CN116568818A - 细菌非特异性过加氧酶(bupo)及其方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质工程和生物催化领域，更具体而言涉及具有过加氧酶活性的新型多肽以及与其相关的方法和用途。提供了一种生产黑色素或黑色素样色素的方法，所述方法包括使用具有产生色素的活性的多肽，其中所述多肽选自：(a)包含当与图1的序列号16的至少200个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列并包含至少两个下述基序的多肽：i)RXFWXRWXXGHQ；ii)LXXLXXCXD；iii)PRXXYH；iv)RXR[ML]ALQH；v)CXXL；vi)HXXIAXH；vii)DLXHXG；和viii)VDGXHHPV；其中X是任何氨基酸；(b)包含当与图2的序列号12的至少150个氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列并包含基序HXXXC的多肽，其中X是任何氨基酸；和(c)具有过加氧酶活性的所述(a)或(b)的多肽的片段。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程和生物催化领域。更具体而言，本发明涉及具有过加氧酶活性的新型多肽以及与其相关的方法和用途。
背景技术
过加氧酶(Peroxygenases)仅使用过氧化氢即可催化芳香族和脂族碳原子上的羟化和环氧化反应。迄今为止已知的酶是真菌起源的，它们属于两个类。I类(短过加氧酶)酶以二聚体蛋白(26kDa MroUPO/CglUPO)为代表，其具有组氨酸作为活性位点中的电荷稳定剂。它们不含分子内二硫键，但分子间二硫键连接所述单体。II类或长过加氧酶含有～44kDa的单体蛋白，其具有精氨酸作为活性位点中的电荷稳定剂，并含有分子内二硫桥。主要代表是AaeUPO和PabUPOs(Wang等，Curr.Opinion in Chem.Biology,Vol.37,2017,pp.1-9)。这两种类别可以通过它们活性位点中高度保守的基序的存在来鉴定(I类为-EHD-S-E-，II类为-EGD-S-R-E)。
细胞色素P450(CYP)是一个含有血红素作为辅因子的起到单加氧酶作用的酶的超家族。在哺乳动物中，这些蛋白质氧化甾类、脂肪酸和异生物质，并且对清除各种不同化合物以及激素合成和分解都是重要的。在植物中，这些蛋白质对防御化合物、脂肪酸和激素的生物合成是重要的。CYP酶已在所有生命界中鉴定到：动物、植物、真菌、原生生物、细菌、古菌(archaea)以及病毒。然而，它们不是无处不在的；例如，在大肠杆菌(Escherichia coli)中尚未发现它们。已知超过50,000种不同的CYP蛋白。
CYP通常是被广泛归类为含P450系统的电子传递链中的末端氧化酶。术语“P450”源自于当所述酶处于还原状态并与一氧化碳复合时在酶的最大吸收波长(450nm)处的分光光度峰。大多数CYP需要蛋白质配偶体传递一个或多个电子来还原铁(并最终还原分子氧)。
P450的显著反应性和底物多样性长期以来一直受到化学家的关注。最近在实现使用P450进行困难氧化的潜力方面取得的进展包括：(i)通过用廉价的含过氧化物的分子代替天然辅因子来消除对所述天然辅因子的需求，(ii)探索P450与有机溶剂的相容性，和(iii)使用小的非手性助剂来可预测地指导P450氧化。
真菌过加氧酶作为可以在许多反应中代替P450的一组有希望的酶出现。更确切地说，过加氧酶可以代替P450用于生物催化转化，从而能够实现此类过程的规模放大。P450的使用通常由于多组分系统而变得复杂。即使在BM3样P450的情况下，仍依赖于辅因子NAD(P)H和有效的解偶联率，所述解偶联率进一步导致酶失活(Holtmann等，ChemBioChem 2016,17,1391)。
WO2008/119780公开了来自于茶树菇(Agrocybe aegerita)、灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)、双色蜡蘑(Laccaria bicolor)和辐毛鬼伞(Coprinus radians)的8种不同的真菌过加氧酶。Ullrich等，2004,Appl.Env.Microbiol.70(8):4575-4581公开了一种来自于伞菌担子菌菌株茶树菇(Agrocybe aegerita)(菌株TM-A1)的过加氧酶，发现其能氧化芳基醇和醛。WO2006/034702公开了使用茶树菇TM A1的AaP过加氧酶对非活化烃类例如萘、甲苯和环己烷进行酶促羟化的方法。DE 10332065 A1公开了通过使用茶树菇TMA1的AaP过加氧酶由醇经由醛的中间态形成进行酶促制备酸的方法。
WO2011/120938公开了使用各种不同的真菌过加氧酶在取代或未取代的直链或支链脂族烃的2或3位上进行酶促羟化的方法。
过加氧酶的蛋白质工程仍有几个问题有待解决。这些问题包括对映选择性和离体选择性，但也包括阻止或降低过加氧酶活性。例如，一旦羟化后，芳香族化合物产生酚类，其可以作为具有过加氧酶活性的底物产生苯氧自由基作为产物，所述自由基导致形成不想要的聚合物。文献中提出的一种解决方案是添加自由基清除剂，文献中有许多将抗坏血酸用于该目的的实例。
然而，现有过加氧酶的改进和(工业)应用的一个主要障碍是它们是真菌来源的这一事实。这需要酵母或真菌表达系统，阻碍了生产和工业化。本领域中已记载了两种不同类型的来自于细菌来源的血红素过氧化物酶(heme peroxidase enzyme)，但它们被怀疑是过加氧酶。它们是来自于淡紫色链霉菌(Streptomyces lavendulae)的SfmD(Tang等，J.Biol.Chem.Vol.287,2012,pp.5112-5121)和来自于雷福恩链霉菌(Streptomycesrefuineus)的Orf13/LmbB2(Connor等，Biochemistry 2011,50,8926-8936)，两者均参与复杂天然产物的合成。SfmD参与番红霉素A(Saframycin A)的合成，Orf13参与安曲霉素的生物合成途径。
然而，发现参与次级代谢物的合成的酶具有相当特定的底物用法，因此限制了它们作为用于过加氧酶类型的反应的广范围生物催化剂的应用。
发明内容
因此，发明人着手于识别新的非真菌来源的具有高底物多样性，即对一组多样化的(商业上相关的)底物表现出过加氧酶活性的酶。在理想情况下，所述酶可以在非真菌宿主细胞中高水平表达。此外，他们旨在提供使用重组微生物宿主细胞生产黑色素类型的色素的酶和方法，所述重组是为了例如提高生物体的天然黑色素生成能力或产生新的产黑色素(细菌)菌株。
这些目标中的至少一些通过识别一组新的细菌非特异性过加氧酶(BUPO)得以实现，这些酶被发现可应用于工业用途的各种感兴趣的反应中。一个新的BUPO亚家族与Orf13/LmbB2显示出一定的序列相似性，而第二个亚家族与SfmD显示出一定的序列相似性。然而，值得注意的是，发现所述新的BUPO与已知的酶相比具有不同的催化性质。这些性质包括取代或未取代的、直链或支链、脂族或芳香族底物的羟化或氧化。具体而言，发明人识别了当在细菌宿主细胞中表达时具有生产深色黑色素类型色素的能力的BUPO。所述BUPO的其他有用的新应用包括任选取代的烷基硫醚、芳基硫醚或芳基烷基硫醚底物的对映选择性磺化氧化、取代或未取代的靛蓝染料的制备以及伯醇的氧化。
因此，一方面，本发明涉及一种生产黑色素和/或黑色素样色素的(生物技术)方法，所述方法包括使用选自下述的多肽：
(a)包含当与图1的序列号16的至少200个、优选地至少250个、更优选地至少270个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列并包含至少两个下述基序的多肽：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV；
其中X是任何氨基酸；
(b)包含当与图2的序列号12的至少150个、优选地180个、更优选地220个连续氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列并包含基序HXXXC的多肽，其中X是任何氨基酸，所述基序优选为H[IRKAQVG][GNELSYRHM][VI]C，更优选为HARVC；
(c)具有产生色素的活性的所述(a)或(b)的多肽的片段。
