TW202413319A - 以動態動力學立體異構體分解製備(1r,2s)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法 - Google Patents
以動態動力學立體異構體分解製備(1r,2s)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202413319A TW202413319A TW112129496A TW112129496A TW202413319A TW 202413319 A TW202413319 A TW 202413319A TW 112129496 A TW112129496 A TW 112129496A TW 112129496 A TW112129496 A TW 112129496A TW 202413319 A TW202413319 A TW 202413319A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- amino acid
- different
- lipase variants
- nuc
- prt
- Prior art date
Links
- NMRCYNVWDPJOAC-GZMMTYOYSA-N (1r,2s)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1h-inden-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2[C@H](N)[C@@H](C)CC2=C1 NMRCYNVWDPJOAC-GZMMTYOYSA-N 0.000 title abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title abstract 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 title abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 122
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 120
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000010933 acylation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims description 189
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 141
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 88
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 51
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 50
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 claims description 45
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 17
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 10
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 9
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 3
- AUHZEENZYGFFBQ-UHFFFAOYSA-N mesitylene Substances CC1=CC(C)=CC(C)=C1 AUHZEENZYGFFBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001827 mesitylenyl group Chemical group [H]C1=C(C(*)=C(C([H])=C1C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 3
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 52
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 abstract description 426
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 abstract description 425
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 abstract description 424
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 abstract description 424
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- NMRCYNVWDPJOAC-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1h-inden-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N)C(C)CC2=C1 NMRCYNVWDPJOAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1330
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1246
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1218
- 102220601082 Cytochrome c oxidase subunit 5B, mitochondrial_L280A_mutation Human genes 0.000 description 140
- 102220213236 rs1060501337 Human genes 0.000 description 122
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 104
- 102200107884 rs74315436 Human genes 0.000 description 100
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 96
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 86
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 86
- 102220558072 Olfactory receptor 2A1/2A42_Q111E_mutation Human genes 0.000 description 80
- 102220487557 Phospholipase A and acyltransferase 1_K40M_mutation Human genes 0.000 description 74
- 102220645922 Cell surface A33 antigen_N29H_mutation Human genes 0.000 description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- 102200024044 rs1555523872 Human genes 0.000 description 44
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 22
- 102220556912 ATPase WRNIP1_V18A_mutation Human genes 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 102220573538 Tyrosine-protein kinase Fer_M3Q_mutation Human genes 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- -1 [(1R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]carbamic acid methyl ester Chemical compound 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 102220097508 rs876658707 Human genes 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 102200067482 rs34817956 Human genes 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- OIFBSDVPJOWBCH-UHFFFAOYSA-N Diethyl carbonate Chemical compound CCOC(=O)OCC OIFBSDVPJOWBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DYLIWHYUXAJDOJ-OWOJBTEDSA-N (e)-4-(6-aminopurin-9-yl)but-2-en-1-ol Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2C\C=C\CO DYLIWHYUXAJDOJ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- ARXJGSRGQADJSQ-UHFFFAOYSA-N 1-methoxypropan-2-ol Chemical compound COCC(C)O ARXJGSRGQADJSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclohexen-1-yl)cyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1C1=CCCCC1 GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 102220554117 Cyclic GMP-AMP synthase_L17T_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 2
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 2
- 102220471967 Single-stranded DNA cytosine deaminase_V18S_mutation Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N chlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1 MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AZVCGYPLLBEUNV-UHFFFAOYSA-N lithium;ethanolate Chemical compound [Li+].CC[O-] AZVCGYPLLBEUNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RPDAUEIUDPHABB-UHFFFAOYSA-N potassium ethoxide Chemical compound [K+].CC[O-] RPDAUEIUDPHABB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N sodium ethoxide Chemical compound [Na+].CC[O-] QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODZAJPZIKWGMCJ-KWQFWETISA-N (1S,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-ol Chemical compound C[C@H]1Cc2ccc(C)cc2[C@H]1O ODZAJPZIKWGMCJ-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- NZNTWOVDIXCHHS-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-aminocyclohexyl)amino]-4-(3-methylanilino)pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound CC1=CC=CC(NC=2C(=CN=C(NC3C(CCCC3)N)N=2)C(N)=O)=C1 NZNTWOVDIXCHHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXRCBURMZUPAJF-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(1-hydroxy-2,3,4,5-tetraphenylcyclopenta-2,4-dien-1-yl)phenyl]-3,4,5-triphenylcyclopenta-2,4-dien-1-one Chemical compound OC1(C(=C(C(=C1C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)C1=C(C=CC=C1)C=1C(C(=C(C=1C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)=O XXRCBURMZUPAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 2-azanyl-3-sulfanyl-propanoic acid Chemical compound SCC(N)C(O)=O.SCC(N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222518 Agaricus Species 0.000 description 1
- 244000251953 Agaricus brunnescens Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 241000588881 Chromobacterium Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102100031375 Endothelial lipase Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 description 1
- 241000146406 Fusarium heterosporum Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- QRMHDGWGLNLHMN-UHFFFAOYSA-N Methyl methoxyacetate Chemical compound COCC(=O)OC QRMHDGWGLNLHMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010084311 Novozyme 435 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 101001064468 Pseudozyma aphidis (strain ATCC 32657 / CBS 517.83 / DSM 70725 / JCM 10318 / NBRC 10182 / NRRL Y-7954 / St-0401) Lipase A Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 1
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- VMWZRHGIAVCFNS-UHFFFAOYSA-J aluminum;lithium;tetrahydroxide Chemical compound [Li+].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] VMWZRHGIAVCFNS-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010005400 cutinase Proteins 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- IEJIGPNLZYLLBP-UHFFFAOYSA-N dimethyl carbonate Chemical compound COC(=O)OC IEJIGPNLZYLLBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- YFONKFDEZLYQDH-BOURZNODSA-N indaziflam Chemical compound CC(F)C1=NC(N)=NC(N[C@H]2C3=CC(C)=CC=C3C[C@@H]2C)=N1 YFONKFDEZLYQDH-BOURZNODSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L lithium carbonate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C([O-])=O XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052808 lithium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- JILPJDVXYVTZDQ-UHFFFAOYSA-N lithium methoxide Chemical compound [Li+].[O-]C JILPJDVXYVTZDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 238000002888 pairwise sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000012495 positive regulation of renal sodium excretion Effects 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- BDAWXSQJJCIFIK-UHFFFAOYSA-N potassium methoxide Chemical compound [K+].[O-]C BDAWXSQJJCIFIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011997 shvo catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001300301 uncultured bacterium Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000013022 venting Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Abstract
