BE1027221B1 - Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase - Google Patents

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Claire Remacle
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Abstract

La présente invention porte sur un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.

Description

Polypeptide monomerique presentant une activite hydrogenase, en particulier polypeptide monomerique recombinant presentant une activite hydrogenase La présente invention porte sur un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier sur un polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase, sur une cellule hôte incluant ce polypeptide monomérique et sur une cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour ce polypeptide monomérique. La présente invention porte également sur un procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier sur un procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase et sur l’utilisation d’un tel polypeptide monomérique, en particulier sur l’utilisation d'un tel polypeptide monomérique recombinant.
La disponibilité décroissante de sources d'énergie fossile et la crainte d'un changement climatique dramatique ont favorisé l'émergence de technologies propres et renouvelables. L'hydrogène (Hz) est considéré comme un vecteur d’énergie renouvelable prometteur en raison de sa forte teneur en énergie et de l’absence de pollution lors de son utilisation dans les piles à combustible. La production d’Hz est actuellement réalisée par extraction chimique d'hydrocarbures fossiles, électrolyse de l'eau ou pyrolyse de biomasse. Cependant, le manque de systèmes de production à la fois non-polluants et commercialement viables est une limitation majeure. L'utilisation de méthodes de production biotechnologique d’Hz, aussi appelé bio-hydrogène, pourrait être une solution. Le nombre de recherches sur la production de bio-hydrogène a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Cela inclut la production microbienne principalement par le processus de la fermentation dans les bactéries et de la photosynthèse dans les microalgues, mais aussi la generation enzymatique d'hydrogène par « électro-enzymologie ». Toutes ces méthodes reposent sur des enzymes particulières appelées hydrogénases.
Les hydrogénases sont des métallo-enzymes qui catalysent la réaction chimique : 2 H* + 2e’ + Ha. La réaction est réversible et sa direction
? BE2019/5783 dépend du potentiel redox des composants capables d'interagir avec l'enzyme. En présence d’Hz et d’un accepteur d’électrons, une hydrogénase consomme l'hydrogène. En présence d’un donneur d’électrons de faible potentiel, une hydrogénase utilise des protons comme accepteurs d’électrons et produit de l’Hz. Les hydrogénases sont largement répandues parmi les microorganismes car nombre d’entre eux utilisent l'hydrogène comme vecteur ou source d'énergie. Ces enzymes comptent de nombreux représentants dans le domaine des bactéries et des archées et sont également présentes dans certains organismes eucaryotes unicellulaires. Malgré leur diversité à bien des égards (hôte, taille, structure quaternaire, donneurs ou accepteurs d'électrons), les hydrogénases sont divisées en trois classes phylogénétiquement distinctes : les [Fe]- hydrogénases, les [FeFe]-hydrogénases et les [NiFe]-hydrogénases. Chaque classe est caractérisée par une composition métallique distinctive du site actif. Physiologiquement, il a été démontré que ces enzymes fonctionnent comme une valve pour un excès d'électrons.
Le centre catalytique des [Fe]-hydrogénases ne contient aucun centre FeS ou Ni et a donc été nommé « hydrogénase libre de centre fer-soufre » ou [Fe]-hydrogénases (Shima and Thauer. 2007. A third type of hydrogenase catalyzing H2 activation. Chem Rec 7:37-46). Les [Fe]-hydrogénases sont limitées à certains microorganismes méthanogènes (Pilak et al. 2006. The crystal structure of the apoenzyme of the iron-sulphur cluster-free hydrogenase. J Mol Biol 358:798-809) où elles sont essentielles à la croissance lors d’une carence en nickel (Thauer. 1998. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. 1998 Marjory Stephenson Prize Lecture. Microbiology 144 (Pt 9):2377-2406). Associé à un cofacteur spécifique, ces enzymes ont des propriétés catalytiques très différentes des autres types d’hydrogénases. En effet, elles ne catalysent pas la réaction réversible de production d’H2 (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Pour cette raison, ainsi que par leur faible distribution, cette classe d'hydrogénases a été peu étudiée. La grande majorité des hydrogénases connues appartiennent aux deux autres classes.
Les [FeFe]-hydrogénases sont des enzymes monomériques dont le centre catalytique est hautement conservé. Il s'agit d'un site de fer bi-nucléaire lié à un centre [4Fe-45] par un pont de cystéine. Les ligands non protéiques, le cyanure (CN) et le monoxyde de carbone (CO), sont liés aux atomes de fer du centre bi-nucléaire. Les atomes de fer partagent également deux ligands soufre (Nicolet et al. 2000. A novel FeS cluster in Fe-only hydrogenases. Trends Biochem Sci 25:138-143, Nicolet et al. 2002. Fe-only hydrogenases: structure, function and evolution. J Inorg Biochem 91:1-8). Des domaines supplémentaires hébergent plusieurs centres FeS et assurent le transfert d'électrons entre la source d'électrons externe et le site actif intégré dans ces protéines monomériques. De plus, un canal hydrophobe relie la surface au site actif et fournit un accès pour les protons et une sortie pour les molécules d’Hz. Trois protéines chaperonnes nommées HydE, HydF et HydG sont connues comme nécessaires à l'assemblage correct des [FeFe]-hydrogénases (Vignais et al.
2001. Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol Rev 25:455-501). Ces enzymes sont présentes dans les procaryotes anaérobies (genres Clostridium ou Desulfovibrio), mais aussi dans quelques eucaryotes inférieurs tels que les champignons anaérobies ou les microalgues unicellulaires (genres Chlorella ou Chlamydomonas) (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Les [FeFe]-hydrogénases favorisent thermodynamiquement la réoxydation du cofacteur (ferrédoxine ou NADH) et génèrent ainsi de l'H2. Ces enzymes sont donc généralement impliquées dans l'élimination d’un excès de pouvoir redox dans la cellule afin d’éviter, par exemple, un arrêt de la fermentation. Elles sont également capables d'interagir avec la chaine photosynthétique d'un groupe restreint de microalgues pour oxyder la chaine photosynthétique et ainsi activer la fixation du carbone après une incubation anoxique (Ghysels et al. 2013. Function of the chloroplast hydrogenase in the microalga Chlamydomonas: the role of hydrogenase and state transitions during photosynthetic activation in anaerobiosis. PLoS One 8:e64161, Godaux et al.
2015. Induction of Photosynthetic Carbon Fixation in Anoxia Relies on Hydrogenase Activity and Proton-Gradient Regulation-Like1-Mediated Cyclic Electron Flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol 168:648-658).
Les [NiFe]-hydrogenases forment des hétéro-multimères globulaires (Volbeda et al. 1995. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature 373:580-587). Le site actif bi-metallique [NiFe] est situé dans la grande sous-unité où il est coordonné par quatre cystéines et trois ligands non protéiques, une molécule de CO et deux CN, liés à l’atome de fer (Happe et al. 1997. Biological activation of hydrogen. Nature 385:126, Pierik et al. 1999. Carbon monoxide and cyanide as intrinsic ligands to iron in the active site of [NiFe]-hydrogenases. NiFe(CN)2CO, Biology's way to activate H2. J Biol Chem 274:3331-3337). Les autres sous-unités de l’hétéro-multimère contiennent plusieurs centres FeS médiaux et distaux, qui conduisent les électrons entre le site actif et le donneur ou l'accepteur d'électrons physiologique. Le groupe [4Fe- 45] situé à proximité du site actif est considéré comme essentiel à l'activité (Albracht. 1994. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim Biophys Acta 1188:167-204). En plus des gènes structurels, il existe plusieurs gènes accessoires impliqués dans la maturation et l'insertion de Ni, Fe, CO et CN dans le site actif de ces hétéro-multimères. En effet, la maturation des [NiFe]- hydrogénases suit une voie complexe impliquant au moins sept protéines auxiliaires (HypA-F et une endopeptidase) (Vignais and Billoud. 2007.
Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview.
Chem Rev 107:4206-4272). Une autre caractéristique du site actif des [NiFe]- hydrogénases est la forte affinité pour l'hydrogène. Ces enzymes agissent donc principalement en consommant l’H2 chez le micro-organisme hôte, même si certaines [NiFe]-hydrogénases présentent une bonne capacité de production d'hydrogène. Les [NiFe]-hydrogénases sont des enzymes assez répandues parmi les procaryotes avec de nombreux représentants chez les bactéries et les archées. La classification des [NiFe]-hydrogénases est basée sur les alignements de séquences en acides aminés des différentes sous-unités et divise les [NiFe]-hydrogénases en quatre groupes. Remarquablement, cette classification est en bon accord avec les groupes dérivés des fonctions physiologiques (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272).
L’extrême sensibilité des hydrogénases à l’oxygène aussi bien in vitro que in vivo est un problème lorsque l’on considère ces enzymes pour la
> BE2019/5783 production d'hydrogène à un niveau industriel. L’oxygène se lie en tant que ligand au site actif, accepte les électrons et est réduit en espèce réactive de l'oxygène (ROS) piégée dans l'enzyme. Cela peut entraîner des dommages permanents lorsque le ROS survit suffisamment longtemps pour attaquer le centre catalytique vulnérable. Les [FeFe]-hydrogénases présentent une sensibilité grave à l'O2 car l'enzyme est endommagée de manière irréversible après une exposition à de petites concentrations d'O2 (Ghirardi et al. 1997. Oxygen sensitivity of algal H2- production. Appl Biochem Biotechnol 63-65:141-151). Cependant, les [NiFe]- hydrogénases sont décrites comme étant plus résistantes que les [FeFe]- hydrogénases aux dommages causés par l'oxygène. De plus, les [NiFe]- hydrogénases sont inactivées de manière réversible par l’O2. Certains micro- organismes, tels que Ra/stonia sp., ont même développé un site actif tolérant à l'oxygène, et sont capables d'oxyder l'hydrogène même en présence d'air (Van der Linden et al. 2004. The soluble [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha contains four cyanides in its active site, one of which is responsible for the insensitivity towards oxygen. J Biol Inorg Chem 9:616-626). Ces diverses caractéristiques font des [NiFe]-hydrogénases de meilleurs candidats pour une utilisation technologique industriellement viable.
HoxEFUYH est une [NiFe]-hydrogénase bien caractérisée présente chez la cyanobactérie Synéchocystis sp. PCC6803. HoxEFUYH est une [NiFe]- hydrogénase pentamérique et cytoplasmique. HoxY et HoxH forment la partie « hydrogénase » tandis que HoxE, HoxF et HoxU constituent la partie en contact avec le cofacteur redox (Carrieri et al. 2011. The role of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377). HoxH est la sous-unité responsable de l'activité catalytique, c’est-à-dire la sous-unité comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase. HoxH contient les résidus conservés pour la liaison des atomes de nickel et de fer. HoxY contient le groupe proximal [4Fe-4S] prèRs du centre catalytique NiFe. HoxF et HoxU sont des protéines de type fer-soufre responsables de l'interaction in vivo avec le substrat (NADH, flavodoxine ou ferrédoxine réduite). HoxFU contiennent les centres FeS médiaux et distaux transportant les électrons vers HoxYH. La fonction de HoxE n'est pas claire, mais il peut s'agir d'une sous-unité d’ancrage dans la membrane.
Une analyse mutationnelle de la voie de maturation a identifié sept facteurs de maturation essentiels, appelés HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW (Hoffmann et al. 2006. Mutagenesis of hydrogenase accessory genes of Synechocystis sp.
PCC 6803. Additional homologues of hypA and hypB are not active in hydrogenase maturation.
FEBS J 273:4516-4527). Un modèle de maturation de HoxEFUYH a été proposé (Carrieri et al. 2011. The role of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria.
Bioresour Technol 102:8368-8377, Cassier-Chauvat et al. 2014. Advances in the function and regulation of hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis PCC6803. Int J Mol Sci 15:19938-19951). Au cours de l'assemblage de HoxHY, la sous-unité HoxH est traitée par la protéase spécifique HoxW, puis le site [Ni-Fe] est ajouté à la sous- unité catalytique par le complexe HypABCDEF.
