CN1845989A - 抗微生物剂的重组产生 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗微生物剂和酶的共表达用途，以期提高产率和/或总生产经济。抗微生物剂的实例为抗微生物肽，如lactoferricin和抗微生物酶，如溶菌酶和葡萄糖氧化酶，酶的实例为内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α－半乳糖苷酶、果胶酸裂合酶、α－淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。包含所述抗微生物剂和所述酶和可切割的连接体的融合产物是新的，并且可以用于动物饲料和动物饲料添加剂中。本发明还描述了保护结构域的用途，其中所述肽保护结构域中包含的氨基酸残基的至少50％为D(Asp)和/或E(Glu)。所述保护或淬灭结构域用于在表达期间暂时和可逆地失活所述抗微生物肽。

Description

抗微生物剂的重组产生
发明领域
本发明涉及抗微生物剂的重组产生领域，具体涉及抗微生物剂和酶的共表达，以及涉及保护结构域的用途，其中该结构域中包含的至少50％的氨基酸残基为D(天冬氨酸，Asp)和/或E(谷氨酸，Glu)。
发明背景
背景技术
WO 96/14413公开了用于在曲霉(Aspergillus)的多种株系中表达重组人乳铁蛋白(lactoferrin)的多种表达载体。用于在泡盛曲霉(Aspergillusawamori)中表达的一种表达质粒含有葡糖淀粉酶启动子、信号序列和编码与人乳铁蛋白融合的泡盛曲霉的内源原-葡糖淀粉酶的498个氨基酸的序列。为了在米曲霉(Aspergillus oryzae)中表达人乳铁蛋白，表达质粒掺入米曲霉AMY II基因，其编码α-淀粉酶启动子、分泌信号序列和成熟α-淀粉酶的第一个密码子。为了在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中表达人乳铁蛋白，表达质粒掺入构巢曲霉alcA基因的300bp 5’-侧翼序列，其含有控制基因表达必需的所有调节元件，包括来自构巢曲霉的醇脱氢酶启动子。
WO 96/28559公开了某些阳离子抗微生物蛋白质作为融合蛋白质的表达，所述阳离子部分用于抑制阳离子蛋白质的抗微生物活性。阳离子载体肽的实例为谷胱甘肽-S-转移酶、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的蛋白A、蛋白A的两种合成的IgG-结合结构域(ZZ)，和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外膜蛋白F。
WO 98/54336公开了某些抗微生物蛋白质作为融合蛋白质的表达，其中带负电的酸性肽具有至少两个半胱氨酸残基。
WO 00/75344公开了使用多种连接体将外源多肽作为与果胶酸裂合酶的融合物表达，所述连接体为例如，PEPT(SEQ ID NO：79)、EPTP(SEQID NO：80)、PTEP(SEQ ID NO：81)、TPEP(SEQ ID NO：82)或IEGR(SEQ ID NO：83)(的重复序列)。外源多肽的实例为单链人胰岛素、人GLP1、和多种α-淀粉酶。
Okamoto等人在Plant Cell Physiol.39(1)：57-63(1998)中公开可通过GUS融合在转基因烟草植物中表达抗微生物肽麻蝇毒素IA。GUS指β-葡糖醛酸糖苷酶的蛋白质编码序列。
本发明的一个目的是提供用于产生抗微生物剂的改进方法。
发明概述
在第一方面，本发明涉及重组微生物宿主细胞，其包含编码抗微生物剂的第一种核酸序列，和编码酶的第二种异源核酸序列。这两种核酸序列的任一种，优选两种都可以整合到宿主细胞的染色体，或者它们可以以一种或多种染色体外实体存在。
在第二方面，本发明涉及核酸构建体，其包含编码抗微生物剂的第一种核酸序列，和编码酶的第二种核酸序列，所述核酸序列有效连接指导所述酶和所述抗微生物剂在适宜的表达宿主中表达的一种或多种控制序列，其中第二种核酸序列是表达宿主异源的。
在第三方面，本发明涉及通过使用本发明的重组宿主细胞产生所述酶和/或所述抗微生物剂的方法。
在第四方面，本发明涉及包含酶、抗微生物剂、可切割的连接体的融合产物，以及该融合产物在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。
在第五方面，本发明涉及抗微生物肽和酶的共表达的用途，用作提高所述肽的产率和/或改善总的生产经济的工具。
在第六方面，本发明涉及淬灭结构域(quenching domain)在抗微生物肽的重组产生中的用途，用于在所述肽的表达期间暂时和可逆地失活该肽，其中肽保护结构域中包含的氨基酸残基的至少50％为D和/或E。本发明还涉及鉴定此类淬灭结构域的方法，涉及通过该方法鉴定的淬灭结构域，和它们在抗微生物肽的重组产生中的用途。
发明详述
一般地，无论何时提及“一个(种)”时都指“至少一个(种)”，例如，在第一种和第二种核酸序列、抗微生物剂、酶和多种DNA构建体的上下文中。
本发明涉及至少一种酶与至少一种抗微生物剂的共表达。所述酶和所述抗微生物剂可以从宿主细胞的染色体、从不同的DNA构建体，或者从一种DNA构建体共表达，或者使用这些技术的联合。当使用不同构建体时，可以使用不同的选择性标记和不同的复制起点。当使用仅一种构建体时，基因可以从一个或多个启动子表达。如果在一个启动子的调节下克隆(二-或多-顺反子)，基因所克隆的顺序可以影响蛋白质的表达水平。所述酶和抗微生物剂还可以以融合蛋白质表达，即编码酶的基因已经与编码抗微生物剂的基因融合在框内。如果抗微生物剂将负面影响所选宿主细胞的生长，那么可以通过将所述肽作为与保护肽(淬灭结构域)的融合物表达淬灭抗微生物活性，其中在保护肽中至少50％的氨基酸残基为D和/或E(Asp和/或Glu)。
抗微生物剂
在本上下文中，术语抗微生物剂指具有抗微生物活性的化合物(见下文)。抗微生物剂的实例为抗微生物肽和抗微生物酶。