本發明描述一種用於製備實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法,其特徵在於使2,6-二甲基-1-胺基茚烷之四種立體異構體之混合物與醯化劑或羧化劑在具有脂肪酶活性之蛋白質之存在下反應及在動態動力學立體異構體分解下進行。
Description
本發明係關於一種用於製備實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法,(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷係用於合成除草活性成分茚嗪氟草胺(indaziflam)之有價值之建構組元。具體言之,本發明係關於一種用於藉由外消旋2,6-二甲基-1-胺基茚烷之酶催化之立體選擇性醯化製備實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法。
根據先前技術,迄今為止已知用於製備實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之唯一方法係彼等由於使用昂貴之反應組分及觸媒而僅適用於實驗室規模,但不適用於工業用途之方法。例如,WO 2004/69814 A1揭示一種特徵在於下列五個反應步驟之方法:
1. 藉由相應肟之鈀催化還原製備2,6-二甲基-1-胺基茚烷之四種立體異構體之混合物。
2. 將該等四種立體異構體管柱層析術分離成順式及反式異構體。
3. 反式異構體與2-甲氧基乙酸甲酯在酶Novozym 435®之存在下反應以形成相應之乙醯化(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷。
4. 分離該乙醯化(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷。
5. 酸性水解該乙醯化(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷以形成游離之(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷。
Tetrahedron 2007, 63 (29), 6755-6763描述一種用於製備(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法,其特徵在於下列兩個反應步驟:
1. 藉助於對掌性釕觸媒非鏡像異構體選擇性(96:4 d.r.)及對映體選擇性(98:2 e.r.)還原外消旋1,6-二甲基茚-1-酮以形成產率為80%之相應(1S,2S)-2,6-二甲基茚-1-醇。
2. 因此獲得之(1S,2S)-2,6-二甲基茚-1-醇與二苯基磷醯基疊氮化物反應及隨後用氫化鋰鋁還原產生產率為76%之(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷。
認為此方法之缺點不僅在於使用昂貴之試劑,且亦在於總計八天之長反應時間。
本發明之目的係提供一種用於製備實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法,其克服自先前技術已知的缺點。
吾人發現一種用於製備實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法,其特徵在於:
a) 使2,6-二甲基-1-胺基茚烷之四種立體異構體之混合物與醯化劑或羧化劑在具有脂肪酶活性之蛋白質之存在下選擇性反應,及
b) 將2,6-二甲基-1-吲達胺之三種非所需之立體異構體之混合物連續金屬催化異構化為2,6-二甲基-1-吲達胺之四種立體異構體。
本發明提供一種用於製備實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法,其特徵在於:
1. 於第一步驟中,使2,6-二甲基-1-胺基茚烷(I)之四種立體異構體之混合物與醯化劑或羧化劑R-C(=O)R
1a) 在具有脂肪酶活性之蛋白質之存在下選擇性反應以形成相應之醯胺或胺甲酸酯(II)及2,6-二甲基-1-胺基茚烷之未反應立體異構體之混合物(III),及
b) 該混合物(III)係在金屬觸媒之存在下及在氫壓下異構化,同時生物催化轉化以形成2,6-二甲基-1-吲達胺(I)之四種立體異構體之起始材料:
,
其中該蛋白質係由選自由以下組成之群之胺基酸序列編碼:
I.與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之蛋白質,
II.與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之蛋白質,除與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列具有選自由以下組成之群之修飾的事實外:
i. 於位置186處之胺基酸不同於L;
ii. 於位置280處之胺基酸不同於L;
iii. 於位置312處之胺基酸不同於P;
iv. 於位置3處之胺基酸不同於M;
v. 於位置29處之胺基酸不同於N;
vi. 於位置17處之胺基酸不同於L;
vii. 於位置4處之胺基酸不同於S;
viii. 於位置18處之胺基酸不同於V;
ix. 於位置202處之胺基酸不同於A;
x. 於位置301處之胺基酸不同於D;
xi. 於位置309處之胺基酸不同於P;
xii. 於位置31處之胺基酸不同於Q;
xiii. 於位置111處之胺基酸不同於Q;
xiv. 於位置85處之胺基酸不同於W;
xv. 於位置8處之胺基酸不同於K;
xvi. 於位置79處之胺基酸不同於E;
xvii. 於位置40處之胺基酸不同於K;
2. 於第二步驟中,藉由結晶自次要組分分離該醯胺或胺甲酸酯(II),及
3. 於第三步驟中,使用鹼或酸將該醯胺或胺甲酸酯(II)轉化為該實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷(IV),
其中R意謂選自由以下組成之群之基團:CH
2OCH
3、CH
2OCH
2CH
3、CH
3、OCH
3、OCH
2CH
3、OCH(CH
3)
2、OCH
2CH
2CH
2CH
3、OCH
2CHCH
2及OCH
2(C
6H
5),
及
其中R
1意謂選自由以下組成之群之基團:OCH
3、OCH
2CH
3、OCH(CH
3)
2、OCH
2CH
2CH
2CH
3、OCH
2CHCH
2及OCH
2(C
6H
5)。
需作為用於根據本發明之方法之起始材料之2,6-二甲基-1-胺基茚烷(I)之四種立體異構體的混合物係已知的且可(例如)如WO2004/69814中描述製備。
較佳地,R意謂選自由以下組成之群之基團:OCH
3及OCH
2CH
3,
及
R
1意謂選自由以下組成之群之基團:OCH
3及OCH
2CH
3。
在根據本發明之方法中,使用具有解脂酶或脂肪酶活性之蛋白質。
SEQ ID No. 1係解脂野生型蛋白之胺基酸序列。野生型脂肪酶係來源於來自環境樣本之非培養細菌,其可來源於GenPept (PDB),登錄號為QRD81023 (版本ORD81023.1)。在SEQ ID No. 1中顯示之胺基酸序列與上文資料庫條目中顯示之序列之間存在疑問之情況下,SEQ ID No. 1具有優先權。
本發明進一步描述具有解脂酶或脂肪酶活性之蛋白質,其中此等蛋白質之胺基酸序列係具有解脂酶或脂肪酶活性之已知蛋白質之變體。特定言之,本文描述之具有脂肪酶活性之蛋白質之胺基酸序列係由SEQ ID No. 1中顯示之胺基酸描述之胺基酸序列之變體,其中,在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列中,至少於位置186處之胺基酸、於位置280處之胺基酸、於位置312處之胺基酸、於位置3處之胺基酸、於位置29處之胺基酸、於位置17處之胺基酸、於位置4處之胺基酸、於位置18處之胺基酸、於位置202處之胺基酸、於位置301處之胺基酸、於位置309處之胺基酸、於位置31處之胺基酸、於位置111處之胺基酸、於位置85處之胺基酸、於位置8處之胺基酸、於位置79處之胺基酸或於位置40處之胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處存在之胺基酸。
如本文使用,術語「變體」意謂一種與根據現有技術已知的實體不同之實體。關於核酸分子及蛋白質,應瞭解變體意謂偏離相應已知序列,但編碼具有相同功能或催化相同反應之蛋白質(例如編碼具有脂肪酶活性之蛋白質之功能)之核酸序列或胺基酸序列。核酸分子序列及胺基酸序列自已知核酸序列及蛋白質序列之「偏離」意謂相較於相應已知核酸序列或胺基酸序列,該等序列包含核苷酸或胺基酸之取代(置換)及/或缺失及/或插入。
通常使用具有脂肪酶活性之蛋白質,其中該等蛋白質係由與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列編碼。
同樣使用具有脂肪酶活性之蛋白質,其中該等蛋白質係由與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列編碼,除與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列具有選自由以下組成之群之修飾的事實外:
i. 於位置186處之胺基酸不同於L,較佳於位置186處之胺基酸係F、W、Y、E、D、Q、T、H、P、C、K、S、N、I或V,更佳於位置186處之胺基酸係F、W、Y、E、D或K,特別佳於位置186處之胺基酸係W或Y,最佳於位置186處之胺基酸係Y;
ii. 於位置280處之胺基酸不同於L,較佳於位置280處之胺基酸係E、S、K、D或A,更佳於位置280處之胺基酸係A;
iii. 於位置312處之胺基酸不同於P,較佳於位置312處之胺基酸係N、F、D、Q或K,更佳於位置312處之胺基酸係N;
iv. 於位置3處之胺基酸不同於M,較佳於位置3處之胺基酸係L、Q或C,更佳於位置3處之胺基酸係Q;
v. 於位置29處之胺基酸不同於N,較佳於位置29處之胺基酸係H、W或Y,更佳於位置29處之胺基酸係H或W,最佳於位置29處之胺基酸係H;
vi. 於位置17處之胺基酸不同於L,較佳於位置17處之胺基酸係P或T,更佳於位置17處之胺基酸係P;
vii. 於位置4處之胺基酸不同於S,較佳於位置4處之胺基酸係P或L,更佳於位置4處之胺基酸係P;
viii. 於位置18處之胺基酸不同於V,較佳於位置18處之胺基酸係A、T、C或S,更佳於位置18處之胺基酸係A或C;
ix. 於位置202處之胺基酸不同於A,較佳於位置202處之胺基酸係Q或N,更佳於位置202處之胺基酸係N;
x. 於位置301處之胺基酸不同於D,較佳於位置301處之胺基酸係A;
xi. 於位置309處之胺基酸不同於P,較佳於位置309處之胺基酸係C;
xii. 於位置31處之胺基酸不同於Q,較佳於位置31處之胺基酸係W;
xiii. 於位置111處之胺基酸不同於Q,較佳於位置111處之胺基酸係E;
xiv. 於位置85處之胺基酸不同於W,較佳於位置85處之胺基酸係H;
xv. 於位置8處之胺基酸不同於K,較佳於位置8處之胺基酸係E;
xvi. 於位置79處之胺基酸不同於K,較佳於位置79處之胺基酸係S、I或W,更佳於位置79處之胺基酸係S;
xvii. 於位置40處之胺基酸不同於K,較佳於位置40處之胺基酸係M。
胺基酸縮寫A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T V、W、Y之含義可於下表2中標題為「序列描述」之部分中找到。
根據本發明之另一實施例涉及具有脂肪酶活性之蛋白質,其中該等蛋白質係選自由以下組成之群:
a) 包含SEQ ID No. 1中顯示之胺基酸序列之蛋白質,除於位置186處之胺基酸不同於L的事實外;
b) 具有與在a)顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列之蛋白質,限制條件為於位置186處之胺基酸不同於L。
較佳地,根據a)或b)之蛋白質中於位置186處之胺基酸係F、W、Y、E、D、Q、T、H、P、C、K、S、N、I或V。更佳地,於位置186處之胺基酸係F、W、Y、E、D或K。特別佳地,於位置186處之胺基酸係W或Y。最佳地,於位置186處之胺基酸係Y。
「對應於第一胺基酸序列中位置X之胺基酸」 (例如SEQ ID No. 1中之位置3)於本文中意謂若第二胺基酸序列之胺基酸編號偏離該第一胺基酸序列之胺基酸編號,則相較於該第一胺基酸序列,該第二胺基酸序列之胺基酸於該第一胺基酸序列與該第二胺基酸序列之成對序列比對中出現於該第一胺基酸序列之位置x處。
結合本發明,應瞭解與序列一致性或相同序列相關之術語「一致性」意謂於整個序列長度上,第一核酸或胺基酸序列與另一(第二)核酸或胺基酸序列共有之相同胺基酸或核苷酸之數量,以百分率表示。
「序列一致性」可藉由使用如(例如)諸如GAP或BESTFIT或Emboss程式「Needle」之已知軟體中含有之全域或局部比對演算法比對兩個胺基酸或兩個核苷酸序列確定。此軟體使用Needleman及Wunsch之全域比對演算法以於其等整個長度上比對兩個序列,用於使匹配數量最大化及用於使空位數量最小化。一般而言,使用默認參數,及空位產生罰分= 10及空位擴展罰分= 0.5 (針對核苷酸比對及蛋白質比對兩者)。針對核苷酸,使用之默認評分矩陣係DNAFULL,及針對蛋白質,該默認評分矩陣係Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919)。用於序列一致性百分比之序列比對及分數可例如使用諸如可於EBI網站(ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上獲得之EMBOSS之軟體確定。或者,序列相似性或一致性可藉由使用通常已知的演算法及輸出格式(諸如FASTA、BLAST等)於資料庫(例如EMBL、GenBank)中搜索確定,但較佳應檢索命中並成對比對以最終確定序列一致性。
若待彼此比較之序列在長度上有所不同,則一致性應藉由確定較短序列與較長序列共有之胺基酸或核苷酸之數量之一致性百分比來確定。較佳地,一致性係在已知及公開可用之電腦程式ClustalW之幫助下確定(Thompson等人,Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680)。ClustalW可自Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)及Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstraße 1, D 69117 Heidelberg, Germany公開獲取。ClustalW亦可自各種網站下載,諸如自IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France;ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)及自EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)及自EBI之鏡像網站(European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK)獲取。
較佳地,使用電腦程式ClustalW之1.8版本確定本發明之內文中描述之蛋白質與其他蛋白質之間的一致性。此處,必須如下設定參數:KTUPLE=1,TOPDIAG=5,WINDOW=5,PAIRGAP=3,GAPOPEN=10,GAPEXTEND=0.05,GAPDIST=8,MAXDIV=40,MATRIX=GONNET,ENDGAPS(OFF),NOPGAP,NOHGAP。
較佳地,使用電腦程式ClustalW之1.8版確定例如結合本發明描述之核酸分子之核苷酸序列與其他核酸分子之核苷酸序列之間的一致性。此處,必須如下設定參數:
KTUPLE=2,TOPDIAGS=4,PAIRGAP=5,DNAMATRIX:IUB,GAPOPEN=10,GAPEXT=5,MAXDIV=40,TRANSITIONS:未加權。
「一致性」亦意謂所述核酸分子或由此編碼之蛋白質之間存在功能及/或結構等效。功能等效意謂該等核酸分子序列或該等胺基酸序列編碼具有脂肪酶活性之蛋白質。與上文描述之分子及此等分子之衍生物同源之核酸分子一般為此等分子之變體,其等係具有相同生物功能或催化相同反應(即編碼具有脂肪酶活性之蛋白質)之修飾。其等可為自然發生之變體,例如來自其他物種之序列,或突變,其中該等突變可為自然發生或係藉由靶向誘變引入。此外,該等變體可為合成產生之序列。對偶基因變體可為自然發生之變體或合成產生之變體,或藉由重組DNA技術產生之變體。然而,對本發明而言至關重要的是,此等變體編碼具有脂肪酶活性之蛋白質且包括關於根據本發明之蛋白質之目前描述之胺基酸取代(置換)、缺失或插入。
衍生物之一特定類型係例如核酸分子,其等透過遺傳密碼之簡併性而不同於本發明之內文中描述之核酸分子。
根據NC-IUBMB (國際生物化學與分子生物學聯合會命名委員會(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)),脂肪酶屬於水解酶之類別(EC 3)。水解酶係一類通常充當生物化學觸媒並使用水來破壞化學鍵(此通常導致較大分子分裂成較小分子)的酶。該等水解酶之群包含作用於酯鍵上之酶(EC 3.1),諸如羧酸酯水解酶(EC 3.1.1),及作為亞群,脂肪酶(EC 3.1.1.3)。已自植物、哺乳動物及微生物鑑別脂肪酶,例如假單胞菌屬(
Pseudomonas)、弧菌屬(
Vibrio)、不動桿菌屬(
Acinetobacter)、伯克氏菌屬(
Burkholderia)、產色細菌屬(
Chromobacterium)、來自茄鐮孢菌(
Fusarium solani)之角質酶(FSC)、南極假絲酵母A (
Candida antarctica A) (CalA)、米根黴(
Rhizopus oryzae) (ROL)、疏棉嗜熱黴菌(
Thermomyces lanuginosus) (TLL)、米氏假根毛黴(
Rhizomucor miehei) (RML)、黑麴菌(
Aspergillus Niger)、異孢鐮孢菌(
Fusarium heterosporum)、尖鐮孢菌(
Fusarium oxysporum)或禾稈鐮孢菌(
Fusarium culmorum)。
若蛋白質具有脂肪酶活性,則其可使用已知及根據先前技術描述之方法偵測。使用何種方法來偵測根據本發明之蛋白質是否具有脂肪酶活性並非關鍵的。較佳地,結合本發明於「實例」部分中給定該方法之描述。
相較於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文描述之胺基酸序列,根據本發明之脂肪酶變體蛋白可具有其他胺基酸修飾(胺基酸取代、缺失或插入)。
