更佳地至高20%,又更佳地至高30%,甚佳地至高40%,最佳地至高50%之量的有機溶劑。
若根據本發明用於製造胺之方法中步驟a)所提供的胺受體分子及/或步驟b)所提供的胺供體分子具有低溶解度,使用包括有機溶劑之水溶液具有可提高其個別溶解度之優點,使得有較高量的基質供ω-TA使用。此項導致較高反應速度,其意味著以較小體積和較短的時間產生較高量所欲的胺,因而提升時空產率。
若本發明蛋白質在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中係於水溶液中與步驟a)所提供的胺受體分子和步驟b)所提供的胺供體分子
接觸,則該溶液較佳地係包括用於調整pH之緩衝系統。較佳的緩衝系統為該等包括TRIS-HCl、MOPS、HEPES、TRIS、Bicine者。
較佳地,其中本發明蛋白質在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中與步驟a)所提供的胺受體分子和步驟b)所提供的胺供體分子接觸之水溶液的pH係調整至介於pH 4至pH 11間的值,更佳地介於pH 5至pH 10之間的值,又更佳地介於pH 6至pH 10之間的值,甚佳地介於pH 7至pH 10之間的值,又甚佳地介於pH 8至pH 10之間的值,最佳地介於pH 8.5至pH 9.5之間的值。
較佳地在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中,步驟a)所提供的胺受體分子和步驟b)所提供的胺供體分子與本發明蛋白質接觸係發生在介於10℃至60℃之間,更佳地介於20℃至60℃之間,又更佳地介於25℃至55℃之間,甚佳地介於30℃至50℃之間,又甚佳地介於30℃至45℃之間,最佳地介於34℃至42℃之間的溫度。
步驟a)所提供的胺受體分子和步驟b)所提供的胺供體分子係在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中與本發明蛋白質接觸歷經一段足以製造胺的時間。
較佳地步驟a)所提供的胺受體分子和步驟b)所提供的胺供體分子係在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中與本發明蛋白質接觸5小時至48小時,更佳地5小時至36小時,又更佳地5小時至30小時,甚佳地5小時至24小時,又甚佳地5小時至18小時,最佳地5小時至14小時,及特佳地5小時至13小時。
就本發明蛋白質在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中與步驟a)所提供的胺受體分子和步驟b)所提供的胺供體分子接觸,此蛋白質可以不同的形式與胺受體分子和胺供體分子接觸,較佳地此蛋白質係以部份純化的形式與胺受體分子和胺供體分子接觸,或此蛋白質係以經純化的方式與胺受體分子和胺供體分子接觸,或當與胺受體分子和胺供體分子接觸時此蛋白質係存在粗細胞萃取物中,或與胺受體分子和胺供體分子接觸時,此蛋白質係以作為活的或無生命宿主細胞的組份存在。
若此蛋白質在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中係以宿主細胞的組份與胺受體分子和胺供體分子接觸,則該宿主細胞可為該等包括用來培養宿主細胞之培養基,或該宿主細胞可為無培養宿主細胞之培養基,或該宿主細胞可經處理,較佳地該宿主細胞係近乎無培養宿主細胞的培養基,更佳地該宿主細胞係經(進一步)處理,甚佳地該宿主細胞係近乎無培養宿主細胞的培養基且該宿主細胞係經(進一步)處理。
「粗細胞萃取物」在文中應指藉由破壞包含所有或實質上所有存在細胞中的無機或有機物(包括另外的蛋白質及/或核酸分子)之活細胞所得到的萃取物。
「部份純化」在文中應指含有包括存在細胞中(僅)部分的總無機或有機物(包括另外的蛋白質及/或核酸分子)之組成物的蛋白質。
部份純化的萃取物可例如以習知的方法,例如離心、過濾、任何類型的層析分離、透析等,藉由從粗細胞萃取物分餾有機或無機物來製得。分餾粗細胞萃取物可使用相同或不同的分餾方法重複進行並可包括沉澱步驟。
「純化」文中應指其特定活性(以物質的乾重除以總重之分數表示的蛋白質活性,特別是其他蛋白質的乾重分量)無法藉由進一步分餾或純化步驟增加。
從術語「純化的」所普遍接納的上述定義,不言可喻的,「純化」可但在大多數的情況下並非指完全無任何另外無機及/或有機化合物之蛋白質。較佳地純化的在文中應指本發明蛋白質代表至少95%,更佳地至少96%,又更佳地至少97%,甚佳地至少98%,又甚佳地至少99%,最佳地至少99.5%之包括蛋白質的乾重物質總量。
術語「活細胞」在文中應指能生長及/或繁殖的細胞。
術語「無生命細胞」在文中應指不能生長及/或繁殖的細胞。
無生命細胞,雖然無法再繁殖及/或生長,然而仍顯現酵素活性,就本申請案而言,特言之本發明蛋白質之活性係具有ω-TA活性。
術語「無培養基」如文中所用係指用於培養(宿主)細胞的培養基已例如藉由離心及/或過濾之方法移除。
從術語「無培養基」所普遍接納的上述理解,不言可喻的,可但在大多數的情況下基本上並非必然指細胞完全無任何另外存在培養基中的無機及/或有機化合物。較佳地「純化的」在文中應指本發明細胞係代表至少95%,更佳地至少96%,又更佳地至少97%,甚佳地至少98%,又甚佳地至少99%,最佳地至少99.5%之乾重物質總量,包括無培養基之細胞。
術語「經(進一步)處理之宿主細胞」在文中應指包括本發明蛋白質之宿主細胞其在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中與胺受體分子和胺供體分子接觸之前係經物理及/或化學方法處理,較佳地其係經物理方法處理,更佳地其係經乾燥,又更佳地其係經冷凍乾燥或噴霧乾燥,最佳地其係經噴霧乾燥。
乾燥處理,特別是細胞的冷凍乾燥和噴霧乾燥處理已為熟習本項技術者所知。較佳地,包括本發明蛋白質之宿主細胞係經冷凍乾燥或噴霧乾燥,最佳地其在藉由文中「通用方法」第9項所述的方法於根據本發明用於製造胺之方法步驟c)接觸之前係經噴霧乾燥。
熟習本項技術者已知,具有ω-TA活性的蛋白質為磷酸吡哆醛(PLP)依賴的酵素。在一較佳的實施例中,此蛋白質係於PLP的存在下在根據本發明用於製造胺之方法步驟c)中與步驟a)所提供的胺受體分子和步驟b)所提供的胺供體分子接觸,更佳地PLP係以介於0.05g/l至2.0g/l之量,又更佳地以介於0.05g/l至1.5g/l之量,甚佳地以介於0.05g/l至1.0g/l之量,又甚佳地以介於0.075g/l至0.75g/l之量,最佳地以介於0.1g/l至0.5g/l之量存在。
在用於製造胺之方法中於必要步驟d)中得到胺可指該胺係存在步驟d)的組成物中所產生的胺無任何進一步純化,或其可指所產生的胺係經進一步純化。胺的純化可藉由熟習本項技術者已知的方法來進行。此等用於純化胺的方法包括但不限於涉及沉澱的方法、包括層析、蒸餾、萃取、吸附或過濾的方法。
根據本發明用於製造胺之方法的一較佳實施例為用於製造包括(S)-胺鏡像異構物超越值優於其(個別的)(R)-胺之組成物的方法,其係包括下列步驟:
a)提供胺受體分子;
b)提供胺供體分子;
c)將步驟a)所提供的胺受體和步驟b)所提供的胺供體與本發明蛋白質接觸;
d)視需要,得到包括(S)-胺鏡像異構物超越值優於其(個別的)(R)-胺之組成物。
術語「鏡像異構物」如文中所用係具有化學技術中一般理解之意義,其彼此互為不重疊之結構鏡像的二種立體異構物之一的分子。術語「鏡像異構物」一般亦稱為「光學異構物」。
術語「鏡像異構物超越值」(一般縮寫為「ee」)在化學技術領域中已為普遍理解且在文中係用來指出組成物中,如各鏡像異構物之莫耳分率間的絕對差異所定義,一鏡像異構物的超越值超過個別的另一鏡像異構物。通常鏡像異構物超越值在本項技術中係以鏡像異構物超越值百分比來表示。例如,包括70%的(S)-鏡像異構物和30%的(R)-鏡像異構物之組成物具有關於(S)-鏡像異構物ee=40%(40%純(S)-鏡像異構物+60%外消旋(=30%(S)+30%(R))。總結,鏡像異構物混合物係具有ee=0%,純(S)-或(R)-鏡像異構物係具有ee=100%。
用於製造包括鏡像異構物超越的(S)-胺之組成物的本發明方法之一較佳實施例為一用於製造鏡像異構物超越的脂肪(S)-胺(包括但不限於直鏈、支鏈或環狀烷胺、烯胺、炔胺)之方法,或用於製造鏡像異構物超越的芳基(S)-胺之方法或用於製造胺基酸之方法,或用於製造鏡像異構物超越的(S)-胺基酸之方法,更佳地用於製造鏡像異構物超越的(S)-α-胺基酸之方法,又更佳地用於製造鏡像異構物超越的支鏈(S)-α-胺基酸、芳香系(S)-α-胺基酸或包括經取代苯基基團之芳香(S)-α-胺基酸的方法,最佳地用於製造鏡像異構物超越的胺基酸(S)-正纈胺酸、(S)-白胺酸、(S)-苯丙胺酸或(S)-酪胺酸之方法。
就包括進一步胺基酸修飾的本發明ω-TA變體而言,用於製造包括鏡像異構物超越的(S)-胺之組成物的本發明方法較佳地為用於製造鏡像異構物超越的包括磷之脂肪系(S)-胺(包括但不限於包括磷之直鏈、支
鏈或環狀烷(S)-胺、烯(S)-胺、炔(S)-胺)之方法,或用於製造鏡像異構物超越的包括磷之芳基(S)-胺的方法,或用於製造鏡像異構物超越的包括磷之(S)-胺基酸的方法,更佳地用於製造鏡像異構物超越的包括磷之(S)-α-胺基酸的方法,又更佳地用於製造鏡像異構物超越的包括磷之支鏈(S)-α-胺基酸、包括磷之芳香系(S)-α-胺基酸或包括磷之包括經取代苯基基團之芳香(S)-α-胺基酸的方法,甚佳地用於製造鏡像異構物超越的包括磷之(S)-α-胺基酸的方法,又甚佳地用於製造鏡像異構物超越的包括經甲基取代磷之(S)-α-胺基酸的方法,最佳地用於製造鏡像異構物超越的(S)-固殺草之方法。
用於製造包括鏡像異構物超越的(S)-胺之組成物的本發明方法之另外較佳實施例為,用於製造包括至少20%,更佳地至少40%,又更佳地至少60%,甚佳地至少80%,又甚佳地至少90%,特佳地至少94%,最佳地至少96%或特佳地至少98%鏡像異構物超越值(ee)的(S)-胺之組成物的方法。