抗微生物酶的实例为破坏细胞壁、产生毒性化合物、除去必需营养物或者失活不希望的微生物生长必需的化合物的酶。溶菌酶(具有1，4-β-乙酰基胞壁质酶活性的酶)是破坏革兰氏阳性细菌的细胞壁的抗微生物酶的实例。氧化酶，如葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)产生对许多不希望的微生物有毒的过氧化氢。产生毒性化合物的抗微生物酶的其他实例为黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶、脂肪酶、髓过氧化物酶和磷脂酶。葡萄糖氧化酶也是除去必需营养物，即氧，从而防止需氧的不希望的微生物生长的酶。最后，巯基氧化酶是能够失活必需化合物，即不希望的微生物的那些必需酶的抗微生物酶，所述必需酶的活性依赖于完整巯基。这些酶是公知的并且已经重组产生，例如对于溶菌酶和葡萄糖氧化酶分别见Bio/Technology 8，1990，741-745，和WO 89/12675。
在具体实施方案中，抗微生物酶选自溶菌酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶，优选所述抗微生物酶为溶菌酶和/或葡萄糖氧化酶。
现在转向抗微生物肽，在具体实施方案中，根据本发明使用的抗微生物肽包含不超过100个氨基酸。
表达“包含不超过”某一数目的氨基酸(例如，100)指肽序列中氨基酸的数目小于或者等于100个。
在具体实施方案中，所述肽包含，或者具有或者由不超过100个氨基酸组成(对于下面提到的额外的上限数字反之亦然)。
在另一具体实施方案中，所述肽包含不超过90、80、70、60、50或不超过40个氨基酸。
可以将所述肽称作寡肽。
在另一具体实施方案中，所述肽包含至少3个氨基酸。
表达“包含至少”某一数目的氨基酸(例如，3个)指肽序列中氨基酸数目高于或者等于3个。
在额外具体实施方案中，所述肽包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20个氨基酸。
在另一具体实施方案中，所述肽包含，或者具有，或者由至少3个氨基酸组成(对于下面提到的额外的下限数字反之亦然)。
在下面列出根据本发明使用的抗微生物肽的实例。
抗微生物活性
术语“抗微生物活性”在本文中定义为能够杀死微生物细胞或者抑制微生物细胞生长的活性。在本发明上下文中，术语“抗微生物”意在指有杀细菌和/或抑细菌和/或杀真菌和/或抑真菌效果和/或杀病毒效果。
将术语“杀细菌”理解为能够杀死细菌细胞。将术语“抑细菌”理解为能够抑制细菌生长，即抑制正生长的细菌细胞。将术语“杀真菌”理解为杀死真菌细胞。将术语“抑真菌”理解为能够抑制真菌生长，即抑制正生长的真菌细胞。将术语“杀病毒”理解为能够失活病毒。术语“微生物细胞”指细菌或者真菌细胞(包括酵母)。
在本发明上下文中，术语“抑制微生物细胞的生长”意在指细胞处于非生长状态，即它们不能繁殖。
对于本发明，可以根据Lehrer等人，Journal of ImmunologicalMethods，Vol.137(2)pp.167-174(1991)描述的方法测定抗微生物活性。
在20℃，具有抗微生物活性的肽的25％(w/w)的水溶液；优选10％(w/w)的水溶液；更优选5％(w/w)的水溶液；甚至更优选1％(w/w)的水溶液；最优选0.5％(w/w)的水溶液；尤其0.1％(w/w)的水溶液中孵育8小时后，优选4小时后，更优选2小时后，最优选1小时后，尤其30分钟后，具有抗微生物活性的肽和/或酶能够将大肠杆菌(Escherichia coli)(DSM1576)的活细胞数减少到1/100。
在25℃，微生物生长基质中，具有抗微生物活性的肽和/或酶当以1000ppm的浓度加入；优选当以500ppm的浓度加入；更优选当以250ppm的浓度加入；甚至更优选当以100ppm的浓度加入；最优选当以50ppm的浓度加入；尤其当以25ppm的浓度加入时，所述具有抗微生物活性的肽和/或酶也能够抑制大肠杆菌(DSM 1576)的生长晕24小时。
在20℃，具有抗微生物活性的肽的25％(w/w)的水溶液；优选10％(w/w)的水溶液；更优选5％(w/w)的水溶液；甚至更优选1％(w/w)的水溶液；最优选0.5％(w/w)的水溶液；尤其0.1％(w/w)的水溶液中孵育30分钟后，具有抗微生物活性的肽和/或酶能够将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(ATCC 6633)的活细胞数减少到1/100。
在25℃，微生物生长基质中，具有抗微生物活性的肽和/或酶当以1000ppm的浓度加入；优选当以500ppm的浓度加入；更优选当以250ppm的浓度加入；甚至更优选当以100ppm的浓度加入；最优选当以50ppm的浓度加入；尤其当以25ppm的浓度加入时，所述具有抗微生物活性的肽和/或酶也能够抑制枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的生长晕24小时。
在实施例1中描述了抗微生物活性的详细测定法。
在具体实施方案中，作为抗微生物活性的备选方案，或者除了抗微生物活性，所述肽和/或酶还具有免疫刺激效果。该免疫刺激效果可以通过巨噬细胞中氧化爆发的增加或者备选地通过淋巴细胞的增殖增加来介导。
抗微生物肽(AMPs)的实例为膜活性抗微生物肽，或者影响/与细胞内靶标相互作用，例如，结合细胞DNA的抗微生物肽。它们通常具有针对正常哺乳动物细胞的低溶血活性和/或细胞毒性。用红细胞进行并且通过血红蛋白的释放测量溶血作用。用相关细胞系，例如人ME180宫颈上皮细胞(ATCC HTB-33)或者A549人肺上皮细胞(ATCC CCL-185)，使用四氮唑还原测定法(Boeringer-Mannheim，Indianapolis，USA)进行细胞毒性测定。
根据本发明使用的抗微生物肽通常是高度阳离子和疏水性的。它通常含有一些精氨酸和赖氨酸残基，并且它可以不含有一个谷氨酸或者天冬氨酸。它通常含有大比例的疏水残基。该肽通常具有两亲结构，一个表面高度阳性，另一个表面为疏水的。
所述肽和编码核苷酸序列可以来自植物、无脊椎动物、昆虫、两栖动物和哺乳动物，或者来自微生物，如细菌或者真菌。
抗微生物肽可以作用于靶微生物的细胞膜，例如，通过与膜的非特异结合，通常以膜平行的方向，仅与双层的一面相互作用实现对细胞膜的作用。