术语“黑色素或黑色素样色素”意味着包括一组广泛存在于自然界中的聚合棕黑色色素，它们是酚类或吲哚类底物的酶催化氧化的产物。具体而言，它们包括真黑色素(eumelanin)、褪黑素(pheomelanin)、异黑色素(allomelanin)和脓黑色素(pyomelanin)。
当在本文中使用时，术语“产生色素的活性”是指由一种或多种黑色素或黑色素样色素的前体催化形成所述一种或多种黑色素或黑色素样色素的能力。
在一个特定方面，所述方法包括将L-酪氨酸羟化成L-DOPA，随后氧化成多巴色素，以及形成黑色素或黑色素样色素。可选或额外的底物包括L-半胱氨酸和N-(羟基苯基)甘氨酸。
本发明还涉及一种用于取代或未取代的、直链或支链、脂族或芳香族底物的羟化或氧化的方法，所述方法包括将所述底物与具有过加氧酶活性的多肽和过氧化氢源接触，其中所述多肽选自如上文中所定义的(a)和(b)项下的多肽或具有所需过加氧酶活性的所述(a)或(b)的多肽的片段。
当在本文中使用时，术语“具有过加氧酶活性”是指催化反应S+H2O2→SO+H2O的能力，S是待羟化的底物。例如，如果S被描述为RH，则所述待催化的反应是RH+H2O2→ROH+H2O。
优选地，所述方法包括下述一者或多者：
-任选取代的烷基硫醚、芳基硫醚或芳基烷基硫醚底物的对映选择性磺化氧化；
-通过将取代或未取代的吲哚底物与过氧化氢源和所述多肽接触来制备取代或未取代的靛蓝染料；
-伯醇的氧化。
术语“成对序列同一性百分率”通常意味着当两个蛋白质序列比对时，在所述两个比对的序列中具有相同氨基酸的氨基酸残基位置与所有位置之间的系数。相对于本文公开的氨基酸序列的序列同一性百分数(％)被定义为在将序列对齐并且如有必要引入空位以实现最大序列同一性百分数，并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参比序列中的氨基酸残基成对相同的氨基酸残基的百分率。出于确定氨基酸序列同一性百分数目的的比对可以以本领域技术范围内的各种不同方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，例如当使用自由末端空位的全局比对方法、BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件进行比对时的成对序列同一性。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适合参数，包括在被比较序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”是指α-或β-氨基羧酸。当与蛋白质或肽结合使用时，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常指具有其现有技术公认的定义的α-氨基羧酸，例如选自下述的氨基酸：L-丙氨酸(Ala或A)；L-精氨酸(Arg或R)；L-天冬酰胺(Asn或N)；L-天冬氨酸(Asp或D)；L-半胱氨酸(Cys或C)；L-谷氨酰胺(Gln或Q)；L-谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；L-组氨酸(His或H)；L-异亮氨酸(Ile或I)；L-亮氨酸(Leu或L)；L-赖氨酸(Lys或K)；L-甲硫氨酸(Met或M)；L-苯丙氨酸(Phe或F)；L-脯氨酸(Pro或P)；L-丝氨酸(Ser或S)；L-苏氨酸(Thr或T)；L-色氨酸(Trp或W)；L-酪氨酸(Tyr或Y)；和L-缬氨酸(Val或V)，尽管在需要时可以使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸例如牛磺酸、鸟氨酸、硒代半胱氨酸、高胱氨酸、羟脯氨酸、硫代脯氨酸、碘代酪氨酸、3-硝基酪氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、5-羟色氨酸、肌肽、环亮氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸、脯氨醇、烯丙基甘氨酸或乙酰乙基-2-甲酸。通常，氨基酸可以被分组为具有：非极性侧链(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷的侧链(例如Asp、Glu)；带正电荷的侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电荷的极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
当在本文中使用时，“片段”是指母体蛋白质的一部分，所述部分具有过加氧酶活性。这种片段可以包含所述母体蛋白质的连续氨基酸。“片段”也可以是指其中将母体蛋白质的片段融合在一起的蛋白质。与母体蛋白质相比，片段也可以包含修饰例如氨基酸替换、氨基酸缺失或氨基酸插入。
本发明的方法在本领域中未被公开或提出。
US7,291,490涉及参与苯二氮卓类的生物合成的细菌酶。所公开的酶之一(UNKV或ORF13；被称为SEQ ID NO：26)与本发明的序列号16的代表性BUPO显示出一定的序列相似性。已证实ORF13具有酪氨酸3-羟化酶活性，并用于将酪氨酸转变成L-DOPA。WO02/101051也公开了这种酶，并表明它在导致林可霉素类或安曲霉素类形成的涉及几种其他酶的反应级联的第一步中，具有将L-酪氨酸羟化成L-3,4-二羟基苯丙氨酸的能力。然而，并没有教导或提出在黑色素类型的色素的生产或本发明的任何其他羟化/氧化反应中使用ORF13酶。
Martinez等人(Frontiers in Bioeng.and Biotech.2019,Vol.7,Art.285)对产黑色素重组微生物的产生方法和与其相关的生产过程进行了总结和讨论。提到的黑色素生成酶主要是酪氨酸酶和漆酶，两者都是含铜酶。然而，包括来自于链霉菌属菌种的酪氨酸酶在内的某些酪氨酸酶需要伴侣蛋白进行铜插入。4-羟基苯乙酸(4-HPA)羟化酶是一种双组分黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性单加氧酶，其可以羟化各种不同的一元和二元酚，因此它可以显示出黑色素生成活性。重要的是，所引用的技术未叙述本发明中公开的含血红素黑色素形成酶。甚至更令人吃惊的是，在链霉菌中观察到的黑色素生成活性在本领域中仅归因于酪氨酸酶(Lin等，J Microbiol Immunol Infect.2005Oct；38(5):320-6；Guo等，FEMS Microbiol Lett.2015Apr；362(8))，而本发明人将序列号15的链球菌酶鉴定为最有效的产生色素的酶之一。因此，尽管酪氨酸酶和漆酶可以被认为是微生物生产黑色素的天然工具，但本发明人首次证明，来自于次级代谢途径的某些受到严格调控的酶如酪氨酸羟化酶或在本文中重命名的BUPO，当在异源宿主中表达时可以促进高效的黑色素生产。
UniProt条目A0A3N4UNC0公开了一种从P.pacifica的基因组DNA获得的氨基酸序列。所述序列被称为假设蛋白质。尽管它与本发明的序列号12的代表性BUPO具有100％的序列同一性，但该公开没有教导或提出所述蛋白质实际上可以被生产并具有技术功能。因此，本领域未提到所述蛋白质在羟化或氧化方法中的用途，正如本发明中所证实的。
在一个实施方案中，本发明的方法包括“LmbB2型”或“II型”多肽的使用，所述多肽包含当与序列号16(参见表1)的至少200个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列并包含至少两个下述基序：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV；
其中X是任何氨基酸。
优选地，存在至少基序i)和vi)。
发现II型酶具有高度活性和通用的过加氧酶活性。关于本发明的示例性II型酶的比对，包括似乎保守的基序，参见图1。
本发明的示例性多肽包含下述基序中的至少三者，优选地至少四者，更优选地至少五者，甚至更优选地至少六者：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV。
例如，提供了一种多肽，其包含基序RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；CXXL，优选为C[EAR][AE]L；HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV。