有關根據本發明用於製造胺之方法,所提供的胺受體分子之較佳實施例和步驟a)中所提供的量之較佳實施例,以及所提供的胺供體分子之較佳實施例和步驟b)中所提供的量之較佳實施例,在上文已定義的為據此可分別應用於步驟a)中的胺受體分子和步驟b)中的胺供體分子,用於製造包括(S)-胺物鏡像異構物超越值優於其(個別的)(R)-胺之組成物的方法中。然而不言可喻的,若在製造包括(S)-胺物鏡像異構物超越值優於其(個別的)(R)-胺之組成物的方法中,步驟b)中所提供的胺供體分子為一對掌分子,則係提供至少一包括胺供體之(S)-立體異構物的鏡像異構物混合物,較佳地提供胺供體之外消旋混合物。若就經濟成本而言為可取得和可行的,則對掌胺供體較佳地可以其中(S)-立體異構物為鏡像異構物超越的混合物來提供,更佳地,此胺供體可以包括物鏡像異構物超越的(S)-異構物之組成物來提供,在該情況下高鏡像異構物超越值的(S)-立體異構物係指至少30%,更佳地至少40%,又更佳地至少60%,甚佳地至少80%,又甚佳地至少90%,特佳地至少94%,最佳地至少96%或特佳地至少98%的鏡像異構物超越值。
有關溶液、水溶液、包括有機溶劑的水溶液、緩衝系統、pH值及/或溫度、蛋白質形式(粗細胞萃取物、部份純化的蛋白質、純化的蛋白質、以一活的或無生命宿主細胞、(進一步)處理的宿主細胞、噴霧乾燥的宿主細胞之組分存在的蛋白質)、蛋白質的量和有關用於製造胺之本發明方法步驟c)之PLP的存在及量,在上文已定義的為據此可應用於製造包括(S)-胺物鏡像異構物超越值優於其(個別的)(R)-胺之組成物的方法步驟c)中。
有關用於製造胺之本發明方法步驟d)的較佳實施例,上文已定義的為據此可應用於製造包括(S)-胺鏡像異構物超越值優於其(個別的)(R)-胺之組成物的方法步驟d)中。
除了已就製造胺之本發明方法步驟d)所定義的之外,較佳地在用於製造包括(S)-胺鏡像異構物超越值優於其(個別的)(R)-胺之組成物的方法步驟d)中,係得到包括至少40%,更佳地至少70%,又更佳地至少80%,甚佳地至少90%,又甚佳地至少95%,特佳地至少97%,最佳地至少98%或特佳地至少99%之鏡像異構物超越值的(S)-胺之組成物。
本發明之蛋白質亦可用於從包括(R)-和(S)-胺立體異構物之組成物降低或消除立體異構物之方法中。當從包括(R)-和(S)-胺異構物之組成物中降低或消除立體異構物時,由本發明蛋白質所催化的反應係依循通用方程式(Ia)。相較於合成胺之反應(參見方程式(I)),可在反應中看到胺基供體和胺基受體彼此交換,從包括(R)-和(S)-胺之組成物降低或消除立體異構物(參見方程式(Ia))。根據方程式(Ia)之反應,具有在包括不同立體異構物之組成物中特定的立體異構物可能為富集的優點,或換言之,可從組成物中移除特定立體異構物,有時候在本項技術中亦稱為解析鏡像異構物混合物。若一化合物係藉由化學合成的方式產生,其通常生成一外消旋混合物,則該等方法為特別重要。就處理經濟性或其他理由而言,此一化合物之化學合成可能為所欲的製造方法。然而,分離化學製造的鏡像異構物可能是困難的、昂貴的或甚至不可能的。可使用本發明蛋白質從此等化學製造的外消旋混合物進行選擇性移除立體構物。
本發明另一實施例因此係關於在一包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法,其係包括下列步驟:
a)提供包括(R)-胺和(S)-胺鏡像異構物之組成物
b)提供胺受體分子;
c)將步驟a)所提供的組成物和步驟b)所提供的胺受體與本發明蛋白質接觸;
d)視需要,得到相較於存在步驟a)所提供的組成物中的量,其中胺鏡像異構物之量減少之組成物。
用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法中,存在各個這些方法之步驟a)所提供的組成物中結構上不同的(R)-胺和(S)-胺分子有多少並非決定性的,只要至少有一(S)-和一(R)-胺分子存在即可。
用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法中步驟a)所提供的包括(R)-胺和(S)-胺之組成物係包括至少一(R)-胺和至少一(S)-胺,其中該至少一(R)-胺和該至少一(S)-胺可為相同分子的立體異構物,或該至少一(R)-胺和該至少一(S)-胺可為來自結構上不同的分子之立體異構物。
一用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法之較佳實施例為一用於降低脂族胺(包括但不限於直鏈、支鏈或環狀烷胺、烯胺、炔胺)之鏡像異構物之量的方法,或一用於降低芳基胺之鏡像異構物之量的方法,或用於降低胺基酸之鏡像異構物之量的方法,更佳地用於降低α-胺基酸之鏡像異構物之量的方法,又更佳地用於降低支鏈α-胺基酸鏡像的異構物、芳香系α-胺基酸的鏡像異構物或包括經取代苯基基團的芳香α-胺基酸之鏡像異構物之量的方法,最佳地用於降低選自正纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸之胺基酸的鏡像異構物之量的方法。
就根據本發明包括進一步胺基酸修飾之ω-TA變體而言,用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺之鏡像異構物之量的本發明方法較佳地係為用於降低包括磷之脂族胺(包括但不限於包括磷之直鏈、支鏈或環狀烷胺、烯胺、炔胺)的鏡像異構物之量的方法,或用於降低包括磷之
芳基胺的鏡像異構物之量的方法或用於降低包括磷之胺基酸的鏡像異構物之量的方法,更佳地用於降低包括磷之α-胺基酸的鏡像異構物之量的方法,又更佳地用於降低包括磷之支鏈α-胺基酸的鏡像異構物、包括磷之芳香系α-胺基酸的鏡像異構物或包括磷之包括經取代苯基基團之芳香α-胺基酸的鏡像異構物之量的方法,甚佳地用於降低包括經取代磷之α-胺基酸的鏡像異構物之量的方法,又甚佳地用於降低包括經甲基取代磷之α-胺基酸的鏡像異構物之量的方法,最佳地用於降低固殺草的鏡像異構物之量的方法。
有關溶液、水溶液、包括有機溶劑的水溶液、緩衝系統、pH值及/或溫度、蛋白質形式(粗細胞萃取物、部份純化的蛋白質、純化的蛋白質、以一活的或無生命宿主細胞、(進一步)處理的宿主細胞、噴霧乾燥的宿主細胞之組分存在的蛋白質)、蛋白質的量和有關用於製造胺之本發明方法步驟c)之PLP的存在及量,在上文已定義的為據此可應用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法步驟c)中。
有關用於製造胺之本發明方法步驟d)的較佳實施例,上文已定義的為據此可應用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法步驟d)中。
本發明之蛋白質特別可用於從包括(R)-胺和(S)-胺立體異構物之組成物中降低或實質上或幾乎完全消除(S)-鏡像異構物之量的方法中,藉此產生其中(R)-胺係以鏡像異構超越存在之組成物。在形式上藉由(S)-選擇性ω-TA製造鏡像異構物富集或幾乎鏡像異構上純的胺之方法可用通式(II)來描述。
R1-CH((S,R)-NH2)-R2+R3-CO-R4 → R1-CO-R2+R3-CH((R)-NH2)-R4
許多具有生物活性,例如醫藥之化合物,用於農藝學之活性化合物,補充的食品添加物,飼料添加物等係以鏡像異構物存在。在絕大多數的案例中,僅有一鏡像異構物顯示所欲的生物活性而另一種為無活性的或通常甚至顯示不欲的副作用。目前許多具有生物活性的化合物且用作為醫藥,用於農藝學中,作為補充的食品或飼料添加物(例如胺基酸)可能藉由化學合成的方式製造或僅在經濟上可行的條件下製造,其中缺點為該等化合物僅可取得外消旋混合物。本發明之蛋白質係提供(S)-胺之量可部分、
明顯地或幾乎完全從此等外消旋混合物中移除之優點,以便得到包括生物活性的鏡像異構物或獲得用於製造生物活性鏡像異構物之前驅物的組成物,或在包括生物活性的鏡像異構物或其前驅的組成物中幾乎無失活的鏡像異構物。此項降低了在醫藥、用於農藝學的產品或包括補充食品或飼料添加物之產品中的副作用。
在一較佳的實施例中,該用於包括(R)-胺和(S)-胺鏡像異構物之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法為一在包括(S)-胺和(R)-胺之組成物中用於降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法,其係包括下列步驟:
a)提供一包括(R)-胺和(S)-胺之組成物;
b)提供胺受體分子;
c)將步驟a)所提供的組成物和步驟b)所提供的胺受體分子與本發明蛋白質接觸;
d)視需要,得到相較於存在步驟a)所提供的組成物中的量,其中(S)-胺鏡像異構物之量減少之組成物。
用於在包括(R)-胺和(S)-胺鏡像異構物之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法一較佳的實施例為用於降低脂肪系(S)-胺(包括但不限於直鏈、支鏈或環狀烷(S)-胺、烯(S)-胺、炔(S)-胺)之量的方法,或一用於降低芳基(S)-胺之量的方法,或用於降低(S)-胺基酸之量的方法,更佳地用於降低(S)-α-胺基酸之量的方法,又更佳地用於降低支鏈(S)-α-胺基、芳香系(S)-α-胺基酸的鏡像異構物或包括經取代苯基基團的芳香(S)-α-胺基酸之量的方法,最佳地用於降低選自(S)-正纈胺酸、(S)-白胺酸、(S)-苯丙胺酸或(S)-酪胺酸之胺基酸之量的方法。
就根據本發明包括進一步胺基酸修飾之ω-TA變體而言,用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的本發明方法較佳地係為用於降低包括磷之脂肪系(S)-胺(包括但不限於包括磷之直鏈、支鏈或環狀烷(S)-胺、烯(S)-胺、炔(S)-胺)之量的方法,或用於降低包括磷之芳基(S)-胺之量的方法或用於降低包括磷之(S)-胺基酸之量的方法,更佳地用於降低包括磷之(S)-α-胺基酸之量的方法,又更佳地用於降低包括磷之支鏈(S)-α-胺基酸、包括磷之芳香系(S)-α-胺基酸或包括磷之包括經取代苯