Le génome complet de Synéchocystis sp.
PCC6803 a été séquencé.
Les gènes HoxEFUYH ont été identifiés comme étant regroupés dans un opéron octacistronique, contrairement aux gènes hypABCDEF dispersés dans le chromosome de Synéchocystis.
Le promoteur de l'opéron hoxEFUYH n'est pas très actif (Dutheil et al. 2012. The AbrB2 autorepressor, expressed from an atypical promoter, represses the hydrogenase operon to regulate hydrogen production in Synechocystis strain PCC6803. J Bacteriol 194:5423-5433). Il est régulé par diverses conditions environnementales, telles que les disponibilités en hydrogène, en lumière, en nitrates, en nickel, en oxygène ou en soufre (Oliveira and Lindblad. 2009. Transcriptional regulation of the cyanobacterial bidirectional Hox-hydrogenase.
Dalton Trans 9990-9996). Il est important de noter que les gènes hox sont exprimés de manière constitutive en présence d’oxygène (Kiss et al. 2009. Transcriptional regulation of the bidirectional hydrogenase in the cyanobacterium
Synechocystis 6803. J Biotechnol 142:31-37), mais que l'enzyme, sensible à l'oxygène, est par conséquent inactive en conditions aérobies.
La fonction physiologique précise fait encore l’objet de débats, mais HoxEFUYH fonctionnerait comme une valve de sécurité qui dissipe l’excès d’électrons en conditions redox défavorables, maintenant ainsi une balance oxydation/réduction adéquate dans la cellule pendant la fermentation ou la photosynthèse (Carrieri et al. 2011. The role of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria.
Bioresour Technol 102:8368-8377).
Il existe un grand nombre d'études sur HoxEFUYH.
De nombreuses caractéristiques font de cette enzyme un bon candidat pour la production de bio- hydrogène.
Premièrement, cette [NiFe]-hydrogénase présente un biais en faveur de la réduction des protons (Mclntosh et al. 2011. The [NiFe]-hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp.
PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production.
J Am Chem Soc 133:11308-11319). L’opéron, et par conséquent l’enzyme, sont faiblement exprimés dans Synéchocystis sp.
PCC6803 en condition aérobie (Kiss et al. 2009. Transcriptional regulation of the bidirectional hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis 6803. J Biotechnol 142:31- 37). L’inactivation de HoxEFUYH en présence d'oxygène est totale et presque instantanée.
Cependant, HoxEFUYH peut être réactivé rapidement (délais de l’ordre de la minute) en condition redox (par exemple par réduction avec de l'hydrogène et/ou par élimination de l'oxygène) (Appel et al. 2000. The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp.
PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis.
Arch Microbiol 173:333-338, Germer et al. 2009. Overexpression, isolation, and spectroscopic characterization of the bidirectional [NiFe] hydrogenase from Synechocystis sp.
PCC 6803. J Biol Chem 284:36462- 36472, Mclntosh et al. 2011. The [NiFe]-hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp.
PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production.
J Am Chem Soc 133:11308-11319). Plusieurs protocoles de purification sont disponibles (Schmitz et al. 2002. HoxE--a subunit specific for the pentameric bidirectional hydrogenase complex (HoxEFUYH) of cyanobacteria.
Biochim Biophys Acta 1554:66-74, Germer et al. 2009. Overexpression, isolation, and spectroscopic characterization of the bidirectional [NiFe] hydrogenase from Synechocystis sp.
PCC 6803. J Biol Chem 284:36462-36472) et de mise en œuvre en électrochimie (Mclntosh et al. 2011. The [NiFe]-hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp.
PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production.
J Am Chem Soc 133:11308-11319). La possibilité de catalyser efficacement la production d'hydrogène, et avec une sensibilité limitée à l'oxygène, a permis à HoxEFUYH d'être identifié comme un bon candidat.
Un procédé commun et efficace pour produire une grande quantité d'une protéine d'intérêt est la production recombinante de cette protéine au sein d'un hôte hétérologue.
Ce processus biotechnologique implique l'introduction et l'expression de gènes d'intérêts dans le génome de l'organisme hôte afin de produire une grande quantité de la protéine d'intérêt, avec un excellent degré de pureté. Il existe plusieurs systèmes de production recombinants. Le système procaryote reste le système le plus rapide et le plus facile afin de produire une protéine d'intérêt, le système eucaryote étant plus lent et plus compliqué à mettre en œuvre. Chaque organisme a ses propres avantages et inconvénients. Il n’existe pas encore de système d’expression universellement applicable. Il est très difficile de prédire quel hôte fonctionnera le mieux pour une protéine particulière ou pour une utilisation finale particulière. Escherichia coli (E. coli) est l'organisme de référence pour la production recombinante. En effet, cette bactérie est très connue du point de vue de l'ingénierie génétique et physiologique, avec par exemple : cellule optimisée (productivité élevée, utilisation de codons, inhibition des protéases endogènes), milieu de culture optimisé, temps de doublement court, faible contamination, disponibilité de nombreux vecteurs commerciaux, mise à l'échelle industrielle, rendement de production important.
La production et l'ingénierie d'hydrogénases recombinantes, à l'instar des métalloprotéines en général, ont connu un succès limité. La littérature fournit des exemples de [FeFe]-hydrogénases exprimées de manière hétérologue dans E. coli (King et al. 2006. Functional studies of [FeFe] hydrogenase maturation in an Escherichia coli biosynthetic system. J Bacteriol 188:2163-2172, Yacoby et al. 2012. Optimized expression and purification for high-activity preparations of algal [FeFe]-hydrogenase. PLoS One 7:e35886, Kuchenreuther et al. 2009. Tyrosine, cysteine, and S-adenosyl methionine stimulate in vitro [FeFe] hydrogenase activation. PLoS One 4:e7565). Les [FeFe]- hydrogénases sont des enzymes monomériques nécessitant un nombre limité de facteurs de maturation.
La production hétérologue de [NiFe]-hydrogénases est qualifiée de difficile (English et al. 2009. Recombinant and in vitro expression systems for hydrogenases: new frontiers in basic and applied studies for biological and synthetic H2 production. Dalton Trans 9970-9978).
Premièrement, la difficulté provient de la complexité et de la spécificité du processus d'assemblage du site actif [NiFe], qui nécessite au moins sept facteurs de maturation pour un assemblage fonctionnel.
Deuxièmement, le repliement correct de chacune des sous-unités de l’hétéro-multimère est requis, ce qui est particulièrement difficile à contrôler et à assurer lors d’une production hétérologue.
Troisièmement, l'assemblage correct de chaque sous-unité dans le complexe hétéro-multimérique est obligatoire. Un mauvais repliement peut mener à un phénomène d’agrégation et donc à une diminution de la quantité d’enzyme active (Singh et al. 2015. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14:41).
L'obtention d’une séquence précise est nécessaire pour obtenir une activité enzymatique, ce qui peut s'avérer être difficile à contrôler et à assurer chez un hôte hétérologue.
Tout ceci explique pourquoi les [NiFe]-hydrogénases ne sont pas toujours actives lorsqu'elles sont produites par recombinaison hétérologue.
Cependant, il existe plusieurs cas dans la littérature où une [NiFe]-hydrogénase active a été produite dans E. coli (Kim et al. 2011. Production of biohydrogen by heterologous expression of oxygen-tolerant Hydrogenovibrio marinus [NiFe]- hydrogenase in Escherichia coli. J Biotechnol 155:312-319, Maier et al. 2015. Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFe]-hydrogenase 2 from Citrobacter sp. SG in Escherichia coli. J Biotechnol 199:1-8, Schiffels et al. 2013. An innovative cloning platform enables large-scale production and maturation of an oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenase from Cupriavidus necator in Escherichia coli. PLoS One 8:e68812, Weyman et al. 2011. Genetic analysis of the Alteromonas macleodii [NiFe]-hydrogenase. FEMS Microbiol Lett 322:180- 187).
En particulier, les travaux de Sun et de ces collaborateurs (Sun et al. 2010. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]- hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526) ont permis l’expression de la [NiFe]-hydrogénase de Pyrococcus furiosus en anoxie dans E. coli par l'intermédiaire de quatre vecteurs d'expression permettant la co- expression de 13 gènes hétérologues (quatre gènes de structure et neuf facteurs de maturation). Plus spécifiquement, les travaux de Sun et al. ont permis d'obtenir une enzyme recombinante tétramérique de type [NiFe]-hydrogénase comprenant les quatre sous-unités dénommées PF0891, PFO892, PF0893 et PF0894. Après purification, cette enzyme recombinante tétramérique s'est révélée être fonctionnellement similaire à l'enzyme native purifiée à partir de P. furiosus.
HoxEFUYH étant une protéine procaryote de la cyanobactérie Synéchocystis, le système E. coli convient à sa production recombinante. Cette production dans E. coli a déjà été réalisée avec succès. En ce sens, Maeda et ses collègues ont montré une augmentation in vivo de la production d'hydrogène dans les cellules de E. coli exprimant, en condition anoxique, l’enzyme HoxEFUYH cyanobactérienne (Maeda et al. 2007. Inhibition of hydrogen uptake in Escherichia coli by expressing the hydrogenase from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. BMC Biotechnol 7:25). Une telle production d'hydrogène accrue en présence de HoxEFUYH est due à l’inhibition de l'activité des hydrogénases endogènes 1 et 2 consommatrices d’H2 chez E. coli.
Citons également Wells et ses collaborateurs qui ont introduit les gènes HoxEFUYH et ces facteurs de maturation associés dans E. coli (Wells et al. 2011. Engineering a non-native hydrogen production pathway into Escherichia coli via a cyanobacterial [NiFe] hydrogenase. Metab Eng 13:445-453). Ce travail a démontré la production d'hydrogène, en anoxie, aussi bien in vivo que in vitro via HoxEFUYH dans un hôte nul pour les hydrogénases endogènes. Ils indiquent un couplage avec des systèmes de transfert d'électrons de l'hôte comme la fermentation et montrent le potentiel de HoxEFUYH dans l'ingénierie métabolique pour améliorer les rendements de production d'hydrogène.
Malheureusement, comme il ressort notamment de l’état de la technique mentionné ci-dessus, il demeure plusieurs inconvénients freinant considérablement l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases, et notamment l’utilisation de HoxEFUYH, pour une bio-production d'hydrogène commercialement rentable.
A ce jour, il existe donc un réel besoin de surmonter les obstacles freinant l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases pour une production d'hydrogène dès lors que, comme indiqué plus haut, les [NiFe]-hydrogénases présentent indéniablement un haut potentiel pour la production d’hydrogène.
Pour résoudre ces problèmes, il est prévu suivant l'invention, un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site
H BE2019/5783 actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique comprend une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.
De préférence, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique est constitué d’une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.
De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique consiste en une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.
Dans le cadre de la présente invention, il a été mis en évidence qu’un tel polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase et présentant une activité hydrogénase permet de s'affranchir au moins en partie des obstacles freinant l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases pour une production d’hydrogène, ceci tout en garantissant une activité hydrogénase d’au moins 0,05 umol Hz . min” . mg”.
En effet, dès lors qu’il s’agit selon l'invention d’un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, les difficultés rencontrées avec les [NiFe]- hydrogénases, notamment pour assurer l’assemblage du site actif, pour assurer un repliement adéquat de chacune des sous-unités impliquées et pour assurer un assemblage correct de chaque sous-unité dans un complexe hétéro- multimérique, sont fortement réduites voire éliminées. Ceci permet d'augmenter la reproductibilité lors du processus d'obtention de la [NiFe]-hydrogénase puisqu’une seule sous-unité est impliquée. En effet, la production d’un seul polypeptide monomérique simplifie fortement le processus complexe de repliement en comparaison avec les enzymes dimérique, tétramérique et pentamérique pour lesquelles un assemblage correct du site actif, de chacune des sous-unités et enfin de l’enzyme entière est particulièrement difficile à contrôler et à garantir, ce qui constitue un obstacle à leur utilisation. Selon l'invention, le repliement adéquat d’une seule sous-unité est nécessaire et aucun assemblage entre différentes sous-unités n’est requis pour former un complexe hétéro-multimérique.