此外，所述(a)项下的多肽还可以包含下述基序中的一者或两者：
a.LWRAM
b.EDL[YF]DN[FY][FY]，优选为EDLYDNFF。
在本发明中使用的II型酶可以包含与表1中示出的序列(序列号16、15、17或18；第II组酶)中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％成对序列同一性的氨基酸序列或其具有过加氧酶活性的片段，或者由所述氨基酸序列或片段组成。一方面，II型酶包含当与序列号16的至少200个、优选地至少250个、更优选地至少280个连续氨基酸残基比对时具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％成对序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。
一方面，所述酶含有对应于序列号16的Arg115、Met118、Phe125、Ser 126、Leu180、Tyr200和Phe204的残基中的一者或多者，因为发现这些残基对重组表达和/或催化活性、特别是对黑色素生产是重要的。例如，所述酶含有对应于序列号16的Phe125、Ser126、Leu180、Tyr200和Phe204的残基中的一者或多者。在一种特定情况下，至少存在Tyr200，优选地与Arg115、Met118、Phe125、Ser 126、Leu180和Phe204中的一者或多者组合。在另一个实施方案中，至少存在Arg115和/或Leu180或类似残基例如Lys115、Val180或Ile180。
序列号16的第50、53和/或110位处的Trp残基可以被另一个“大体积”残基例如Phe、Tyr或Arg代替。
在一个实施方案中，所述多肽是根据序列号15-18中的任一者，优选为序列号16的酶，或其具有所需的产生过加氧酶/色素的活性的片段。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种“SfmD型”或“I型”多肽，其包含当与序列号12的优选地从序列号12的第156位亮氨酸残基开始的至少150个氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列，并包含基序HXXXC,其中X是任何氨基酸。关于本发明的示例性I型酶的比对，参见图2。
所述HXXXC基序与血红素在所述酶中的并入有关。在一个实施方案中，所述I型酶包含基序H[IRKAQVG][GNELSYRHM][VI]C，优选为HARVC。
所述I型多肽优选地还包含下述残基/基序中的一者或多者：
i)DXXFXXXR；优选为D[LEAFDSRHT][AGFHY]F[GNCLR][IAV][VELKIRSD]R，更优选为DSYFLVER；
ii)R[WR]XX[GQ]HXXF；优选为R[WR][VIRMKH][RYCLVQK][GQ]-H[HLYQR][VLIAS]F，更优选为RWKQQHQLF；
iii)YXXXXR[PV]；优选为Y[N/T/Q/V/E/A/H/D/R/Q][E/T/D/S/Q/A]-[Q/R/E/S/A/I/G/F/T/V/M/L/N][IV]RP，更优选为YESRIRP；
iv)H232；
v)[LM]281；优选为L281；
其中X是任何氨基酸，并且其中编号对应于序列号12的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述多肽包含基序HXXXC(其中X是任何氨基酸)和至少如上所定义的基序i)。例如，它至少包含基序i)、ii)和iii)，或基序i)和ii)，或基序i)和iii)。示例性的酶包括具有序列号2-13和19-22(参见表2)的酶。
在一个实施方案中，所述多肽包含基序HXXXC(其中X是任何氨基酸)和至少基序ii)、iii)、iv)和/或v)，例如至少基序ii)和iii)，或基序iii)和iv)，或基序ii)、iv)和v)。在优选实施方案中，至少存在基序HXXXC和H232(基序iv)。在特定情况下，所述多肽不含基序i)。示例性的酶包括具有序列号23-29的酶。
在一个实施方案中，所述I型多肽包含下述残基/基序：
i)DXXFXXXR；优选为D[LEAFDSRHT][AGFHY]F[GNCLR][IAV][VELKIRSD]R，更优选为DSYFLVER；
ii)R[WR]XX[GQ]HXXF；优选为R[WR][VIRMKH][RYCLVQK][GQ]-H[HLYQR][VLIAS]F，更优选为RWKQQHQLF；
iii)YXXXXR[PV]；优选为Y[N/T/Q/V/E/A/H/D/R/Q][E/T/D/S/Q/A]-[Q/R/E/S/A/I/G/F/T/V/M/L/N][IV]RP，更优选为YESRIRP；
iv)H232；和
v)[LM]281。
I型多肽可以包含与序列号2-13和19-29(第I组酶)中的任一者具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％成对序列同一性的氨基酸序列或其具有过加氧酶活性的片段，或者由所述氨基酸序列或片段组成。优选地，所述多肽与序列号2-7、10-13、19-21和23-29中的任一者，优选地与序列号12显示出至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％的成对序列同一性，
示例性的酶包括具有根据序列号2-13和19-29中的任一者、优选为序列号12的序列的多肽或其具有过加氧酶活性的片段。优选的I型酶包括包含序列2、3、4、7、8、11、12、13、20、21和28中的任一者或其具有过加氧酶活性的片段，或者由所述序列或片段组成的酶。
根据本发明的多肽可以在其N-和/或C-端包含(通过遗传融合)一个或多个另外的氨基酸序列或蛋白质标记物。在一个实施方案中，所述多肽包含N-端标记物。在另一个实施方案中，所述多肽包含C-端标记物。在另一个实施方案中，所述多肽包含N-和C-端标记物两者。所述另外的标记物序列可能有助于所述多肽的表达产率、折叠、溶解、纯化和/或固定化。此类序列在本领域中是公知的。示例性的融合标记物包括麦芽糖结合蛋白、N-利用物质A(NusA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、生物素羧基载体蛋白、硫氧还蛋白和纤维素结合结构域、短肽标记物例如寡聚组氨酸(6xHis；His标记物)、寡聚赖氨酸、S-肽和FLAG肽。示例性的溶解性标记物包括SUMO(小遍在蛋白样修饰剂)或MBP(麦芽糖结合蛋白)。在特定情况下，所述酶含有N-端His标记物。可选地或另外地，它被提供有SUMO标记物。
在将所述多肽应用于催化过加氧酶之前，可以从它们(蛋白水解)除去所述标记物序列。例如，可以使用SUMO特异性蛋白酶例如Ulp1切割SUMO融合蛋白，以除去SUMO组成部分。
本发明还涉及一种组合物，其包含一种或多种根据本发明所述的多肽。例如，所述组合物包含全细胞、通透化细胞、细胞提取物或无细胞提取物，其包含重组表达的本发明的酶。在优选情况下，所述组合物是细菌细胞培养物，其包含将本发明的一种或多种多肽作为异源酶表达的细菌宿主细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含溶解或固定化形式的所述酶。所述组合物可以是包含一种或多种过加氧酶、一种或多种底物、H2O2源和/或产物的反应混合物。
还公开了一种分离的多核苷酸，其编码根据本发明所述的多肽。所述多核苷酸可以被包含在核酸构建物或表达载体中，优选地其中所述多核苷酸被可操作连接到指导所述多肽在表达宿主中的生产的一个或多个控制序列。示例性的表达载体在本领域中是已知的。所述载体优选地含有一个或多个可选择标记，其允许容易地选择被转化、转染、转导等的细胞。可选择标记是一个基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、针对营养缺陷型的原养型等。在一个实施方案中，所述载体是大肠杆菌表达载体。例如，多肽可以使用基于pET(IPTG诱导型)的载体或基于pBAD(阿拉伯糖诱导型)的载体来表达。