基基團之芳香(S)-α-胺基酸之量的方法,甚佳地用於降低包括經取代磷之(S)-α-胺基酸之量的方法,又甚佳地用於降低包括經甲基取代磷之(S)-α-胺基酸之量的方法,最佳地用於降低(S)-固殺草之量的方法。
較佳地就各個用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法或用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法,步驟a)中所提供的包括(S)-胺和(R)-胺之組成物係包括由下列化合物組成之群中選出的(R)-及/或(S)-胺:脂肪系(R)-和(S)-胺(包括但不限於直鏈、支鏈或環狀烷(R)-和(S)-胺、烯(R)-和(S)-胺、炔(R)-和(S)-胺)或芳基(R)-和(S)-胺或(R)-和(S)-胺基酸,更佳地(R)-和(S)-α-胺基酸,又更佳地支鏈(R)-和(S)-α-胺基酸、芳香系(R)-和(S)-α-胺基酸或包括經取代苯基基團之芳香系(R)-和(S)-α-胺基酸,最佳地胺基酸(R)-和(S)-正纈胺酸、(R)-和(S)-白胺酸、(R)-和(S)-苯丙胺酸或(R)-和(S)-酪胺酸。
就根據本發明包括進一步胺基酸修飾之ω-TA變體而言,較佳地,就各個用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法或用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法,步驟a)所提供的包括(R)-和(S)-胺之組成物係包括由下列化合物組成之群中選出的(R)-及/或(S)-胺:包括磷之脂肪系(R)-和(S)-胺(包括但不限於包括磷之直鏈、支鏈或環狀烷(R)-和(S)-胺、烯(R)-和(S)-胺、炔(R)-和(S)-胺)或包括磷之芳基(R)-和(S)-胺或包括磷之(R)-和(S)-胺基酸,更佳地包括磷之(R)-和(S)-α-胺基酸,又更佳地包括磷之支鏈(R)-和(S)-α-胺基酸、包括磷之芳香系(R)-和(S)-α-胺基酸或含有經取代苯基基團之包括磷的芳香系(R)-和(S)-α-胺基酸,甚佳地包括經取代磷之(R)-和(S)-α-胺基酸,又甚佳地包括經甲基取代的磷之(R)-和(S)-α-胺基酸,最佳地(R)-和(S)-固殺草。
更佳地,就各個用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法或用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法,步驟a)中所提供的包括(R)-胺和(S)-胺之組成物係包括相同分子之(R)-和(S)-胺,更佳地其係包括各代表由下列化合物組成之群中選出的單一化合物之鏡像異構物的(R)-胺和(S)-胺:脂肪系(R)-和(S)-胺(包括但不限於直鏈、支鏈或環狀烷(R)-和(S)-胺、烯(R)-和(S)-胺、炔(R)-和
(S)-胺)或芳基(R)-和(S)-胺或(R)-和(S)-胺基酸,更佳地(R)-和(S)-α-胺基酸,又更佳地支鏈(R)-和(S)-α-胺基酸、芳香系(R)-和(S)-α-胺基酸或包括經取代苯基基團之芳香系(R)-和(S)-α-胺基酸,最佳地胺基酸(R)-和(S)-正纈胺酸、(R)-和(S)-白胺酸、(R)-和(S)-苯丙胺酸或(R)-和(S)-酪胺酸。
就根據本發明包括進一步胺基酸修飾之ω-TA變體而言,較佳地,就各個用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法或用於包括(S)-胺和(R)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法,步驟a)所提供的包括(R)-和(S)-胺之組成物係包括相同分子之(R)-和(S)-胺,更佳地其係包括各代表由下列化合物組成之群中選出的單一化合物之鏡像異構物的(R)-胺和(S)-胺:包括磷之脂肪系(R)-和(S)-胺(包括但不限於包括磷之直鏈、支鏈或環狀烷(R)-和(S)-胺、烯(R)-和(S)-胺、炔(R)-和(S)-胺)或包括磷之芳基(R)-和(S)-胺或包括磷之(R)-和(S)-胺基酸,更佳地包括磷之(R)-和(S)-α-胺基酸,又更佳地包括磷之支鏈(R)-和(S)-α-胺基酸、包括磷之芳香系(R)-和(S)-α-胺基酸或含有經取代苯基基團之包括磷的芳香系(R)-和(S)-α-胺基酸,甚佳地包括經取代磷之(R)-和(S)-α-胺基酸,又甚佳地包括經甲基取代的磷之(R)-和(S)-α-胺基酸,最佳地(R)-和(S)-固殺草。
較佳地就各用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法或用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法,步驟b)中所提供的胺受體分子為一分子,其結構係相當於如上文用於製造胺之方法步驟b)中所提供之胺供體分子所述的結構,除此之外該等如上文用於製造胺之方法步驟b)中所提供之胺供體分子所述的分子之胺基團係經羰基置換。例如,如用於製造胺之方法步驟b)中所提供之胺供體分子所述的異丙基胺的胺基團係經羰基基團置換,產生各用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法或用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法其步驟b)中所用的對應胺受體分子丙酮。
各用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法或用於包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法其步驟b)中所提供的最佳胺受體分子為丙酮。
有關溶液、水溶液、包括有機溶劑的水溶液、緩衝系統、pH值及/或溫度、蛋白質形式(粗細胞萃取物、部份純化的蛋白質、純化的蛋白質、以一活的或無生命宿主細胞、(進一步)處理的宿主細胞、噴霧乾燥的宿主細胞之組分存在的蛋白質)、蛋白質的量和有關用於製造胺之本發明方法步驟c)之PLP的存在及量,在上文已定義的據此可應用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法步驟c)中。
有關用於製造胺之本發明方法步驟d)的較佳實施例,上文已定義的據此可應用於在包括(R)-胺和(S)-胺之組成物中降低(S)-胺鏡像異構物之量的方法步驟d)中。
本發明另一實施例為本發明蛋白質用於製造胺,較佳地用於製造(S)-胺之用途。
本發明蛋白質用於鏡像異構物混合物中降低胺量,較佳地(S)-胺量之用途亦為本發明一實施例。
用於本發明宿主細胞中表現本發明蛋白質之本發明核酸亦為本發明一實施例。
本發明另外的實施例係關於供轉化或基因改造本發明宿主細胞,或供製造本發明蛋白質之本發明核酸分子、本發明重組的核酸分子、本發明質體或本發明載體。
用於製造胺或用於降低胺量,較佳地用於鏡像異構物混合物中降低(S)-胺量之本發明宿主細胞的用途亦為本發明一實施例。
在整個說明書中,核苷酸和胺基酸縮寫係根據下列IUPAC編碼來使用:
為了區分胺基酸和核苷酸,上表中所給予的大寫核苷酸碼其縮寫在文中係以小寫書寫。
密碼子使用係依循文中根據下列所謂的「通用基因碼」,其中在核醣核酸(RNA)序列中「t」係以「u」取代。「TLC」係代表胺基酸的三字母編碼而「SLC」係代表單字母編碼。
SEQ ID NO 1:藉由回轉譯SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列所得到的編碼巨桿菌之ω-轉胺酶(ω-TA)的核酸序列,其中該回轉譯係依循由於通用基因碼簡併之轉譯原則。在位於位置1450至1452的停止密碼子之前,將位置1432至1449之編碼6個His胺基酸的核苷酸插入巨桿菌的序列。
SEQ ID NO 2:編碼具有如SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列來自巨桿菌之ω-TA的核酸序列。在位於位置1450至1452的停止密碼子之前將位置1432至1449之編碼6個His胺基酸的核苷酸插入巨桿菌的序列。
SEQ ID NO 3:衍生自GenPept(PDB)登錄號5G09_A之巨桿菌的ω-TA胺基酸序列。所顯示的胺基酸係由SEQ ID NO 1和2所示的核酸序列所編碼。將位置478至483的六個His胺基酸藉由序列修飾插入巨桿菌的序列。
SEQ ID NO 4:藉由回轉譯SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列所得到的編碼節桿菌屬ω-TA的核酸序列,其中該回轉譯係依循由於通用基因碼簡併之轉譯原則。
SEQ ID NO 5:編碼具有如SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列來自結桿菌屬ω-TA的核酸序列。在位於位置1456至1458停止密碼子之前將位置1438至1455之編碼6個His胺基酸的核苷酸插入節桿菌的序列。
SEQ ID NO 6:可衍生自GenPept(PDB)登錄號5G2P_A來自節桿菌的ω-TA胺基酸序列。所顯示的胺基酸係由SEQ ID NO 4和5所示的核酸序列所編碼。藉由序列修飾將位置480至485的六個His胺基酸插入節桿菌的序列。
SEQ ID NO 7:藉由回轉譯SEQ ID NO 9所示之胺基酸序列所得到的編碼芽孢桿菌屬(soil 76801D1)ω-TA的核酸序列,其中該回轉譯係依循由於通用基因碼簡併之轉譯原則。
SEQ ID NO 8:編碼可衍生自GenBank登錄號LMTA01000079.1)來自芽孢桿菌屬(soil 76801D1之ω-TA的核酸序列。
SEQ ID NO 9:可衍生自GenPept(PDB)登錄號KRF52528.1)來自芽孢桿菌屬(soil 76801D1之ω-TA的胺基酸序列。所示的胺基酸係由,如上所述,SEQ ID NO 7和8所示的核酸序列所編碼。