Par ailleurs, il a été mis en évidence que le procédé de fabrication d’un tel polypeptide monomérique selon l'invention peut être totalement réalisé en condition aérobie (pas de précaution requise par rapport à l’oxygène lors des étapes d'expression et de purification), ce qui écarte les problématiques rencontrées avec les procédés de fabrication des [NiFe]-hydrogénases dimériques, tétramériques et pentamériques recombinantes rencontrées dans l’état de la technique et pour lesquelles les procédés de fabrication sont réalisés en anoxie. Comme mentionné plus haut, même si l’accumulation de biomasse est réalisée en présence d’oxygène, la phase de production de l’hydrogénase recombinante est quant à elle réalisée en anoxie selon les procédés connus de l’état de la technique (Sun et al. 2010. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526, Wells et al. 2011. Engineering a non-native hydrogen production pathway into Escherichia coli via a cyanobacterial [NiFe] hydrogenase. Metab Eng 13:445-453). L'absence d'oxygène est également rapportée (boite anoxie, dithionite de sodium dans les tampons) lors des diverses étapes chromatographiques de la purification. Le maintien d’un tel niveau d’anoxie aux cours du procédé implique évidemment une augmentation des coûts liés à la production recombinante, ce qui est solutionné par la présente invention.
De façon avantageuse suivant l'invention, la taille du polypeptide monomérique selon l'invention est nettement plus faible en comparaison avec l’'hétéro-multimère, une augmentation de l’activité massique de l’enzyme (nombre d’entité catalytiquement active par mg de protéine total) étant ainsi obtenue.
Une meilleure intégration et donc une densification du catalyseur enzymatique est également réalisable, par exemple, lors d’une mise en œuvre électrochimique du polypeptide monomérique selon l'invention, comme par exemple dans une pile à combustible.
En outre, la structure tridimensionnelle d'un polypeptide monomérique selon l'invention est facilement modélisable notamment pour déterminer les résidus exposés à la surface de la protéine, par exemple pour faciliter l'orientation ainsi que l’adsorption par rapport à une interface, par exemple par rapport à une électrode de carbone. Cette caractéristique permet avantageusement, par exemple, d’améliorer la stabilité du lien entre l'interface et le catalyseur enzymatique, mais aussi une optimisation du transfert d’électrons direct entre l'interface et le site actif. Le rendement énergétique est dès lors amélioré en l'absence de relais redox supplémentaires, ce qui limite les pertes énergétiques.
Dans le contexte de la présente invention, il a également été démontré que le polypeptide monomérique est bien actif et apte à la production par catalyse d’Hz (test standard de production in-vitro d’H2 par les hydrogénases utilisant le méthyl-viologène comme médiateur redox; mise en œuvre électrochimique), sans présence du centre FeS proximal ni d’ailleurs d'aucun autres relais redox. Ceci est tout à fait surprenant puisqu’une simplification aussi poussée de l’enzyme hétéro-multimérique n’a jamais été proposée ni suggérée par l’état de la technique. Que du contraire, l'ensemble des travaux réalisés et donc l’ensemble de l’état de la technique considère que le centre [4Fe-45] situé à proximité du site actif est essentiel et indispensable à l'activité hydrogénase (Albracht. 1994. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim Biophys Acta 1188:167-204) mais aussi que la réduction du nombre de sous- unité n’est ni favorable à l’activité ni à la stabilité de l’hydrogénase. De façon d’autant plus avantageuse, alors que seule une production d’H2 limitée est actuellement obtenue avec les [NiFe]-hydrogénases recombinantes connues (Sun et al. 2010. Heterologous expression and maturation of an NADP- dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526, Schiffels et al. 2013. An innovative cloning platform enables large- scale production and maturation of an oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenase from Cupriavidus necator in Escherichia coli. PLoS One 8:e68812, Maier et al. 2015. Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFe]-hydrogenase 2 from Citrobacter sp. SG in Escherichia coli. J Biotechnol 199:1-8), il a été montré que le polypeptide monomérique selon l'invention présente une activité hydrogénase au moins équivalente voire même supérieure à celles obtenues avec les [NiFe]-hydrogénases (recombinantes) connues.
Selon un mode de réalisation suivant l’invention, le polypeptide monomérique est isolé de son environnement naturel, en particulier isolé d’une protéine naturelle de type [NiFe]-hydrogénase.
A titre d'exemple, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique peut être issu/isolé d’un procaryote. Les exemples incluent, mais ne sont pas limité à un membre du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coli), un membre du genre Desulfovibrio (comme par exemple Desulfovibrio gigas), un membre du genre Hydrogenophilus (comme par exemple Hydrogenophilus thermoluteolus), un membre du genre Desulfomicrobium (comme par exemple Desulfomicrobium _baculatum), Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803), un membre du genre Phormidium (comme par exemple Phormidium ambiguum) ou un membre du genre Spirulina (comme par exemple Spirulina platensis). Par exemple, ledit polypeptide monomérique peut être issu d’une cellule ou d’un microbe ou peut être produit in vitro ou in vivo.
Selon un mode de réalisation suivant l’invention, le polypeptide monomérique est recombinant ou hétérologue.
Avantageusement, selon linvention, le polypeptide monomérique est purifié.
Préférentiellement, selon linvention, le polypeptide monomérique présente une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De façon encore préférée, selon l'invention, le polypeptide monomérique présente une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 81% d'identité, au moins 82% d'identité, au moins 83% d'identité, au moins 84% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 86% d'identité, au moins 87% d'identité, au moins 88% d'identité, au moins 89% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 91% d'identité, au moins 92% d'identité, au moins 93% d'identité, au moins 94% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 96% d'identité, au moins 97% d'identité, au moins 98%
d'identité, au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4. De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique présente une activité hydrogénase d’au moins 0,05 umol Hz . min” . mg”, de préférence d'au moins 10 umol Ha . min* . mg”.
La présente invention porte également sur une cellule hôte incluant un polypeptide monomérique selon l'invention, ledit polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
A titre d'exemple, selon l'invention, la cellule hôte, notamment pour l'expression dudit polypeptide monomérique, peut-être une cellule bactérienne hôte du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coli, du genre Bacillus (comme par exemple Bacillus subtilis), du genre Streptomyces (comme par exemple Streptomyces coelicolor), du genre Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803), du genre Synéchococcus (comme par exemple Synéchococcus WH8102), ou toute autre cellule procaryote, une cellule eucaryote par exemple du genre Chlamydomonas (comme par exemple Chlamydomonas reinhardti), du genre Saccharomyces (comme par exemple Saccharomyces cerevisiae), de type Pichia (comme par exemple Pichia pastoris), ou un autre type de cellule eucaryotes.
Selon l'invention, ledit polypeptide monomérique inclus dans ladite cellule hôte peut lui-même mais non indispensablement être issu de l’expression d’un gène inclus dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide inséré dans ladite cellule hôte.
Avantageusement, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique inclus dans ladite cellule hôte a une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon linvention, ladite cellule hôte peut inclure un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase, de préférence un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
La présente invention porte également sur une cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l'invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
De préférence, selon l'invention, ledit polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique présente une séquence nucléotidique ayant au moins
15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, respectivement par rapport aux séquences, par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID NO :1 et/ou SEQ ID NO :3.
A titre d’exemple, selon l'invention, la cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l'invention, et étant utilisée notamment pour l’expression dudit polypeptide monomérique, peut être une cellule bactérienne hôte du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coli), du genre Bacillus (comme par exemple Bacillus subtilis), du genre Streptomyces (comme par exemple Streptomyces coelicolor), une cellule bactérienne photosynthétique du genre Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803) ou Synéchococcus (comme par exemple Synéchococcus WH8102) ou toute autre cellule procaryote, une cellule eucaryote par exemple du genre Chlamydomonas (comme par exemple Chlamydomonas reinhardtii), du genre Saccharomyces (comme par exemple Saccharomyces cerevisiae), de type Pichia (comme par exemple Pichia pastoris), ou un autre type de cellule eucaryotes.
Selon l’invention, ledit polynucléotide inclus dans ladite cellule hôte peut lui-même mais non indispensablement être inclus dans un vecteur d'expression, par exemple dans un plasmide, inséré dans ladite cellule hôte.
Avantageusement, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique codé par ledit polynucléotide inclus dans ladite cellule hôte a une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon l'invention, ladite cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique peut inclure un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, de préférence un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
La présente invention porte encore sur un procédé d'obtention, par exemple dans une cellule hôte (par exemple dans E. coli), d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon l'invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : e modification d’un vecteur d'expression, par exemple d'un plasmide, en y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]- hydrogénase ; et e incubation dudit vecteur d’expression modifié selon des conditions d'incubation permettant d'assurer une expression dudit polynucléotide exogène pour produire un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
Le procédé selon l'invention permet de réaliser une production de la seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]- hydrogénase.
L'homme de métier est bien entendu à même de définir les conditions d’incubation requises et adéquates.
Selon l'invention, lors de l’étape de modification d’un vecteur d'expression, le polynucléotide peut lui-même mais non indispensablement être inclus dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide.
Avantageusement, selon l'invention, ladite étape de modification dudit vecteur d'expression consiste en une inclusion dans ledit vecteur d'expression dudit polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon l'invention, ladite étape de modification dudit vecteur d'expression peut comprendre l'inclusion dans ledit vecteur d’expression d’un ou de plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase, de préférence d’un ou de plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
Selon l'invention, lors de l’étape de modification dudit vecteur d'expression, une séquence codant pour le facteur de maturation peut elle-même mais non indispensablement être incluse dans un vecteur d'expression, par exemple dans un plasmide.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape subséquente d'isolation et/ou de purification dudit polypeptide monomérique.
La présente invention porte encore sur une utilisation d’un polypeptide monomérique suivant l'invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule, pour produire ou consommer de l'hydrogène par incubation dudit polypeptide monomérique selon des conditions d’incubation permettant d'assurer une production ou une consommation d'hydrogène.
La présente invention porte encore sur une utilisation d’un polypeptide monomérique suivant l'invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule, pour revêtir une surface, en particulier pour revêtir une surface d’un conducteur électrique, par exemple pour revêtir une surface d’une anode ou d'une cathode.
Définitions Par le terme « polypeptide », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaine unique composée d’un minimum de deux acides aminés liés entre eux par un lien peptidique entre le groupement carboxylique d’un acide aminé et le groupement amine de l’acide aminé suivant.
Le terme « polypeptide » inclut également les molécules qui contiennent plus qu’un polypeptide, ceux-ci liés entre eux, par exemple par des ponts disulfures, ou des complexes de polypeptides, ceux-ci liés entre eux par exemple de manière covalente ou non- covalente, et formant un multimère (par exemple un dimère, un trimère, un quadrimère, un pentamère). Un polypeptide peut aussi contenir des ligands non- protéiques, comme par exemple le fer inorganique (Fe), le nickel (Ni), un centre fer-soufre (FeS), ou autre ligand organique comme par exemple le monoxyde de carbone (CO), le cyanure (CN) ou une flavine.
Les termes peptide, polypeptide, enzyme, sous-unité ou protéine sont tous inclus dans la définition du polypeptide et ces termes peuvent être interchangeables.
La définition de « polypeptide » ne tient pas compte de la longueur dudit polypeptide ni de la façon dont ledit polypeptide est produit.
Par le terme « polypeptide recombinant» ou « polypeptide hétérologue », il est entendu, au sens de la présente invention, un polypeptide qui n’est pas naturellement présent dans l’environnement, en particulier dans une cellule hôte, et dont la production est réalisée par des techniques recombinantes, par exemple par ajout de matériel génétique dans une cellule hôte.
Par les termes « polypeptide monomérique », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaine unique composée d’un minimum de deux acides aminés liés entre eux par un lien peptidique entre le groupement carboxylique d’un acide aminé et le groupement amine de l’acide aminé suivant.