所述控制序列可以是启动子，即被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导所述多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所述宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码对所述宿主细胞来说同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。所述控制序列也可以是前导序列，即mRNA的对被宿主细胞翻译来说重要的非翻译区。所述前导序列被可操作连接到编码所述多肽的多核苷酸的5'-端。可以使用在所述宿主细胞中有功能的任何前导序列。所述控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。所述终止子被可操作连接到编码所述多肽的多核苷酸的3'-端。在本发明中可以使用在所述宿主细胞中有功能的任何终止子。用于细菌宿主细胞的优选终止子从克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)碱性蛋白酶{aprH)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformi)α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌(Escherichia coli)核糖体RNA(rrnB)的基因获得。所述控制序列也可以是启动子下游和基因编码序列上游的提高基因表达的mRNA稳定区。适合的mRNA稳定区的实例从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)crylllA基因和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SP82基因获得。
本发明的另一个实施方案涉及一种重组宿主细胞，其包含编码本文所公开的多肽的本发明的核酸构建物或表达载体。一方面，所述编码核酸序列是表达载体的一部分。在另一个实施方案中，所述编码核酸序列被整合到所述宿主细胞的基因组中。例如，可以通过本领域中已知的方法包括基因组编辑方法、同源重组和涉及CRISPR-Cas系统的方法，将所述编码基因整合到宿主生物体的基因组中。
所述宿主细胞可以是可用于本发明的多肽的重组生产的任何细胞，例如原核生物或真核生物。
所述原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、地芽孢杆菌(Geobacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)和链霉菌(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括弯曲杆菌(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌(Flavobacterium)、梭杆菌(Fusobacterium)、螺杆菌(Helicobacter)、泥杆菌(Ilyobacter)、奈瑟氏菌(Neisseria)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)和脲原体(Ureaplasma)。
在特定情况下，所述宿主细胞是大肠杆菌。对于使用基于pET的载体的表达，可使用大肠杆菌BL21、大肠杆菌C41/C43或大肠杆菌BL21AI菌株，而对于基于pBAD的载体，可以使用大肠杆菌NEB10beta、大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21AI和其他标准菌株。
宿主细胞可以被遗传修饰以具有改进遗传操作、蛋白质分泌、蛋白质稳定性和/或过加氧酶的表达或分泌所需的其他性质的特征。例如，宿主细胞可以被修饰以含有能够除去融合到本发明的多肽的标记物序列的酶。例如，所述宿主细胞包含不仅编码带有SUMO和His标记物的目标过加氧酶，而且编码带有SUMO标记物的Ulp1蛋白酶的载体。这两种蛋白质的共表达导致所述目标酶与SUMO标记物的体内切割，同时仍将所述目标酶保持在可以通过镍亲和层析从可溶性细胞裂解物中纯化的形式。
还提供了一种生产具有过加氧酶活性的多肽的方法，所述方法包括：(a)在有助于所述多肽生产的条件下培养所述宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
用于生长本发明的宿主的适合的培养基在本领域中是公知的，例如参见Sambrook等，《分子克隆》(Molecular Cloning)(1989)，同上。通常，适合的培养基含有用于宿主系统生长的所有必需营养物。所述培养基可以增补有为宿主-载体系统所选的抗生素。
表达的多肽可以以包含本发明的酶的全细胞、通透化细胞、细胞提取物或无细胞提取物的形式使用。在另一个实施方案中，所述酶以可溶或固定化形式使用。表达的酶可以使用本领域中已知的方法从细胞回收。任选地，可以使用本领域中公知的方法来富集(例如纯化或部分纯化)蛋白质。例如，所述多肽可以通过常规程序进行分离，包括离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、层析(例如离子交换、固相结合、亲和、疏水相互作用、层析聚焦和孔径排阻层析)和/或过滤或沉淀。根据需要，可以使用蛋白质重折叠步骤来完成成熟蛋白质的构造。最后，可以在最终纯化步骤中使用高效液相色谱(HPLC)。
本发明还提供了一种羟化或氧化目标底物的方法，所述方法包括将所述底物与过氧化氢源和根据本发明的具有过加氧酶活性的多肽接触。优选地，所述底物是烃类底物，更优选为取代或未取代的、直链或支链、脂族或芳香族底物。
所述过加氧酶所需的过氧化氢可以被提供为过氧化氢或用于原位产生过氧化氢的过氧化氢前体的水性溶液。在溶解后释放可以被过加氧酶使用的过氧化物的任何固体实体可充当过氧化氢源。在水或适合的水基介质中溶解后产生过氧化氢的化合物包括金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸、烷基过氧化物、酰基过氧化物、过氧酯、过氧化脲、过硼酸盐和过氧羧酸或其盐。
另一种过氧化氢源是产生过氧化氢的酶系统，例如氧化酶以及用于所述氧化酶的底物。氧化酶和底物的组合的实例包括但不限于氨基酸氧化酶(参见例如US 6,248,575)和适合的氨基酸、葡萄糖氧化酶(参见例如WO95/29996)和葡萄糖、乳酸氧化酶和乳酸盐、半乳糖氧化酶(参见例如WO00/50606)和半乳糖、甲酸氧化酶和甲酸盐(Willot等，2020,ChemCatChem Volume12,Issue10,pp.2713-2716)以及醛糖氧化酶(参见例如WO99/31990)和适合的醛糖。
过氧化氢或过氧化氢源可以在本发明的方法开始时或过程中加入，例如作为过氧化氢的一次或多次单独添加或作为进料连续地分批添加。过氧化氢的典型量对应于0.001mM至25mM的水平，优选地对应于0.005mM至5mM的水平，特别是对应于0.01至1mM或0.02至2mM过氧化氢的水平。过氧化氢也可以以对应于0.1mM至25mM的水平、优选地0.5mM至15mM的水平、更优选地1mM至10mM的水平、最优选地2mM至8mM过氧化氢水平的量使用。本发明的方法可以使用固定化的过加氧酶进行。
因此，本发明还涉及根据本发明的多肽作为催化剂的用途，优选地作为过加氧酶或产生黑色素型色素的反应的催化剂。
本发明的方法可以在水性溶剂或缓冲体系(反应介质)中进行。适合的缓冲体系容易被本领域技术人员确认，并包括磷酸钾(K-Pi)缓冲液。
根据本发明的方法可以在0至90℃之间、优选地5至80℃之间、更优选地10至70℃之间、甚至更优选地15至60℃之间、最优选地20至50℃之间、特别是20至40℃之间的温度下进行。本发明的方法可以使用10秒至(至少)24小时、优选地1分钟至(至少)12小时、更优选为地5分钟至(至少)6小时、最优选地5分钟至(至少)3小时、特别是5分钟至(至少)1小时的处理时间。
在一个实施方案中，本发明提供了一种羟化目标底物的方法。例如，本文所公开的过加氧酶适合用于催化取代的酚或酚酸的羟化。在特定情况下，使用序列号7、15、16、17或18的酶或其活性片段。
令人吃惊地发现，本发明的过加氧酶适合用于L-DOPA和黑色素的合成。也被称为左旋多巴或l-3,4-二羟基苯丙氨酸的L-DOPA是一种氨基酸，它被人类以及某些动物和植物制备并用作其正常生物学的一部分。人类以及一部分在其生物学中利用L-DOPA的其他动物通过从氨基酸L-酪氨酸开始的生物合成来制备它。L-DOPA是被统称为儿茶酚胺类的神经递质多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的前体。此外，L-DOPA本身介导大脑和CNS释放神经营养因子。纯形式的L-DOPA作为一种精神活性药物以非专利名称“左旋多巴”销售。作为药物，它被用于帕金森氏病和多巴胺响应性肌张力障碍的临床治疗中。