抗微生物肽通常具有属于5个主要类别之一的结构：α-螺旋的、富含胱氨酸的(防卫素样)、β-折叠、具有常规氨基酸的罕见组成的肽，和含有稀有和/或经修饰的氨基酸的肽。其他实例为来自巨大曲霉(Aspergillusgiganteus)和黑曲霉(Aspergillus niger)的抗真菌肽(AFP)，例如，WO02/090384中公开的那些。
在具体实施方案中，根据本发明使用的抗微生物肽为(i)α-螺旋肽；(ii)富含胱氨酸的肽；(iii)β-折叠肽；(iv)具有常规氨基酸的罕见组成的肽；(v)含有稀有的经修饰氨基酸的肽；和/或(vi)抗真菌肽。
在另一具体实施方案(vii)中，α-螺旋肽选自Novispirin、爪蟾抗菌肽1、爪蟾抗菌肽2、天蚕杀菌肽A、天蚕杀菌肽B、天蚕杀菌肽P1、CAP18、雄抗菌肽、Clavanin A、Clavanin AK、Styelin D、Styelin C、Buforin II和WO 02/000839、DK 2004000800、PCT/DK2004/000399和/或PCT/DK2004/000400中描述的抗微生物肽；以及它们的保持抗微生物活性的变体或者片段。
在另一具体实施方案(viii)中，富含胱氨酸的肽选自Plectasin、α-防卫素、HNP-1(人嗜中性粒细胞肽)、HNP-2、HNP-3、β-防卫素-12、Drosomycin、γ1-蝶呤硫素、昆虫防卫素A，和/或WO 03/044049中描述的抗微生物肽；以及它们的保持抗微生物活性的变体或者片段。
在另一具体实施方案(ix)中，具有罕见组成的肽选自Indolicidin、富含Pro-Arg的肽PR39、杀菌素Bac5、杀菌素Bac7、Histatin 5；聚-L-赖氨酸，和/或DK 2003001324中描述的抗微生物肽；以及它们的保持抗微生物活性的变体或者片段。
在另一具体实施方案(x)中，具有罕见氨基酸的肽选自乳链菌肽、短杆菌肽A，和/或丙甲甘肽；以及它们的保持抗微生物活性的变体或者片段。
在额外的具体实施方案(xi)中，所述肽为抗真菌肽。
在另一具体实施方案(xii)中，所表达的肽没有任何保护性支架蛋白质。
在具体实施方案(xiii)中，所述肽具有抗微生物活性和/或免疫刺激效果。
在另一具体实施方案(xiv)中，β-折叠肽选自乳铁蛋白、lactoferricins(如Lactoferricin B)、鲎抗菌肽I和/或Protegrin PG1-5；以及它们的保持抗微生物活性的变体或者片段。
乳铁蛋白是涉及哺乳动物中铁结合和递送的糖蛋白，其中在奶和其他体液中发现乳铁蛋白。乳铁蛋白的实例为人乳铁蛋白、牛乳铁蛋白、猪乳铁蛋白、马乳铁蛋白、鼠乳铁蛋白、羊乳铁蛋白等等。在20多年前将乳铁蛋白描述为抗微生物剂。
本文所用的术语lactoferricin指乳铁蛋白的片段，其具有抗微生物活性和/或免疫刺激效果。在具体实施方案中，根据本发明使用的lactoferricin来自牛乳铁蛋白(LFB)，其是具有689个氨基酸的蛋白质，多年来已经在工业上从干酪乳清产生并且添加到婴儿配方中。
在下面列出(非排他性列表)了根据本发明使用的lactoferricin的许多实例：
EP 474506中公开的SEQ ID NOs：1-4为通过乳铁蛋白水解产生的抗微生物肽；
在EP 503939中公开的SEQ ID NOs：5-19以及它们的在羧基末端具有酰胺的衍生物是基于牛乳铁蛋白的氨基酸18-28的抗微生物肽(LFB(18-28))；
EP 510912中公开的SEQ ID NOs：20-31以及它们的在羧基末端具有酰胺的衍生物是从牛乳铁蛋白通过水解可以得到的抗微生物肽；
EP 629213中公开的SEQ ID NO：32是另一种乳铁蛋白衍生物，其用于生产促进从多形核嗜中性粒细胞释放白三烯B4或者从肥大细胞释放组胺的药物。
美国专利号5,656,591中公开的SEQ ID NOs：1-4、SEQ ID NO：15、SEQ ID NOs：20-32和SEQ ID NOs：33-46是基于乳铁蛋白的抗微生物肽的额外的实例。
SEQ ID NO：47是牛乳铁蛋白的氨基酸1-50(LFB(1-50)，lactoferricinB(简写LFcinB，或LFB(17-41))指SEQ ID NO：47的氨基酸17-41。
SEQ ID NOs：48-52，即LFB(14-31)、LFB(17-31)、LFB(18-31)、LFB(19-31)、和LFB(20-31)分别为Rekdal等人在J.Peptide Sci.5：32-45(1999)中公开的额外的乳铁蛋白片段，所述文献还公开了SEQ ID NOs：53-55，即分别为变体LFB(17-31)17K、LFB(17-31)20F和LFB(17-31)17K+20F。
额外的lactoferricins，例如，SEQ ID NOs.56-57，即分别LFB(17-30)和LFB(19-37)由Groenink等人在FEMS Microbiology Letters 179(1999)217-222中公开。
根据Vogel等人(Biochem.Cell.Biol.80(2002)：49-63)，LFB的片段必须含有其6个氨基酸20-25(LFB(20-25)，SEQ ID NO：58)以便保持任何实际水平的抗微生物活性。
Stroem等人在J.Peptide Res.2000，56，265-274中公开了LFB(17-31)的许多变体，即17A、18A、19A、20A、21A、22A、23A、24A、25A、26A、27A、28A、29A、30A、和31A。
Haug和Svendsen在J.Peptide Sci.7：190-196(2001)中公开了LFB(17-31)的额外变体，即22F、24F和22F+24F。
在具体实施方案中，根据本发明使用的抗微生物肽(a)包含SEQ IDNO：58；(b)包含SEQ ID NO：47，和/或其片段或变体；(c)包含SEQ ID NOs：48-52、SEQ ID NOs：56-57的任一种，和/或其片段或变体。
酶
酶为具有酶活性的多肽。用于本发明目的的其他目的蛋白质产物(与抗微生物剂共表达)为激素、凝血因子、免疫球蛋白，以及其片段或变体。