Par opposition au terme « polypeptide », le terme « polypeptide monomérique »
inclut seulement les molécules qui ne contiennent qu’un polypeptide, c’est-à-dire sans interaction avec d'autre polypeptide, et cela peu importe la nature du lien. Par exemple, il ne s’agit en aucun cas d’un multimère (par exemple un dimère, un trimère, un quadrimère, un pentamère, …). Un polypeptide monomérique peut aussi contenir des ligands non-protéiques, comme par exemple le fer inorganique (Fe), le nickel (Ni), les centres fer-soufre (FeS), ou autre ligand organique comme par exemple le monoxyde de carbone (CO), le cyanure (CN) ou une flavine. La définition de « polypeptide monomérique » ne tient pas compte de la longueur dudit polypeptide ni de la façon dont ledit polypeptide est produit.
Par les termes « polypeptide monomérique recombinant » ou « polypeptide monomérique hétérologue », il est entendu, au sens de la présente invention, que le polypeptide monomérique n’est pas naturellement présent dans l’environnement, en particulier dans une cellule hôte, et dont la production est réalisée par des techniques recombinante, par exemple par ajout de matériel génétique dans une cellule hôte.
Par les termes « polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase », il est entendu, au sens de la présente invention, que le polypeptide monomérique est apte à catalyser la réaction réversible H2 > 2H* + 2e.
Par les termes « site actif », il est entendu, au sens de la présente invention, la partie du polypeptide qui, lorsque la structure tertiaire est formée, est responsable de l’activité catalytique dudit polypeptide, par exemple de l’activité hydrogénase. La partie du polypeptide peut comprendre, par exemple, plusieurs portions de la séquence en acides aminés et/ou la liaison avec un ou plusieurs ligands non-protéiques.
Par le terme « polynucléotide », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaine unique composée d’un minimum de deux nucléotides liés entre eux, par exemple par un lien covalent, peu importe qu’il s'agisse de ribonucléotides ou de désoxynucléotides. Cela inclut donc les RNA etles DNA, simple brin ou double brin. La définition de « polynucléotide » ne tient pas compte de la longueur dudit polynucléotide, ni de la fonction, ni de la forme, ni de la façon dont ledit polynucléotide est produit. Un polynucléotide peut être, par exemple, un plasmide, une partie d’un plasmide, un gène ou un fragment de gêne.
Par les termes « polynucléotide exogène », il est entendu, au sens de la présente invention, un polynucléotide qui n’est pas normalement présent dans la cellule hôte. Par exemple, le polynucléotide exogène peut être une séquence codante pour un polypeptide qui n’est pas naturellement présent dans la cellule hôte ou un plasmide.
Par le terme « concaténaire », il est entendu, au sens de la présente invention, un enchainement de plusieurs séquences afin de n’en former qu’une seule, par exemple de séquences polynucléotidiques ou de séquences polypeptidiques.
Par le terme « plasmide », il est entendu, au sens de la présente invention, une molécule d’ADN double brins distinct de l'ADN chromosomique, exogène, capable de réplication autonome, grâce à sa propre origine de réplication, et non essentielle à la survie de la cellule. Le plasmide peut comporter également d'autres séquences d'intérêts, comme par exemple un gène codant pour un facteur de sélection (résistance à un antibiotique, etc), un site de clonage multiple permet l'ajout de polynucléotide, et/ou des séquences de régulation de la transcription. Les termes « plasmide » ou « vecteur d'expression » sont interchangeables.
Par le terme « cellule hôte », il est entendu, au sens de la présente invention, une cellule qui a subi une modification. Cette modification peut par exemple être l’introduction d’un polynucléotide exogène dans la cellule, par exemple un plasmide.
Par les termes « facteur de maturation », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui participe à la formation de la structure d’une autre molécule biologique, par exemple d’une protéine.
Par le terme « isolé », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule qui a été retirée de son environnement naturel, par exemple qui a été retirée d’une [NiFe]-hydrogénase naturelle.
Par le terme « purifié », il est entendu au sens de la présente invention, toute molécule qui a été esseulée par l'intermédiaire de techniques biochimiques. Cette définition ne tient pas compte de la façon dont est produite la molécule, par exemple de manière naturel ou par recombinaison, synthétisée chimiquement ou enzymatiquement, ni des techniques biochimiques mises en œuvre pour la purification, comme par exemple une chromatographie d’affinité ou un tamis moléculaire. Par exemple, un polynucléotide, un polypeptide ou l’H2 peuvent être purifiés. De manière préférentielle, une substance est purifiée lorsqu'elle représente au minimum 60% par rapport aux autres composants qui lui sont associés, préférentiellement 75% par rapport aux autres composants qui lui sont associés, préférentiellement 90% par rapport aux autres composants qui lui sont associés.
Par le terme « homogénéité apparente », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule purifiée représentant minimum 90% par rapport aux autres composants qui lui sont associés.
Par le terme « identité », il est entendu, au sein de la présente invention, une similarité structurelle entre deux polynucléotides ou deux polypeptides. La similarité structurelle est déterminée par un alignement entre les deux séquences, alignement qui optimise le nombre de nucléotides identiques ou le nombre d’acides aminés identiques le long de la séquence. Les trous dans une ou les deux séquences sont permis afin d’optimiser l’alignement et donc la similarité structurelle. Les séquences des nucléotides ou des acides aminés doivent cependant rester les mêmes.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront des exemples donnés ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux figures annexées.
La figure 1 illustre la carte du plasmide pET-26b(+) (5360pb).
La figure 2 illustre l'analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d'expression pET26b(+) + HoxH par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl.
La figure 3 illustre la carte du plasmide pACYCDuet-1 (4008pb).
La figure 4 illustre l'analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW par les enzymes de restrictions Ncol et Hindlll.
La figure 5 illustre l'analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d'expression pET26b(+) + HoxH, issus de l'ADN plasmidique d'une colonie d’E. coli, par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl.
La figure 6 illustre l'analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d'expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW, issus de l'ADN plasmidique d’une colonie d’E. coli, par les enzymes de restrictions Ncol et Hindlll.
La figure 7 illustre la méthode de purification de la protéine recombinante d'intérêt HoxH. NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d'affinité Ni-NTA. Lavage, échantillon élué avec le tampon de lavage contenant 10mM en Imidazole. 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 100mM, échantillon élué à une concentration de 100mM en imidazole. 150mM, échantillon élué à une concentration de 150mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole. 250mM, échantillon élué à une concentration de 250mM en imidazole.
La figure 8 illustre l’analyse par SDS-PAGE de la composition protéique de diverses fractions récoltées lors de la chromatographie d’affinité. Charge, surnageant appliqué sur la colonne d’affinité Ni-NTA et issus de la lyse des cellules de E. coli recombinante ; NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d'affinité Ni-NTA. Lavage, échantillon élué avec le tampon de lavage contenant 10mM en Imidazole. M, marqueur de poids moléculaire. 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 100mM, échantillon élué à une concentration de 100mM en imidazole. 150mM, échantillon élué à une concentration de 150mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole. 250mM, échantillon élué à une concentration de 250mM en imidazole.
La figure 9 illustre l’analyse par immuno-détection (Western blot) de la présence de HoxH dans diverses fractions récoltées lors de la chromatographie d’affinité. M, marqueur de poids moléculaire. Charge, surnageant appliqué sur la colonne d’affinité Ni-NTA et issus de la lyse des cellules de E. coli recombinante. NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d'’affinité Ni-NTA ; 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole.
La figure 10 est une représentation schématique de la structure de HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803. HoxE,
19KDa et 1 centre FeS ; HoxF, 57.5KDa, 2 centres FeS et un centre FMN ; HoxU, 26KDa et 4 centres FeS ; HoxY, 20KDa et un centre FeS ; HoxH, 53KDa et le site actif.
La figure 11 est une représentation schématique (flèche grisée) du transfert d’électrons et des interactions attendues avec le NADPH et le methyl- viologène (MV) chez HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803.
La figure 12 est une représentation schématique où le point d'interrogation pose la question de savoir si le site actif de la protéine recombinante HoxH peut accepter ou non les électrons directement du MV et donc produire de l'hydrogène en l’absence de relais redox additionnels.
La figure 13 illustre la production d'hydrogène qui résulte de l’ajout de la protéine recombinante HoxH à un réactif contenant du methyl-viologène préalablement réduit par du dithionite de sodium en absence d'oxygène. Le niveau d'hydrogène dissout dans le réactif est mesuré en continu à l’aide d’un micro-senseur (Unisense, Danemark). La flèche montre le moment où l’ajout de la protéine recombinante HoxH est réalisé, moment concomitant avec l'augmentation du niveau d'hydrogène dissout détecté par le micro-senseur.
Exemples
1. Construction d’un vecteur d’expression de HoxH
1.1. Séquence « simple » de HoxH HoxH correspond à la grande sous-unité comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18091.1. Le point isoélectrique théorique de HoxH est de 5,86 pour une masse moléculaire théorique de
52996.53 Daltons. La séquence en nucléotides (1425bp) de HoxH est la suivante et est nommée SEQ ID NO:1 dans le cadre de la présente invention :
atgtctaaaaccattgttatcgatcccgttacccggattgaaggccatgccaaaatctccattitcctcaacgacc agggcaacgtagatgatgttcgtttccatgtggtggagtatcggggttttgaaaaattttgcgaaggtcgtcccat gtgggaaatggctggtattaccgcccgtatttgeggcatttgtccggttagccatctgctctgtgcggctaaaacc ggggataagttactggcggtgcaaatccctccagccggggaaaaactgcgccgtttaatgaatttagggcaa attacccaatcccacgccctaagttttttccatctcagcagtcctgattttctgettggttgggacagtgatcccgcta ctcgcaatgtgtttggtttaattgctgctgaccccgatttagctagggcaggtattcggttacggcaatttggccaa acggtaattgaacttttgggagctaaaaaaatccactctgcttggtcagtgcccggtggagtccgatcgccgttg tcggaagaaggcagacaatggattgtggaccgtttaccagaagcaaaagaaaccgtttatitagccttaaattt gtttaaaaatatgttggaccgcttccaaacagaagtggcagaatttggcaaatttccctccctatttatgggcttag ttgggaaaaataatgaatgggaacattatggcggctccctgcggtttaccgacagtgaaggcaatattgtcgcg gacaatctcagtgaagataattacgctgattttattggtgaatcggtggaaaaatggtcctatttaaaatttcccta ctacaaatctctgggttatcccgatggcatttatcgggttggtccccttgcccgccttaatgtttgtcatcacattggc accccggaagcagaccaagaattagaagaatatcggcaacgggctggaggtgtggccacgtcctctttetttt atcattacgcccgcttggtggaaattcttgcctgtttagaagccatcgaattgttaatggctgaccctgatattttgtc caaaaattgtcgagctaaggcagaaattaattgtaccgaagcggtgggagtgagcgaagcaccccggggta ctttattccaccattacaagatagatgaagatggtctaattaagaaagtgaatttgatcattgccacgggcaaca ataacttagccatgaataaaaccgtggcccaaattgccaaacactacattcgcaatcatgatgtgcaagaag ggtttttaaaccgggtggaagcgggtattcgttgttatgatccctgccttagttgttctacccatgcagcgggacaa atgccattgatgatcgatttagttaaccctcagggggaactaattaagtccatccagcgggattaa La séquence en acides aminés (474 aa) de HoxH est la suivante et est nommée SEQ ID NO:2 dans le cadre de la présente invention :
MSKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDVRFHVVEYRGFEKFCEGRPMWE — MAGITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLLAVQIPPAGEKLRRLMNLGQITQSHAL SFFHLSSPDFLLGWDSDPATRNVFGLIAADPDLARAGIRLRQFGQTVIELLGAK KIHSAWSVPGGVRSPLSEEGRQWIVDRLPEAKETVYLALNLFKNMLDRFGQTE VAEFGKFPSLFMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGNIVADNLSEDNYADFIG ESVEKWSYLKFPYYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEEYRQR AGGVATSSFFYHYARLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAEINCTEAVGVS EAPRGTLFHHYKIDEDGLIKKVNLIATGNNNLAMNKTVAQIAKHYIRNHDVQEG
FLNRVEAGIRCYDPCLSCSTHAAGQMPLMIDLVNPQGELIKSIQRD La figure 1 représente la carte du plasmide pET26b(+) utilisé pour construire le vecteur d'expression de HoxH par insertion de SEQ ID NO:3 dans pET26b(+). pET26b(+) est un plasmide de 5360pb possédant une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance à la kanamycine, un site de clonage multiple (MCS) contenant de nombreux sites de restriction, le promoteur T7 et le terminateur de transcription 77. Il contient également le gene /ac/ codant 40 pour un répresseur de transcription. Cette répression de la transcription peut être levée par ajout d’IPTG.