因此，在特定情况下，本发明提供了一种将L-酪氨酸羟化成L-DOPA的方法，所述方法任选地还包括氧化成多巴色素和形成黑色素。对于该反应，特别感兴趣地是包含与序列号2、8、11、12、13、16、17或20中的任一者、优选为12或16具有至少40％、至少50％、至少60％或至少70％成对序列同一性的序列或由所述序列组成的多肽，或其具有所需L-Tyr羟化活性的片段。因此，本发明提供了一种生物技术生产L-DOPA的方法。
黑色素在保护人体免受紫外线的有害影响方面发挥重要作用。黑色素也是医学和美容领域中的一种重要因子。已知黑色素在皮肤组织中形成或合成。过量黑色素使皮肤变黑，并且黑色素的不均匀分布导致黄褐斑和雀斑这两种皮肤障碍。黑色素的生物合成途径涉及酪氨酸向L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)的催化羟化和L-DOPA向多巴色素的转化。
在特定情况下，本发明提供了一种生产黑色素或黑色素样色素的方法。对于该反应，特别感兴趣地是包含与序列号2、8、11、12、13、15、16、17、18和20中的任一者、优选为序列号15、16或17具有至少40％、至少50％、至少60％或至少70％成对序列同一性的序列或由所述序列组成的多肽，或其具有所需的产生色素的活性的片段。因此，本发明提供了一种生物技术生产黑色素和/或与黑色素相关的棕色或黑色色素的方法。
通过应用遗传工程技术，可过表达一个或多个编码本发明的参与微生物宿主细胞中黑色素形成的BUPO的基因。这允许提高黑色素生成生物体的生产能力，并允许产生可以生产多种类型黑色素的新型重组微生物菌株。此外，通过修饰与供应黑色素生成前体相关的途径对微生物宿主进行代谢工程改造，可以提供具有以克为规模由简单碳源全合成黑色素的能力的菌株。
在一个实施方案中，本发明提供了一种发酵生产黑色素或黑色素样色素的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供将具有产生色素的活性的BUPO作为异源多肽表达的微生物宿主细胞；
ii)在培养基中培养所述宿主细胞并使其生产黑色素或黑色素样色素；和
iii)分离黑色素或黑色素样色素。
例如，多肽可以作为异源酶在基于pET的载体或基于pBAD的载体中表达。在一个实施方案中，使用基于pET的载体。
在黑色素的发酵生产中使用的优选BUPO包括与序列号2、8、11、12、13、15、16、17、18和20、优选为序列号15、16或17具有至少60％或至少70％或至少80％成对序列同一性的BUPO，或其具有所需的产生色素的活性的片段。例如，已发现对应于Leu180和Arg115的残基对于黑色素生产是重要的。在特定情况下，它是序列号16的多肽或其显示出产生色素的活性的变体，例如其中Trp50和/或Trp53被改变成“大体积”残基例如Arg或Phe的突变体。
所述宿主细胞可以是细菌、酵母或真菌宿主细胞，优选为细菌宿主细胞，更优选为大肠杆菌。使用这些生物体获得黑色素的方法可能涉及旨在识别对生产力有积极影响的培养条件和培养基组分的实验优化方法。例如，已经发现培养参数例如温度、pH、氧气和黑色素前体浓度对生产力有贡献。通过提高培养基中L-酪氨酸或含有它的组分的浓度，可以观察到与色素生产的正相关性。因此，本发明的方法可以包括使用增补有至少一种黑色素前体、优选为L-酪氨酸的培养基。然而，在大多数情况下，典型的培养基包括酵母提取物或蛋白质水解物例如胰蛋白胨。因此，在黑色素形成过程中，除了L-酪氨酸之外的某些培养基组分也可以掺入到聚合物色素中，产生不是纯的真黑色素的色素。
因此，可以将宿主细胞在含有葡萄糖或甘油作为碳源的限定培养基中生长，以产生纯度更高和/或更容易纯化的黑色素。此外，这种培养基可以增补有黑色素前体例如酪氨酸以产生真黑色素，或者增补有前体例如酪氨酸、半胱氨酸和/或N-(羟基苯基)甘氨酸的混合物，以产生具有不同特征的黑色素。
本领域中已知存在各种不同的从微生物细胞培养物分离或纯化黑色素类型的色素的方式，例如使用低pH沉淀或层析法。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了细菌酶用于产生黑色素或黑色素样色素的用途,其中所述酶是选自下述的多肽：
(a)包含当与图1的序列号16的至少200个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列并包含至少两个下述基序的多肽：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV；
其中X是任何氨基酸；
(b)包含当与图2的序列号12的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列并包含基序HXXXC的多肽，其中X是任何氨基酸，所述基序优选为H[IRKAQVG][GNELSYRHM][VI]C，更优选为HARVC；
(c)具有产生色素的活性的所述(a)或(b)的多肽的片段。
具体来说，本发明提供了所述酶的用途，其中所述细菌酶被包含在全细胞，优选为将所述酶作为异源酶表达的重组微生物细胞中。
另一方面，本发明涉及伯醇的氧化，优选为藜芦醇向藜芦醛的氧化。对于该反应，特别感兴趣地是包含与序列号12、15、16、17或18中的任一者具有至少40％、至少50％、至少60％或至少70％成对序列同一性的序列或由所述序列组成的多肽，或其具有所需醇氧化活性的片段。
又一方面，本发明涉及一种催化磺化氧化的多肽。提供了一种对任选取代的烷基硫醚、芳基硫醚或芳基烷基硫醚底物进行对映选择性磺化氧化的方法，所述方法包括将所述底物与过氧化氢源和根据本发明的具有所需磺化氧化活性的多肽接触。例如，所述底物选自甲基苯基硫醚、苯甲基苯基硫醚、烯丙基苯基硫醚、苯甲基甲基硫醚、正丁基甲基硫醚、乙基苯基硫醚和异丙基苯基硫醚。对于磺化氧化来说，特别感兴趣的酶包括与序列号4、15、16、17或18中的任一者显示出至少40％、至少50％、至少60％或至少70％成对序列同一性的多肽，或其具有所需(苯甲硫醚)磺化氧化活性的片段。
本发明还提供了一种制备取代或未取代的靛蓝染料的方法，所述方法包括将取代或未取代的吲哚与过氧化氢源和根据本发明的多肽接触。对于该反应来说，特别感兴趣的是包含与本文公开的任何II型酶、特别是序列号15、16、17或18中的任一者具有至少40％、至少50％、至少60％或至少70％成对序列同一性的序列或由所述序列组成的多肽，或其具有所需吲哚羟化活性的片段。
本发明的其他方面：
1.一种具有过加氧酶活性的分离的多肽，其选自：
(a)包含当与图1的序列号16的至少200个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列并包含至少两个下述基序的多肽：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV；
其中X是任何氨基酸；
(b)包含当与图2的序列号12的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列并包含基序HXXXC、优选为H[IRKAQVG][GNELSYRHM][VI]C、更优选为HARVC的多肽，其中X是任何氨基酸；
(c)具有过加氧酶活性的所述(a)或(b)的多肽的片段。
2.方面1(b)所述的多肽，其还包含下述残基/基序中的一者或多者：
i)DXXFXXXR，优选为D[LEAFDSRHT][AGFHY]F[GNCLR][IAV][VELKIRSD]R，更优选为DSYFLVER；
ii)R[WR]XX[GQ]HXXF，优选为R[WR][VIRMKH][RYCLVQK][GQ]-H[HLYQR][VLIAS]F，更优选为RWKQQHQLF；
iii)YXXXXR[PV]，优选为Y[N/T/Q/V/E/A/H/D/R/Q][E/T/D/S/Q/A]-[Q/R/E/S/A/I/G/F/T/V/M/L/N][IV]RP，更优选为YESRIRP；
iv)H232；
v)[LM]281，优选为L281；
其中X是任何氨基酸，并且其中编号对应于序列号12的氨基酸序列。
3.方面1所述的多肽，其包含与表1(II组酶)的序列号15、16、17和18中的任一者具有至少60％、至少70％、至少80％或至少90％成对序列同一性的序列，或其具有过加氧酶活性的片段。