SEQ ID NO 10:藉由回轉譯SEQ ID NO 12所示之胺基酸序列所得到的編碼節桿菌屬突變ω-TA的核酸序列,其中該回轉譯係依循由於通用基因碼簡併之轉譯原則。
SEQ ID NO 11:編碼具有如SEQ ID NO 12所示之胺基酸序列來自節桿菌屬之突變ω-TA變體的核酸序列。該序列可衍生自WO 2006/063336 A2之SEQ ID NO 15。
SEQ ID NO 12:可衍生自WO 2006/06336 A2之SEQ ID NO 16來自節桿菌之突變ω-TA的胺基酸序列。所示的胺基酸係由如上文所述SEQ ID NO 11和12所示的核酸序列所編碼。
SEQ ID NO 13:藉由回轉譯SEQ ID NO 15所示之胺基酸序列所得到的編碼節桿菌屬野生型ω-TA的核酸序列,其中該回轉譯係依循由於通用基因碼簡併之轉譯原則。
SEQ ID NO 14:編碼具有如SEQ ID NO 15所示之胺基酸序列來自節桿菌屬之野生型ω-TA的核酸序列。該序列可衍生自WO 2006/063336 A2之SEQ ID NO 1。
SEQ ID NO 15:可衍生自WO 2006/06336 A2之SEQ ID NO 2來自節桿菌之野生型ω-TA的胺基酸序列。所示的胺基酸係由如上文所述SEQ ID NO 13和14所示的核酸序列所編碼。
SEQ ID NO 16:藉由回轉譯SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列所得到的編碼改良型ω-TA的核酸序列,其中該回轉譯係依循由於通用基因碼簡併之轉譯原則。
SEQ ID NO 17:編碼具有如SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列之改良ω-TA的核酸序列。
SEQ ID NO 18:改良的ω-TA胺基酸序列,其中相較於SEQ ID NO 3和9所示之來自巨桿菌的胺基酸序列和相較於SEQ ID NO 12和15所示之來自節桿菌屬的胺基酸序列,其改良處係藉由胺基酸取代來取得。
SEQ ID NO 19:來自圓紅酵母(Rhodotorula toruloides)(同義名:Rhodotorula gracilis)之D-胺基酸氧化酶(DAO1)基因的核酸編碼序列。
SEQ ID NO 20:得自SEQ ID NO 19所示之編碼序列,具有D-胺基酸氧化酶(DAO1)活性之蛋白質的胺基酸序列。
SEQ ID NO 21:得自圓紅酵母之D-胺基酸氧化酶(DAO1)基因變體的核酸編碼序列,相較於圓紅酵母之核酸序列其係在位置160-162的核苷酸所鑑別的密碼子和位置172-174的核苷酸所鑑別的密碼子及位置637-639的核苷酸所鑑別的密碼子中包括核苷酸取代(置換)。
SEQ ID NO 22:由SEQ ID NO 21所示的編碼序列所得來,具有D-胺基酸氧化酶活性之蛋白質的胺基酸序列。相較於圓紅酵母之核酸序列位置54、58和213,相較於SEQ ID NO 21所示的胺基酸序列,該胺基酸序列係包括胺基酸取代(置換)且因此為DAAO變體(突變物)之胺基酸序列。
SEQ ID NO 23:來自斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)催化酶基因的核酸編碼序列。
SEQ ID NO 24:由SEQ ID NO 23所示的編碼序列所得來,具有催化酶活性之蛋白質的胺基酸序列。
SEQ ID NO 25:核酸序列其係編碼具有催化酶活性之SEQ ID NO 24所示之胺基酸序列的蛋白質。
SEQ ID NO 26:圖1中標示為「lac操縱子」之遺傳因子的核酸序列。
SEQ ID NO 27:圖1中標示為「Trc啟動子」之遺傳因子的核酸序列。
SEQ ID NO 28:圖1中標示為「rrnB」之遺傳因子的核酸序列。
SEQ ID NO 29:圖1中標示為「順反子」之遺傳因子的核酸序列。
SEQ ID NO 30:圖1中標示為「rrnB終止子」之遺傳因子的核酸序列。
編碼具有文中所述之ω-TA活性的蛋白質之文中已知的核苷酸序列,係由Eurofins Genomics GmbH(Eurofins Genomics GmbH,Anzinger Str.7a,85560 Ebersberg,Germany)之服務供應商所合成。
將核苷酸取代(置換)導入SEQ ID No 2、5、8、11、14所示的核酸序列中。此置換可在編碼參照多肽的核酸序列中以任何適合用於置換核酸序列中的核苷酸方法來進行。該等方法係廣泛地描述於文獻中並為
熟習個別序列的技術者所熟知。數種分子生物方法可用來進行個別的核苷酸置換。可用於製備本發明突變的核酸序列和對應蛋白質之方法係包括在編碼一或多個胺基酸之預先選定的密碼子上進行定點突變,藉此改變所選擇之密碼子使其編碼不同的胺基酸。用於獲得這些定點突變的方法已為熟習技術者所熟知且廣泛地描述於文獻中(特別是:Directed Mutagenesis:A Practical Approach,1991,Edited by M.J.McPHERSON,IRL PRESS),或為可能應用市售套組之方法(例如Qiagen或Stratagene公司的QUIKCHANGETM lightening mutagenesis kit)。定點突變後,將核酸轉化至大腸桿菌菌株MG1655。藉由使用適當的篩選方法選擇含有有利的生物轉化產率之突變多肽的細胞。適當的篩選方法係描述於本文的「通用方法」第4和7項中。將編碼改良多肽的突變核酸序列進行定序確認。用於定序確認的方法已為熟習本項技術者所熟知且廣泛地描述於文獻中(例如Sambrook和Russell(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY))。
將編碼如文中所述的野生型ω-TA(SEQ ID No 2、5、8、14)或包括突變之已知ω-TA(SEQ ID NO 11)或ω-TA變體的核酸序列選殖至市售的pET22B載體(Merck KGaA,Frankfurter Str 250,64293 Darmstadt,Germany)中並表現在大腸桿菌菌株BL21DE3細胞。
讓一包括其中導入編碼ω-TA變體之個別核酸序列之pET22B載體的預培養大腸桿菌菌株BL21DE3,於含有添加卡本西林(carbenicillin)之20ml LB-培養基的燒瓶中在37℃於180rpm旋轉震盪器上生長至隔夜。藉由將預培養轉移到含有添加卡本西林之250ml LB-培養基的燒瓶,進行ωTA蛋白質之表現。於37℃在180rpm旋轉震盪器上生長達到介於0.6-0.8之OD(光學密度)之後,藉由加入0.5mM IPTG(最終濃度)引發ω-TA蛋白質表現。將引發的細胞培養於20℃在180rpm震盪下培養20h。使用Qiagen(Qiagen GmbH,Qiagen Strasse 1,40724 Hilden)的Ni-NTA Fast Start Kit,根據製造商的方法進行酵素純化。
於40μl三乙醇胺緩衝液中(200mM溶於去離子水之溶液,pH=9,0)於室溫加入10μl磷酸吡哆醛(10mM溶於去離子水之溶液)和10μl的胺基供體(2M溶於去離子水之溶液,添加HCl水溶液調整至pH=9,0)。隨後,加入20μl的胺基受體(100mM溶於去離子水之溶液)(若胺基受體不溶於水,則加入成比例的DMSO)。最後於室溫加入20μl的轉胺酶酵素(1,5mg/ml)並將混合物於40℃在800rpm旋轉震盪器上培養6-7h。於反應期間的不同時間間隔取等份藉由HPLC-分析來監測轉胺反應。
具有進一步胺基酸修飾之ω-TA變體的活性檢測係藉由使用包括二個反應步驟的方法來進行。
第一個反應步驟(步驟1)係產生ω-TA之胺受體。此步驟係由D-胺基酸氧化酶(DAAO或DAO,EC 1.4.3.3)所催化。DAAO為含黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的黃素蛋白質,根據下列通式(III),其係催化D-胺基酸與氧的氧化性去胺作用,產生對應的2-側氧酸以及過氧化氫和氨:
α-D-胺基酸+H2O+O2──>α-2-側氧羧酸+NH3+H2O2
在第一反應步驟中用於製造α-2-側氧羧酸之具有DAAO活性的蛋白質為來自圓紅酵母之DAO1蛋白質的DAAO變體。圓紅酵母之野生型DAO1蛋白質的編碼核酸序列可衍生自GenBank登錄號U6006.1(如SEQ ID NO 19所示)而由SEQ ID NO 19所示的核酸序列所編碼的對應胺基酸序列可衍生自UniProt登錄號P80324(如SEQ ID NO 20所示)。文中所用的DAAO變體係揭示於WO 2017/151573中為突變體Ac305(第36頁的表1)。相較於SEQ ID NO 20,突變體Ac305係包括在位置54和58及213之胺基酸取代(置換)。在突變體Ac305中SEQ ID NO 20位置54的胺基酸N係經C取代(置換),及SEQ ID NO 20位置58的胺基酸F係經H取代(置換),及SEQ ID NO 20位置213的胺基酸M係經S取代(置換)。突變體Ac305之胺基酸序列係如SEQ ID NO 22所示。編碼具有SEQ ID NO 22胺基酸序列之蛋白質的個別核酸序列係如SEQ ID NO 21所示。步驟1之反應係藉由
具有DAAO活性的蛋白質催化,而該蛋白質係具有如SEQ ID NO 22所示的胺基酸序列。
在第二反應步驟(步驟2)中,由第1步驟中具有DAAO)活性的蛋白質所產生的α-2-側氧羧酸係在胺供體的存在下藉由具有ω-TA活性的蛋白質根據通式(I)轉變為胺基酸。
藉由通式(III)從步驟1的說明則變得更清晰,由具有DAAO活性的蛋白質催化D-胺基酸轉變為酮酸產生了過氧化氫(H2O2),移除H2O2可能為需要的,但在每個情況下並不一定為必要的。移除H2O2係結合本發明藉由加入具有催化酶活性的蛋白質來進行。
具有催化酶活性的蛋白質(EC 1.11.1.6;過氧化氫:過氧化氫氧化還原酶)已為本項技術所知且根據下列通式(IV)係催化過氧化氫(H2O2)轉變為水(H2O)和氧(O2):