與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文在點a)下描述之脂肪酶變體可另外具有於位置79、202、280、301、3、11、17、40或111處之至少一、二、三、四、五、六或七個其他胺基酸取代。換而言之,具有脂肪酶活性之根據本發明之蛋白質係選自由以下組成之群:a)包含SEQ ID No. 1中顯示之胺基酸序列之蛋白質,除於位置186處之胺基酸不同於L且其等具有至少一、二、三、四、五、六、七個或更多個選自由以下組成之群之其他胺基酸取代的事實外:(i)於位置79處之胺基酸不同於E;(ii)於位置202處之胺基酸不同於A;(iii)於位置280處之胺基酸不同於L;(iv)於位置301處之胺基酸不同於D;(v)於位置3處之胺基酸不同於M;(vi)於位置11處之胺基酸不同於C;(vii)於位置17處之胺基酸不同於L;(viii)於位置40處之胺基酸不同於K;(ix)於位置111處之胺基酸不同於Q;及b)具有與上文在a)下直接顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列之蛋白質,限制條件為於位置186處之胺基酸不同於L且具有至少一個選自上文直接提及之(i)至(ix)群之另一胺基酸取代。較佳地,於位置79處之胺基酸係S、W或I,更佳S;較佳地,於位置202處之胺基酸係N;較佳地,於位置280處之胺基酸係A;較佳地,於位置301處之胺基酸係A;較佳地,於位置3處之胺基酸係Q;較佳地,於位置11處之胺基酸係A;較佳地,於位置17處之胺基酸係P;較佳地,於位置40處之胺基酸係M;較佳地,於位置111處之胺基酸係E。
此外,除其他胺基酸修飾外,相較於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文描述之胺基酸序列,根據本發明之脂肪酶變體蛋白可具有另外胺基酸取代。此等另外胺基酸取代涉及不同於與其他胺基酸修飾相關之位置79、202、280、301、3、11、17、40或111之胺基酸序列之位置。與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文在點a)下描述之脂肪酶變體可具有於位置4、8、18、29、31、42、84、85、192、217、309或312處之至少一、二、三、四、五、六、七個或更多個另外胺基酸取代。於位置4處之胺基酸不同於S,較佳於此位置處之胺基酸係P。於位置8處之胺基酸不同於K,較佳於此位置處之胺基酸係E。於位置18處之胺基酸不同於V,較佳於此位置處之胺基酸係C。於位置29處之胺基酸不同於N,較佳於此位置處之胺基酸係W或H。於位置31處之胺基酸不同於Q,較佳於此位置處之胺基酸係W。於位置42處之胺基酸不同於L,較佳於此位置處之胺基酸係D。於位置84處之胺基酸不同於N,較佳於此位置處之胺基酸係T。於位置85處之胺基酸不同於W,較佳於此位置處之胺基酸係H。於位置192處之胺基酸不同於F,較佳於此位置處之胺基酸係A或V。於位置217處之胺基酸不同於Q,較佳於此位置處之胺基酸係M。於位置309處之胺基酸不同於P,較佳於此位置處之胺基酸係C。於位置312處之胺基酸不同於P,較佳於此位置處之胺基酸係N。
因此,根據本發明之另一實施例涉及具有其他胺基酸修飾之根據本發明之蛋白質;較佳地,此等實施例係具有脂肪酶活性之蛋白質,其中該等蛋白質係選自由以下組成之群:
具有SEQ ID No. 1中顯示之胺基酸序列之蛋白質,除以下外:
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y,更佳Y,及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 具有與在a)顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列之蛋白質,限制條件為於位置186處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y,且其中該等蛋白質具有至少一個選自上文在本文列舉之符號下直接顯示之群的另一胺基酸取代。
較佳地,與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文在點a)下描述之脂肪酶變體可具有於位置79、202、280、301、3、11、17、40或111處之至少兩個其他胺基酸取代。較佳地,於位置79處之胺基酸係S、W或I,更佳S;較佳地,於位置202處之胺基酸係N;較佳地,於位置280處之胺基酸係A;較佳地,於位置301處之胺基酸係A;較佳地,於位置3處之胺基酸係Q;較佳地,於位置11處之胺基酸係A;較佳地,於位置17處之胺基酸係P;較佳地,於位置40處之胺基酸係M;較佳地,於位置111處之胺基酸係E。
因此,根據本發明之另一實施例涉及具有其他胺基酸修飾之根據本發明之蛋白質;較佳地,此等實施例係具有脂肪酶活性之蛋白質,其中該等蛋白質係選自由以下組成之群:具有SEQ ID No. 1中顯示之胺基酸序列之蛋白質,除以下外:
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置202處之胺基酸不同於A,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置202處之胺基酸較佳為N;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置280處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置280處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置301處之胺基酸不同於D,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置301處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置280處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置280處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置301處之胺基酸不同於D,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置301處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置301處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置40處之胺基酸較佳為M及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 具有與在a)顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列之蛋白質,限制條件為於位置186處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y,且其中該等蛋白質具有至少兩個選自上文在本文列舉之符號下直接顯示之群的其他胺基酸取代。
較佳地,與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文在點a)下描述之脂肪酶變體可具有於位置79、202、280、301、3、11、17、40或111處之至少三個其他胺基酸取代。較佳地,於位置79處之胺基酸係S、W或I,更佳S;較佳地,於位置202處之胺基酸係N;較佳地,於位置280處之胺基酸係A;較佳地,於位置301處之胺基酸係A;較佳地,於位置3處之胺基酸係Q;較佳地,於位置11處之胺基酸係A;較佳地,於位置17處之胺基酸係P;較佳地,於位置40處之胺基酸係M;較佳地,於位置111處之胺基酸係E。
因此,根據本發明之另一實施例涉及具有其他胺基酸修飾之根據本發明之蛋白質;較佳地,此等實施例係具有脂肪酶活性之蛋白質,其中該等蛋白質係選自由以下組成之群:具有SEQ ID No. 1中顯示之胺基酸序列之蛋白質,除以下外:
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置280處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置280處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置301處之胺基酸不同於D,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置301處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置301處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y,更佳Y,及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M,其中特別佳於位置186處之胺基酸係Y及於位置79處之胺基酸係S及於位置301處之胺基酸係A及於位置40處之胺基酸係M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置79處之胺基酸不同於E及於位置40處之胺基酸不同於K及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置79處之胺基酸較佳為S、W或I,更佳S,及於位置40處之胺基酸較佳為M及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置301處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置202處之胺基酸不同於A及於位置40處之胺基酸不同於K及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置202處之胺基酸較佳為N及於位置40處之胺基酸較佳為M及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置3處之胺基酸不同於M,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置280處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置280處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置11處之胺基酸不同於C,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置11處之胺基酸較佳為A;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置301處之胺基酸不同於D及於位置40處之胺基酸不同於K及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置301處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置17處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置3處之胺基酸不同於M及於位置40處之胺基酸不同於K及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置3處之胺基酸較佳為Q及於位置40處之胺基酸較佳為M及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置40處之胺基酸較佳為M;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置11處之胺基酸不同於C及於位置40處之胺基酸不同於K及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置11處之胺基酸較佳為A及於位置40處之胺基酸較佳為M及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 於位置186處之胺基酸不同於L及於位置17處之胺基酸不同於L及於位置40處之胺基酸不同於K及於位置111處之胺基酸不同於Q,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y及於位置17處之胺基酸較佳為P及於位置40處之胺基酸較佳為M及於位置111處之胺基酸較佳為E;
- 具有與在a)顯示之胺基酸序列具有至少80%,較佳85%,更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,甚至更佳97%,特別佳98%,最佳99%一致性之胺基酸序列之蛋白質,限制條件為於位置186處之胺基酸不同於L,其中較佳於位置186處之胺基酸較佳為W或Y,更佳Y,且其中該等蛋白質具有至少三個選自上文在本文列舉之符號下直接顯示之群的其他胺基酸取代。
與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文在點a)下描述之脂肪酶變體可具有於位置79、202、280、301、3、11、17、40或111處之至少四個其他胺基酸取代。較佳地,於位置79處之胺基酸係S、W或I,更佳S;較佳地,於位置202處之胺基酸係N;較佳地,於位置280處之胺基酸係A;較佳地,於位置301處之胺基酸係A;較佳地,於位置3處之胺基酸係Q;較佳地,於位置11處之胺基酸係A;較佳地,於位置17處之胺基酸係P;較佳地,於位置40處之胺基酸係M;較佳地,於位置111處之胺基酸係E。
與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文在點a)下描述之脂肪酶變體可具有於位置79、202、280、301、3、11、17、40或111處之至少五個其他胺基酸取代。較佳地,於位置79處之胺基酸係S、W或I,更佳S;較佳地,於位置202處之胺基酸係N;較佳地,於位置280處之胺基酸係A;較佳地,於位置301處之胺基酸係A;較佳地,於位置3處之胺基酸係Q;較佳地,於位置11處之胺基酸係A;較佳地,於位置17處之胺基酸係P;較佳地,於位置40處之胺基酸係M;較佳地,於位置111處之胺基酸係E。
與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文在點a)下描述之脂肪酶變體可具有於位置79、202、280、301、3、11、17、40或111處之至少六個其他胺基酸取代。較佳地,於位置79處之胺基酸係S、W或I,更佳S;較佳地,於位置202處之胺基酸係N;較佳地,於位置280處之胺基酸係A;較佳地,於位置301處之胺基酸係A;較佳地,於位置3處之胺基酸係Q;較佳地,於位置11處之胺基酸係A;較佳地,於位置17處之胺基酸係P;較佳地,於位置40處之胺基酸係M;較佳地,於位置111處之胺基酸係E。
與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之本文上文在點a)下描述之脂肪酶變體可具有於位置79、202、280、301、3、11、17、40或111處之至少七個其他胺基酸取代。較佳地,於位置79處之胺基酸係S、W或I,更佳S;較佳地,於位置202處之胺基酸係N;較佳地,於位置280處之胺基酸係A;較佳地,於位置301處之胺基酸係A;較佳地,於位置3處之胺基酸係Q;較佳地,於位置11處之胺基酸係A;較佳地,於位置17處之胺基酸係P;較佳地,於位置40處之胺基酸係M;較佳地,於位置111處之胺基酸係E。
根據本發明之較佳實施例係編碼具有在SEQ ID No. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401顯示之胺基酸序列之脂肪酶的蛋白質。
根據本發明之特別佳實施例係編碼具有在SEQ ID No. 233及399顯示之胺基酸序列之脂肪酶的蛋白質。
已測試具有解脂酶或脂肪酶活性之其他蛋白質。此等其他蛋白質之胺基酸序列係由SEQ ID No. 1中之胺基酸描述之胺基酸序列之變體,其中:
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置40及79處之兩個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置40處之胺基酸係M及於位置79處之胺基酸係S;
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置40及186處之兩個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置40處之胺基酸係M及於位置186處之胺基酸係Y;
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置40及301處之兩個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置40處之胺基酸係M及於位置301處之胺基酸係A;
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置79及186處之兩個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置79處之胺基酸係S及於位置186處之胺基酸係Y;
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置79及301處之兩個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置79處之胺基酸係S及於位置301處之胺基酸係A;
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置186及301處之兩個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置186處之胺基酸係Y及於位置301處之胺基酸係A。
已測試具有解脂酶或脂肪酶活性之又其他蛋白質。此等其他蛋白質之胺基酸序列係由SEQ ID No. 1中之胺基酸描述之胺基酸序列之變體,其中:
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置40、79及186處之三個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置40處之胺基酸係M及於位置79處之胺基酸係S及於位置186處之胺基酸係Y;
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置40、79及301處之三個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置40處之胺基酸係M及於位置79處之胺基酸係S及於位置301處之胺基酸係A;
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置40、186及301處之三個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置40處之胺基酸係M及於位置186處之胺基酸係Y及於位置301處之胺基酸係A;
- 在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之情況下,於位置79、186及301處之三個胺基酸不同於在SEQ ID No. 1顯示之序列中之相應胺基酸位置處指示之胺基酸。於與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列相關之特定測試變體中,於位置79處之胺基酸係S及於位置186處之胺基酸係Y及於位置301處之胺基酸係A。