1.2. Séquence « optimisée » de HoxH Optionnellement, selon un mode de réalisation suivant l'invention, les séquences SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:2 sont optimisées pour usage des codons chez E. coli. En particulier, les sites de restriction Ndel (catatg) et BlpI (gcinagc) sont ajoutés respectivement en début et en fin de la séquence de nucléotides pour le clonage dans le plasmide pET26b(+) et la séquence caccaccaccaccatcac (soulignée ci-dessous) est également ajoutée (séquence codant pour l’étiquette poly-histidines proche de l'extrémité N-terminal de la protéine). La séquence de nucléotides optimisée (1453bp) est la suivante et est nommée SEQ ID NO:3 dans le cadre de la présente invention : catatgagccaccaccaccaccatcacaaaaccatcgtcatcgacccagtcacccgcatcgaaggccacg ccaaaattagcatttttctgaacgaccagggcaacgtcgacgacgtccgctttcacgttgttgaataccgtggctt cgaaaaattttgtgaaggtcgtccgatgtgggaaatggccggtatcacggcacgtatttgtggaatttgtccggt gagccatctgctgtgtgccgcaaaaaccggagataaactgctggcagtgcagattccgccggcaggtgaaa aactgcgtcgtctgatgaatctgggtcagattacacagtcgcatgcactgtctttctttcatctgagtagcccagatt ttctgctggggtgggatagcgacccggcaacacgtaatgtgtttggtctgattgcggctgatccggatctggcgec gtgccggtattcgtctgcgtcagtttggtcagacagttattgagctgctgggggcgaaaaagattcatagtgcatg gtctgtgccgggtggtgttcgtagtccgctgagtgaagaaggtcgtcagtggattgttgatcgtctgccggaggc aaaagaaacggtctatctggcactgaatctgtttaaaaatatgctggatcgtttccagacagaagttgcagaatt tggaaaatttccgtcactgtttatgggtctggttggtaaaaataatgaatgggaacactatggtggtagcctgcgtt tcacggactctgaaggtaatattgttgcggataatctgagcgaagacaattatgcagattttatcggtgaaagtgt ggaaaaatggagctatctgaaatttccgtattacaaaagcctgggctatccggatgggatctaccgtgttggac cgctggcacgtctgaacgtttgtcatcatattggtaccccggaagcagatcaggaactggaagaatatcgtca gcgtgcgggtggtgttgcgactagcagctttttttatcattatgcacgtctggttgaaattctggcctgtctggaggc aattgaactgctgatggcagatcctgatattctgtctaaaaattgtcgtgcaaaagcagaaattaactgtaccga ggcagttggtgttagtgaggcgccgcgtggtaccctgtttcatcactataaaattgacgaagatggtctgattaaa aaggttaatctgattatcgcaaccggtaacaataatctggcaatgaataaaaccgttgcacagattgcaaaac actacattcgcaaccacgatgttcaggaagggtttctgaatcgtgtagaagccggcattcgctgttatgatccgt gtctgagctgtagcacccatgcagcaggtcagatgcctctgatgattgacctggttaatccgcagggtgagctg attaaaagcattcagcgtgattaagcigage La séquence en acides aminés (480 aa) optimisée est la suivante et est nommée SEQ ID NO:4 dans le cadre de la présente invention :
MSHHHHHHKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDVRFHVVEYRGFEKFCEG RPMWEMAGITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLLAVQIPPAGEKLRRLMNLGQIT QSHALSFFHLSSPDFLLGWDSDPATRNVFGLIAADPDLARAGIRLRQFGQTVIE LLGAKKIHSAWSVPGGVRSPLSEEGRQWIVDRLPEAKETVYLALNLFKNMLDR FQTEVAEFGKFPSLFMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGNIVADNLSEDNYA DFIGESVEKWSYLKFPYYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEE YRQRAGGVATSSFFYHYARLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAEINCTEA VGVSEAPRGTLFHHYKIDEDGLIKKVNLIIATGNNNLAMNKTVAQIAKHYIRNHD
VQEGFLNRVEAGIRCYDPCLSCSTHAAGQMPLMIDLVNPQGELIKSIQRD Le plasmide pET26b(+) est utilisé pour construire le vecteur d'expression de HoxH par insertion de SEQ ID NO:3 dans pET26b(+).
La figure 2 montre l'analyse de la digestion du vecteur d'expression pET26b(+) + HoxH (SEQ ID NO:3) par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl. Deux fragments d'ADN à environ 5300pb (pET26b(+) linéarisé) et à environ 1500pb (séquence HoxH excisé du plasmide pET26b(+)) sont mis en évidence. Ceci confirme la présence de la séquence HoxH d'intérêt dans le vecteur d'expression pET26b(+).
2. Construction du vecteur d’expression d’au moins un facteur de maturation Au moins les facteurs de maturation suivants sont considérés dans le cadre de la présente invention : HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW.
HypA est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogenase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18357.1. Le point isoélectrique théorique de HypA est de 4,94 pour une masse moléculaire théorique : 12773,47 Daltons. La séquence en nucléotides (342bp) de HypA est la suivante et est nommée SEQ ID NO:5 dans le cadre de la présente invention : atgcacgaagttagtctgatggagcaaactttggcgatcgccattgcccaggcggaagaccatggagccagc caaatccatcgtttaaccctgcgggtggggcaacagtctggggtggtggccgatgccctacggtitgcgtttgaa gtggtgcgacaaaataccatggccgccgaggcgagattggaaattgaagaaattcccgttacctgtegttgcc aacactgccacgaaaattttcagccagaggattggatttaccgctatecccactgcgaccagattagecaaac agtaatggatggcaaacagttggaactagcatccctagaactgagttga La séquence en acides aminés (113 aa) de HypA est la suivante et estnommée SEQ ID NO:6 dans le cadre de la présente invention :
MHEVSLMEQTLAIAIAQAEDHGASQIHRLTLRVGQQSGVVADALRFAFEVVRQ NTMAAEARLEIEEIPVTCRCQHCHENFQPEDWIYRCPHCDQISQTVMDGKQL
ELASLELS HypB est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18312.1. Le point isoélectrique théorique de HyB est de 5,75 pour une masse moléculaire théorique : 31242,97 Daltons. La séquence en nucléotides (858bp) de HypB est la suivante et est nommée SEQ ID NO:7 dans le cadre de la présente invention : atgtgccaaaactgcggttgtagtgcggtgggaaccgttgcccatagccaccatcaccatggcgatggaaattt tgcccacagccatgatgaccatgaccagcaagaacatcatcaccaccatggcaactacagcaaaagtcca agtcagcagactgtgaccattgaacccgatcgccagtccattgccattggccaaggcattctcagcaagaatg accgcctagcggaaaggaatcggggctatttccaggctaagggcttactggtgatgaatttcctctcttctcccg gagccggtaaaactgctctgatcgaaaaaatggtcggcgatcgacaaaaagaccatcccaccgccgtcatt gtgggggatitagccaccgataacgatgcccaacgtctccgcagtgccggggcgatcgccattcaggtcacc acaggaaatatttgccatctggaagcggaaatggtggccaaggcggcccaaaagttagatttagacaatatc gatcaattgatcattgaaaatgttggtaatttggtttgccccaccacctatgatctaggggaagatttacgggtcgt attattttccgtcacagaaggggaggataaaccccttaaatatcccgccaccttcaaatcagcccaggttattitta gtcaccaaacaggacattgccgccgcagtggattttgatgcagagctggcttggcaaaacctacggcaagtg gccccccaagcccaaatttitgcagtgtctgcccgcacggggaaaggattgcagtcctggtatgagtatttggat caatggcaactccaacactattcgccgttggitgatccagcattggcctaa La séquence en acides aminés (285 aa) de HypB est la suivante et est nommée SEQ ID NO:8 dans le cadre de la présente invention :
MCQNCGCSAVGTVAHSHHHHGDGNFAHSHDDHDQQEHHHHHGNYSKSPS — QQTVTIEPDRQSIAIGQGILSKNDRLAERNRGYFQAKGLLVMNFLSSPGAGKT ALIEKMVGDRQKDHPTAVIVGDLATDNDAQRLRSAGAIAIQVTTGNICHLEAEM VAKAAQKLDLDNIDQLIENVGNLVCPTTYDLGEDLRVVLFSVTEGEDKPLKYP ATFKSAQVILVTKQDIAAAVDFDAELAWQNLRQVAPQAQIFAVSARTGKGLQS
WYEYLDQWQLQHYSPLVDPALA HypC est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogenase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18180.1. Le point isoélectrique théorique de HypC est de 4,20 pour une masse moléculaire théorique : 7987,42 Daltons. La séquence en nucléotides (231bp) de HypC est la suivante et est nommée SEQ ID NO:9 dans le cadre de la présente invention : atgtgtctagccctacctggccaggttgtcagtttaatgcccaactccgatcccctgttactgacgggaaaggtta gctttgggggcatcattaaaaccattagccttgcctacgtacccgaggttaaggtgggggattacgtgattgtcc atgtgggctttgccattagcattgtggacgaagaggcggcccaggaaactttgatagacttggcagaaatggg agtttaa La séquence en acides aminés (76 aa) de HypC est la suivante et est nommée SEQ ID NO:10 dans le cadre de la présente invention :
MCLALPGQVVSLMPNSDPLLLTGKVSFGGIIKTISLAYVPEVKVGDYVIVHVGF