2H2O2──>O2+2H2O
用於移除H2O2所使用之具有來自斯氏李斯特菌催化酶活性的蛋白質之胺基酸序列係如SEQ ID NO 24所示且可衍生自GenePept登錄號WP_012986600.1。SEQ ID NO 23(可衍生自GenBank登錄號NC_013891.1)顯示為具有SEQ ID NO 24所示之胺基酸序列的催化酶蛋白質之斯氏李斯特菌的核酸編碼序列。SEQ ID NO 25亦為編碼具有SEQ ID NO 24所示之胺基酸序列的催化酶蛋白質之核酸序列。相較於SEQ ID VNO 23所示的核酸序列,SEQ ID NO 25所示的核酸序列之密碼子係經改變而適用於大腸桿菌之密碼子使用。
就用於製造具有DAAO活性的蛋白質、製造具有ω-TA活性的蛋白質和具有催化酶活性的蛋白質,係以將全部三種蛋白質從單一操縱子作為三順反子RNA由trc-啟動子(由源自trp-和lacUV5-啟動子之序列所組成的雜交啟動子)轉錄的方式,將編碼個別三種蛋白質之核酸序列選殖至大腸桿菌表現載體中。有關從啟動子轉錄的基因順序為DAAO(SEQ ID NO 21)->編碼包括進一步胺基酸修飾之ω-TA變體的核酸分子(如上文所述)->催化酶(SEQ ID NO 25)。SEQ ID NO 21係在其5'-端與編碼胺基酸序列M A R I R L之核酸序列轉譯稠合。
所用的表現載體係以pSE420為基準(說明和序列可引自:Addgene,75 Sidney St,Suite 550A,Cambridge,MA 02139;https://www.addgene.org/vector-database/4064/或來自Thermo Fisher Scientific(Invitrogen),Thermo Fisher Scientific Inc.168 Third Avenue,Waltham,MA 02451 USA,https://www.thermofisher.com/search/results?query=pSE420& focusarea)。藉由習知的方法將遺傳因子導入修飾的pSE420載體中。存在所使用的表現載體中之相關遺傳因子係如圖1中所示。就表現三種酵素,係將表現載體轉移至大腸桿菌菌株MG1655細胞中。
將包括進一步胺基酸修飾之ω-TA變體選殖至上文「通用方法」第5項所述的三-順反子表現載體並表現在大腸桿菌菌株MG1655細胞中。就此,將添加卡納黴素(kanamycin)之LB-培養基中的20ml預培養物置於震盪燒瓶中於37℃在180rpm的旋轉震盪器上生長至隔夜。藉由將預培養物轉移至含有添加卡納黴素之200ml LB-培養基的燒瓶中進行ωTA蛋白質之表現。表現ωTA蛋白質係藉由加入1mM IPTG(最終濃度)在達到介於0.6-0.8之OD後引發。將引發的細胞培養物於180rpm震盪下在20℃培養20h。就收取,係將細胞培養物於4℃以8000g離心15分鐘並將得到的細胞儲存於-80℃直到冷凍乾燥或噴霧乾燥。
於配置有機械攪拌器、O2-氣體入口和pH-控制給劑單元之1公升可調整溫度的玻璃雙套反應器中加入268ml的50w%外消旋(R,S)-固殺草銨(glufosinate ammonium)水溶液(相當160,8g外消旋固殺草銨)。於機械攪拌下(250rpm)經由pH-控制給劑單元加入2M異丙基胺水溶液,直到達到pH=9,0。於整個反應期間藉由控制添加2M異丙基胺水溶液讓pH保持恆定。反應器係加熱至35℃內部溫度。
在一燒杯中,將8g噴霧乾燥的大腸桿菌菌株MG1655細胞,其係含有如圖1所述之表現載體(表現野生型ω-TA蛋白質和具有進一步胺基酸修飾之ω-TA變體)、200mg磷酸吡哆醛、2ml聚丙二醇(P 2000)和138ml去離子水混合。將此混合物於35℃攪拌下(250rpm)加到玻璃反應器。
經由O2-氣體入口管,將氧氣以0,1l/min的流速通入反應混合物中。將混合物攪拌24h並經由於反應期間的不同時間間隔取等份藉由HPLC-分析來監測反應進度。之後,停止氧氣進料以及異丙基胺進料並於攪拌下(250rpm)以90℃讓反應混合物變性30min。將殘餘的混合物冷卻至室溫。
經由HPLC分析監測轉胺反應的過程。用於此操作的HPLC法係以Davankov等入的公開刊物(1980,Chromatographia 13(11),677-685)為基準。
特言之,係使用下列HPLC參數:
管柱:Phenomenex Chirex 3126(D)-青黴胺(penicillamine)150*4,6mm(型號:00F-3126-E0)
流速:1ml/min
溶離劑:A)去離子水+0,5g/L CuSO4(v/v)
B)甲醇
A:B=90:10(等位)
偵測器:DAD 230nm
烘箱:30℃
運作時間:15min
經由HPLC分析監測轉胺反應的過程。特言之,係使用下列HPLC參數:
管柱:Phenomenex Prodigy 3μm ODS-3 100A 100*4mm(型號:00D-4222-D0)
流速:2ml/min
溶離劑:A)乙腈
B)去離子水
從A:B之梯度=5:95至A:B=95:5於7min內
偵測器:VWD1 A,210nm
烘箱:40℃
運作時間:9min
以最高溫度輸入220℃於試驗室(實驗室規模)的噴霧乾燥機中進行噴霧乾燥實驗。乾燥機係以200-800l/h(公升/小時)於5-8bar下使用壓縮空氣或氮氣。最大氣流可達35m3/h(公尺3/小時)。
為了乾燥燒瓶生長培養物或發酵物(亦即1公升總體基)之細菌細胞團塊,將培養基液以離心濃縮10倍及於離心後所得到的培養物上清液中再懸浮至100ml的最終體積。所得到的濃縮物需適用於抽汲並應以磁力攪拌器混合均勻。將此液體使用500l/h氣流以設定至100%的吸氣機施用於0.7mm噴嘴。典型的產物流為10ml/min及施用的入口溫度平均為-145℃而出口為85℃。將完成的乾燥生物質稱重並以g/l規模用於生物轉化實驗。
如「通用方法」第3項所述,表現來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示的胺基酸序列之野生型ω-TA蛋白質,或來自巨桿菌具有SEQ ID NO 3所示的胺基酸序列,或具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列之ω-TA變體並純化。
於25μl溶於去離子水之三乙醇胺緩衝液中(200mM溶於去離子水之溶液,pH=9.0)於室溫加入10μl溶於去離子水之磷酸吡多醛(PLP)(10mM溶於去離子水之溶液)和10μl溶於去離子水之異丙基胺(2M溶於去離子水之溶液,藉由加入HCl水溶液調整至pH=9.0)。隨後,加入20μl的2-側氧戊酸(100mM溶於去離子水之溶液)。最後於室溫加入包括1.5mg/ml個別ω-TA蛋白質之35μl溶液並將混合物於40℃在800rpm旋轉震盪器上培養6h。如「通用方法」第8項所述,於反應期間在不同時間間隔取等份藉由HPLC-分析來監測轉胺反應。
表6係顯示具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體相較於來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列和來自巨桿
菌具有SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列的野生型蛋白質所得到的結果。結果亦顯示於圖2中。
從表6和圖2可以衍生出,在ω-TA變體所催化的反應中,從2-側氧基戊酸製造(S)-正纈胺酸比來自節桿菌屬和巨桿菌之野生型蛋白質所催化的反應進行更快。此外,在反應期間,相較於來自節桿菌屬和巨桿菌之野生型蛋白質所催化的反應,在ω-TA變體催化的反應中所產生的(S)-正纈胺酸明顯較早達到最大量。
如「通用方法」第3項所述,表現來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 3胺基酸序列或來自巨桿菌具有SEQ ID NO 6胺基酸序列之野生型ω-TA蛋白質,或具有SEQ ID NO 18胺基酸序列之ω-TA變體並純化。
於40μl三乙醇胺緩衝液中(200mM溶於去離子水之溶液,pH=9.0)於室溫加入10μl磷酸吡多醛(PLP)(10mM溶於去離子水之溶液)和10μl異丙基胺(2M溶於去離子水之溶液,藉由加入HCl水溶液調整至
pH=9.0)。隨後,加入20μl的4-甲基-2-側氧基戊酸(100mM溶於去離子水之溶液)。最後於室溫加入包括1.5mg/ml個別ω-TA蛋白質之20μl溶液並將混合物於40℃在800rpm旋轉震盪器上培養6h。如「通用方法」第8項所述,於反應期間在不同時間間隔取等份藉由HPLC-分析來監測轉胺反應。
表6係顯示具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體相較於來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列和來自巨桿菌具有SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列的野生型蛋白質所得到的結果。結果亦顯示於圖3中。
從表7和圖3可以衍生出,來自節桿菌屬和巨桿菌之野生型酵素並未藉由4-甲基-2-側氧基戊酸之胺化作用產生(S)-白胺酸,而ω-TA變體則相當高效率地產生(S)-白胺酸。
如「通用方法」第3項所述,表現來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 3胺基酸序列或來自巨桿菌具有SEQ ID NO 6胺基酸序列之野生型ω-TA蛋白質,或具有SEQ ID NO 18胺基酸序列之ω-TA變體並純化。