根據本發明之脂肪酶及脂肪酶變體具有與2,6-二甲基-1-胺基茚烷(DMAI)之立體選擇性醯化或羧化相關之高選擇性及/或高比活性且能夠產生對映體富集或實質純之[(1R,2S)-2,6-二甲基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺甲酸甲酯。[(1R,2S)-2,6-二甲基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺甲酸甲酯係用於合成具有除草作用之化合物茚嗪氟草胺之重要中間物。
本文中「對映體富集」意謂組合物中兩種對映體中之一者係以比另一種對映體更大之量存在,較佳該組合物中之一種對映體係以至少60%之程度存在,更佳該組合物中之一種對映體係以至少65%之程度存在,甚至更佳該組合物中之一種對映體係以至少70%之程度存在,甚至更佳該組合物中之一種對映體係以至少75%之程度存在,甚至更佳該組合物中之一種對映體係以至少80%之程度存在,特別佳該組合物中之一種對映體係以至少85%之程度存在,最佳該組合物中之一種對映體係以至少90%之程度存在或極特別佳該組合物中之一種對映體係以至少94%之程度存在。
本文中「對映體實質純」意謂組合物中兩種對映體中之一者係以至少95.0%之量存在,較佳組合物中兩種對映體中之一者係以至少95.5%之量存在,更佳組合物中兩種對映體中之一者係以至少96.0%之量存在,甚至更佳組合物中兩種對映體中之一者係以至少96.5%之量存在,甚至更佳組合物中兩種對映體中之一者係以至少97.0%之量存在,甚至更佳組合物中兩種對映體中之一者係以至少98.0%之量存在,特別佳組合物中兩種對映體中之一者係以至少98.5%之量存在,最佳組合物中兩種對映體中之一者係以至少99.0%之量存在或極特別佳組合物中兩種對映體中之一者係以至少99.5%之量存在。
根據本發明之另一實施例涉及編碼根據本發明之蛋白質之核酸分子。
根據本發明之核酸分子可為任何種類之核酸,限制條件為該核酸編碼根據本發明之蛋白質。該等核酸可為核糖核酸分子(例如RNA、mRNA)或脫氧核糖核酸分子(DNA,包括基因體DNA,其可或可不包括內含子並編碼DNA)。
本發明特別關注編碼具有脂肪酶活性之蛋白質之核酸分子,包含在SEQ ID No. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401顯示之胺基酸序列。
本發明進一步涉及編碼具有脂肪酶活性之蛋白質之核酸分子,選自由以下組成之群:
a) 包含在SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402顯示之核酸序列之核酸分子;
b) 與在a)顯示之核酸序列具有至少60%,較佳70%,更佳80%,甚至更佳90%,甚至更佳95%,甚至更佳96%,特別佳97%,最佳98%或極特別佳99%一致性之核酸分子。
結合本發明,「與……雜交」意謂在習知雜交條件下,較佳在嚴格條件下雜交,如描述(例如)於Sambrook等人,(Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版,(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773)中或於Ausubel等人,(Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons;第5版,(2002), ISBN: 0471250929)中。特別佳地,「雜交」意謂在下列條件下雜交:
雜交緩衝液:
2x SSC;10x登哈特(Denhardt’s)溶液(Fikoll 400+PEG+BSA;1:1:1比率);0.1% SDS;5 mM EDTA;50 mM Na
2HPO
4;250 µg/ml鯡魚精子DNA;50 µg/ml tRNA;
或
25 M磷酸鈉緩衝液,pH 7.2;1 mM EDTA;7% SDS
雜交溫度: T = 65℃至68℃
洗滌緩衝液: 0.1x SSC;0.1% SDS
洗滌溫度: T = 65℃至68℃。
與編碼具有脂肪酶活性之蛋白質之核酸分子雜交的核酸分子可起源於任何有機體;因此,其等可起源於細菌、真菌、動物、人類、植物或病毒。
與編碼具有脂肪酶活性之蛋白質之核酸分子雜交的核酸分子較佳起源於微生物,更佳起源於真菌或細菌,最佳起源於細菌。
與前述分子雜交之核酸分子可例如自基因體DNA或cDNA庫分離。此等核酸分子可使用本文描述之核酸分子鑑別及分離或其等可使用此等分子之部分或此等分子之反向互補體鑑別及分離,例如藉由根據標準方法雜交(參見例如Sambrook等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版,(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773;Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons;第5版,(2002), ISBN: 0471250929)或藉由在PCR之幫助下擴增。
用作雜交探針之片段亦可為合成片段,或使用習知合成技術產生之寡核苷酸,其序列係與本發明之內文中描述之核酸分子大體上相同。當鑑別及分離與結合本發明描述之核酸序列雜交之基因時,應確定該序列及應分析由該序列編碼之蛋白質之性質以確定其等是否為具有脂肪酶活性之蛋白質。用於確定蛋白質是否存在具有脂肪酶活性之蛋白質之活性的方法為一般技術者已知。
與本發明之內文中描述之核酸分子雜交之分子尤其包括前述核酸分子之片段、衍生物及對偶基因變體。結合本發明,術語「衍生物」意謂此等分子之序列之一或多個位置不同於上文描述之核酸分子之序列且在很大程度上係與此等序列一致。與上文描述之核酸分子相關之差異可例如歸因於缺失、添加、取代、插入或重組。
根據本發明之較佳核酸分子係在SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402顯示之核酸分子。
核苷酸縮寫a、c、g、t及用於簡併核苷酸r、y、s、w、k、m、b、d、h、v、n之縮寫之含義可於下表1中標題為「序列描述」之部分中找到。由簡併核苷酸編碼之胺基酸可於下表3中標題為「序列描述」之部分中找到。
本發明亦揭示包含適用於根據本發明之方法之核酸分子之重組核酸分子。
應瞭解術語「重組核酸分子」意謂不僅含有適用於根據本發明之方法之核酸分子,且亦含有用於根據本發明之方法之重組核酸中出現之組合中非自然出現之其他序列的核酸分子。前述另外序列可為任何序列;較佳其等為功能或調節序列(啟動子、終止訊號、強化子、核糖體結合位點(rbs)、增加轉錄、轉譯或RNA穩定性之前導序列、亞細胞靶向序列等),特別佳其等為於微生物中具有活性之功能或調節序列,及極特別佳其等為於真菌中,特定言之於酵母菌中或於細菌中具有活性之調節序列。用於產生適用於根據本發明之方法之重組核酸分子之方法為一般技術者已知。此等包括遺傳方法,諸如藉由核酸分子之連接、遺傳重組或從頭合成來結合核酸分子。此等方法係(例如)描述於Sambrok等人,(Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版,(2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773)中或於Ausubel等人,(Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons;第5版,(2002), ISBN: 0471250929)中。
可用於根據本發明之方法之重組核酸分子包含合適之核酸分子,其係連接至於原核或真核細胞中啟動轉錄之調節序列。
於細胞中啟動轉錄之調節序列亦稱為啟動子。有關調節序列及質體之資訊為一般技術者熟知,且係(例如)描述於由國際基因工程機器(The International Genetically Engineered Machine,iGEM)基金會(一號肯德爾廣場,Suite B6104,劍橋,MA 02139,美國)於網路(http://parts.igem.org/Catalog)上支援之標準生物學元件登記庫中。
於原核有機體(諸如大腸桿菌)中及於真核有機體中啟動轉錄之調節序列係於文獻中廣泛描述;特定言之描述彼等與酵母菌(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中之表現相關者。對用於在不同宿主有機體中表現蛋白質之不同系統的概述可例如於Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516中及於Bitter等人,(Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)中或於Gomes等人,(2016, Advances in Animal and Veterinary Sciences, 4(4), 346)及Baghban等人,(2018, Current Pharmaceutical Biotechnology, 19(6))中找到。習知酵母菌啟動子為pAOX1、pHIS4、pGAL、pScADH2 (Baghban等人,2018,參見上文)。習知細菌啟動子為T5啟動子、T7啟動子、鼠李糖誘導型啟動子、阿拉伯糖誘導型啟動子、PhoA啟動子、人工trc(trp-lac)啟動子,如由Marschall等人,(2017, Appl Microbiol Biotechnol 101, 501-512)及Tegel等人,(2011, FEBS Journal 278, 729-739)描述。
可用於根據本發明之方法之重組核酸分子之另一實施例係包含合適核酸分子之質體之載體。
「載體」於分子生物學領域中係熟知的,且於本文中係包含用於將遺傳物質(DNA或RNA)轉移至靶細胞內之核酸序列或包含核酸序列之媒介物。載體可為質體,例如用於產生轉基因植物之T-DNA或二元載體、用於在宿主細胞中表現核酸序列之表現載體、能夠於不同宿主中繁殖之穿梭載體,或載體可為已經修飾以將外源遺傳物質遞送至宿主內之病毒顆粒或噬菌體。
「質體」於分子生物學領域中係熟知的,且於本文中係自主自我複製,通常環狀之DNA分子,當存在於宿主細胞中時,其係自染色體DNA分離。
合適之核酸分子、重組核酸分子、載體或質體可用於產生用於根據本發明之方法之蛋白質,例如藉由於宿主細胞中表現合適之核酸分子。
本發明亦揭示包含或表現適用於根據本發明之方法之核酸分子或包含合適之具有脂肪酶活性之蛋白質或包含適用於根據本發明之方法之重組核酸分子或包含適用於根據本發明之方法之載體或包含適用於根據本發明之方法之質體的宿主或宿主細胞。
編碼具有脂肪酶活性之蛋白質之合適之核酸分子可表現於宿主細胞中,例如用於其繁殖或用於產生具有脂肪酶活性之蛋白質。針對於宿主細胞中之表現,合適之核酸分子可存在於載體或質體上或係穩定整合至特定宿主細胞之基因體內。該等合適之核酸分子亦可存在於載體中,該等載體有助於將該等核酸分子引入宿主細胞內。
本發明亦揭示一種適用於根據本發明之方法之宿主或宿主細胞,其包含適用於根據本發明之方法之核酸分子或包含適用於根據本發明之方法之重組核酸分子或包含適用於根據本發明之方法之載體或包含適用於根據本發明之方法之質體,各包含適用於根據本發明之方法之蛋白質。本發明亦揭示適用於根據本發明之方法之宿主或宿主細胞,其包含適用於根據本發明之方法之核酸分子或包含適用於根據本發明之方法之重組核酸分子或包含適用於根據本發明之方法之載體或包含適用於根據本發明之方法之質體,各表現適用於根據本發明之方法之蛋白質,其中該蛋白質較佳具有脂肪酶活性。
本文中應瞭解「核酸分子之表現」意謂若核酸分子係RNA或mRNA,則將該核酸分子轉譯成蛋白質,較佳轉譯成具有脂肪酶活性之蛋白質,或若該核酸分子係DNA或cDNA,則將其轉錄成mRNA (且在含有內含子之基因體DNA之情況下係經處理),較佳轉錄成編碼具有脂肪酶活性之蛋白質之mRNA,且隨後轉譯成蛋白質,較佳轉譯成具有脂肪酶活性之蛋白質。
特定核酸分子於宿主中之轉錄可藉由一般技術者已知的方法偵測,例如藉由北方墨點轉漬分析法或藉由RT-PCR偵測外源核酸分子之特定轉錄本(mRNA)。
確定宿主或宿主細胞是否包含特定蛋白質或包含來源於核酸分子之表現之蛋白質可藉由一般技術者已知的方法,例如藉由免疫學方法,諸如西方墨點法分析、ELISA (酶聯免疫吸附測定)或RIA (放射性免疫測定法)進行。一般技術者熟悉用於產生與特定蛋白質特異性反應之抗體(即該等抗體特異性結合至特定蛋白質)之方法(參見例如Lottspeich及Zorbas (編輯者),1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4)。一些公司(Thermo Fisher Scientific, 168 Third Avenue, Waltham, MA USA 0245;GenScript, 60 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854, USA)為產生該等抗體提供定製服務。
此外,一般技術者可藉由偵測具有脂肪酶活性之蛋白質於相應宿主細胞中之(另外)活性檢查宿主或宿主細胞是否包含適用於根據本發明之方法之蛋白質。較佳地,具有另外脂肪酶活性之蛋白質於相應宿主細胞中之活性係藉由比較用於根據本發明之方法之宿主細胞中脂肪酶之活性與不包含適用於根據本發明之方法之蛋白質之宿主細胞之相應活性偵測。檢查蛋白質是否具有脂肪酶活性可使用根據先前技術已知的方法進行。
用於根據本發明之方法之宿主或宿主細胞可由一般技術者在用於有機體之遺傳修飾或轉形之已知方法的幫助下產生。
因此,本發明亦揭示適用於根據本發明之方法之宿主或宿主細胞,特定言之原核或真核宿主或宿主細胞,已使用合適之核酸分子或使用合適之重組核酸分子或使用合適之載體或使用合適之質體進行基因修飾(或轉形)。較佳地,用於根據本發明之方法之經基因修飾(轉形)之宿主或宿主細胞表現具有脂肪酶活性之蛋白質;更佳地,該經基因修飾(轉形)之宿主或宿主細胞表現適用於根據本發明之方法之蛋白質。本文應瞭解「使用核酸分子進行基因修飾」或「使用核酸分子轉形」意謂核酸分子係或已藉由技術及/或非自然存在之方式引入宿主內或引入宿主細胞內,較佳藉由來自分子生物學、生物技術或基因技術領域之技術方法引入。
本發明同樣揭示用於根據本發明之方法之宿主或宿主細胞之後代或子代;較佳該等後代或子代包含適用於根據本發明之方法之核酸分子或包含合適之重組核酸分子或包含合適之載體或包含合適之質體或包含合適之蛋白質,更佳該等後代或子代包含合適之核酸分子或包含合適之重組核酸分子或包含合適之載體或包含合適之質體且其等在任何情況下均表現具有脂肪酶活性之蛋白質,甚至更佳該等後代或子代包含合適之核酸分子或包含合適之重組核酸分子或包含合適之載體或包含合適之質體且其等在任何情況下均表現具有脂肪酶活性之蛋白質,其可用於根據本發明之方法中。
用於根據本發明之方法之宿主或宿主細胞可為來自原核有機體或真核有機體之宿主或宿主細胞。該宿主或宿主細胞可為細菌或細菌細胞(例如大腸桿菌、桿菌屬之細菌(特定言之枯草桿菌(
Bacillus subtilis))、農桿菌屬(特定言之根癌農桿菌(
Agrobacterium tumefaciens)或根毛農桿菌(
Agrobacterium rhizogenes))、假單胞菌屬(特定言之螢光假單胞菌(
Pseudomonas fluorescens))、鏈黴菌屬(
Streptomyces spp)、紅球菌屬(特定言之紫紅紅球菌(
Rhodococcus rhodochrous))、需鈉弧菌(
Vibrio natrigens)、棒狀桿菌屬(特定言之麩胺酸棒狀桿菌(
Corynebacterium glutamicum)))或真菌或真菌細胞(例如傘菌屬(特定言之洋菇(
Agaricus bisporus))、麴菌屬(
Aspergillus)、木黴菌屬(
Trichoderma)或酵母菌(特定言之釀酒酵母(
S. cerevisiae)、畢赤酵母屬(諸如巴斯德畢赤酵母(
P. pastoris))),及亦植物或植物細胞或其等可為動物或動物細胞。較佳之宿主細胞係微生物細胞。在本專利申請案之內文中,假定包括所有細菌及原生生物(例如真菌,特定言之酵母菌及海藻),如定義(例如)於Schlegel 「General Microbiology」 (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2)中。關於微生物,用於根據本發明之方法之宿主或宿主細胞較佳為細菌/細菌細胞或酵母菌/酵母菌細胞,更佳細菌/細菌細胞,甚至更佳桿菌屬物種/桿菌屬物種細胞或大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)/大腸埃希氏桿菌細胞,最佳大腸埃希氏桿菌/大腸埃希氏桿菌細胞。或者,假單胞菌(特定言之螢光假單胞菌)、鏈黴菌屬、紅球菌屬(特定言之紫紅紅球菌)、弧菌屬(特定言之需鈉弧菌)、棒狀桿菌屬(特定言之麩胺酸棒狀桿菌),或其他宿主或宿主細胞可用於根據本發明之方法。
用於根據本發明之方法之較佳宿主或宿主細胞包含合適之核酸分子,其特徵在於該核酸分子之密碼子已經改變使得其等適應該等密碼子於宿主中或宿主細胞中之使用頻率。
序列描述在整個本申請案中,根據下列IUPAC編碼使用用於核苷酸及胺基酸之縮寫:
表1
為在胺基酸與核苷酸之間加以區分,上表中大寫之縮寫核苷酸編碼於本文中未大寫。
IUPAC核苷酸編碼 | 鹼基 |
A | 腺嘌呤 |
C | 胞嘧啶 |
G | 鳥嘌呤 |
T (或U) | 胸腺嘧啶(或尿嘧啶) |
R | A或G |
Y | C或T |
S | G或C |
W | A或T |
K | G或T |
M | A或C |
B | C或G或T |
D | A或G或T |
H | A或C或T |
V | A或C或G |
N | 任何鹼基 |
- | 空位 |
表2
根據下表,本文中密碼子之使用遵循所謂之「一般遺傳編碼」,於核糖核酸(RNA)序列中用「u」置換「t」。
IUPAC胺基酸編碼 | 三字母編碼 | 胺基酸 |
A | Ala | 丙胺酸 |
C | Cys | 半胱胺酸 |
D | Asp | 天冬胺酸 |
E | Glu | 麩胺酸 |
F | Phe | 苯丙胺酸 |
G | Gly | 甘胺酸 |
H | His | 組胺酸 |
I | Ile | 異白胺酸 |
K | Lys | 離胺酸 |
L | Leu | 白胺酸 |
M | Met | 甲硫胺酸 |
N | Asn | 天冬醯胺酸 |
P | Pro | 脯胺酸 |
Q | Gln | 麩醯胺酸 |
R | Arg | 精胺酸 |
S | Ser | 絲胺酸 |
T | Thr | 蘇胺酸 |
V | Val | 纈胺酸 |
W | Trp | 色胺酸 |
Y | Tyr | 酪胺酸 |
表3
胺基酸 | 三字母編碼 | 單字母編碼 | DNA密碼子 | 由於簡併遺傳密碼產生之密碼子 |
丙胺酸 | Ala | A | gca | gcn |
丙胺酸 | Ala | A | gcc | gcn |
丙胺酸 | Ala | A | gcg | gcn |
丙胺酸 | Ala | A | gct | gcn |
精胺酸 | Arg | R | aga | mgn |
精胺酸 | Arg | R | agg | mgn |
精胺酸 | Arg | R | cga | mgn |
精胺酸 | Arg | R | cgc | mgn |
精胺酸 | Arg | R | cgg | mgn |
精胺酸 | Arg | R | cgt | mgn |
天冬醯胺酸 | Asn | N | aac | aay |
天冬醯胺酸 | Asn | N | aat | aay |