下面的是尤其重要的酶实例的非限制性列表：内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶(galactanase)、甘露聚糖酶(mannanase)、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶。尤其相关的额外的酶为果胶酸裂合酶、α-淀粉酶和AMG。在具体实施方案中，所述酶为木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、半乳聚糖酶或者蛋白酶。在另一具体实施方案中，所述酶为肌醇六磷酸酶或者蛋白酶。在另一具体实施方案中，所述酶不是谷胱甘肽-S-转移酶。在另一具体实施方案中，所述酶不是β-葡糖醛酸糖苷酶。
对于酶的来源没有限制。从而，该术语不仅包括从任何属的微生物得到的天然或者野生型酶，还包括其任意类似物、突变体、变体、片段等等，以及合成酶，如改组的酶，和共有酶，只要它们显示出相关酶活性。可以如本领域公知的，例如，通过定点诱变、通过PCR，或者通过随机诱变制备此类基因工程化酶。
在具体实施方案中，所述酶，和/或编码它的核苷酸序列分别是异源或外源的酶和/或核苷酸序列。这表示它对于所选的或者计划的表达宿主细胞是外来的。术语异源的排除所讨论的宿主细胞内源的天然或野生型核酸序列。
在具体实施方案中，所述酶为低变应原性变体，其设计成当暴露于动物(包括人)时引起减小的免疫应答。可以使用本领域已知的技术制备低变应原性变体。
可以基于NC-IUBMB的手册Enzyme Nomenclature，1992对酶分类，也参见因特网： http：//www.expasy.ch/enzyme/的ENZYME站点。ENZYME是相对于酶命名法的信息仓库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB)的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为所述酶提供EC(酶委员会)编号(Bairoch A.The ENZYME database，2000，Nucleic Acids Res 28：304-305)。该IUB-MB酶命名法是基于它们的底物专一性和偶然基于它们的分子机理；这种分类不反映这些酶的结构特征。
对于本发明目的，木聚糖酶是分类为EC 3.2.1.8的酶。木聚糖酶可以来自细菌木聚糖酶，例如来自芽孢杆菌株系，或者可以是真菌木聚糖酶，包括酵母和丝状真菌木聚糖酶。真菌木聚糖酶可以，例如，来自曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、Thermomyces或者木霉属(Trichoderma)。
对于本发明目的，术语内切葡聚糖酶表示经分类或者可以分类为EC3.2.1.4、EC 3.2.1.6、EC 3.2.1.73或EC 3.2.1.39的酶。在具体实施方案中，内切葡聚糖酶是分类为EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6的酶。内切葡聚糖酶可以来自多种真菌和细菌株系，例如来自热子囊菌属(Thermoascus)。
本文所用的术语蛋白酶是可以以EC 3.4酶组分类的酶。蛋白酶的实例为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)蛋白酶I或蛋白酶II；黑曲霉(Aspergillus niger)酸性蛋白酶(蛋白酶A)；米曲霉(Aspergillusoryzae)aspergillopepsin O；在WO 01/58275的第5页，19-23行公开的来自芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、Paecilomyces lilacinus、曲霉属、Acremonium chrysogenum和Acremonium kiliense的酸稳定的枯草杆菌蛋白酶；和在WO 01/58276的第4页第27-28行公开的来自Nocardiopsis sp.和Nocardiopsis alba的酸稳定的蛋白酶。
Nocardiopsis sp.蛋白酶包含SEQ ID NO：59的成熟部分的氨基酸序列(氨基酸1-188)。优选的蛋白酶为SEQ ID NO：59的A87T，即具有SEQ IDNO：59的氨基酸1-188的蛋白酶变体，其中87位的Ala用Thr替代。
其他优选的蛋白酶如下：
来自Nocardiopsis dassonvillei subsp.Dassonvillei并且包含SEQ IDNO：60的成熟部分的氨基酸序列(氨基酸1-188)的蛋白酶。
来自Nocardiopsis alba并且包含SEQ ID NO：61的成熟部分的氨基酸序列(氨基酸1-188)的蛋白酶。
来自Nocardiopsis prasina并且包含SEQ ID NO：62的成熟部分的氨基酸序列(氨基酸1-188)的蛋白酶。
来自Nocardiopsis prasina并且包含SEQ ID NO：63的成熟部分的氨基酸序列(氨基酸1-188)的蛋白酶。
在具体实施方案中，SEQ ID NO：59、60、61、62或63的蛋白酶为包含延伸，如N-或C-末端延伸，优选C-末端延伸的变体。所述延伸可以在所述多肽的C-末端的最后4个氨基酸内包含至少三个非极性或不带电的极性氨基酸，尤其这些变体与野生型相比具有加入C-末端的一个或多个氨基酸的延伸。在其他具体实施方案中：
i)一个或多个加入的氨基酸为非极性或者不带电的；
ii)一个或多个加入的氨基酸为Q、S、V、A或P的一个或多个；
iii)一个或多个加入的氨基酸选自：QSHVQSAP(SEQ ID NO：84)、QSAP(SEQ ID NO：85)、QP、TL、TT、QL、TP、LP、TI、IQ、QP、PI、LT、TQ、IT、QQ和PQ。
在其他实施方案中，所述蛋白酶与SEQ ID NO：59的氨基酸1-188具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％或至少95％的同一性程度。
对于本发明，两条氨基酸序列之间同一性程度由程序“align”确定，该程序是Needleman-Wunsch比对(即，全局比对)。对多肽比对使用默认得分矩阵BLOSUM50。对于多肽，缺口的第一个残基的罚分为-12，对于多肽，缺口的其他残基的罚分为-2。