於40μl三乙醇胺緩衝液中(200mM溶於去離子水之溶液,pH=9.0)於室溫加入10μl磷酸吡多醛(PLP)(10mM溶於去離子水之溶液)和10μl異丙基胺(2M溶於去離子水之溶液,藉由加入HCl水溶液調整至pH=9.0)。隨後,加入20μl溶於比率1:1之DMSO/去離子水的苯丙酮酸(100mM苯丙酮酸溶液)。最後於室溫加入包括1.5mg/ml個別ω-TA蛋白質之20μl溶液並將混合物於40℃在800rpm旋轉震盪器上培養6h。如「通用方法」第8項所述,於反應期間在不同時間間隔取等份藉由HPLC-分析來監測轉胺反應。
表8係顯示具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體相較於來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列和來自巨桿菌具有SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列的野生型蛋白質所得到的結果。結果亦顯示於圖4中。
從表8和圖4可以衍生出,相較於ω-TA變體所產生的(S)-苯丙胺酸之量,來自節桿菌屬之野生型酵素並未從苯丙酮酸產生(S)-苯丙胺酸,來自巨桿菌之野生型酵素則非常緩慢地產生低量的(S)-苯丙胺酸。
如「通用方法」第3項所述,表現來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 3胺基酸序列或來自巨桿菌具有SEQ ID NO 6胺基酸序列之野生型ω-TA蛋白質,或具有SEQ ID NO 18胺基酸序列之ω-TA變體並純化。
於40μl三乙醇胺緩衝液中(200mM溶於去離子水之溶液,pH=9.0)於室溫加入10μl磷酸吡多醛(PLP)(10mM溶於去離子水之溶液)和10μl異丙基胺(2M溶於去離子水之溶液,藉由加入HCl水溶液調整至pH=9.0)。隨後,加入20μl溶於比率1:1之DMSO/去離子水的對羥基苯丙酮酸(100mM對-羥基苯丙酮酸溶液)。最後於室溫加入包括1.5mg/ml個別ω-TA蛋白質之20μl溶液並將混合物於40℃在800rpm旋轉震盪器上培養6h。如「通用方法」第8項所述,於反應期間在不同時間間隔取等份藉由HPLC-分析來監測轉胺反應。
表9係顯示具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體相較於來自節桿菌屬具有SEQ ID NO 6所示之胺基酸序列和來自巨桿菌具有SEQ ID NO 3所示之胺基酸序列的野生型蛋白質所得到的結果。結果亦顯示於圖5中。
從表9和圖5可以衍生出,來自節桿菌屬和巨桿菌之野生型酵素並未藉由對-羥基苯丙酮酸之胺化作用產生(S)-酪胺酸,而ω-TA變體則非常高效率地產生(S)-酪胺酸。
如「通用方法」第6項所述,將具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列之ω-TA變體和如文中表2所述包括進一步胺基酸修飾的ω-TA變體與具有DAAO活性的蛋白質和具有催化酶活性的蛋白質共同表現(參見「通用方法」第5項),接著如「通用方法」第9項所述,噴霧乾燥。DAAO藉由(R)-固殺草之去胺作用產生4-[羥基(甲基)磷氧基]-2-側氧基丁酸。隨後藉由具有進一步胺基酸修飾的ω-TA變體,使用4-[羥基(甲基)磷氧基]-2-側氧基丁酸作為胺基受體並以胺化反應轉變成(S)-固殺草。根據「通用方法」第7項所述試驗,進行具有SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列的ω-TA變體和如文中表2所述包括進一步胺基酸修飾的ω-TA變體之活性檢測。反應開始5h之後,如「通用方法」第8項所述,藉由HPLC-分析,測定各反應中所產生的(S)-固殺草之量來監測轉胺反應。
表10係顯示各個包括進一步胺基酸修飾的ω-TA變體所產生的(S)-固殺草(S-GA)之量和具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列之ω-TA變體所產生的量。
就鑑別胺基酸改變,第1欄的數字係鑑別於SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列中胺基酸的位置。出現在數字前面的字母係鑑別於SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列中出現在個別位置的胺基酸。出現在數字後面的字母係鑑別在包括進一步胺基酸修飾的ω-TA變體之胺基酸序列中出現在個別位置的胺基酸。在欄中同一列所給予的二組數字,各自帶有出現在數字之前和之後的字母,係鑑別相較於SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列,二個同時存在的胺基酸取代(置換)。
從表10可以衍生出,相較於具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列之ω-TA變體,包括進一步胺基酸修飾的ω-TA變體產生更多的(S)-固殺草。
<110> 德商拜耳廠股份有限公司(Bayer AG)
<120> 編碼改良之轉胺酶蛋白質之核酸
<130> BCS181013FC
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<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由於基因碼簡併藉由回轉譯蛋白質序列所製造
<220>
<221> 各種特徵
<222> (1)..(1449)
<223> 根據IUPAC編碼使用核苷酸縮寫從SEQ ID NO 3所示的蛋白質序列回轉譯
<400> 1
<210> 2
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由回轉譯蛋白質序列所製造
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1452)
<223> 從衍生自NCBI登錄號5G09之SEQ ID NO 3所示的蛋白質序列回轉譯
<400> 2
<210> 3
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的建構體
<400> 3
<210> 4
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由於基因碼簡併藉由回轉譯蛋白質序列所製造
<220>
<221> 各種特徵
<222> (1)..(1455)
<223> 根據IUPAC編碼使用核苷酸縮寫從SEQ ID NO 6所示的蛋白質序列回轉譯
<400> 4
<210> 5
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由回轉譯蛋白質序列所製造
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1458)
<223> 從衍生自NCBI登錄號5G2P之SEQ ID NO 6所示的蛋白質序列回轉譯所製造
<400> 5
<210> 6
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的建構體
<400> 6
<210> 7
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由於基因碼簡併藉由回轉譯蛋白質序列所製造
<220>
<221> 各種特徵
<222> (1)..(1428)
<223> 根據IUPAC編碼使用核苷酸縮寫從SEQ ID NO 9所示的蛋白質序列回轉譯
<400> 7
<210> 8
<211> 1431
<212> DNA
<213> 芽孢桿菌(Bacillus spec.)Soil768D1
<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> 芽孢桿菌(Bacillus spec.)Soil768D1
<220>
<223> 藉由回轉譯蛋白質序列所製造
<400> 9
<210> 10
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 由於基因碼簡併藉由回轉譯蛋白質序列所製造
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<221> 各種特徵
<222> (1)..(1428)
<223> 根據IUPAC編碼使用核苷酸縮寫從SEQ ID NO 12所示的蛋白質序列回轉譯
<400> 10
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<212> DNA
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<223> 突變的野生型序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 由於基因碼簡併藉由回轉譯蛋白質序列所製造
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<221> 各種特徵
<222> (1)..(1428)
<223> 根據IUPAC編碼使用核苷酸縮寫從SEQ ID NO 15所示的蛋白質序列回轉譯
<400> 13
<210> 14
<211> 1431
<212> DNA
<213> 節桿菌(Arthrobacter spec.)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1431)
<300>
<302> 熱安定性ω-轉胺酶
<308> NRN_EA065097
<309> 2006-10-12
<310> WO 2006/063336 A2
<311> 2005-12-12
<312> 2006-06-12
<313> (1)..(1431)
<400> 14
<210> 15
<211> 476
<212> PRT
<213> 節桿菌(Arthrobacter spec.)