天冬胺酸 | Asp | D | gac | gay |
天冬胺酸 | Asp | D | gat | gay |
半胱胺酸 | Cys | C | tgc | tgy |
半胱胺酸 | Cys | C | tgt | tgy |
麩胺酸 | Glu | E | gaa | gar |
麩胺酸 | Glu | E | gag | gar |
麩醯胺酸 | Gln | Q | caa | car |
麩醯胺酸 | Gln | Q | cag | car |
甘胺酸 | Gly | G | gga | ggn |
甘胺酸 | Gly | G | ggc | ggn |
甘胺酸 | Gly | G | ggg | ggn |
甘胺酸 | Gly | G | ggt | ggn |
組胺酸 | His | H | cac | cay |
組胺酸 | His | H | cat | cay |
異白胺酸 | Ile | I | ata | ath |
異白胺酸 | Ile | I | atc | ath |
異白胺酸 | Ile | I | att | ath |
白胺酸 | Leu | L | cta | ytn |
白胺酸 | Leu | L | ctc | ytn |
白胺酸 | Leu | L | ctg | ytn |
白胺酸 | Leu | L | ctt | ytn |
白胺酸 | Leu | L | tta | ytn |
白胺酸 | Leu | L | ttg | ytn |
離胺酸 | Lys | K | aaa | aar |
離胺酸 | Lys | K | aag | aar |
甲硫胺酸 | Met | M | atg | atg |
苯丙胺酸 | Phe | F | ttc | tty |
苯丙胺酸 | Phe | F | ttt | tty |
脯胺酸 | Pro | P | cca | ccn |
脯胺酸 | Pro | P | ccc | ccn |
脯胺酸 | Pro | P | ccg | ccn |
脯胺酸 | Pro | P | cct | ccn |
絲胺酸 | Ser | S | agc | wsn |
絲胺酸 | Ser | S | agt | wsn |
絲胺酸 | Ser | S | tca | wsn |
絲胺酸 | Ser | S | tcc | wsn |
絲胺酸 | Ser | S | tcg | wsn |
絲胺酸 | Ser | S | tct | wsn |
蘇胺酸 | Thr | T | aca | acn |
蘇胺酸 | Thr | T | acc | acn |
蘇胺酸 | Thr | T | acg | acn |
蘇胺酸 | Thr | T | act | acn |
色胺酸 | Thr | W | tgg | tgg |
酪胺酸 | Tyr | Y | tac | tay |
酪胺酸 | Tyr | Y | tat | tay |
纈胺酸 | Val | V | gta | gtn |
纈胺酸 | Val | V | gtc | gtn |
纈胺酸 | Val | V | gtg | gtn |
纈胺酸 | Val | V | gtt | gtn |
終止密碼子 | Stop | Stop | taa | trr |
終止密碼子 | Stop | Stop | tag | trr |
終止密碼子 | Stop | Stop | tga | trr |
表4
與本申請案相關之序列表係以電子格式提交並藉由全文引用之方式併入本專利檔案中。「PRT」意謂「蛋白質」及「NUC」意謂「核酸」。
具有脂肪酶活性之蛋白質較佳係以混合物(I)之0.1至50重量%之量使用。特別佳係0.5至10重量%之量。尤其佳係1至5重量%之量。
SEQ ID No. | 主體 | 突變/變化 | 類型 |
1 | 野生型(WT) | - | PRT |
2 | 野生型(WT) | - | NUC |
3 | 脂肪酶變體 | L186F | PRT |
4 | 脂肪酶變體 | L186F | NUC |
5 | 脂肪酶變體 | L280E | PRT |
6 | 脂肪酶變體 | L280E | NUC |
7 | 脂肪酶變體 | L280S | PRT |
8 | 脂肪酶變體 | L280S | NUC |
9 | 脂肪酶變體 | L280K | PRT |
10 | 脂肪酶變體 | L280K | NUC |
11 | 脂肪酶變體 | P312N | PRT |
12 | 脂肪酶變體 | P312N | NUC |
13 | 脂肪酶變體 | P312F | PRT |
14 | 脂肪酶變體 | P312F | NUC |
15 | 脂肪酶變體 | L186W | PRT |
16 | 脂肪酶變體 | L186W | NUC |
17 | 脂肪酶變體 | M3L | PRT |
18 | 脂肪酶變體 | M3L | NUC |
19 | 脂肪酶變體 | N29Y | PRT |
20 | 脂肪酶變體 | N29Y | NUC |
21 | 脂肪酶變體 | L17P | PRT |
22 | 脂肪酶變體 | L17P | NUC |
23 | 脂肪酶變體 | S4P | PRT |
24 | 脂肪酶變體 | S4P | NUC |
25 | 脂肪酶變體 | L280D | PRT |
26 | 脂肪酶變體 | L280D | NUC |
27 | 脂肪酶變體 | V18A | PRT |
28 | 脂肪酶變體 | V18A | NUC |
29 | 脂肪酶變體 | M3Q | PRT |
30 | 脂肪酶變體 | M3Q | NUC |
31 | 脂肪酶變體 | P312D | PRT |
32 | 脂肪酶變體 | P312D | NUC |
33 | 脂肪酶變體 | N29W | PRT |
34 | 脂肪酶變體 | N29W | NUC |
35 | 脂肪酶變體 | L186Y | PRT |
36 | 脂肪酶變體 | L186Y | NUC |
37 | 脂肪酶變體 | V18T | PRT |
38 | 脂肪酶變體 | V18T | NUC |
39 | 脂肪酶變體 | L186E | PRT |
40 | 脂肪酶變體 | L186E | NUC |
41 | 脂肪酶變體 | A202Q | PRT |
42 | 脂肪酶變體 | A202Q | NUC |
43 | 脂肪酶變體 | D301A | PRT |
44 | 脂肪酶變體 | D301A | NUC |
45 | 脂肪酶變體 | P309C | PRT |
46 | 脂肪酶變體 | P309C | NUC |
47 | 脂肪酶變體 | L186D | PRT |
48 | 脂肪酶變體 | L186D | NUC |
49 | 脂肪酶變體 | Q31W | PRT |
50 | 脂肪酶變體 | Q31W | NUC |
51 | 脂肪酶變體 | A202N | PRT |
52 | 脂肪酶變體 | A202N | NUC |
53 | 脂肪酶變體 | Q111E | PRT |
54 | 脂肪酶變體 | Q111E | NUC |
55 | 脂肪酶變體 | L186Q | PRT |
56 | 脂肪酶變體 | L186Q | NUC |
57 | 脂肪酶變體 | L186T | PRT |
58 | 脂肪酶變體 | L186T | NUC |
59 | 脂肪酶變體 | M3C | PRT |
60 | 脂肪酶變體 | M3C | NUC |
61 | 脂肪酶變體 | W85H | PRT |
62 | 脂肪酶變體 | W85H | NUC |
63 | 脂肪酶變體 | N29H | PRT |
64 | 脂肪酶變體 | N29H | NUC |
65 | 脂肪酶變體 | K8E | PRT |
66 | 脂肪酶變體 | K8E | NUC |
67 | 脂肪酶變體 | L186H | PRT |
68 | 脂肪酶變體 | L186H | NUC |
69 | 脂肪酶變體 | E79I | PRT |
70 | 脂肪酶變體 | E79I | NUC |
71 | 脂肪酶變體 | E79W | PRT |
72 | 脂肪酶變體 | E79W | NUC |
73 | 脂肪酶變體 | L17T | PRT |
74 | 脂肪酶變體 | L17T | NUC |
75 | 脂肪酶變體 | V18C | PRT |
76 | 脂肪酶變體 | V18C | NUC |
77 | 脂肪酶變體 | L186P | PRT |
78 | 脂肪酶變體 | L186P | NUC |
79 | 脂肪酶變體 | P312Q | PRT |
80 | 脂肪酶變體 | P312Q | NUC |
81 | 脂肪酶變體 | K40M | PRT |
82 | 脂肪酶變體 | K40M | NUC |
83 | 脂肪酶變體 | P312K | PRT |
84 | 脂肪酶變體 | P312K | NUC |
85 | 脂肪酶變體 | L186C | PRT |
86 | 脂肪酶變體 | L186C | NUC |
87 | 脂肪酶變體 | L280A | PRT |
88 | 脂肪酶變體 | L280A | NUC |
89 | 脂肪酶變體 | S4L | PRT |
90 | 脂肪酶變體 | S4L | NUC |
91 | 脂肪酶變體 | V18S | PRT |
92 | 脂肪酶變體 | V18S | NUC |
93 | 脂肪酶變體 | L186K | PRT |
94 | 脂肪酶變體 | L186K | NUC |
95 | 脂肪酶變體 | L186S | PRT |
96 | 脂肪酶變體 | L186S | NUC |
97 | 脂肪酶變體 | E79T | PRT |
98 | 脂肪酶變體 | E79T | NUC |
99 | 脂肪酶變體 | L186N | PRT |
100 | 脂肪酶變體 | L186N | NUC |
101 | 脂肪酶變體 | L186I | PRT |
102 | 脂肪酶變體 | L186I | NUC |
103 | 脂肪酶變體 | L186V | PRT |
104 | 脂肪酶變體 | L186V | NUC |
105 | 脂肪酶變體 | E79S、L186Y | PRT |
106 | 脂肪酶變體 | E79S、L186Y | NUC |
107 | 脂肪酶變體 | C11A、L186Y、P312N | PRT |
108 | 脂肪酶變體 | C11A、L186Y、P312N | NUC |
109 | 脂肪酶變體 | L186Y、L280A、P312N | PRT |
110 | 脂肪酶變體 | L186Y、L280A、P312N | NUC |
111 | 脂肪酶變體 | L17P、L186Y、P312N | PRT |
112 | 脂肪酶變體 | L17P、L186Y、P312N | NUC |
113 | 脂肪酶變體 | L186W、L280A、P312N | PRT |
114 | 脂肪酶變體 | L186W、L280A、P312N | NUC |
115 | 脂肪酶變體 | N29H、L186W、L280A | PRT |
116 | 脂肪酶變體 | N29H、L186W、L280A | NUC |
117 | 脂肪酶變體 | L17P、L186Y、P309C | PRT |
118 | 脂肪酶變體 | L17P、L186Y、P309C | NUC |
119 | 脂肪酶變體 | S4P、L186W、A202N | PRT |
120 | 脂肪酶變體 | S4P、L186W、A202N | NUC |
121 | 脂肪酶變體 | L186W、A202N、P312N | PRT |
122 | 脂肪酶變體 | L186W、A202N、P312N | NUC |
123 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、P309C、P312N | PRT |
124 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、P309C、P312N | NUC |
125 | 脂肪酶變體 | L186Y、F192A、A202N、P312N | PRT |
126 | 脂肪酶變體 | L186Y、F192A、A202N、P312N | NUC |
127 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、L186W、P312N | PRT |
128 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、L186W、P312N | NUC |
129 | 脂肪酶變體 | E79S、L186Y、P309C、P312N | PRT |
130 | 脂肪酶變體 | E79S、L186Y、P309C、P312N | NUC |
131 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186W、P309C | PRT |
132 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186W、P309C | NUC |
133 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、F192A、P312N | PRT |
134 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、F192A、P312N | NUC |
135 | 脂肪酶變體 | N29H、N84T、L186Y、A202N | PRT |
136 | 脂肪酶變體 | N29H、N84T、L186Y、A202N | NUC |
137 | 脂肪酶變體 | V18C、K40M、N84T、L186W、P312N | PRT |
138 | 脂肪酶變體 | V18C、K40M、N84T、L186W、P312N | NUC |
139 | 脂肪酶變體 | S4P、N29H、L186Y、A202N、P312N | PRT |
140 | 脂肪酶變體 | S4P、N29H、L186Y、A202N、P312N | NUC |
141 | 脂肪酶變體 | V18A、L186Y、F192A、D301A、P312N | PRT |
142 | 脂肪酶變體 | V18A、L186Y、F192A、D301A、P312N | NUC |
143 | 脂肪酶變體 | N29H、Q111E、L186W、P309C、P312N | PRT |
144 | 脂肪酶變體 | N29H、Q111E、L186W、P309C、P312N | NUC |
145 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、K8E、N84T、L186W、P312N | PRT |
146 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、K8E、N84T、L186W、P312N | NUC |
147 | 脂肪酶變體 | E79S、L186Y、D301A | PRT |
148 | 脂肪酶變體 | E79S、L186Y、D301A | NUC |
149 | 脂肪酶變體 | L186Y、A202N、D301A | PRT |
150 | 脂肪酶變體 | L186Y、A202N、D301A | NUC |
151 | 脂肪酶變體 | L17P、L186W、A202N | PRT |
152 | 脂肪酶變體 | L17P、L186W、A202N | NUC |
153 | 脂肪酶變體 | M3Q、E79S、L186Y、P312N | PRT |
154 | 脂肪酶變體 | M3Q、E79S、L186Y、P312N | NUC |
155 | 脂肪酶變體 | K40M、E79S、L186Y、P312N | PRT |
156 | 脂肪酶變體 | K40M、E79S、L186Y、P312N | NUC |
157 | 脂肪酶變體 | K8E、L186Y、L280A、D301A | PRT |
158 | 脂肪酶變體 | K8E、L186Y、L280A、D301A | NUC |
159 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186Y、P309C | PRT |
160 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186Y、P309C | NUC |
161 | 脂肪酶變體 | L186Y、F192A、L280A、D301A | PRT |
162 | 脂肪酶變體 | L186Y、F192A、L280A、D301A | NUC |
163 | 脂肪酶變體 | L186Y、A202N、L280A、P312N | PRT |
164 | 脂肪酶變體 | L186Y、A202N、L280A、P312N | NUC |
165 | 脂肪酶變體 | K40M、L186W、L280A、P309C | PRT |
166 | 脂肪酶變體 | K40M、L186W、L280A、P309C | NUC |
167 | 脂肪酶變體 | C11A、N29W、E79S、L186Y | PRT |
168 | 脂肪酶變體 | C11A、N29W、E79S、L186Y | NUC |
169 | 脂肪酶變體 | N29W、L186Y、A202N、D301A | PRT |
170 | 脂肪酶變體 | N29W、L186Y、A202N、D301A | NUC |
171 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、E79S、L186Y | PRT |
172 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、E79S、L186Y | NUC |
173 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、L186Y、D301A | PRT |
174 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、L186Y、D301A | NUC |
175 | 脂肪酶變體 | S4P、E79S、L186W、A202N、P309C | PRT |
176 | 脂肪酶變體 | S4P、E79S、L186W、A202N、P309C | NUC |
177 | 脂肪酶變體 | Q31W、E79S、L186W、A202N、P309C | PRT |
178 | 脂肪酶變體 | Q31W、E79S、L186W、A202N、P309C | NUC |
179 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、L280A、P309C、P312N | PRT |
180 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、L280A、P309C、P312N | NUC |
181 | 脂肪酶變體 | Q31W、E79S、L186W、F192A、D301A | PRT |
182 | 脂肪酶變體 | Q31W、E79S、L186W、F192A、D301A | NUC |
183 | 脂肪酶變體 | Q31W、E79S、N84T、L186W、A202N | PRT |
184 | 脂肪酶變體 | Q31W、E79S、N84T、L186W、A202N | NUC |
185 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186Y、F192A、L280A | PRT |