″Align″是FASTA包版本v20u6的一部分(见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS85：2444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 183：63-98)。FASTA蛋白质比对使用Smith-Waterman算法，对缺口大小没有限制(见″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)。
在本上下文中，肌醇六磷酸酶是可以分类为EC 3.1.3.8和/或EC3.1.3.26的酶。可以从例如曲霉属和Emericella、Thermomyces、腐质霉属(Humicola)、Peniophora、青霉属(Penicillium)、芽孢杆菌属、大肠杆菌；或者Schwanniomyces的多种株系得到肌醇六磷酸酶。
优选的肌醇六磷酸酶来自Peniophora lycii并且包含SEQ ID NO：64的氨基酸1-409，或者是其变体。在具体实施方案中，该变体选自WO03/066847的表1-5中公开的变体。
在其他具体实施方案中，肌醇六磷酸酶与SEQ ID NO：64的氨基酸31-439具有至少75％的同一性程度。
本文所用的术语半乳聚糖酶是可以分类为EC 3.2.1.89的酶。半乳聚糖酶可以来自例如，曲霉属、芽孢杆菌属、Thermotoga、Meripilus、毁丝霉属(Myceliophthora)腐质霉属、假单胞菌属(Pseudomonas)、Xanthomonas或者Yersinia的株系。
本文所用术语甘露聚糖酶指可以分类为EC 3.2.1.78的酶。甘露聚糖酶可以例如，来自曲霉属、芽孢杆菌属或者木霉属的株系。
本文所用术语葡聚糖酶指可以分类为EC 3.2.1.11的酶。葡聚糖酶可以例如，来自拟青霉属(Paecilomyces)的株系。
本文所用术语α-半乳糖苷酶指可以分类为EC 3.2.1.22的酶。α-半乳糖苷酶可以例如，来自曲霉属的株系。
本文所用术语α-淀粉酶指可以分类为EC 3.2.1.1的酶。
本文所用术语葡糖淀粉酶指可以分类为EC 3.2.1.3的酶。
本文所用术语果胶酸裂合酶指可以分类为EC 4.2.2.2的酶。
上面提到的物种的株系和本文提到的其他株系可以在许多培养物保藏中心容易得到，所述保藏中心为诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究机构保藏中心(NRRL)。
核酸序列
用于本发明的核酸序列可以为基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的，或者它们的任意组合。
用于分离或克隆编码本领域已知的抗微生物剂或者酶的核酸序列的技术是本领域已知的并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备、化学合成或者它们的组合。多数肽基因通过化学合成。通过信号捕获(例如，TAST，即转座子辅助的信号捕获(Transposon Assisted Signal Trapping))发现的肽基因为天然来源。
从此类基因组DNA克隆核酸序列可以例如，通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或者通过抗体筛选表达文库以检测具有共有的结构特征的所克隆DNA片段来实现。见，例如，Innis等人，1990，PCR：A Guide toMethods and Application，Academic Press，New York。也可以使用其他核酸扩增方法，如连接酶链反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
编码所述酶和/或抗微生物剂的核酸序列可以例如，从所希望的细菌或者真菌的株系，或者另一种或相关生物克隆，并且从而例如，可以是等位变体或者种变体。
本文所用的术语“分离的核酸序列”指基本上没有其他核酸序列的核酸序列，例如，如通过琼脂糖电泳测定为至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选至少约60％纯，甚至更优选至少约80％纯，最优选至少约90％纯。例如，通过用于基因工程将核酸序列从其天然位置重定位到不同位置(在该位置将复制该核酸序列)的标准克隆方法可以得到分离的核酸序列。克隆步骤可以包括切除和分离包含编码抗微生物剂或者酶的核酸序列的所希望的核酸片段，将所述片段插入到载体分子，并将重组载体掺入到宿主细胞，在宿主细胞中将复制所述核酸序列的多个拷贝或者克隆。
如权利要求1中定义的编码抗微生物剂或者酶的核酸序列的修饰可能对于变体剂或者变体酶的合成是必要的。术语“变体剂”和“变体酶”指其非天然发生的形式。这些可以以工程化方式与从其天然来源分离的抗微生物剂或者酶不同，例如，在比活、热稳定性、pH最适值、变应原性方面不同的活性剂或者酶变体，或者在抗微生物活性或者特异性谱等不同的活性剂变体。基于编码所述活性剂或者酶的成熟部分，例如，其子序列的核酸序列，和/或通过引入不产生所述核酸序列编码的多肽的另一氨基酸序列，但是相应于意在产生所述酶和活性剂的宿主生物的密码子选择，或者通过引入产生不同氨基酸序列的核苷酸替换，可以构建变体序列。关于核苷酸替换的一般描述，见，例如，Ford等人，1991，Protein Expression andPurification 2：95-107。例如，可以如上述制备低变应原性酶和抗微生物剂。
将对于本领域技术人员显而易见的是，可以在对分子的功能关键的区域之外进行此类替换并且仍然导致活性剂或者酶。对核酸序列编码的酶或者抗微生物剂的活性必需，并且因此优选不受到替换的氨基酸残基可以根据本领域已知的方法，例如，定点诱变或者丙氨酸扫描诱变进行鉴定(见，例如，Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一技术中，在分子的每个带正电荷的残基处引入突变，并测试所得突变分子的活性以鉴定对该分子的活性关键的氨基酸残基。可以通过分析如通过诸如核磁共振分析、晶体学或者光亲和标记的技术(见，例如，de Vos等人，1992，Science 255：306-312；Smith等人，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)测定的三维结构确定底物-酶相互作用位点。