<400> 15
<210> 16
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由於基因碼簡併藉由回轉譯蛋白質序列所製造
<220>
<221> 各種特徵
<222> (1)..(1446)
<223> 根據IUPAC編碼使用核苷酸縮寫從SEQ ID NO 18所示的蛋白質序列回轉譯
<400> 16
<210> 17
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變的野生型序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1449)
<400> 17
<210> 18
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的建構體
<400> 18
<210> 19
<211> 1107
<212> DNA
<213> 圓紅酵母(Rhodosporidium toruloides)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1107)
<300>
<308> GenBank/U60066.1
<309> 2001-10-16
<313> (1)..(1107)
<400> 19
<210> 20
<211> 368
<212> PRT
<213> 圓紅酵母(Rhodosporidium toruloides)
<400> 20
<210> 21
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自圓紅酵母(Rhodosporidium toruloides)之DAO1,
其係在位置160-162的核苷酸所鑑別的密碼子和
位置172-174的核苷酸所鑑別的密碼子及
位置637639的核苷酸所鑑別的密碼子中包括突變
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1107)
<220>
<221> 各種特徵
<222> (639)..(639)
<223> n為a、c、g或t
<400> 21
<210> 22
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的建構體
<400> 22
<210> 23
<211> 1467
<212> DNA
<213> 斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1467)
<300>
<308> GenBank/NC_013891.1
<309> 2017-02-26
<313> (2760202)..(2761668)
<400> 23
<210> 24
<211> 488
<212> PRT
<213> 斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)
<400> 24
<210> 25
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼具有催化酶活性之蛋白質的密碼子改變序列
<400> 25
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)
<400> 26
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括來自大腸桿菌trp-啟動子和大腸桿菌lacUV5啟動子之合成的啟動子
<400> 27
<210> 28
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rho-獨立的終止子
<400> 28
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小-順反子
<400> 29
<210> 30
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉錄終止子訊號
<400> 30
Claims (13)
- 一種具有ω-轉胺酶(ω-TA)活性之蛋白質,其中該蛋白質係選自由下列組成之群組:a)包括如SEQ ID NO 3所示從位置1至477之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;b)包括如SEQ ID NO 6所示從位置1至479之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為T,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;c)包括如SEQ ID NO 9所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸不為E,在位置187的胺基酸不為S,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391 的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;d)包括如SEQ ID NO 12所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸和在位置187的胺基酸不為S,不為E,在位置197的胺基酸不為T,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;e)包括如SEQ ID NO 15所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,在位置25的胺基酸不為F,在位置64的胺基酸不為L,在位置88的胺基酸不為T,在位置157的胺基酸不為T,在位置165的胺基酸不為R,在位置169的胺基酸不為V,在位置174的胺基酸和在位置187的胺基酸不為S,不為E,在位置197的胺基酸不為M,在位置239的胺基酸不為S,在位置327的胺基酸不為S,在位置328的胺基酸不為V,在位置384的胺基酸不為Y,在位置389的胺基酸不為I,在位置391的胺基酸不為D,在位置396的胺基酸不為K,在位置410的胺基酸不為H,在位置414的胺基酸不為P;f)與a)、b)、c)、d)、e)或f)所示的任何胺基酸序列具有至少60%,較佳地70%,更佳地80%,又更佳地90%,甚佳地95%,又甚佳地96%,特佳地97%,最佳地98%或特佳地99%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過在各情況下對應位置25的胺基酸不為F,對應位置64的胺基酸不為L,對應位置88的胺基酸不為T,對應位置157的胺基酸不為T,對應位置165的胺基酸不為R,對應位置169的胺基酸不為V,對應位置174的胺基酸不為E,對應位置187的胺基酸不為S,對應位置197的胺基酸不為T或M,對應位置239的胺基酸不為S,對應位置327的胺基酸不為S,對應位置328的胺基酸不為V,對應位置384的胺基酸不為Y, 對應位置389的胺基酸不為I,對應位置391的胺基酸不為D,對應位置396的胺基酸不為K,對應位置410的胺基酸不為H,對應位置414的胺基酸不為P。
- 根據請求項1之蛋白質,其係選自由下列組成之群組:a)包括如請求項1段落a)所定義之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,另外在位置2的胺基酸不為S,在位置48的胺基酸不為D,在位置164的胺基酸不為Y,在位置202的胺基酸不為D,在位置205的胺基酸不為L,在位置242的胺基酸不為A,在位置245的胺基酸不為A,在位置311的胺基酸不為L,在位置353的胺基酸不為F,在位置359的胺基酸不為D,在位置424的胺基酸不為K,在位置475的胺基酸不為A,在位置476的胺基酸不為L,而在位置477的胺基酸係經刪除;b)包括如請求項1段落b)所定義之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,另外在位置46的胺基酸不為T,位置60的胺基酸不為C,在位置185的胺基酸不為C,在位置186的胺基酸不為S,在位置195的胺基酸不為S,在位置205的胺基酸不為Y,在位置252的胺基酸不為V,在位置268的胺基酸不為S,在位置409的胺基酸不為R,在位置436的胺基酸不為A,在位置477、478和479的胺基酸係經刪除;c)包括如請求項1段落c)所定義之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,另外在位置2的胺基酸不為S,在位置48的胺基酸不為D,在位置69的胺基酸不為P,在位置90的胺基酸不為S,在位置164的胺基酸不為Y,在位置242的胺基酸不為A,在位置245的胺基酸不為A,在位置268的胺基酸不為T,在位置311的胺基酸不為L,在位置318的胺基酸不為E,在位置322的胺基酸不為R,在位置353的胺基酸不為S,在位置424的胺基酸不為K,在位置452的胺基酸不為E;d)包括如請求項1段落d)所定義之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,另外在位置46的胺基酸不為T,在位置60的胺基酸不為C,在位置185的胺基酸不為C,在位置186的胺基酸不為C,在位置195的胺基酸不為S,在位置205的胺基酸不為Y,在位置252的胺基酸不為V,在位置 268的胺基酸不為S,在位置409的胺基酸不為R,在位置436的胺基酸不為A;e)包括如請求項1段落d)所定義之胺基酸序列的蛋白質,除此之外,另外在位置48的胺基酸不為D,在位置164的胺基酸不為Y,在位置242的胺基酸不為A,在位置245的胺基酸不為A,在位置255的胺基酸不為F,在位置424的胺基酸不為K;f)具有與a)、b)、c)、d)或e)中所定義的任何胺基酸序列有至少60%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過如a)、b)、c)、d)或e)所定義的各胺基酸位置,分別亦存在與a)、b)、c)、d)或e)中所定義的任何胺基酸序列為至少60%相同之蛋白質序列的胺基酸序列中對應的胺基酸位置。
- 根據請求項1或2中任一項之蛋白質,其係選自由下列組成之群組:a)包括如SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質;b)具有與如SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列有至少60%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過在SEQ ID NO 18中對應位置25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410和414的胺基酸係代表該等在SEQ ID NO 18下所示的胺基酸序列中於個別位置所顯示的胺基酸;c)具有與如SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列有至少60%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過在SEQ ID NO 18中對應位置2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475、476和477的胺基酸係代表該等在SEQ ID NO 18下所示的胺基酸中於個別位置所顯示的胺基酸。
- 根據請求項1至3中任一項之蛋白質,其係選自由下列組成之群組:a)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置166的胺基酸為G及位置327的胺基酸為Q;b)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置327的胺基酸為Q及位置384的胺基酸為S;c)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置326的胺基酸為Q及位置327的胺基酸為Q;d)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置327的胺基酸為Q;e)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置326的胺基酸為F及位置327的胺基酸為Q;f)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置327的胺基酸為C;g)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置327的胺基酸為I;h)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置327的胺基酸為M;i)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置164的胺基酸為Y;j)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置164的胺基酸為S;k)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置327的胺基酸為V;l)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置409的胺基酸為R;m)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置327的胺基酸為S;n)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置271的胺基酸為I;o)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置329的胺基酸為G;p)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置409的胺基酸為P;q)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置414的胺基酸為M;r)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置165的胺基酸為K;s)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置414的胺基酸為R;t)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置414的胺基酸為H;u)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置165的胺基酸為C;v)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置327的胺基酸為V;w)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置164的胺基酸為C;x)根據請求項1至3中任一項之蛋白質,不過位置409的胺基酸為K。
- 根據請求項4之蛋白質,其係選自由下列組成之群組:a)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置166的胺基酸S係經G取代 及在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代;b)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代及在SEQ ID NO 18中位置384的胺基酸C係經S取代;c)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置326的胺基酸E係經Q取代及在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代;d)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代;e)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置326的胺基酸E係經F取代及在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經Q取代;f)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經C取代;g)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經I取代;h)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經M取代;i)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置164的胺基酸F係經Y取代;j)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置164的胺基酸F係經S取代;k)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經V取代;l)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置409的胺基酸T係經R取代;m)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經S取代;n)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置271的胺基酸V係經I取代;o)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置329的胺基酸S係經G取代;p)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置409的胺基酸T係經P取代;q)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置414的胺基酸L係經M取代;r)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置165的胺基酸Q係經K取代;s)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置414的胺基酸L係經R取代;t)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置414的胺基酸L係經H取代;u)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置165的胺基酸Q係經C取代;v)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置327的胺基酸T係經V取代;w)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置164的胺基酸F係經C取代;x)具有SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質,除此之外在SEQ ID NO 18中位置409的胺基酸T係經K取代;y)具有與a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定義的任何胺基酸序列有至少60%相同性之胺基酸序列的蛋白質,不過如a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義的各胺基酸位置分別亦存在與各a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義之任何 胺基酸序列具有至少60%相同性之蛋白質序列的胺基酸序列中的對應胺基酸位置。