4.方面3所述的多肽，其中所述序列是序列号15、16、17和18中的任一者，优选为序列号16，或其具有过加氧酶活性的片段。
5.方面1或2所述的多肽，其包含与表2的序列号2-13和19-29中的任一者具有至少40％、至少50％、至少60％或至少70％成对序列同一性的序列，或其具有过加氧酶活性的片段。
6.方面5所述的多肽，其中所述序列是序列号2、3、4、7、8、11、12、13、20、21和28中的任一者，或其具有过加氧酶活性的片段。
7.根据方面1-6中的任一方面所述的多肽，其还包含允许增强表达、溶解、纯化和/或固定化的N-和/或C-端蛋白质标记物。
附图说明
图1：多种新的II型BUPO多肽的氨基酸序列比对。在顶部注明了保守序列基序(i)至(viii)以及(a)和(b)。
图2：多种新的I型BUPO多肽的氨基酸序列比对。在顶部注明了保守序列基序(i)至(v)和HXXC。
图3：示出了本发明的新型BUPO之间的进化关系的系统发育树。还包括了已知的酶SfmD(序列号1)和lmbB2(序列号14)。
图4：示例性的纯化BUPO的UV-Vis光谱。在～405nm处Soret条带的存在示出了血红素掺入。图A：序列号12；图B：序列号7；图C：序列号11；图D：序列号18；图E：序列号17；图F：序列号16。
图5：具有序列号12、序列号17或序列号16的酶将L-酪氨酸转化成L-DOPA的HPLC色谱图。L-酪氨酸标准品具有2.50min的保留时间，而L-DOPA标准品(*)在2.41min的保留时间处洗脱。大多数L-酪氨酸被序列号12和16转化成L-DOPA，而对序列号17来说观察到部分转化。
图6：针对不同底物具有过加氧酶活性的新的BUPO酶的筛选。A、B行：由酪氨酸产生黑色素；C、D行：由吲哚产生靛蓝；E、F行：藜芦醇氧化；G、H行：对甲酚氧化。在所有情况下，反应混合物含有50mM pH 7.5的磷酸钾缓冲液中的5mM底物和1-20μM的酶溶液。通过添加过氧化氢(终浓度为2mM)开始反应。照片在1h后获取。
测试的酶：序列1(SfmD)-A1、C1、E1、G1；序列2–A2、C2、E2、G2；序列5–A3、C3、E3、G3；序列3–A4、C4.E4、G4；序列13–A5、C5、E5、G5；序列4–A6、C6、E6、G6；序列12–A7、C7、E7、G7；序列7–B1、D1、F1、H1；序列11–B2、D2、F2、H2；序列15–B3、D3、F3、H3；序列18–B4、D4、F4、H4；序列17–B5、D5、F5、H5；序列16–B6、D6、F6、H6；对照(无酶)–B7、D7、F7、H7。在孔A6、A7、B5和B6中观察到有色产物，对应于黑色素产生；D3、D4、D5和D6对应于靛蓝产生；H5和H6对应于对甲酚氧化和聚合。
图7：通过将示例性BUPO酶与各种不同底物反应获得的反应混合物的代表性HPLC色谱图。
图(A)对甲酚与酶序列号7、序列号16或序列号17的反应。对甲酚标准品的保留时间为9.38min，而观察到的羟化/氧化产物(*)在2.85min(对于no.7)以及8.05min和8.55min(对于no.16和no.17)的保留时间处洗脱。具有序列号16的酶在给定条件下转化大部分底物。
图(B)间甲酚与酶序列号16或序列号17的反应。间甲酚标准品的保留时间为9.40min，而观察到的产物(*)在7.6min、8.05min和8.55min的保留时间处洗脱。
图(C)对硝基酚与酶序列号16或序列号17的反应。对硝基酚标准品的保留时间为3.5min，而观察到的产物(*)在1.25min、5.4min和5.75min的保留时间处洗脱。
图(D)原儿茶酸与酶序列号15、序列号16、序列号17或序列号18的反应。原儿茶酸标准品的保留时间为1.2min，而观察到的产物(*)在5.1min、5.4min和7.0min的保留时间处洗脱。
图8：通过将甲基苯基硫醚(苯甲硫醚)与示例性的BUPO酶反应获得的反应混合物的代表性GCMS色谱图。苯甲硫醚的保留时间为12.42min，而观察到的氧化产物甲基苯基亚砜在17.50min的保留时间处洗脱。图A：对照(无酶)；图B：序列号4；图C：序列号15；图D：序列号16；图E：序列号17；图F：序列号18。
图9：在增补有酪氨酸的限定培养基中培养的表达代表性产色素BUPO的微生物细胞的培养物的上清液。
图10：序列号16的多肽中的突变对黑产生黑色素的活性的影响。深色与黑色素类型的色素的水平相关。
具体实施方式
实施例1：新型BUPO的克隆、表达和纯化
使用SfmD或LmbB2作为查询序列，针对非冗余序列的整个NCBI数据库进行广泛的BLAST搜索。然后，构建了SfmD样酶(I型)和Orf13/LmbB2样酶(II型)的系统发育树(图3)。选择不同分支的代表并作为合成基因进行排序。
将编码所选的推定BUPO的合成基因克隆到pET28a、pBAD-His或pBAD-His-SUMO载体中。在通过Sanger测序确认序列后，对于基于pET28的构建物，将最终的构建物转化到化学感受态大肠杆菌BL21菌株(C43或BL21AI)，或对于基于pBAD的构建物，转化到大肠杆菌NEB10β中。挑取单菌落，并在增补有相应抗生素的5mL Luria Bertani(LB)培养基中生长过夜。
第二天，将过夜培养物在含有相应抗生素的terrific肉汤(TB)中1:100稀释。将培养物在37℃下温育，直至OD600＝0.6。此时通过添加1mM IPTG(对于pET28构建物)或0.02w/v％阿拉伯糖(对于pBAD构建物)以及0.5mM 5-氨基乙酰丙酸(一种血红素前体)来诱导表达；所有浓度均作为最终浓度给出。使用带挡板的Erlenmeyer摇瓶，在具有2.5-5cm轨道的定轨摇床中，以150-200rpm在17℃下进行46-72小时的表达。
使用冷却离心机在4℃下以4000x g收获细胞。将细胞沉积物重悬浮在含有150mMNaCl并添加有0.1mM PMSF和0.1mg/ml溶菌酶的50mM pH 7.8磷酸钾(KPi)缓冲液中。使用VibraCell超声仪破碎细胞(打开5秒，关闭10秒，总时间5min，振幅70％)。在4℃下以19000xg使用冷却离心机，获得澄清的无细胞提取物(CFE)。
将CFE负载在预先平衡的Ni-Sepharose柱上(含有150mM NaCl的50mM pH 7.8KPi缓冲液)。用3CV的起始缓冲液，然后用3CV的含有30mM咪唑的起始缓冲液洗去未结合的蛋白质，并在含有0.5M咪唑的起始缓冲液中洗脱。合并洗脱的级分，并使用EconoPac脱盐柱(BioRad)将缓冲液交换成含有150mM NaCl的50mM pH 7.8KPi缓冲液。收集UV-Vis光谱以评估纯化的蛋白质的浓度。然后将蛋白质在液氮中快速冷冻，并在-70℃下储存。可以以～60mg/L terrific肉汤(TB)培养基的产量纯化大多数BUPO。这些酶是红色的，并在它们的UV-Vis光谱中显示出存在Soret条带，这是血红素掺入的证据。一些示例性酶的光谱参见图4。
实施例2：过氧化物酶活性的定性分析
使用已建立的Russig’s blue测定法(Yamada等，(2017)PLoS ONE 12(4):e0175846)测试第一批纯化的酶的过加氧酶活性。标准测定混合物包含15％(v/v)乙醇、100mM KPi(pH 7.5)、过量(～5-10mM)的H2O2、1-甲氧基萘(1-MN)和10μL纯化的酶，总体积为100μl。通过添加所述酶开始反应，并在室温下进行5min。从610nm处吸光值的增加确定反应产物Russig's blue的产生[(ε)1.45×104M-1cm-1]。所述测定在读板器中进行。
已发现，至少序列号15、17和18的II型酶可以利用1-MN作为底物，而本领域中已知的SfmD酶不接受1-MN作为底物。此外，有趣的是注意到尽管SphingoUPO和SpinosaUPO酶(序列号11和13)均对1-MN没有活性，但它们在细菌宿主细胞中的表达确实产生了深色/黑色培养基。这表明所选酶之间的不同底物范围。
实施例3：L-Tyr羟化成L-DOPA和黑色素
将由在50mM pH 7.5KPi中的5mM L-Tyr、5-20μM纯化的酶(序列12、16和17)和1mMH2O2组成的反应混合物(0.5mL)在25℃温育1h，并通过在95℃加热5min停止反应。将反应混合物以15000xg离心5min，并得到的上清液通过反相HPLC-DAD，使用Waters Xselect CSHFluoro-phenyl 5μm 4.6x250 mm柱，使用18min内含有0.8％甲酸(A)和乙腈(B)的水的线性梯度(10-50％)，以1.2mL/min的流速分析。使用L-Tyr和可商购的L-DOPA作为标准品。发现所有测试的酶都产生L-DOPA(参见图5)和黑色素(参见图6，A、B行)作为产物，这意味着这些酶具有单酚酶和二酚酶活性。