186 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186Y、F192A、L280A | NUC |
187 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186W、F192A、L280A | PRT |
188 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186W、F192A、L280A | NUC |
189 | 脂肪酶變體 | S4P、L17P、N29W、L186Y、D301A | PRT |
190 | 脂肪酶變體 | S4P、L17P、N29W、L186Y、D301A | NUC |
191 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、L186W、F192A、A202N | PRT |
192 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、L186W、F192A、A202N | NUC |
193 | 脂肪酶變體 | E79S、W85H、L186Y、F192A、D301A | PRT |
194 | 脂肪酶變體 | E79S、W85H、L186Y、F192A、D301A | NUC |
195 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、E79S、L186Y、P309C | PRT |
196 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、E79S、L186Y、P309C | NUC |
197 | 脂肪酶變體 | N29H、Q31W、L186Y、L280A、D301A | PRT |
198 | 脂肪酶變體 | N29H、Q31W、L186Y、L280A、D301A | NUC |
199 | 脂肪酶變體 | S4P、C11A、W85H、L186Y、A202N | PRT |
200 | 脂肪酶變體 | S4P、C11A、W85H、L186Y、A202N | NUC |
201 | 脂肪酶變體 | S4P、E79S、W85H、L186Y、L280A | PRT |
202 | 脂肪酶變體 | S4P、E79S、W85H、L186Y、L280A | NUC |
203 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、E79S、N84T、L186Y、P312N | PRT |
204 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、E79S、N84T、L186Y、P312N | NUC |
205 | 脂肪酶變體 | Q31W、N84T、Q111E、L186Y、L280A、P312N | PRT |
206 | 脂肪酶變體 | Q31W、N84T、Q111E、L186Y、L280A、P312N | NUC |
207 | 脂肪酶變體 | Q31W、L186Y、F192A、L280A、D301A、P312N | PRT |
208 | 脂肪酶變體 | Q31W、L186Y、F192A、L280A、D301A、P312N | NUC |
209 | 脂肪酶變體 | S4P、K8E、N29W、E79S、Q111E、L186W | PRT |
210 | 脂肪酶變體 | S4P、K8E、N29W、E79S、Q111E、L186W | NUC |
211 | 脂肪酶變體 | L17P、V18A、L186W、L280A、P309C、P312N | PRT |
212 | 脂肪酶變體 | L17P、V18A、L186W、L280A、P309C、P312N | NUC |
213 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、Q111E、L186Y、P309C、P312N | PRT |
214 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、Q111E、L186Y、P309C、P312N | NUC |
215 | 脂肪酶變體 | N29H、L186Y、F192A、L280A、D301A、P312N | PRT |
216 | 脂肪酶變體 | N29H、L186Y、F192A、L280A、D301A、P312N | NUC |
217 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、N29H、Q31W、L186Y、D301A | PRT |
218 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、N29H、Q31W、L186Y、D301A | NUC |
219 | 脂肪酶變體 | S4P、N29H、Q31W、E79S、L280A、D301A | PRT |
220 | 脂肪酶變體 | S4P、N29H、Q31W、E79S、L280A、D301A | NUC |
221 | 脂肪酶變體 | K8E、N29H、Q31W、E79S、L186W、D301A | PRT |
222 | 脂肪酶變體 | K8E、N29H、Q31W、E79S、L186W、D301A | NUC |
223 | 脂肪酶變體 | K8E、L17P、V18A、Q111E、L186W、P309C | PRT |
224 | 脂肪酶變體 | K8E、L17P、V18A、Q111E、L186W、P309C | NUC |
225 | 脂肪酶變體 | C11A、N29W、E79S、N84T、W85H、L186Y、P309C | PRT |
226 | 脂肪酶變體 | C11A、N29W、E79S、N84T、W85H、L186Y、P309C | NUC |
227 | 脂肪酶變體 | N29H、N84T、L186Y、A202N、L280A、P309C、P312N | PRT |
228 | 脂肪酶變體 | N29H、N84T、L186Y、A202N、L280A、P309C、P312N | NUC |
229 | 脂肪酶變體 | N29H、Q31W、E79S、N84T、W85H、L186Y、F192A、L280A、P309C | PRT |
230 | 脂肪酶變體 | N29H、Q31W、E79S、N84T、W85H、L186Y、F192A、L280A、P309C | NUC |
231 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186W、A202N | PRT |
232 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186W、A202N | NUC |
233 | 脂肪酶變體 | K40M、E79S、L186Y、D301A | PRT |
234 | 脂肪酶變體 | K40M、E79S、L186Y、D301A | NUC |
235 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、A202N、L280A | PRT |
236 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、A202N、L280A | NUC |
237 | 脂肪酶變體 | L17P、Q111E、L186Y、D301A | PRT |
238 | 脂肪酶變體 | L17P、Q111E、L186Y、D301A | NUC |
239 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186Y、A202N | PRT |
240 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186Y、A202N | NUC |
241 | 脂肪酶變體 | M3Q、E79S、L186Y、D301A | PRT |
242 | 脂肪酶變體 | M3Q、E79S、L186Y、D301A | NUC |
243 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、L280A、D301A | PRT |
244 | 脂肪酶變體 | E79S、L186W、L280A、D301A | NUC |
245 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、Q111E、L186W、P309C | PRT |
246 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、Q111E、L186W、P309C | NUC |
247 | 脂肪酶變體 | L17P、V18C、E79S、L186W、L280A | PRT |
248 | 脂肪酶變體 | L17P、V18C、E79S、L186W、L280A | NUC |
249 | 脂肪酶變體 | N29H、K40M、E79S、L186W、D301A | PRT |
250 | 脂肪酶變體 | N29H、K40M、E79S、L186W、D301A | NUC |
251 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、L186W、A202N、L280A | PRT |
252 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、L186W、A202N、L280A | NUC |
253 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、Q111E、L186W、L280A | PRT |
254 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、Q111E、L186W、L280A | NUC |
255 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、L186W、A202N、D301A | PRT |
256 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、L186W、A202N、D301A | NUC |
257 | 脂肪酶變體 | C11A、L186Y、L280A、D301A、P309C | PRT |
258 | 脂肪酶變體 | C11A、L186Y、L280A、D301A、P309C | NUC |
259 | 脂肪酶變體 | K8E、E79S、L186Y、L280A、D301A | PRT |
260 | 脂肪酶變體 | K8E、E79S、L186Y、L280A、D301A | NUC |
261 | 脂肪酶變體 | L17P、N29W、Q111E、L186W、A202N | PRT |
262 | 脂肪酶變體 | L17P、N29W、Q111E、L186W、A202N | NUC |
263 | 脂肪酶變體 | L17P、L186Y、L280A、D301A、P309C | PRT |
264 | 脂肪酶變體 | L17P、L186Y、L280A、D301A、P309C | NUC |
265 | 脂肪酶變體 | Q111E、L186W、A202N、L280A、P312N | PRT |
266 | 脂肪酶變體 | Q111E、L186W、A202N、L280A、P312N | NUC |
267 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、Q111E、L186Y、D301A | PRT |
268 | 脂肪酶變體 | N29H、E79S、Q111E、L186Y、D301A | NUC |
269 | 脂肪酶變體 | L17P、N29W、E79S、L186Y、A202N、P312N | PRT |
270 | 脂肪酶變體 | L17P、N29W、E79S、L186Y、A202N、P312N | NUC |
271 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、N84T、L186Y、L280A、P309C | PRT |
272 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、N84T、L186Y、L280A、P309C | NUC |
273 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、E79S、W85H、L186W、L280A | PRT |
274 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、E79S、W85H、L186W、L280A | NUC |
275 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186Y、F192A、A202N、P309C | PRT |
276 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186Y、F192A、A202N、P309C | NUC |
277 | 脂肪酶變體 | V18A、K40M、E79S、L186W、F192A、D301A | PRT |
278 | 脂肪酶變體 | V18A、K40M、E79S、L186W、F192A、D301A | NUC |
279 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、Q31W、E79S、L186W、D301A | PRT |
280 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、Q31W、E79S、L186W、D301A | NUC |
281 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、Q111E、L186W、L280A、P309C | PRT |
282 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、Q111E、L186W、L280A、P309C | NUC |
283 | 脂肪酶變體 | M3Q、K8E、L17P、L186Y、D301A、P312N | PRT |
284 | 脂肪酶變體 | M3Q、K8E、L17P、L186Y、D301A、P312N | NUC |
285 | 脂肪酶變體 | L17P、N29W、L186W、A202N、L280A、P309C | PRT |
286 | 脂肪酶變體 | L17P、N29W、L186W、A202N、L280A、P309C | NUC |
287 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、L186W、A202N、L280A、P309C | PRT |
288 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、L186W、A202N、L280A、P309C | NUC |
289 | 脂肪酶變體 | S4P、N29W、E79S、L186W、A202N、L280A、P309C | PRT |
290 | 脂肪酶變體 | S4P、N29W、E79S、L186W、A202N、L280A、P309C | NUC |
291 | 脂肪酶變體 | N29W、E79S、Q111E、L186W、L280A、P309C、P312N | PRT |
292 | 脂肪酶變體 | N29W、E79S、Q111E、L186W、L280A、P309C、P312N | NUC |
293 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、K40M、E79S、W85H、L186W、P309C | PRT |
294 | 脂肪酶變體 | K8E、C11A、K40M、E79S、W85H、L186W、P309C | NUC |
295 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、N29H、K40M、L186Y、A202N、P309C | PRT |
296 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、N29H、K40M、L186Y、A202N、P309C | NUC |
297 | 脂肪酶變體 | V18A、K40M、N84T、Q111E、L186Y、L280A、P309C、P312N | PRT |
298 | 脂肪酶變體 | V18A、K40M、N84T、Q111E、L186Y、L280A、P309C、P312N | NUC |
299 | 脂肪酶變體 | S4P、C11A、V18A、K40M、N84T、L186Y、D301A、P312N | PRT |
300 | 脂肪酶變體 | S4P、C11A、V18A、K40M、N84T、L186Y、D301A、P312N | NUC |
301 | 脂肪酶變體 | S4P、K8E、C11A、L186Y、F192A、A202N、L280A、P309C | PRT |
302 | 脂肪酶變體 | S4P、K8E、C11A、L186Y、F192A、A202N、L280A、P309C | NUC |
303 | 脂肪酶變體 | E79S、Q111E、L186W、L280A、D301A | PRT |
304 | 脂肪酶變體 | E79S、Q111E、L186W、L280A、D301A | NUC |
305 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、K40M、E79S、L186Y | PRT |
306 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、K40M、E79S、L186Y | NUC |
307 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、Q111E、L186W、L280A | PRT |
308 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、Q111E、L186W、L280A | NUC |
309 | 脂肪酶變體 | C11A、E79S、L186Y、A202N、D301A | PRT |
310 | 脂肪酶變體 | C11A、E79S、L186Y、A202N、D301A | NUC |
311 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、Q111E、L186Y | PRT |
312 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、Q111E、L186Y | NUC |
313 | 脂肪酶變體 | C11A、L17P、K40M、E79S、L186Y | PRT |
314 | 脂肪酶變體 | C11A、L17P、K40M、E79S、L186Y | NUC |
315 | 脂肪酶變體 | K40M、Q111E、L186Y、L280A、D301A | PRT |
316 | 脂肪酶變體 | K40M、Q111E、L186Y、L280A、D301A | NUC |
317 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186W、A202N、L280A、D301A | PRT |