AISIVDEEAAQETLIDLAEMGV HypD est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA16622.1. Le point isoélectrique théorique de HypD est de 6,31 pour une masse moléculaire théorique de 40632,94 Daltons. La séquence en nucléotides (1125bp) de HypD est la suivante et est nommée SEQ ID NO:11 dans le cadre de la présente invention : atgaaatacgttgatgaatatcgggatgcccaggcggtggcccattaccgtcaggcgatcgccagggagata accaaaccttggacgctgatggagatttgcggcggccagacccacagcattgtcaaatatggcttggatgcttt gttgccgaagaatttgactctgatccatggtcccggetgtectgtgtgegtcactccgatggaattaattgaccag gctttgtggttagctaagcaaccggagatcattttitgttcctttggcgatatgttgegggtgcccggcagtggggc ggatttgctgagcattaaagcccagggcggcgatgtgcgcattgtctattctcctttggattgtttggcgatcgcca gggagaatcctaatcgggaagtggtatttttcggagtaggttttgaaactacagcccctgccacggccatgact ctccaccaagctagggcccagggaattagcaatttcagtttactttgcgcccatgtattggtgcccccggctatg gaggctttattaggcaatcccaattccctcgtgcagggctttttggcggcagggcatgtctgtacggtgaccggg gaaagggcctatcaacatatcgctgaaaaataccaagtacccattgtcatcactggctttgaacctgtggatatt atgcagggcatctttgcctgtgtgcgccaactggagtcgggacaattcacctgcaacaatcaatatcggcgatc ggtccaaccccagggcaatgcccatgctcagaaaattattgaccaagtgtttgagccagtcgatcgccattgg cggggtttgggattaattccggccagcggtttgggtitaaggccagcatttgccccctgggatgccgcagttaaa ttcgccaatttattgcaaaccatggccccaacgatgggagaaacagtgtgtattagcggggaaattttacaggg acaacggaagcccagcgattgtccagcctttggtactatctgcaccccagaacaacccttgggggetcccatg gtttcctcggaaggagcctgtgccgcctattaccgttatcgccaacaattaccggaaccagtgggagcggcca gagtttag La séquence en acides aminés (374 aa) de HypD est la suivante et estnommée SEQ ID NO:12 dans le cadre de la présente invention :
MKYVDEYRDAQAVAHYRQAIAREITKPWTLMEICGGQTHSIVKYGLDALLPKN LTLIHGPGCPVCVTPMELIDQALWLAKOPEIFCSFGDMLRVPGSGADLLSIKA QGGDVRIVYSPLDCLAIARENPNREVVFFGVGFETTAPATAMTLHQARAQGIS NFSLLCAHVLVPPAMEALLGNPNSLVQGFLAAGHVCTVTGERAYQHIAEKYQV PIVITGFEPVDIMQGIFACVRQLESGQFTONNQYRRSVQPQGNAHAQKIIDQVF EPVDRHWRGLGLIPASGLGLRPAFAPWDAAVKFANLLQTMAPTMGETVCISG EILQGORKPSDCPAFGTICTPEQPLGAPMVSSEGACAAYYRYRQQLPEPVGA
ARV HypE est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA17478.1. Le point isoélectrique théorique de HypE est de 4,93 pour une masse moléculaire théorique de … 36425,60 Daltons. La séquence en nucléotides (1038bp) de HypE est la suivante et est nommée SEQ ID NO:13 dans le cadre de la présente invention : gtgaacttagtctgtcccgttcccettgatcgttatccccaggtactgttagcccacggcggcggcggtaagttga gccaacaattacttaagcaaatttttttaccggcctttggcgcttctgaaacgggtagtcatgatgcggcggttttta ctgccaaccaaagttctttagctttcaccaccgactcctatgtgatcaatcccctcttitttcctgggggcgatattgg ttctttggcagtccacggcaccgttaatgacctagccatggccggcgcaacccctcgctatatcagcgttggtttt atcctcgaagaaggattgcccatggagaccctctggcgggtggcccaatccctagggcaagcggcccaaa actgtggggtggaaattcttaccggtgataccaaagtggtggaccggggtaagggagacggcattttcatcaa caccagcggcattggttccctcgaccatcaacaaactatccatcccaatcaggtacaggtaggcgatcgccta attttgagcggtgatttgggacgtcatggcatggccattatggcagtgcgccaaggattagaatttgaaaccacc attgaaagtgattcggccccggttcacagagaagtgcaggcattattgtcggcagggatcccaatccattgtct gcgggatttaaccagggggggattagccagtgcggttaatgaaattgcccaaacttccggggtaaccatggct ttacgagaaacgttaatcccggtggaggccgaagtacaagccgcctgtgaactgttgggttttgaccccctctat gtggccaatgagggaagattcctggccattgtgcccccggaagcagaacagaagaccgtggaaattttgca aactttccatccccaagctacggcgatcggtacagtaacaggcaaaagtgcacaaaccttggggttagtcagt ttggaaagttccattggtgccccccggttgctagacatgatcagtggggagcaattaccccgtatttgttag La séquence en acides aminés (345 aa) de HypE est la suivante et estnommée SEQ ID NO:14 dans le cadre de la présente invention :
MNLVCPVPLDRYPQVLLAHGGGGKLSQQLLKQIFLPAFGASETGSHDAAVFT ANQSSLAFTTDSYVINPLFFPGGDIGSLAVHGTVNDLAMAGATPRYISVGFILE EGLPMETLWRVAQSLGQAAQNCGVEILTGDTKVVDRGKGDGIFINTSGIGSLD HQQTIHPNQVQVGDRLILSGDLGRHGMAIMAVRQGLEFETTIESDSAPVHREV QALLSAGIPIHCLRDLTRGGLASAVNEIAQTSGVTMALRETLIPVEAEVQAACEL LGFDPLYVANEGRFLAIVPPEAEQKTVEILQTFHPQATAIGTVTGKSAQTLGLV
SLESSIGAPRLLDMISGEQLPRIC HypF est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA10154.1. Le point isoélectrique théorique de HypF est de 8,19 pour une masse moléculaire théorique de 85358,25 Daltons. La séquence en nucléotides (2304bp) de HypF est la suivante etestnommée SEQ ID NO:15 dans le cadre de la présente invention : atgttaaaaaccgttgccatacaggtccagggaagggtgcaaggagtgggttttegtccctttgtttatacccttg cccaggaaatgggactgaatggttgggtgaataattccactcaaggagctaccgttgtcattaccgccgacga aaaggcgatcgccgactttacggagagattaacgaagacattacctccccctggtttgattgaacaattagccg ttgaacagttaccgctggaaagttttactaactttactatccgccccagtagtgatggccctaaaactgcgagtatt ttacccgatttatccacttgttccgcctgcttaacagaactatttgaccctagcgatcgccgttatctttacccctttatt aactgtacccattgcggtccccgctacaccattattgaagccctaccttacgaccgttgtcgtaccaccatggct aggtttcgccaatgtaccgactgtgaaagggaatataagcaaccaggcgatagacgcttccatgcccaacct aatgcctgtcctcgetgtggcccccaactggctttttggaaccgacaaggccaagtaattgcagaagcaaatg aagctttaaactitgctgtagataatttaaaagtcggcaatattatcgctattaaaggcttaggtggcttccatttgtg ttgtgatgccactgattttgaagctgtggaaaaattaagattaaggaaacatcgaccggataaacctttggcggt aatgtatggtaatcttggtcaaattgtggagcattaccaacctaataatctagaagttgaattgttacaaagtgcc gccgcccctattgtgttattaaacaaaaaaaaacaattaatittggtggaaaatattgccccaggcaacccccg agtcggcgtaatgttagcctatactcctttgcatcacttattactaaaaaaattaaagaaacccatggtagctacc agtggtaacttagctggggagcaaatttgcattgataatattgacgctttaacccggttacaaaatattgctgacg gttttctcgttcatgatcgcccgattgtttgtccagtggatgattccgttgtccaaatagtagctgggaagccattattt ttgcgtcgagcceggggttacgctcctcaacccattactttaccaaagcctactcaaaaaaaactattggcgat gggaggtcattataaaaatacagtggcgatcgccaaacaaaatcaagcttacgtcagccaacatttgggcga tttgaattctgctcccacctaccaaaattttgaagaagccattgcccatttaagccagctatacgatttctctcccca ggaaattgttgcagatttacaccctgattatticagtcatcaatatgctgaaaaccaagctttgcctgtcacttttgtg cagcatcactatgctcatattttagcggttatggcggaacatggagttatggaggagtccgtgttaggtattgettg ggatggcactggctacggcatggacggtactatttgggggggagaatitttaaaaatcacccaaggtacttggc agagaattgctcatctacaaccatitcatitattaggtaatcaacaagccattaaatatccccatcggattgctttg gcgttgttatggcccactittggtgatgatitttctgctgattctttaggaaattggttgaatticaataatgggtitaaaa acaagataaacagcaggttaaatcaggatctaaacaacaaaaatttacgtcaactttggcaacgagggcaa gcaccgctcacttcgagtatgggaagattatttgacggtattgcgacactgataggattgattaacgaagtaactt ttgaaggtcaggcggccatagctctggaagctcagattatgccaaatttaactgaggagtattatcctttgactct aaacaacaaggaaaaaaaattagctgttgattggcgccccitaattaaagctataaccacagaagatagaa gcaaaactaacctaatagccactaaattccacaacagtitagtaaatttaattatcactattgcccaacagcagg gaatcgaaaaagttgctctggggggaggttgctttcaaaattgttatttgetigccagtaccattactgccctcaaa aaagctggtititctcctttgtggcccagagaactaccgcccaacgacggtgccatttgcatgggtcaactgttag ctaaaattcaggctcggcaatatatctgttaa La séquence en acides aminés (767 aa) de HypF est la suivante et est nommée SEQ ID NO:16 dans le cadre de la présente invention : miktvaiqvqgrvagvafrpfvytlagemgIngwvnnstqgatvvitadekaiadfterltktlpppglieglaveq IplesfinftirpssdgpktasilpdIstcsacltelfdpsdrrylypfincthegprytiiealpydrcrttmarfrgctde ereykgpgdrrfhagpnacprcgpdlafwnrggqviaeanealnfavdnlkvgniiaikglggfnlccdatdfe aveklrirkhrpdkplavmygniggivehyqpnnlevellgsaaapivlinkkkd/lilveniapgnprvgvmlayt plhhlllkkikkpmvatsgnlagegicidnidaltriqniadgflvhdrpivcpvddsvvgivagkplflrrargyapq pitlpkptgkkllamgghykntvaiakgnqayvsghlgdinsaptygnfeeaiahlsqlydfspgqeivadlhpdy fshqyaengalpvtfvghhyahilavmaehgvmeesvigiawdgtgygmdgtiwggeflkitggtwqriahl qpfhllgnqgaikyphrialallwptfgddfsadsIgnwinfnngfknkinsriIngdinnknirglwqragapitss mgrlfdgiatliglinevtfegqaaialeagimpniteeyypltinnkekklavdwrplikaittedrsktnliatkfhns Ivnliitaqqqgiekvalgggefgneyllastitalkkagfsplwprelppndgaiemggllakiqarqyic HoxW est une protéine hypothétique chez Synéchocystis sp.
PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA17680.1. Le point isoélectrique théorique de HoxW est de 4,93 pour une masse moléculaire théorique de 17129,53 Daltons. La séquence en nucléotides (474bp) de HoxW est la suivante et est nommée SEQ ID NO:17 dans le cadre de la présente invention : atgccaggccaatccaccaagtccactttaatcatcggttacggcaataccctgcggggggacgacggcatg gggcgttacctagcggaagaaattgctcagcaaaactggccccattgtggagttatttccacccatcaactcac cccagaattggccgaggcgatcgccgctgtggaccgggtaatittcaitgatgcccaactgcaggaatcagca aacgaaccatcggtggaagttgtggccttaaaaaccctggaacccaacgaactgtcaggggatttggggca ccggggtaatcccagggaactcttgaccctggctaaaattctctacggcgttgaggtaaaggcttggtgggtgtt gattccggccttcacctttgattatggagagaaattgtctcccctgaccgcccgggcccaagccgaagccttag cccagatccgccccttggtattgggggagagataa La séquence en acides aminés (157 aa) de HoxW est la suivante et est nommée SEQ ID NO:18 dans le cadre de la présente invention :
MPGQSTKSTLIIGYGNTLRGDDGVGRYLAEEIAQQNWPHCGVISTHQLTPELA EAIAAVDRVIFIDAQLQESANEPSVEVVALKTLEPNELSGDLGHRGNPRELLTL
AKILYGVEVKAWWVLIPAFTFDYGEKLSPLTARAQAEALAQIRPLVLGER Optionnellement, selon un mode de réalisation suivant l'invention, l'ensemble des facteurs de maturations HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW sont assemblés sous forme d’une séquence nucléotidique concaténaire (6515bp). Cette séquence nucléotidique comporte le site de restriction Ncol (CCATGG) en début de séquence et le site de restriction Avril (CCTAGG) en fin de séquence pour réaliser le clonage dans le plasmide pACYCDuet-1. Cette séquence nucléotidique concaténaire est la suivante et est nommée SEQ ID NO:19 dans le cadre de la présente invention : ccatggcccacgaagttagcctgatggaacagacgctggccattgccattgcgcaggcggaagaccacgg ggcgagccaaattcaccgtttaacgctgcgcgttgggcagcagtcgggtgttgttgcagatgcattacgctttgc atttgaagttgttcgccagaacacaatggctgcagaagcacgtctggaaatcgaggaaattccggttacctgtc gttgtcagcattgtcatgaaaattttcagccggaggattggatatatagatgtccccattgtgaccagattagtcaa accgttatggacggcaaacagctggagttagcaagcctggaactgagctaagcatggaaaggaggtcgttat tatgtgccagaactgtgggtgtagcgcggttgggaccgttgcgcatagccaccatcaccacggggatggcaa ctttgcgcatagccatgacgaccacgaccagcaggagcaccaccaccaccacggtaactattcaaaatcac catcacagcagaccgtaaccatagaaccagacagacaaagcatagcaattggccaaggaattctgagcaa aaacgatcgtctggcagaacgcaaccgcggctacttccaggccaaaggtctgttagtaatgaatttcctgagc agcccgggagcaggcaaaaccgcactgatcgaaaaaatggttggtgatcgtcagaaagatcatccgaccg cagttattgttggtgatctggcaaccgataatgatgcacagcgtctgcgtagcgcaggtgcaattgcaattcagg ttaccaccggtaatatttgtcatctggaagcagaaatggttgcaaaagcagcacagaaactggatctggataat attgatcagctgattattgaaaatgttggtaatctggtttgtccgaccacctatgatctgggtgaagatctgcgtgtt gttctgtttagcgttaccgaaggtgaagataaaccgctgaaatatccggcaacctttaaaagcgcacaggttatt ctggttaccaaacaggatattgcagcagcagttgattitgatgcagaactggcatggcagaatctgcgtcaggtt gcaccgcaggcacagatttttgcagttagcgcacgtaccggtaaaggtctgcagagctggtatgaatatctgg atcagtggcagctgcagcattatagcccgctggttgatccggcactggcataagagttgaaaggaggtttcctc catgtgcctggcgttaccggggcaggttgtttcgttaatgccgaactcggatccgctgttattaaccgggaaagtt agctttggtggtattattaaaaccattagcctggcgtatgttccggaagttaaagttggcgattatgttattgttcatgt tggttitgctatcagtattgttgatgaagaagcagcacaggagacactgattgatctggccgagatgggcgttta attcctaaaaggaggttttagccatgaagtacgttgacgaataccgcgacgcgcaggcagttgcccactaccg ccaggccattgcccgtgaaattaccaaaccgtggacgctgatggaaatttgtgggggccagacccatagcat cgttaaatatggtctggatgcattattaccgaaaaacttaaccttaatccacggtccgggttgtccggttigtgttac gccgatggaactgattgatcaggcattatggctggcaaaacagccggagattatttittgtagctttggtgatatg ctgcgcgtgccgggtagtggtgcagatctgctgagcattaaagcacaggggggagacgttcgtatagtttattct ccgttagattgtctggcgattgegcgtgaaaatccgaatcgtgaagttgttititttggtgtgggttitgaaactaccg ccccggcaaccgcaatgacactgcatcaggcacgggcccagggtattagcaattttagcttattatgtgcaca cgtgttagttccgccggcgatggaagctctgctgggtaacccgaatagcctggttcaagggtttttagcagcag gtcatgtttgtacggttaccggtgagcgggcgtatcagcatattgcagagaaatatcaggttccgatagttattac cggttitgaaccggttgatattatgcagggtatttttgcatgtgttegtcagctggagagcgggcagtttacatgtaa taatcagtaccggcggtcggttcagccgcagggtaacgcacatgcccagaaaattattgaccaggttitigaac cggtggatcgtcattggcgtggattaggtcttattceggcctcaggtttaggtttacgtccggcatttgcaccgtgg gacgcagcagttaaattcgcaaatctgttacagacaatggctccgacaatgggtgaaaccgtttgtatttctggce gaaattttacagggtcagcgcaaacctagtgattgtcctgcatttiggtaccatctgcaccccggaacaaccgct gggcgcccctatggttagcagtgaaggcgcttgtgccgcctattatcgttatcgtcagcaattaccggaaccggt tggtgccgcacgtgtttaattttgcaaaggaggtcctgccaatgaacctggtgtgtceggtgccgctggacegct acccgcaggttttactggcacacggggggggggggaagctgagtcagcagctgttaaaacagattittetgcc ggcgittggtgcatcagaaaccggtagccatgatgcagcagtttttaccgcaaatcagagcagcttagcattta caacagattcctatgttatcaatccgctgtttittcctggtggtgatattggtagtcttgcagttcatggaaccgttaat gatttagcaatggcaggtgcaacaccgcgttatattagcgttgggtttattctggaggagggtttaccgatggag acactttggcgtgttgcacaaagcctgggtcaggcagcacagaattgtggagtigaaatattaacaggtgatac caaagttgttgatcgtgggaagggagatggtattittattaatacatcgggtatcggtagtttagatcaccagcaa accattcatccgaatcaggttcaggttggtgatcgtctgattctgagtggggatttaggacggcatggtatggcaa ttatggcagttcgtcagggcctggaatttgaaacaaccattgaaagcgatagcgcaccggttcatcgtgaggtt caggctctgctgagcgcagggattccgattcactgtctgegtgacttaacacgtggtggtctggcaagcgccgt gaacgaaattgcacaaacctcaggtgttacaatggctctgegtgaaaccttaattccggttgaggcggaagttc aagccgcctgtgaactgctgggttitgatcctttatatgttgcgaacgaaggccgtttcetggccattgttcegccg gaagccgaacagaaaaccgttgaaattctgcagaccttticacccgcaggcgaccgcaattggtaccgttacc ggcaagagtgcacagaccttaggtctggttagcctggagagtagcataggtgccccacgtctgttagatatgat tagcggagaacaactgccacgtatttgttaagactccaaaggaggctagattaatgctgaaaaccgttgccatt caggttcaggggcgcgttcagggggttggtittcggccgtttgtttacaccttagcccaggaaatgggtctgaatg gctgggttaataactctacgcagggtgcaaccgttgttattaccgcagatgagaaagcaattgcagattitaccg aacgtctgaccaaaacactgccgccaccgggactgatcgaacaactggcagtggaacagctgccgctgga aagctitaccaactttaccattagaccgagtagcgatggtccgaaaaccgcaagcatcctgccagatctgagc acatgtagcgcctgtctgaccgaattatttgatcccagtgatcgtcgttatctgtacccttttattaattgtacccactg tggtcctcgctataccattattgaagcactgccttatgaccgttgtcgtaccacaatggctcgttitegtcagtgtac ggattgtgaacgtgaatataagcagccgggggaccgcegttttcatgcacagccaaacgcgtgtccgcgttgt ggtccgcagctggcattctggaaccgtcagggtcaagttattgcagaagccaatgaagcactgaatitcgcag
10 tagataatttaaaggtcggtaatattatcgcaatcaaaggtctgggtggttttcatttatgttgtgatgcaaccgatttt gaagccgttgaaaaactgcgtttacgtaaacatcgcccggataagccgctggccgttatgtacggtaatctgg gtcagattgttgagcattatcagccgaataatttagaagttgagctgctgcagagcgcagcagcacctattgttct tctgaataaaaagaaacagctgattctggttgaaaatattgcaccgggcaatccgcgtgtgggtgttatgctgge atataccccgttacatcacctgttacttaaaaagttaaagaagccgatggttgcaacctccggtaacttagcagg cgaacagatttgtattgacaatattgacgcactgacccgtttacaaaatattgccgacggctttctggttcacgatc gtccgattgtttgtccggttgacgatagtgttgttcagattgtggcaggtaaaccgttatttttaagaagagcccgcg gttatgcaccgcagccgattacccttcctaaacccacccagaaaaagttattagcaatgggaggccattataa aaataccgttgcaattgcaaagcagaatcaggcatatgtaagccagcatttaggtgatttaaacagcgcacca acctaccaaaatttcgaagaggcgatagcccatttatcacagctgtatgactttagtccccaggaaattgtcgca gatctgcatccggattactttagccatcagtacgcagaaaaccaagccctgccggtgacgtttgtacagcatca ttatgcacatattctggcagttatggcagaacatggtgttatggaagaaagcgtittaggcattgcatgggatggc accggttatggtatggatggtaccatttggggtggtgaatttctgaaaattacgcaggggacctggcaaagaatt gcacatctgcagccgtitcatctgttagggaatcagcaggcaattaaatatccgcaccggattgcacttgctctg ctgtggccgacattcggggacgattttagcgccgatagtctgggtaattggttaaattttaacaacggtttcaaga acaagatcaacagccgtttaaaccaagacttaaataataagaacctgagacaactgtggcagcgtgggcag gcaccgctgacctcgagcatgggcagattatttgatggtatcgcaacactgattggtctgatcaatgaagtaac ctttgaaggccaggcagcaattgcattagaggcacaaattatgccgaatctgaccgaagaatactatccgctt accctgaataacaaagaaaaaaaactggcagttgattggcgtccgctgattaaagcaattaccaccgaagat cgtagcaaaaccaatctgattgcaaccaaatttcataatagcctggttaatctgattattaccattgcacagcagc agggtattgaaaaagttgcactgggtggtggttgttttcagaattgttatctgctggcaagcaccattaccgcactg aaaaaagcaggttttagcccgctgtggccgcgtgaactgccgccgaatgatggtgcaatttgtatgggtcagct gctggcaaaaattcaggcacgtcagtatatttgttaactcaacaaaggaggagctggttatgccgggtcagag caccaaaagcaccctgattatcgggtacgggaacaccttacgtggggacgatggggtggggcgctacctgg cagaagaaatagcacagcagaactggccgcactgtggtgttattagcacacatcagctgaccccggaactg gccgaagcaattgcagcagtggatagagtgattittattgacgcccaactgcaggaaagtgcaaatgaaccgt cagttgaagttgttgccctgaaaaccttagaacccaatgaattaagtggagatctgggtcatcgtggtaatccgc gtgagctgctgaccttagccaaaatattatatggtgttgaagtcaaagcgtggtgggttctgattccggcctttacc tttgattatggtgagaaattatcgcccttaacagcacgtgctcaggccgaagcactggcacagattcgtccgctg gttctgggggaacgttaacctagg La figure 3 représente la carte du plasmide pACYCDuet-1 utilisé pour construire le vecteur d’expression d’au moins un des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW par insertion de SEQ ID NO:5 et/ou SEQ ID NO:7 et/ou SEQ ID NO:9 et/ou SEQ ID NO:11 et/ou SEQ ID NO:13 et/ou SEQ ID NO:15 et/ou SEQ ID NO:17 et/ou SEQ ID NO:19 dans pACYCDuet-
1. pACYCDuet-1 est un plasmide de 4008pb, possédant une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance au chloramphénicol, deux sites de clonage multiple (MCS) contenant de nombreux sites de restriction, le promoteur T7 et le terminateur de transcription 77. Il contient également le gene /ac/ codant pour un répresseur de transcription. Cette répression de la transcription peut être levée par ajout d’IPTG.
La figure 4 montre l'analyse de la digestion du vecteur d'expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW (séquence concaténaire SEQ ID NO:19) par les enzymes de restrictions Ncol et Hindlll. Deux fragments d'ADN à environ 6000pb et à environ 4000pb sont mis en évidence, comme attendu pour une telle digestion enzymatique du vecteur d'expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW. Ceci confirme la présence de la séquence HypABCDEFHoxW dans le vecteur d'expression pACYCDuet-1.
3. Introduction des vecteurs d’expressions pET26b(+) + HoxH et pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW chez E. coli.
Les cellules compétentes BL21 (DE3) d’E. coli ont été utilisées pour l'expression recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803. Ces cellules sont utilisées en routine pour la production de protéine recombinante sous le contrôle du promoteur 77.
Les deux vecteurs d'expression « pET26b(+) + HoxH» et « PACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW » ont été introduits dans ces cellules par co-transformation selon la méthode traditionnelle du choc thermique bien connue de l'homme de métier. Les transformants présentant la double résistance à la kanamycine (50ug/ml) et au chloramphénicol (25ug/ml) ont été conservés sur milieu gélosé à 4°C.
4. Vérification de la présence des séquences d’ADN d’interets chez E.
coli.
Il est possible que certaines colonies possèdent les deux plasmides permettant la résistance aux marqueurs de sélections utilisés sans pour autant posséder les séquences d’ADN d'intérêts, à savoir HoxH et HypABCDEFHoxW.