一些表达酶的细菌培养物呈深色，表明了所述表达的蛋白质产生黑色素样深色(棕色/黑色)色素的能力，所述色素可以通过细胞膜扩散，或者它在培养基中由可通过细胞扩散的反应产物形成。结构单元最可能是从代谢途径获取的酪氨酸。
对于本领域已知的酶(SfmD，序列号1，和LmbB2，序列号14)来说，没有观察到深色的出现，但对于新发现的酶的各种不同代表(序列号2、8、11、13、16、17和20)明显观察到深色。观察到的色素能够通过截留分子量(MWCO)为30kDa的超滤膜。使用单独的纯化的酶进行实验，以测试是否可以在体外获得类似的结果(图6)。
酪氨酸转化成L-DOPA和多巴色素的反应图式：
实施例4：取代的酚和酚酸的羟化
使用与上述相同的程序，使用反相HPLC示出了用酶12、15、16、17和18将对甲酚(图6，G、H行；和图7A)和间甲酚(图7B)羟化并进一步氧化成寡聚物和不溶性聚合物。在HPLC分析之前通过以15000x g离心5min除去不溶性聚合物。也通过HPLC证实了对硝基酚(图7C)和原儿茶酸(图7D)的羟化。对于对硝基酚来说，使用序列号为12、16和17的酶观察到活性，而对于原儿茶酸来说，对序列号为12、15、16、17和18的酶证实了活性。
实施例5：黑色素类型的色素的发酵生产
方法
使用在基于pET或pBAD的载体中过表达不同BUPO的大肠杆菌细胞测试了黑色素的生产。对基于pET28的构建物来说，在增补有卡那霉素和5-氨基乙酰丙酸的自诱导培养基中使用了大肠杆菌BL21细胞。对基于pBAD的构建物来说，在增补有氨苄青霉素、5-氨基乙酰丙酸和0.02％阿拉伯糖的TB培养基中使用了大肠杆菌NEB10β细胞。表达通过将100μL预接种物(过夜培养物)与900μL上述培养基混合来进行，并且表达在深孔微量滴定板(DWMTP)中在30℃下进行20h。此外，在向培养基添加L-酪氨酸(1g/L)的情况下进行了相同的实验。自诱导TB组成(g/L)：胰蛋白胨(12)、酵母提取物(24)、(NH4)2SO4(3.3)、MgSO4(0.15)、葡萄糖(0.5)、乳糖(2.0)并添加磷酸钾缓冲液(14.85，与标准TB缓冲液相同的组成)。
结果
在第一组实验(不向培养基添加酪氨酸)中，仅在使用pET28构建物的培养物中观察到深色的黑色素类型的色素的形成。在表达对应于序列号:7、8、12或20(较低强度)或序列号11、18、17、16和15(高强度)的酶的宿主细胞的培养物中观察到色素形成。
当培养基增补有酪氨酸时，一些使用基于pBAD的构建物的培养物也显示出黑色素生产。它们是对应于下述序列号的培养物：13、12和2(高强度)。从pET构建物表达BUPO的宿主细胞的培养物给出了相同的结果：所有培养物的黑色素产生增加，最显著的是酶12、8和20的培养物。
在复杂培养基(TB和自诱导培养基)中黑色素的发酵生产实验之后，在以葡萄糖为唯一碳源并增补有0.5g/L酪氨酸的基本培养基(minimal media)(M9+微量元素，本领域已知的配方)中评估黑色素的生产。表达使用由pET28构建物表达异源BUPO多肽的大肠杆菌BL21细胞进行。使用1mM IPTG并添加0.5mM 5-氨基乙酰丙酸进行诱导。在该实验中测试的酶包括下述酶：序列号20、7、4、16(两个双重突变体：R115A/L180A和R115A/L180S)、12、8、13、18、11、16、17和15。
得到的培养物显示出一系列的黑色素生产，其可以在有色色素的基础上目测观察(更深的培养物对应于更大量的黑色素)。出乎意料地是，某些培养物能够产生比其他培养物更大量的黑色素。例如，如图9中所示，序列号20、7或4的酶和酶16的两种突变体的培养物仅产生相对少量的黑色素；酶12、8、13、18和11的培养物产生中等量的黑色素，而酶16、17和15的培养物产生大量黑色素。
实施例6：诱变研究
接下来，在被设计用于识别与黑色素类型的色素的产生相关的残基的诱变研究中使用了序列号16的多肽作为代表性生产色素的酶。
评估了向丙氨酸和其他类似残基或系统发育研究中存在的残基的改变。这些残基包括Trp50、Trp53、Tyr110、Arg115、Met118、Phe125、Ser126、Leu180、Tyr200和Phe204。发现某些突变显著影响多肽的表达水平。例如，编码下述单点突变之一的构建物不能产生蛋白质：Tyr110Ala、Trp53Ala、Phe125Ala、Tyr200His、Tyr200Leu、Tyr200Val、Tyr200Ala、Phe204His和Phe204Ala。其余突变体可以被表达并纯化，尽管对于某些突变体来说表达产率降低(数据未示出)。
此外，黑产生色素的活性受到某些点突变的严重影响。这些点突变是Leu180Ser、Leu180Ala、Arg115Ala和Phe204Leu。参见图10。这些数据表明，在II型BUPO中至少残基Leu180和Arg115对于黑产生色素的活性来说是必需的。
实施例7：吲哚的羟化
对于酶的通过催化吲哚的羟化形成蓝色色素靛蓝的能力，测试了代表性的酶。
反应使用5mM吲哚作为底物，在pH 8的磷酸钾缓冲液中，在室温下进行。通过添加2mM过氧化氢开始反应。对于酶NobraUPO(序列号17)和NotUPO(序列号16)来说，靛蓝的形成被观察为强蓝色，对于ActUPO(序列号18)来说观察到浅蓝色，参见图6，C、D行。这些发现表明，使用全细胞、无细胞提取物或可溶或固定化形式的纯化酶，这些酶可用于吲哚和取代的吲哚的转化，以生产靛蓝类染料。
实施例8：伯醇的氧化
通常将藜芦醇(VA)向藜芦醛的氧化作为木质素过加氧酶活性的度量。它可以通过测量形成的醛在340nm处的吸光值来进行(ε340＝93mM-1cm-1)。
将所有酶(10μL)与170μL 5mM VA在50mM pH 8.0KPi中混合，并通过添加20μL50mM H2O2(终浓度为5mM)开始反应。设置不添加H2O2的对照反应。在读板器中测量吸光值的变化。
对于Nobra(seq 17)、Not(seq 16)和StrpetUPO(seq 15)、Ppac(seq 12)和Act(seq 18)，观察到催化VA氧化的明确的证实。参见图6，E、F行。
实施例9：茚、硫茚的氧官能化和磺化氧化反应
将所有底物溶解在1mL甲醇中，并用7mL pH 7.5KPi稀释。得到5mM底物溶液。反应体系包括将400μL含有5mM底物的50mM pH 7.5KPi、50μL酶储备溶液和25-50μL 20mM H2O2(终浓度为1-2mM)混合。将反应在Eppendorf管中温育，同时定轨振摇(1英寸轨道，150rpm，28℃)1-24h，然后通过用乙酸乙酯萃取停止反应(用于GCMS或手性GC分析)。将乙酸乙酯萃取物通过无水硫酸钠干燥，并取1μL进样到HP5柱上用于GCMS或进样到Chiraldex G-TA柱上用于GC-FID分析(两者均使用Shimadzu仪器进行)。或者，可以将使用手性OD-H柱的HPLC-UV/Vis用于对映体过量的定量。
对于序列号为16和17的酶，使用GC-MS确认了茚向1,2-环氧茚满和2-茚-2-酮的转化以及硫茚向羟基-苯并噻吩和苯并噻吩-2-酮的转化。
对于序列号为4、15、16、17和18的酶，使用GCMS分析确认了各种不同硫醚底物(甲基苯基硫醚、苯甲基苯基硫醚、烯丙基苯基硫醚、苯甲基甲基硫醚、正丁基甲基硫醚、乙基苯基硫醚和异丙基苯基硫醚)的磺化氧化。
此外，使用手性GC和手性HPLC分析，发现BUPO能够催化苯甲硫醚的对映选择性磺化氧化(数据未示出)。这是真正的过加氧酶活性的另一个证明，因为它表明氧由血红素铁转移过来。结果表明，所测试的酶主要产生S-对映异构体(酶18：42％ee，酶17：23％ee，酶16：33％ee)。
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Claims (22)
1.一种生产黑色素和/或黑色素样色素的方法，所述方法包括使用选自下述的多肽：
(a)包含当与图1的序列号16的至少200个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列并包含至少两个下述基序的多肽：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV；