318 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186W、A202N、L280A、D301A | NUC |
319 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、N29H、E79S、L186Y、D301A | PRT |
320 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、N29H、E79S、L186Y、D301A | NUC |
321 | 脂肪酶變體 | L17P、Q111E、L186Y、A202N、L280A、P312N | PRT |
322 | 脂肪酶變體 | L17P、Q111E、L186Y、A202N、L280A、P312N | NUC |
323 | 脂肪酶變體 | M3Q、C11A、L186Y、A202N、L280A、P312N | PRT |
324 | 脂肪酶變體 | M3Q、C11A、L186Y、A202N、L280A、P312N | NUC |
325 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、Q111E、L186Y、F192A、D301A | PRT |
326 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、Q111E、L186Y、F192A、D301A | NUC |
327 | 脂肪酶變體 | C11A、E79S、W85H、Q111E、L186Y、L280A、P312N | PRT |
328 | 脂肪酶變體 | C11A、E79S、W85H、Q111E、L186Y、L280A、P312N | NUC |
329 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、N84T、L186Y、A202N、P309C | PRT |
330 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、N84T、L186Y、A202N、P309C | NUC |
331 | 脂肪酶變體 | C11A、Q31W、E79S、L186Y、L280A、D301A、P309C | PRT |
332 | 脂肪酶變體 | C11A、Q31W、E79S、L186Y、L280A、D301A、P309C | NUC |
333 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、E79S、L186W、A202N、D301A、P312N | PRT |
334 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、E79S、L186W、A202N、D301A、P312N | NUC |
335 | 脂肪酶變體 | M3Q、C11A、L186W、A202N、L280A、P309C、P312N | PRT |
336 | 脂肪酶變體 | M3Q、C11A、L186W、A202N、L280A、P309C、P312N | NUC |
337 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、L186W、F192A、A202N、L280A、P309C | PRT |
338 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、L186W、F192A、A202N、L280A、P309C | NUC |
339 | 脂肪酶變體 | K8E、L17P、N29W、K40M、E79S、L186W、F192A、L280A | PRT |
340 | 脂肪酶變體 | K8E、L17P、N29W、K40M、E79S、L186W、F192A、L280A | NUC |
341 | 脂肪酶變體 | S4P、N29H、N84T、Q111E、L186Y、A202N、L280A、D301A | PRT |
342 | 脂肪酶變體 | S4P、N29H、N84T、Q111E、L186Y、A202N、L280A、D301A | NUC |
343 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、Q111E、F192A、L280A、P309C、P312N | PRT |
344 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、Q111E、F192A、L280A、P309C、P312N | NUC |
345 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、V18C、L186Y、A202N、L280A、P309C、P312N | PRT |
346 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、V18C、L186Y、A202N、L280A、P309C、P312N | NUC |
347 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、K8E、C11A、E79S、W85H、L186Y、F192A、D301A | PRT |
348 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、K8E、C11A、E79S、W85H、L186Y、F192A、D301A | NUC |
349 | 脂肪酶變體 | K8E、E79S、W85H、Q111E、L186Y、F192A、A202N、L280A、P309C | PRT |
350 | 脂肪酶變體 | K8E、E79S、W85H、Q111E、L186Y、F192A、A202N、L280A、P309C | NUC |
351 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、E79S、Q111E、L186W、L280A、D301A | PRT |
352 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、E79S、Q111E、L186W、L280A、D301A | NUC |
353 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186Y、F192A、A202N、L280A、D301A | PRT |
354 | 脂肪酶變體 | L17P、E79S、L186Y、F192A、A202N、L280A、D301A | NUC |
355 | 脂肪酶變體 | Q31W、E79S、Q111E、L186W、A202N、L280A、D301A | PRT |
356 | 脂肪酶變體 | Q31W、E79S、Q111E、L186W、A202N、L280A、D301A | NUC |
357 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、Q111E、L186W、F192A、D301A | PRT |
358 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、Q111E、L186W、F192A、D301A | NUC |
359 | 脂肪酶變體 | C11A、K40M、E79S、Q111E、L186W、F192A、D301A | PRT |
360 | 脂肪酶變體 | C11A、K40M、E79S、Q111E、L186W、F192A、D301A | NUC |
361 | 脂肪酶變體 | L17P、V18A、K40M、Q111E、L186Y、A202N、L280A | PRT |
362 | 脂肪酶變體 | L17P、V18A、K40M、Q111E、L186Y、A202N、L280A | NUC |
363 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、E79S、L186W、A202N、D301A、P309C | PRT |
364 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、E79S、L186W、A202N、D301A、P309C | NUC |
365 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、C11A、L17P、E79S、Q111E、L186Y | PRT |
366 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、C11A、L17P、E79S、Q111E、L186Y | NUC |
367 | 脂肪酶變體 | K40M、E79S、Q111E、L186Y、A202N、L280A、P309C、P312N | PRT |
368 | 脂肪酶變體 | K40M、E79S、Q111E、L186Y、A202N、L280A、P309C、P312N | NUC |
369 | 脂肪酶變體 | C11A、N29W、Q31W、E79S、L186Y、A202N、L280A、D301A | PRT |
370 | 脂肪酶變體 | C11A、N29W、Q31W、E79S、L186Y、A202N、L280A、D301A | NUC |
371 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、Q111E、L186W、F192A、L280A、P309C | PRT |
372 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、Q111E、L186W、F192A、L280A、P309C | NUC |
373 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、Q31W、K40M、E79S、Q111E、L186Y、L280A | PRT |
374 | 脂肪酶變體 | L17P、N29H、Q31W、K40M、E79S、Q111E、L186Y、L280A | NUC |
375 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、E79S、Q111E、L186W、A202N、L280A、P309C | PRT |
376 | 脂肪酶變體 | K8E、K40M、E79S、Q111E、L186W、A202N、L280A、P309C | NUC |
377 | 脂肪酶變體 | S4P、K40M、E79S、Q111E、L186Y、A202N、L280A、P309C | PRT |
378 | 脂肪酶變體 | S4P、K40M、E79S、Q111E、L186Y、A202N、L280A、P309C | NUC |
379 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、N29W、Q31W、Q111E、L186Y、A202N、L280A、P309C | PRT |
380 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、N29W、Q31W、Q111E、L186Y、A202N、L280A、P309C | NUC |
381 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、L186Y、A202N、L280A、D301A | PRT |
382 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、L186Y、A202N、L280A、D301A | NUC |
383 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、E79S、Q111E、L186W、F192A、A202N、L280A | PRT |
384 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、E79S、Q111E、L186W、F192A、A202N、L280A | NUC |
385 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、V18A、E79S、Q111E、L186Y、L280A、D301A、P312N | PRT |
386 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、V18A、E79S、Q111E、L186Y、L280A、D301A、P312N | NUC |
387 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、V18A、K40M、E79S、N84T、L186Y、A202N、L280A | PRT |
388 | 脂肪酶變體 | M3Q、L17P、V18A、K40M、E79S、N84T、L186Y、A202N、L280A | NUC |
389 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、N84T、Q111E、L186Y、A202N、L280A、D301A | PRT |
390 | 脂肪酶變體 | L17P、K40M、E79S、N84T、Q111E、L186Y、A202N、L280A、D301A | NUC |
391 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、L17P、K40M、E79S、L186Y、A202N、L280A、D301A | PRT |
392 | 脂肪酶變體 | M3Q、S4P、L17P、K40M、E79S、L186Y、A202N、L280A、D301A | NUC |
393 | 脂肪酶變體 | N29W、Q31W、L186W、P312N | PRT |
394 | 脂肪酶變體 | N29W、Q31W、L186W、P312N | NUC |
395 | 脂肪酶變體 | L186Y、F192A、P309C、P312N | PRT |
396 | 脂肪酶變體 | L186Y、F192A、P309C、P312N | NUC |
397 | 脂肪酶變體 | N29W、Q31W、W85H、L186Y、P312N | PRT |
398 | 脂肪酶變體 | N29W、Q31W、W85H、L186Y、P312N | NUC |
399 | 脂肪酶變體 | K40M、L42D、E79S、N84T、L186Y、F192A、D301A | PRT |
400 | 脂肪酶變體 | K40M、L42D、E79S、N84T、L186Y、F192A、D301A | NUC |
401 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186Y、F192V、Q217M、D301A | PRT |
402 | 脂肪酶變體 | E79S、N84T、L186Y、F192V、Q217M、D301A | NUC |
根據本發明之方法之步驟1可在有或無溶劑之情況下進行。較佳係來自由以下組成之群之溶劑:甲基三級丁基醚、庚烷、甲苯、二甲苯、均三甲苯、苯甲醚、氯苯、正丁醇、異丙醇、正丙醇及乙醇及亦其混合物。特別佳係來自由以下組成之群之溶劑:甲苯、二甲苯、均三甲苯、正丁醇及乙醇及亦其混合物。同樣特別佳係在缺乏溶劑之情況下進行反應。
基於使用之混合物(I)之莫耳量計,醯化劑或羧化劑R-C(=O)R
1較佳係以1至25當量之量使用。特別佳地,其係以1至10當量之量使用。尤其佳地,其係以1至5當量之量使用。
根據步驟1之反應通常係在0至10 巴氫壓下進行。1至5 巴之氫壓係較佳的。
根據步驟1之反應通常係在40至130℃之溫度下進行。較佳地,該反應係在70至130℃下進行。特別佳地,該反應係在105至125℃下進行。
較佳地,鈀負載為0.5至10重量%之碳載鈀(Pd/C)或氧化鋁載鈀(Pd/Al
2O
3)觸媒係於步驟1中用作金屬觸媒。同樣較佳地,以1至10莫耳%之化學計量使用IUPAC名稱為1-羥基四苯基環戊二烯基(四苯基-2,4-環戊二烯-1-酮)-μ-氫四羰基二釕(II)之Shvo觸媒。特別佳地,使用鈀負載為0.5至10重量%之碳載鈀(Pd/C)或氧化鋁載鈀(Pd/Al
2O
3)觸媒。尤其佳地,使用鈀負載為0.5至10重量%之氧化鋁載鈀(Pd/Al
2O
3)觸媒。
觸媒係以式(I)化合物之0.1至10重量%之量使用;優先考慮使用0.5至5重量%。所使用之觸媒的量係基於該等觸媒之乾質量計算。
根據本發明之方法之步驟2中規定之組分(II)之分離係藉由熟習此項技術者已知的結晶或熟習此項技術者已知的一些其他合適之純化方法進行。
根據本發明之方法之步驟3中規定之鹼通常來自由以下組成之群:氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀、甲醇鋰、甲醇鈉、甲醇鉀、乙醇鋰、乙醇鈉及乙醇鉀。特別佳地,使用鹼氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、乙醇鋰、乙醇鈉及乙醇鉀。
較佳地,使用鹼氫氧化鋰、氫氧化鈉及氫氧化鉀。
通常,基於使用之組分(II)之莫耳量計,鹼係以1.00至3.00當量之化學計量使用。較佳地,該鹼係以1.50至2.50當量之量使用。尤其佳地,該鹼係以1.75至2.25當量之量使用。
較佳地,使用乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、二級丁醇、三級丁醇及1-甲氧基丙-2-醇及亦甲苯、二甲苯及藜蘆醚作為溶劑。特別佳地,使用乙醇、正丁醇、異丙醇、1-甲氧基丙-2-醇、甲苯、二甲苯及藜蘆醚。尤其佳地,使用乙醇、正丁醇及二甲苯。
根據步驟3之反應通常係在60至140℃之溫度下進行。較佳地,該反應係在80至120℃下進行。特別佳地,該反應係在90至110℃下進行。
胺甲酸酯(II) (其中R = MeO、EtO、iPrO及n-BuO)係新穎的且同樣由本發明提供。
下列實例更特定闡明本發明。
於去礦質水中使用47.6 g/l粒狀介質及4 ml/l甘油製備Terrific肉湯(TB)培養基並在121℃下將其滅菌20分鐘。
脂肪酶之選殖
編碼如本文描述之脂肪酶及脂肪酶變體之核苷酸序列可如根據先前技術已知合成,例如如由相關服務提供者提供,諸如Eurofins Genomics GmbH (Eurofins Genomics GmbH, Anzinger Str. 7a, 85560 Ebersberg, Germany)。簡而言之,如本文描述,基於載體pKA81a,將野生型脂肪酶之核酸序列(SEQ ID No. 2)或相關變體選殖至表現載體內。藉助於通常已知的方法將基因元件引入經修飾之pKA81a 載體內。藉由將表現載體引入電轉感受態大腸埃希氏桿菌MG1655細胞內表現野生型脂肪酶及脂肪酶變體。
酶變體之產生將核苷酸取代(置換)引入核酸親代序列內,例如以用胺基酸交換其他胺基酸。可使用許多分子生物學方法以達成此等置換。一種可用於產生根據本發明之突變核酸及相應之突變蛋白質之方法係於編碼一或多種胺基酸之密碼子處之定點誘變,該等密碼子係經預先選擇。用於達成此等定點突變之方法為一般技術者熟知且充分描述於文獻中(特定言之:由M.J. McPHERSON, IRL PRESS編輯之Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991)或為可使用商業套組(例如來自Qiagen或Stratagene之QUIKCHANGE™閃電誘變套組)之方法。在定點誘變之後將核酸轉形至大腸埃希氏桿菌MG1655細胞內。