核酸构建体
本发明涉及某种类型的核酸构建体，即包含编码抗微生物剂的第一种核酸序列，和编码酶的第二种核酸序列的构建体，所述核酸序列有效连接一种或多种控制序列，所述控制序列指导这些编码序列在与所述控制序列相容的条件下表达。在具体实施方案中，第二种核酸序列对表达宿主是异源的。
“核酸构建体”在本文定义为单链或双链核酸分子，其与天然发生的基因分离或者已经经修饰而含有核酸片段，所述片段以否则将不在自然中存在的方式组合和并列。当核酸构建体含有表达所需的所有控制序列时，术语核酸构建体与术语表达盒同义。
术语“核酸序列编码”或者“编码序列”在本文定义为直接指定其肽或者酶产物的氨基酸序列的核酸序列。编码序列的边界通常通过核糖体结合位点(原核生物)或者通过位于mRNA的5’末端可读框刚好上游的ATG起始密码子(真核生物)和位于mRNA的3’末端可读框的刚好下游的转录终止子序列确定。编码序列可以包括，但不限于，DNA、cDNA和重组核酸序列。
将表达理解为包括涉及酶和抗微生物剂的产生的任意步骤，包括，但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰，和分泌。
术语“控制序列”在本文中定义为包括分别对于酶和抗微生物剂的表达必要或者有益的所有组分。每个控制序列可以是各自编码核酸序列天然的或外来的。此类控制序列包括，但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列，和转录终止子。控制序列最少包括启动子、转录和翻译终止信号。为了引入特定限制位点以方便控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区的连接，可以为控制序列提供连接体。术语“有效连接”在本文中定义为一种结构，其中控制序列适当地置于相对于DNA序列的编码序列的某个位置使得控制序列指导多肽的表达。
控制序列可以为适宜的启动子序列——被宿主细胞识别用以表达所述核酸序列的一种核酸序列。启动子序列含有转录控制序列，其介导多肽的表达。启动子可以是在所选宿主细胞中显示出转录活性的任意核酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因得到。
用于指导本发明的核酸构建体的转录，尤其在细菌宿主细胞中转录的适宜的启动子的实例为从大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)生麦芽糖的(maltogenic)淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，和原核生物β-内酰胺酶基因得到的启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 80：21-25)。其他启动子在″Useful proteins from recombinantbacteria″in Scientific American，1980，242：74-94；和Sambrook等人，1989，上文中描述。
指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适宜的启动子的实例为从米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或者泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucormiehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)的基因得到的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合启动子)和其突变体、截短的和杂合启动子。
在酵母宿主中，从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)，和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因得到有用的启动子。Romanos等人，1992，Yeast 8：423-488描述了用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是适宜的转录终止子序列——宿主细胞识别用于终止转录的序列。终止子序列有效连接编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中有功能的任意启动子都可以用于本发明中。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因得到。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因得到。Romanos等人，1992(如上文)中描述了用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子。
用于细菌宿主细胞，如芽孢杆菌宿主细胞的优选终止子为来自地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽胞杆菌生麦芽糖的淀粉酶基因(amyM)或者解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的终止子。
控制序列还可以是适宜的前导序列，其是mRNA的非翻译区，其对于宿主细胞的翻译是重要的。前导序列有效连接编码所述多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中有功能的任意前导序列都可以用于本发明中。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因得到。
用于酵母宿主中的适宜前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因得到。