Par conséquent, il est important de vérifier la présence de ces séquences d'ADN d'intérêts. Une expérience, bien connue de l'homme de métier et consistant en une extraction de l'ADN plasmidique de la colonie suivie par une digestion enzymatique de cet ADN plasmidique par les enzymes de restrictions utilisés lors de insertion des séquences d’ADN d'intérêts dans les plasmides, a été réalisé. Ainsi, une extraction d’ADN plasmidique, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, a été réalisée sur une colonie présentant la double résistance à la kanamycine et au chloramphénicol.
La digestion enzymatique a ensuite été réalisée, selon un protocole bien connu de l'homme de métier. La digestion du vecteur d'expression pET26b(+) + HoxH par les enzymes de restriction Ndel et Blpl donne deux fragments d’ADN, respectivement le plasmide pET26b(+) linéarisé à 5300pb et le fragment d’ADN d'intérêt HoxH à 1500pb (voir figure 5). La digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW par les enzymes de restriction Ncol et Hindlll donne deux fragments d'ADN, respectivement le plasmide pACYCDuet-1 linéarisé à 4000pb et le fragment d’ADN d'intérêt HypABCDEFHoxW à 6500pb (voir la figure 6). Ceci confirme la présence dans la colonie bactérienne de la séquence HoxH et HypABCDEFHoxW, respectivement dans les vecteurs d'expression pET26b(+) et PACYCDuet-1.
5. Production recombinante et purification par chromatographie d’affinité de HoxH chez E. coli.
Pour obtenir la forme recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803, une colonie d’E. coli contenant les deux vecteurs d'expressions a été utilisée pour ensemencer 4 erlenmeyers d’un volume de 250ml chacun. Le milieu de culture utilisé est le milieu 2XYT (16g de tryptone, 10g d’extrait de levure, 59 de NaCl parlitre) complété par FeAmCi 100uM, NiSO4 50uM, cystéine 50uM, kanamycine 50ug/ml et chloramphénicol 25ug/ml. A une densité optique (DO 600nm) de 1.2, 0,2mM IPTG sont ajoutés à la culture afin d’induire la production recombinante de la sous-unité HoxH à 18°C et sous agitation (vitesse d’agitation) de 200rpm. La durée de la production est de 20h à 18°C. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation (15min à 4500rpm) avant d’entamer le processus de purification.
Une méthode de purification a été mise au point afin de confirmer la production de la forme recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]-
hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp.
PCC6803. Cette méthode (voir figure 7) permet de purifier HoxH jusqu’à une apparente homogénéité en une seule étape de chromatographie d'affinité.
La méthode implique une chromatographie d’affinité avec un métal immobilisé (IMAC). L'agent chélatant est l’acide nitrilotriacetique (NTA) qui permet la liaison entre la phase immobile et l’ion métallique.
Le métal immobilisé est le nickel (Ni). Cette chromatographie permet une séparation très spécifique de protéines contenant une étiquette poly- histidines.
Après 20 h de production recombinante de HoxH à 18°C, 1 litre de culture d’E. coli est récolté par centrifugation (15min à 4500rpm). Les cellules sont re-suspendues dans 25ml de tampon de lyse (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 2ul benzonase + 50ul MgCla 1M + 1 pastille composée d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases sans EDTA) et ensuite lysées par la presse de French.
Le surnageant (25ml) est récupéré par centrifugation (15min à 15000rpm), filtré (0,45um) et appliqué sur la colonne Ni-NTA (1ml) préalablement équilibré dans le tampon de lavage (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 10mM imidazole). La colonne est ensuite lavée avec 35ml de tampon de lavage (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 10mM imidazole) jusqu’à ce que l’absorbance à 280nm (représentative de la concentration en protéine) retombe à zéro.
L’élution est alors réalisée par l'intermédiaire de 5 paliers avec concentration croissante en imidazole, respectivement 50mM, 100mM, 150mM, 200mM et 250mM) (voir figure 7). L’analyse SDS-PAGE des diverses fractions obtenues lors de la chromatographie montre une bande prédominante proche de 54kDa, ce qui est la taille attendue pour la sous-unité HoxH, dans les fractions éluées à une concentration de 100mM, 150mM, 200mM et 250mM en imidazole (voir figure 8). HoxH montre par ailleurs un excellent degré de pureté puisqu’aucune bande supplémentaire n’est visualisable dans les fractions éluées à des concentrations de 150mM, 200mM et 250mM en imidazole.
Ceci nous permet de conclure que HoxH a été purifié jusqu’à une apparente homogénéité en une seule étape de chromatographie d’affinité.
Afin de confirmer qu'il s'agit bien de la forme recombinante de la sous-unité HoxH comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp.
PCC6803, une immuno-détection à l’aide d’un anticorps
Al BE2019/5783 anti-étiquette poly-histidines a été réalisée (voir figure 9). Un marqueur de poids moléculaire contenant une protéine marquée d’une étiquette poly-histidines a été ajouté afin de servir de contrôle positif. La protéine recombinante HoxH est bien détectée dans la charge, c'est-à-dire le surnageant issu de la lyse des cellules d'E. coli et appliqué sur la colonne d'affinité Ni-NTA. La protéine recombinante HoxH est également présente dans la fraction non-absorbée par la colonne Ni- NTA. Cela indique que la capacité de chargement de la colonne Ni-NTA est dépassée et qu’une proportion de la protéine recombinante HoxH n’a pas pu s’y fixer. Aucun signal n'apparait dans la « fraction élution 50mM >». La protéine recombinante HoxH reste accrochée à la colonne Ni-NTA à cette faible concentration en imidazole. Enfin, la présence de la protéine recombinante HoxH est confirmée par immuno-détection dans la fraction 200mM à la taille attendue, c'est-à-dire proche de 54 kDa. Ceci confirme de manière non-ambiguë la purification de la protéine recombinante HoxH en une seule étape de chromatographie d’affinité. Lorsque la protéine recombinante HoxH est mise en évidence par immuno-détection dans une fraction, quelques bandes de faible intensité apparaissent également à des poids moléculaires inférieurs à 54kDa. Il s’agit vraisemblablement de la protéine recombinante HoxH partiellement dégradé à l’extrémité C-terminal. La proportion de protéines recombinantes HoxH dégradées semble minimum car l’analyse SDS-PAGE ne montre pas la présence de ces bandes. Pour rappel, l’immuno-détection est une méthode extrêmement sensible mettant en évidence de très petite quantité de protéine.
6. Mise en évidence de l’activité hydrogénase chez la protéine recombinante HoxH La faculté d’exprimer de manière recombinante les [NiFe]- hydrogénases permet une large gamme de possibilité dans l’optique de produire des formes mutantes aux propriétés très différentes de l’enzyme native. La figure 10 montre la structure de HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803. Le NADPH est le cofacteur de HoxEFUYH in vivo chez Synéchocystis sp. PCC 6803. Le méthyl-viologène (MV) est utilisé comme médiateur redox lors du test standard d’activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases.
La figure 11 est une représentation schématique (flèche grisée) du transfert d'électrons et des interactions attendues entre HoxEFUYH et le NADPH et/ou le MV.
Il est généralement acquis de l'homme de métier que le MV peut transmettre directement les électrons à un ou plusieurs centres FeS en évitant le FMN. Cependant, comme illustré à la figure 12, il n’est pas connu à ce jour si la seule sous-unité HoxH, contenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénases HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC 6803, peut accepter les électrons directement du MV et donc produire de l'hydrogène en l’absence de relais redox additionnel. Dans le cadre de la présente invention, pour tester cette possibilité, a été mis en oeuvre le test standard d'activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases en présence de la protéine recombinante HoxH et de MV (voir figure 13). Ce test standard d'activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases, selon un protocole bien connu de l'homme de métier, inclut l’utilisation d’une fiole de 2ml fermée par un septum, étanche à l'air et dégazé à l’azote. 1ml de mélange réactionnel, composé de 100mM de dithionite de sodium et 10mM de MV dissout dans du tampon phosphate 10mM pH 6.8 et également dégazé à l’azote, est ajouté dans la fiole à l’aide d’une seringue. 200ug de protéines recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La production d'hydrogène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont ajoutées (moment indiqué par une flèche sur la figure 13). Le contenu en protéines a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La production d'hydrogène est monitorée en continu à l’aide d’un micro-senseur à hydrogène préalablement calibré (Unisense, Aarhus, Danemark).
L'activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.m!*) est connue tout comme la vitesse de dégagement d'hydrogène (umol H2.min"t) pour cette quantité spécifique de protéine recombinante ajouté. Cette activité spécifique peut, par exemple, être de 0.1 umol Ha.min*.mg”.
De façon inattendue et surprenante, le fait que la seule sous-unité catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de
Synéchocystis sp. PCC6803 puisse catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d’un médiateur redox (par exemple, le méthyl-viologène) sans l'intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox, a été mis en évidence dans le cadre de la présente invention.
En absence de l’expression des autres sous-unités du pentamère HoxEFUYH, les problèmes inhérents à l’état de la technique sont solutionnés au moins en partie : la protéine recombinante HoxH est capable à elle seule de catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d’un médiateur redox (par exemple le méthyl-viologène) sans l'intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox. Cette caractéristique exceptionnelle démontre le grand avantage de la présente invention, en particulier la production recombinante d’une seule sous-unité possédant le site actif d’une [NiFe]- hydrogénase et étant catalytiquement active.
La présente invention a été décrite en relation avec des modes de réalisations spécifiques, qui ont une valeur purement illustrative et ne doivent pas être considérés comme limitatifs. D’une manière générale, il apparaîtra évident pour l’homme du métier que la présente invention n’est pas limitée aux exemples illustrés et/ou décrits ci-dessus.
L’usage des verbes « comprendre », « inclure », « comporter », ou toute autre variante, ainsi que leurs conjugaisons, ne peut en aucune façon exclure la présence d’éléments autres que ceux mentionnés.
L’usage de l’article indéfini « un », «une », ou de l’article défini « le », «la» OU « l” », pour introduire un élément n'exclut pas la présence d’une pluralité de ces éléments.

Claims (15)

Revendications
1. Polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
2. Polypeptide monomérique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il est isolé de son environnement naturel, en particulier isolé d’une protéine naturelle de type [NiFe]-hydrogénase.
3. Polypeptide monomérique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il est recombinant ou hétérologue.
4. Polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est purifié.
5. Polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications précédentes dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
6. Polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il présente une activité hydrogénase d’au moins 0,05 umol Hz . min” . mg”, de préférence d’au moins 10 umol Hz . min” mg”.
7. Cellule hôte incluant un polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications 1 à 6.
8. Cellule hôte selon la revendication 7, caractérisée en ce qu’elle inclut en outre au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase, de préférence au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans le groupe constitué des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
9. Cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications 1 à 6.
10. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce qu’elle inclut en outre au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase, de préférence au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans le groupe constitué des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
11.Procédé d’obtention, par exemple dans une cellule hôte, d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : e modification d’un vecteur d'expression, par exemple d'un plasmide,
en y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]- hydrogénase ; et e incubation dudit vecteur d'expression modifié selon des conditions d'incubation permettant d'assurer une expression dudit polynucléotide exogène pour produire un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
12.Procédé d'obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite étape de modification dudit vecteur d’expression consiste en une inclusion dans ledit vecteur d’expression dudit polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
13.Procédé d'obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que ladite étape de modification dudit vecteur d'expression comprend en outre l'inclusion dans ledit vecteur d’expression d'au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, de préférence d'au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase choisi dans le groupe constitué des facteurs de maturation
HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
14.Procédé d'obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon l’une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu’il comprend une étape subséquente d'isolation et/ou de purification dudit polypeptide monomérique.
15.Utilisation d’un polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule, pour produire ou consommer de l’hydrogène par incubation dudit polypeptide monomérique selon des conditions d’incubation permettant d'assurer une production ou une consommation d'hydrogène ou pour revêtir une surface, en particulier pour revêtir une surface d’un conducteur électrique, par exemple pour revêtir une surface d’une anode ou d'une cathode.
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