其中X是任何氨基酸；
(b)包含当与图2的序列号12的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列并包含基序HXXXC的多肽，其中X是任何氨基酸，所述基序优选为H[IRKAQVG][GNELSYRHM][VI]C，更优选为HARVC；
(c)具有产生色素的活性的所述(a)或(b)的多肽的片段。
2.权利要求1所述的方法，其包括将L-酪氨酸羟化成L-DOPA，随后氧化成多巴色素，并形成黑色素和/或黑色素样色素。
3.权利要求1或2所述的方法，其包括黑色素和/或黑色素样色素的发酵生产，所述方法包括下述步骤：
i)提供表达所述具有产生色素的活性的异源多肽的微生物宿主细胞；
ii)将所述宿主细胞在培养基中培养，并使其产生黑色素和/或黑色素样色素；和
iii)分离黑色素和/或黑色素样色素。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌、酵母或真菌宿主细胞，优选为细菌宿主细胞，优选为大肠杆菌(E.coli)。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述培养基包含至少一种黑色素(样)色素前体，优选为L-酪氨酸，任选地与L-半胱氨酸组合。
6.一种羟化或氧化取代或未取代的、直链或支链、脂族或芳香族底物的方法，所述方法包括将所述底物与具有过加氧酶活性的多肽和过氧化氢源接触，其中所述多肽选自：
(a)包含当与图1的序列号16的至少200个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列并包含至少两个下述基序的多肽：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV；
其中X是任何氨基酸；
(b)包含当与图2的序列号12的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列并包含基序HXXXC的多肽，其中X是任何氨基酸，所述基序优选为H[IRKAQVG][GNELSYRHM][VI]C，更优选为HARVC；
(c)具有过加氧酶活性的所述(a)或(b)的多肽的片段。
7.根据权利要求6所述的方法，其包括一个或多个下述反应：
-任选地取代的烷基硫醚、芳基硫醚或芳基烷基硫醚底物的对映选择性磺化氧化；
-通过将取代或未取代的吲哚底物与过氧化氢源和所述多肽接触来制备取代或未取代的靛蓝染料；
-伯醇的氧化。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述多肽包含当与图2的序列号12的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列，并包含基序HXXXC，其中X是任何氨基酸，优选为H[IRKAQVG][GNELSYRHM][VI]C，更优选为HARVC；或具有过加氧酶活性的所述多肽的片段。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述多肽包含当与图1的序列号16的至少200个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列，并包含至少两个下述基序：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV；
其中X是任何氨基酸；或具有过加氧酶活性的所述多肽的片段。
10.根据权利要求6至9中的任一项所述的方法，其包括选自下述的底物的对映选择性磺化氧化：甲基苯基硫醚、苯甲基苯基硫醚、烯丙基苯基硫醚、苯甲基甲基硫醚、正丁基甲基硫醚、乙基苯基硫醚和异丙基苯基硫醚。
11.根据权利要求6至9中的任一项所述的方法，其包括将藜芦醇氧化成藜芦醛。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述多肽被包含在全细胞或无细胞提取物中，或其中所述多肽作为纯化的酶使用。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述(a)项下的多肽还包含下述基序之一或两者：
a.LWRAM
b.EDL[YF]DN[FY][FY]，优选为EDLYDNFF。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述(a)项下的多肽含有对应于序列号16的Arg115、Met118、Phe125、Ser 126、Leu180、Tyr200和Phe204的残基中的一者或多者。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述多肽包含与表1的序列号15、16、17和18中的任一者具有至少60％、至少70％、至少80％或至少90％成对序列同一性的序列，或其具有过加氧酶活性的片段。
16.根据权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中所述(b)项下的多肽还包含下述残基/基序中的一者或多者：
i)DXXFXXXR；优选为D[LEAFDSRHT][AGFHY]F[GNCLR][IAV][VELKIRSD]R，更优选为DSYFLVER；
ii)R[WR]XX[GQ]HXXF；优选为R[WR][VIRMKH][RYCLVQK][GQ]-H[HLYQR][VLIAS]F，更优选为RWKQQHQLF；
iii)YXXXXR[PV]；优选为Y[N/T/Q/V/E/A/H/D/R/Q][E/T/D/S/Q/A]-[Q/R/E/S/A/I/G/F/T/V/M/L/N][IV]RP，更优选为YESRIRP；
iv)H232；
v)[LM]281；优选为L281；
其中X是任何氨基酸，并且其中所述编号对应于序列号12的氨基酸序列。
17.权利要求16所述的方法，其中所述多肽包含与表2的序列号2-13和19-29中的任一者具有至少40％、至少50％、至少60％或至少70％成对序列同一性的序列，或其具有过加氧酶活性的片段。
18.权利要求15所述的方法，其中所述多肽是序列号2、3、4、7、8、11、12、13、20、21和28中的任一者或其具有过加氧酶活性的片段。
19.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述多肽是序列号2、8、11、12、13、15、16、17、18和20中的任一者，优选为序列号15、16或17；或其具有产生色素的活性的片段。
20.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述多肽还包含允许增强表达、溶解、纯化和/或固定化的N-和/或C-端蛋白质标记物。
21.细菌酶用于生产黑色素或黑色素样色素的用途，其中所述酶是选自下述的多肽：
(a)包含当与图1的序列号16的至少200个连续氨基酸残基比对时具有至少50％成对序列同一性的氨基酸序列并包含至少两个下述基序的多肽：
i)RXFWXRWXXGHQ，优选为R[LV]FWYRWIAGHQ；
ii)LXXLXXCXD，优选为L[DE][ALV]L[ACST][TAS]C[IV]D；
iii)PRXXYH，优选为PR[AD][HQ]YH；
iv)RXR[ML]ALQH，优选为R[APT]R[ML]ALQH；
v)CXXL，优选为C[EAR][AE]L；
vi)HXXIAXH，优选为H[DS][HF]IA[ND]H；
vii)DLXHXG，优选为DL[AS]H[NH]G；和
viii)VDGXHHPV，优选为VDG[AR]HHPV；
其中X是任何氨基酸；
(b)包含当与图2的序列号12的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少30％成对序列同一性的氨基酸序列并包含基序HXXXC的多肽，其中X是任何氨基酸，所述基序优选为H[IRKAQVG][GNELSYRHM][VI]C，更优选为HARVC；
(c)具有产生色素的活性的所述(a)或(b)的多肽的片段。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述细菌酶被包含在全细胞中，优选地在作为异源酶表达所述酶的重组微生物细胞中。
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