控制序列还可以是多磷酸化序列，其是有效连接核酸序列的3’末端并且当转录时被宿主细胞识别为向所转录的mRNA加入多腺苷残基的信号的序列。在所选宿主中有功能的任意多腺苷酸化信号都可以用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因得到。
用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码连接酶的氨基末端的氨基酸序列并且将所编码的酶导入细胞的分泌途径。核酸序列的编码序列的5’末端可以内在地含有信号肽编码区，其天然连接翻译读框，其具有编码所分泌酶的编码区的片段。备选地，编码序列的5’末端可以含有编码序列外来的信号肽编码区。当编码序列不天然含有信号肽编码区时，可能需要外来信号肽编码区。备选地，外来信号肽编码区可以简单地代替天然信号肽编码区以便增强酶的分泌。然而，将所表达的酶导入所选宿主细胞的分泌途径的任意信号肽编码区都可用于本发明中。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖的淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)，和枯草芽孢杆菌prsA的基因得到的信号肽编码区。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述了其他信号肽。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶得到的信号肽编码区。
酵母宿主细胞的有用信号肽得自以下来源的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的信号肽编码区。
所述控制序列还可以是编码位于酶氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得的多肽已知是一种酶原或前多肽(或在某些情况下为酶原)。前多肽一般没有活性，并可以通过催化切割或自身催化切割来自前多肽的前肽而转化为成熟的活性酶。所述的前肽编码区可以得自以下来源的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)。
当在酶的氨基末端存在信号肽和前肽区两者时，所述前肽区的位置与酶的氨基末端相邻，所述的信号肽区的位置与所述前肽区的氨基末端相邻。
加入对与宿主细胞生长相关的多肽的表达进行调节的调节序列也是所希望的。调节系统的实例是其对化学或物理刺激物(包括存在的调节化合物)的应答可以使得基因的表达被开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可以用作调节序列。调节序列的其它实例为允许基因扩增的调节序列。在真核系统中，它们包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码酶的核酸序列与调节序列有效连接。
本发明的核酸构建体可以包含编码一种以上酶的一种以上的核酸序列，例如，编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种酶的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种核酸序列。所述酶可以相同或不同。编码所述酶的所述核酸序列可以相同或不同。
本发明的核酸构建体还可以包含编码一种以上抗微生物剂的一种以上的核酸序列，例如，编码、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗微生物剂的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种核酸序列。本发明的核酸构建体还可以包含编码20种以上抗微生物剂的20种以上的核酸序列，例如，编码多达25、30、35、40、45、或甚至多达50种抗微生物剂的多达25、30、35、40、45、或甚至多达50种核酸序列。抗微生物剂可以相同或不同。编码所述抗微生物剂的所述核酸序列可以相同或不同。当在内含体中发生表达时，核酸序列数目可以尤其在更高的范围内。
在本发明的核酸构建体中，编码所述酶的核酸序列可以在编码所述抗微生物剂的核酸序列的上游，或者反之亦然。此外，一些酶编码序列在抗微生物剂编码序列的上游，一些在下游，反之亦然。
当然，作为作为一般知识，在本文描述的所有核酸构建体中，个体组分序列，如编码所述酶、抗微生物剂的核酸序列、控制序列以及将在下文描述的连接体和结构域将正确间隔和并列以便使得发生所希望的正确的表达。
在下面列出了本发明的相对简单的核酸构建体的三个实例a)-c)。以通常的5’到3’方向列出了构建体，并且使用下面的简写：AMP：抗微生物肽；ENZ：酶；RBS：核糖体结合位点；PROM：启动子；TERM：终止子)：
a)PROM-RBS1-基因(AMP)-连接体-基因(ENZ)-TERM
b)PROM-RBS1-基因(AMP)-RBS2-基因(ENZ)-TERM
c)PROM1-RBS1-基因(AMP)-TERM1-PROM2-RBS2-基因(酶)-TERM2
Ad a)：该构建体导致一种转录产物和一种翻译产物，即融合蛋白质(融合产物)。在上面的构建体中，“连接体”表示可切割的连接体，其在下文更详细描述，并且其提供了融合蛋白质AMP-连接体-ENZ随后切割成不同的产物，分别是AMP和ENZ。
Ad b)：该构建体导致一种转录产物，但是两种翻译产物，因为由于基因(AMP)中内在的翻译终止密码子，翻译将终止。因此，将产生两种不同产物AMP和ENZ。
Ad c)：在该构建体中，将在基因(AMP)后终止转录，但是转录在PROM2处继续。因此，从该构建体导致两种转录产物，以及两种翻译产物，AMP和ENZ。通过应用不同长度的PROM1和PROM2启动子，或者通过使用一种或多种可诱导的启动子，与ENZ相比，AMP的表达可以受到调节，或者反之亦然，例如，以期得到所表达的AMP与ENZ的所希望的摩尔比。
下面的构建体d)-f)是本发明的核酸构建体的非限制性实例，该构建体掺入一个以上的编码所述酶和/或肽的核酸序列。应用上面的相同观点，然而，为了简单起见，排除控制序列、连接体等：
d)基因(ENZ)-基因(AMP)-基因(AMP)