- 一種核酸分子,其係編碼根據請求項1至5中任一項之蛋白質。
- 根據請求項6之編碼具有ω-TA活性之蛋白質的核酸分子,其係選自由下列組成之群組:a)包括SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子;b)編碼包括SEQ ID NO 18所示之胺基酸序列中從位置1至476之胺基酸序列的蛋白質之核酸分子;c)具有與SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列有至少60%相同性的核酸分子,不過對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置589至591之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152之密碼子係具有tgy核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188之密碼 子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242之密碼子係具有ytn核苷酸序列;d)具有與SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列有至少60%相同性的核酸分子,不過對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置4至6之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 7中核苷酸位置73至75之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置136至138之密碼子係具有atg核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置142至144之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置178至180之密碼子係具tay有核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置205至207之密碼子係具有car核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置268至270之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492之密碼子係具有tty核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495之密碼子係具有car核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置553至555之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置556至558之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置583至585之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置589至591之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置604至606之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置613至615之密碼子係具有tgy核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17 中核苷酸位置724至726之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置733至735之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置754至756之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置763至765之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置802至804之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置931至933之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置952至954之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置964至966之密碼子係具有aar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1057至1059之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1075至1077之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1270至1272之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1306至1308之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1354至1356之密碼子係具有ggn核苷酸序列;e)與a)、b)、c)或d)所定義的核酸分子之互補股雜交之核酸分子,不過對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264之密碼子係具 有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152之密碼子係具有tgy核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242之密碼子係具有ytn核苷酸序列;f)與a)、b)、c)或d)所定義的核酸分子之互補股雜交之核酸分子,不過對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置4至6之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置136至138之密碼子係具有atg核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置142至144之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置178至180之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置205至207之密碼子係具有car核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置268至270之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492之密碼子係具有tty核苷酸序列, 對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495之密碼子係具有car核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置553至555之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置556至558之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置583至585之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置589至591之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置604至606之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置613至615之密碼子係具有tgy核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717之密碼子係具有ccn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置724至726之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置733至735之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置754至756之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置763至765之密碼子係具有ath核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置802至804之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置931至933之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置952至954之密碼子係具有gcn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置964至966之密碼子係具有aar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984之密碼子係具有ggn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1057至1059之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1075至1077之密碼子係具有aay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152之密碼子係具有tay核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227之密碼子係具有acn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230之密碼子係具有mgn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242之密碼子係具有ytn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1270至1272之密碼子係具有gar核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1306至1308之密碼子係具有gtn核苷酸序列,對應SEQ ID NO 17中核苷酸位置1354至1356之密碼子係具有ggn核苷酸序列;g)由於基因碼簡併從a)、b)、c)、d)、c)或f)所定義的核酸分子衍生的核酸分子;h)編碼與SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列具有至少60%相同性的蛋白質之核酸分子,不過對應SEQ ID NO 18之位置25、64、88、157、165、169、174、187、239、327、328、384、389、391、396、410和414的胺基酸係代表該等在SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列中個別位置所顯示的胺基酸;i)編碼與SEQ ID NO 18所示從位置1至476之胺基酸序列具有至少60%相同性之蛋白質的核酸序列,不過對應SEQ ID NO 18之位置2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475和476的胺基酸係代表該等在SEQ ID NO 18所示的胺基酸序列中個別位置所顯示的胺基酸;j)包括如SEQ ID NO 16所示的核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子。
- 根據請求項6或7中任一項之編碼具有ω-TA活性之蛋白質的核酸分子,其係選自由下列組成之群組:a)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置496至498的密碼子係具有ggn核苷酸序列,及在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;b)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列,及在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密碼子係具有wsn核苷酸序列;c)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置976至978的密碼子係具有car核苷酸序列,及在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;d)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;e)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置976至978的密碼子係具有tty核苷酸序列,及在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;f)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有car核苷酸序列;g)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有ath核苷酸序列;h)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有atg核苷酸序列;i)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密碼子係具有tay核苷酸序列;j)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密碼子係具有wsn核苷酸序列;k)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有gtn核苷酸序列;l)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密碼子係具有mgn核苷酸序列;m)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有wsn核苷酸序列;n)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置811至813的密碼子係具有ath核苷酸序列;o)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置985至987的密碼子係具有ggn核苷酸序列;p)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密碼子係具有ccn核苷酸序列;q)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密碼子係具有atg核苷酸序列;r)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密碼子係具有aar核苷酸序列;s)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密碼子係具有mgn核苷酸序列;t)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密碼子係具有cay核苷酸序列;u)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密碼子係具有tgy核苷酸序列;v)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密碼子係具有gtn核苷酸序列;w)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密碼子係具有tgy核苷酸序列;x)包括如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示之核酸序列中從位置1至1428之核酸序列的核酸分子,除此之外,在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密碼子係具有aar核苷酸序列;y)具有與a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義的任何核酸序列有至少60%相同性之核酸序列的核酸分子,不過各a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義的密碼子核苷酸序列分別亦存在與各a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定義的任何核酸序列具有至少60%相同性之核酸序列中對應的密碼子核苷酸位置。
- 一種重組的核酸分子,其係包括根據請求項6至8中任一項之核酸分子。
- 根據請求項9之重組的核酸分子,其中該重組的核酸分子為載體或質體。
- 一種宿主細胞,其係包括根據請求項1至5中任一項之蛋白質,或包括根據請求項6至8中任一項之核酸分子,或包括根據請求項9或10中任一項之重組的核酸分子。
- 一種製造胺的方法,其係包括下列步驟:a)提供胺受體分子;b)提供胺供體分子;c)將步驟a)中所提供的胺受體和步驟b)中所提供的胺供體與根據請求項1至5中任一項之蛋白質接觸。
- 一種於包括(R)-和(S)-胺鏡像異構物之組成物中降低胺鏡像異構物之量的方法,其係包括下列步驟:a)提供包括(R)-和(S)-胺鏡像異構物之組成物b)提供胺受體分子;a)將步驟a)所提供的組成物和步驟b)所提供的胺受體與根據請求項1至5中任一項之蛋白質接觸。
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