於合適之生物轉形反應中測試轉形細胞以確定產物產率及產物選擇性。合適之生物轉化反應係如下描述。如根據先前技術已知進行序列驗證。
藉由將一體積之40%甘油溶液添加至一體積之大腸桿菌培養物製備用各別表現質體轉形之大腸桿菌培養物之甘油儲備液。
為分離單個細菌菌落,將大腸桿菌培養物之適當稀釋液接種至含有合適濃度之卡那黴素之LB瓊脂盤上並在37℃下培養直至獲得單個菌落。
[(1R,2S)-2,6-二甲基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺甲酸乙酯之合成
實例1:
於100 mL高壓釜中裝入10 g 2,6-二甲基茚-1-胺(82%反式異構體及18%順式異構體之外消旋混合物)、2當量之碳酸二乙酯、0.3莫耳%鈀觸媒(5%氧化鋁載鈀)及3重量%具有脂肪酶活性之蛋白質之混合物。將該高壓釜封閉,並注入5 巴氬,接著進行三次排氣。此後,注入5 巴氫並在120℃下進行攪拌,歷時16小時。然後將該高壓釜冷卻至室溫並排氣。反應混合物用碳酸二乙酯及乙酸乙酯稀釋並藉由HPLC分析。測定2,6-二甲基-1-胺基茚烷之轉化率及形成[(1R,2S)-2,6-二甲基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺甲酸乙酯之化學選擇性及立體選擇性(表5,編號1)。
類似於實例1進行實例2至36 (表5)。
表5:
編號 | 觸媒 [莫耳%] | 蛋白質 [重量%] | p [巴] | T [℃] | t [h] | 轉化率[%] | 化學選擇性[%] | 立體選擇性[%] | |
1 | 0.30 | 3.0 | 5 | 120 | 16 | 94.6 | 89.0 | 95.4 | |
2 | 0.30 | 3.0 | 3 | 120 | 16 | 81.3 | 82.4 | 92.0 | |
3 | 0.60 | 3.0 | 3 | 120 | 16 | 93.1 | 83.7 | 97.4 | |
4 | 0.60 | 3.0 | 5 | 120 | 16 | 94.2 | 94.2 | 95.6 | |
5 | 0.30 | 2.0 | 3 | 120 | 16 | 88.9 | 91.7 | 96.0 | |
6 | 0.30 | 2.0 | 5 | 120 | 16 | 88.7 | 94.4 | 97.4 | |
7 | 0.30 | 2.5 | 5 | 130 | 16 | 89.6 | 87.3 | 95.9 | |
8 | 0.30 | 2.5 | 5 | 140 | 16 | 81.0 | 80.7 | 92.8 | |
9 | 0.30 | 2.5 | 5 | 120 | 16 | 91.7 | 94.6 | 94.2 | |
10 | 0.30 | 2.5 | 5 | 120 | 20 | 93.7 | 93.0 | 95.6 | |
11 | 0.30 | 2.5 | 5 | 120 | 16 | 85.6 | 96.4 | 91.6 | |
12 | 0.15 | 1.3 | 5 | 110 | 12 | 63.0 | 95.4 | 95.4 | |
13 | 0.60 | 3.0 | 5 | 110 | 12 | 84.7 | 94.7 | 96.0 | |
14 | 0.60 | 1.3 | 5 | 110 | 20 | 81.2 | 92.7 | 96.2 | |
15 | 0.60 | 3.0 | 5 | 130 | 12 | 91.5 | 88.1 | 95.7 | |
16 | 0.30 | 2.0 | 5 | 130 | 16 | 86.5 | 88.5 | 95.4 | |
17 | 0.15 | 3.0 | 5 | 110 | 12 | 67.3 | 96.6 | 90.0 | |
18 | 0.15 | 1.3 | 5 | 130 | 12 | 68.5 | 91.7 | 95.7 | |
19 | 0.30 | 1.3 | 5 | 120 | 16 | 76.6 | 92.5 | 96.0 | |
20 | 0.30 | 2.0 | 5 | 110 | 16 | 79.1 | 95.5 | 94.8 | |
21 | 0.15 | 3.0 | 5 | 110 | 20 | 75.2 | 95.3 | 88.8 | |
22 | 0.15 | 3.0 | 5 | 130 | 12 | 83.8 | 89.0 | 94.2 | |
23 | 0.60 | 1.3 | 5 | 130 | 20 | 83.0 | 86.2 | 95.5 | |
24 | 0.60 | 3.0 | 5 | 130 | 20 | 95.2 | 87.6 | 96.2 | |
25 | 0.30 | 2.0 | 5 | 120 | 12 | 79.6 | 91.9 | 95.9 | |
26 | 0.60 | 1.3 | 5 | 130 | 12 | 76.8 | 84.3 | 95.7 | |
27 | 0.15 | 1.3 | 5 | 110 | 20 | 70.0 | 91.0 | 94.1 | |
28 | 0.45 | 3.0 | 3 | 120 | 16 | 82.0 | 88.3 | 89.1 | |
29 | 0.15 | 1.3 | 5 | 130 | 20 | 82.0 | 90.4 | 95.6 | |
30 | 0.60 | 1.3 | 5 | 110 | 12 | 61.4 | 94.0 | 97.6 | |
31 | 0.15 | 2.0 | 5 | 120 | 16 | 82.6 | 93.8 | 94.2 | |
32 | 0.15 | 3.0 | 5 | 130 | 20 | 88.8 | 85.9 | 94.4 | |
33 | 0.60 | 3.0 | 5 | 110 | 20 | 92.4 | 92.0 | 95.5 | |
34 | 0.30 | 2.0 | 5 | 120 | 20 | 90.2 | 86.5 | 95.8 | |
35 | 0.60 | 2.0 | 5 | 120 | 16 | 91.0 | 86.4 | 96.5 | |
36 | 0.30 | 3.0 | 5 | 123 | 17 | 95.0 | 91.9 | 96.1 |
實例38:
於1000 mL高壓釜中裝入150 g 2,6-二甲基茚-1-胺(82%反式異構體及18%順式異構體之外消旋混合物)、2當量之碳酸二乙酯、0.3莫耳%鈀觸媒(5%氧化鋁載鈀)及3重量%具有脂肪酶活性之蛋白質之混合物。將該高壓釜封閉,並注入5 巴氬,接著進行三次排氣。此後,注入3 巴氫並在120℃下進行攪拌,歷時25小時。然後將該高壓釜冷卻至室溫並排氣。反應混合物用總計578 g碳酸二乙酯及350 mL乙酸乙酯稀釋並在70℃下透過抽吸式過濾器抽吸進行過濾。在減壓下濃縮溶液並分析殘餘物。藉由HPLC測定2,6-二甲基-1-胺基茚烷之轉化率及形成[(1R,2S)-2,6-二甲基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺甲酸乙酯之化學選擇性及立體選擇性。轉化率:99.7%;化學選擇性:93%;立體選擇性:95.6%。
藉由定量
1H-NMR測定[(1R,2S)-2,6-二甲基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺甲酸乙酯之純度及產率。純度:67.1%;產率:理論值86.9%。
1H-NMR (400 MHz;CDCl
3) δ = 7.08-7.01 (m, 3H), 4.81-4.71 (m, 2H), 4.19 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.00 (dd, J = 8.0, 14.0 Hz, 1H), 2.51-2.45 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.16 (dt, J = 8.0, 14.0 Hz, 1H), 1.31-1.26 (m, 6H)。
衍生物[(1R,2S)-2,6-二甲基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺甲酸甲酯係使用碳酸二甲酯類似地製備且係以白色固體之形式獲得。
1H-NMR (400 MHz;CDCl
3) δ = 7.08-7.01 (m, 3H), 4.79-4.78 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.00 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 1H), 2.51-2.45 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.20-2.10 (m, 1H), 1.27 (d, J = 8.0 Hz, 3H)。
TW202413319A_112129496_SEQL.xml
Claims (17)
- 一種用於製備實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法,其特徵在於 1. 於第一步驟中,使2,6-二甲基-1-胺基茚烷(I)之四種立體異構體之混合物與醯化劑或羧化劑R-C(=O)R 1, a) 在具有脂肪酶活性之蛋白質之存在下選擇性反應以形成相應之醯胺或胺甲酸酯(II)及2,6-二甲基-1-胺基茚烷之未反應立體異構體之混合物(III),及 b) 在金屬觸媒之存在下,在氫壓下,使該混合物(III)異構化,同時生物催化轉化以形成2,6-二甲基-1-吲達胺(I)之四種立體異構體之起始材料: , 其中該蛋白質係由選自由以下組成之群之胺基酸序列編碼: I.與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列具有至少80%一致性之蛋白質, II.與在SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列具有至少80%一致性之蛋白質,除該胺基酸序列具有選自由以下組成之群之修飾的事實外: i. 於位置186處之胺基酸不同於L; ii. 於位置280處之胺基酸不同於L; iii. 於位置312處之胺基酸不同於P; iv. 於位置3處之胺基酸不同於M; v. 於位置29處之胺基酸不同於N; vi. 於位置17處之胺基酸不同於L; vii. 於位置4處之胺基酸不同於S; viii. 於位置18處之胺基酸不同於V; ix. 於位置202處之胺基酸不同於A; x. 於位置301處之胺基酸不同於D; xi. 於位置309處之胺基酸不同於P; xii. 於位置31處之胺基酸不同於Q; xiii. 於位置111處之胺基酸不同於Q; xiv. 於位置85處之胺基酸不同於W; xv. 於位置8處之胺基酸不同於K; xvi. 於位置79處之胺基酸不同於E; xvii. 於位置40處之胺基酸不同於K; 2. 於第二步驟中,該醯胺或胺甲酸酯(II)藉由結晶作用與次要組分分離,及 3. 於第三步驟中,使用鹼或酸將該醯胺或胺甲酸酯(II)轉化為該實質性對映體純(1R,2S)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷(IV), 其中R意謂選自由以下組成之群之基團:CH 2OCH 3、CH 2OCH 2CH 3、CH 3、OCH 3、OCH 2CH 3、OCH(CH 3) 2、OCH 2CH 2CH 2CH 3, 及 其中R 1意謂選自由以下組成之群之基團:OCH 3、OCH 2CH 3、OCH(CH 3) 2及OCH 2CH 2CH 2CH 3。
- 如請求項1之方法,其中 R意謂選自由以下組成之群之基團:OCH 3及OCH 2CH 3, 及 R 1意謂選自由以下組成之群之基團:OCH 3及OCH 2CH 3。
- 如請求項1之方法,其中該蛋白質係選自由以下組成之群: a) 包含SEQ ID No. 1顯示之胺基酸序列之蛋白質,除於位置186處之胺基酸不同於L的事實外; b) 具有與在a)顯示之胺基酸序列具有至少80%一致性之胺基酸序列之蛋白質,限制條件為於位置186處之胺基酸不同於L,其中根據a)或b)之蛋白質中於位置186處之胺基酸較佳為F、W、Y、E、D、Q、T、H、P、C、K、S、N、I或V。
- 如請求項1之方法,其中該蛋白質具有至少一個,較佳至少兩個,更佳至少三個選自由以下組成之群之其他胺基酸取代: (i) 於位置79處之胺基酸不同於E,較佳於位置79處之胺基酸係S、W或I,更佳於位置79處之胺基酸係S; (ii) 於位置202處之胺基酸不同於A,較佳於位置202處之胺基酸係N; (iii) 於位置280處之胺基酸不同於L,較佳於位置280處之胺基酸係A; (iv) 於位置301處之胺基酸不同於D,較佳於位置301處之胺基酸係A; (v) 於位置3處之胺基酸不同於M,較佳於位置3處之胺基酸係Q; (vi) 於位置11處之胺基酸不同於C,較佳於位置11處之胺基酸係A; (vii) 於位置17處之胺基酸不同於L,較佳於位置17處之胺基酸係P; (viii) 於位置40處之胺基酸不同於K,較佳於位置40處之胺基酸係M; (ix) 於位置111處之胺基酸不同於Q,較佳於位置111處之胺基酸係E。
- 如請求項1之方法,其中該蛋白質具有於位置186處及於位置79處及於位置301處及於位置40處之胺基酸取代,其中較佳於位置186處之胺基酸係Y及於位置79處之胺基酸係S及於位置301處之胺基酸係A及於位置40處之胺基酸係M。
- 如請求項1之方法,其中該蛋白質係以該混合物(I)之0.1至50重量%之量使用。
- 如請求項1之方法,其中該蛋白質係以該混合物(I)之0.5至10重量%之量使用。
- 如請求項1之方法,其中該蛋白質係以該混合物(I)之1至5重量%之量使用。
- 如請求項1之方法,其中步驟1係在無溶劑之情況下或在選自由以下組成之群之溶劑之存在下進行:甲苯、二甲苯、均三甲苯、正丁醇及乙醇。
- 如請求項1之方法,其中於步驟1中, 基於使用之混合物(I)之莫耳量計,該醯化劑或羧化劑R-C(=O)R 1係較佳以1至25當量之量使用。
- 如請求項1之方法,其中於步驟1中, 基於使用之混合物(I)之莫耳量計,該醯化劑或羧化劑R-C(=O)R 1係較佳以1至5當量之量使用。
- 如請求項1之方法,其中於步驟1中,該反應係在70至130℃之溫度下進行。
- 如請求項1之方法,其中於步驟1中,該反應係在105至125℃之溫度下進行。
- 如請求項1之方法,其中於步驟1中,使用鈀負載為0.5至10重量%之碳載鈀(Pd/C)或氧化鋁載鈀(Pd/Al 2O 3)觸媒。
- 如請求項1之方法,其中該觸媒係以該等式(I)化合物之0.5至5重量%之量使用。
- 如請求項1之方法,其中於步驟1中,該反應係於1至5 巴氫壓之壓力範圍內進行。
- 一種式(II)化合物, 其中R = MeO、EtO、iPrO及 n-BuO。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP22191618.2 | 2022-08-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202413319A true TW202413319A (zh) | 2024-04-01 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10023886B2 (en) | (R)-selective amination | |
US20220220457A1 (en) | Nucleic acids encoding improved transaminase proteins | |
CN114341344A (zh) | 用于改进醛脱氢酶活性的工程微生物体和方法 | |
JP6539212B2 (ja) | 光学活性環状イミノ酸の製造方法 | |
US20230416696A1 (en) | Modified daao enzyme and application thereof | |
CA2935979A1 (en) | Recombinant microorganism having enhanced d(-) 2,3-butanediol producing ability and method for producing d(-) 2,3-butanediol using the same | |
AU2003221082A1 (en) | Novel carbonyl reductase, gene encoding it and process for producing optically active alcohols using the same | |
TW202413319A (zh) | 以動態動力學立體異構體分解製備(1r,2s)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法 | |
TW202412627A (zh) | 製備(1r,2s)-2,6-二甲基-1-胺基茚烷之方法 | |
WO2024041972A1 (en) | Nucleic acids encoding improved lipase proteins | |
CN1449447A (zh) | 丁炔醇ⅰ酯酶 | |
EP1904632B1 (en) | A microorganism of enterobacteriacae genus haboring genes associated with l-carintine biosynthesis and methos of producing l-carnitine using the microorganism | |
WO2024041962A1 (de) | Verfahren zur herstellung von (1r,2s)-2,6-dimethyl-1-indanamin durch dynamisch-kinetische stereoisomerenspaltung | |
CN113583989B (zh) | 经修饰的苏氨酸转醛酶及其应用 | |
CN112752841A (zh) | 经修饰的甾醇酰基转移酶 | |
WO2024041961A2 (de) | Verfahren zur herstellung von (1r,2s)-2,6-dimethyl-1-indanamin | |
JP5987824B2 (ja) | 改変型リパーゼ及びその製造方法、並びに当該酵素を用いた反応 | |
EP4180524A1 (en) | Modified glutamate dehydrogenase and use thereof | |
US20200224225A1 (en) | Method for preparing amines from aldehydes and ketones by biocatalysis | |
WO2021219124A1 (zh) | 经修饰的苏氨酸转醛酶及其应用 | |
CN116987687A (zh) | 卤醇脱卤酶突变体及其应用 | |
CN114277010A (zh) | 转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用 | |
WO2005005648A1 (ja) | 新規な光学活性カルボン酸の製造法 | |
JP4652915B2 (ja) | ノルボルナン誘導体の加水分解に関与するdna | |
KR20110029697A (ko) | L형 아미노산아미드에 특이적인 에난티오―선택적 아미다제 및 이를 코딩하는 dna |