e)基因(ENZ)-基因(AMP)-基因(AMP)-基因(AMP)
f)基因(ENZ)-基因(AMP)-基因(AMP)-基因(AMP)-基因(ENZ)
在上面的构建体中，AMP可以表示相同或不同的AMP序列，对于ENZ也是如此。
可切割的连接体
在氨基酸水平，将术语“可切割的连接体”定义为包含切割位点的氨基酸序列，通常相对短的氨基酸序列，例如，由1-30个氨基酸组成。术语“切割位点”指可以通过切割剂，例如通过物理或化学的，通常酶的方法特异切割的特定氨基酸序列，其通常非常短，例如由1-10个氨基酸组成。下面列出了可切割的连接体、识别和切割位点和切割剂的非限制性实例。
例如，可切割的连接体可以是位点特异蛋白酶的识别位点。位点特异蛋白酶(切割剂)的实例为来自酿酒酵母的α细胞的Kex2膜结合的蛋白酶。Kex2蛋白酶水解具有碱性氨基酸对的肽和蛋白酶，这些碱性氨基酸对在它们的肽键的C-末端被切割(Bessmertnaya等人(1997)Biochemistry，Vol.62(8)pp.850-857)。Kex2切割位点的实例是Lys-Arg(K-/-R)和Arg-Arg(R-/-R)，并且可以插入碱性氨基酸的其他组合以优化Kex2的切割(Ledgerwood.等人(1995)J.Biochem.，Vol.308(1)pp.321-325；或Ghosh，S.等人(1996)Gene(Amsterdam)，Vol.176(1-2)pp.249-255)。
蛋白酶(切割剂)和切割连接体的其他有用的组合为：偏好切割氨基酸序列X-D-D-D-K-/-X(SEQ ID NO：86)的肠激酶(La Vallie等人(1993)J.Biol.Chem.，Vol 268 pp.2311-2317)；偏好切割氨基酸序列X-K-R-/-X(SEQ ID NO：87)的胰蛋白酶(Jonasson等人(1996)Eur.J.Biochem.，Vol236(2)pp.656-661)；偏好切割氨基酸序列X-I-E-G-R-/-X(SEQ ID NO：88)的因子Xa(Nagai等人(1985)PNAS，Vol 82pp.7252-7255)；偏好切割氨基酸序列P-X-/-G-P-X-X(SEQ ID NO：89)的胶原酶(Chinery等人(1993)Eur.J.Biochem.，Vol 212(2)pp.557-553)；偏好切割氨基酸序列X-G-V-R-G-P-R-/-X(SEQ ID NO：90)的凝血酶(Rahman等人(1992)Cell.Mol.Biol.，Vol 38(5)pp.529-542)；偏好在赖氨酸处切割的ALP(Achromobacter lyticus Lys特异蛋白酶)(Kjeldsen等人，(1996)Gene，Vol 170(1)pp.107-112)和在Glu切割的来自地衣芽孢杆菌的C-组分蛋白酶(Kakudo等人(1992)J.Biol.Chem.，Vol 267(33)pp.23782-23788)。消化性蛋白酶为额外有用的蛋白酶，尤其胰蛋白酶(上面提到)，以及胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰腺蛋白酶。胰凝乳蛋白酶具有在芳香性氨基酸和Leu后切割的偏好。
在特定靶位点切割肽的另一优选方法是通过使用化合物，如溴化氰，其切割X-M-/-X，或者羟胺，其切割S-N-/-G-X(SEQ ID NO：91)(Currentprotocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.，and Cutting，S.M.(eds.))。
另一特异切割方法可用于D-/-P(Asp-Pro)肽键，其可以通过用弱酸(例如，pH2-3)在适宜温度下处理适当时间来切割。适宜温度的实例为40、50、60、70或80℃，适当时间的实例为从几分钟到几小时，例如，小时到5小时，小时到2小时，1小时到3小时，1小时到2小时。
在核苷酸水平，相应于上面的切割连接体，以及下面的肽保护结构域的核苷酸序列当然容易通过本领域技术人员参考遗传密码容易地推导。如本领域公知的，还可以为所述宿主细胞中的密码子选择优化核苷酸序列。
保护肽
本发明还涉及所称作的淬灭结构域，或者保护肽，或者保护结构域在抗微生物肽的重组表达中的用途，所述淬灭结构域的特征是其组成氨基酸残基的至少50％是E和/或D。此类保护结构域的目的是暂时失活抗微生物肽，以防它抑制宿主细胞的生长。一旦已经产生足够量的肽，那么可以如下面进一步描述的切除保护肽，从而再激活所述抗微生物肽。保护肽优选为合成的(人工的)。
在具体实施方案中，保护肽中包含的氨基酸残基的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％为D和/或E。在另一具体实施方案中，保护肽的完整氨基酸序列由氨基酸残基D和/或E组成。在另一具体实施方案中保护肽由至少一个氨基酸残基D和/或E，任选切割肽组成。
具体地，或者备选地，本发明的该方面的实施方案：(1)保护肽中D和/或E氨基酸残基的数目高于R和/或K残基数；(2)保护肽不含有C残基；(3)保护肽中的氨基酸残基数低于抗微生物肽中氨基酸残基数；和/或(4)保护肽不是细菌蛋白酶的抑制剂。
在具体实施方案中，保护肽指所表达的融合产物的部分，其不是抗微生物剂并且不是信号肽部分(即使有的话)。在其他具体实施方案中，保护肽是与抗微生物肽接近的一段氨基酸序列。在下面更详细描述保护肽的长度。保护肽和抗微生物肽可以通过多达5个、多达8个、多达10个、多达12个、多达15个、多达20个、多达25个、或多达30个氨基酸的氨基酸序列分开。
编码肽保护结构域的氨基酸序列可以在抗微生物肽编码核酸序列的上游或下游。在其他方面，本发明涉及核酸构建体，其包含编码抗微生物肽的第一种核酸序列，和编码如上定义的肽保护结构域的第二种核酸序列；还涉及包含此类构建体的重组宿主细胞；和通过培养所述重组宿主细胞和回收所述肽产生抗微生物肽的方法，该方法任选包括用适宜的切割剂切割肽保护结构域的步骤，切割剂的实例在上面提及。
在本发明的这些淬灭方面的具体实施方案中，本文陈述的与本发明的共表达方面有关的一切也应用于淬灭方面。尤其例如，与抗微生物肽、控制序列、宿主细胞等尤其如此。同样，本文关于淬灭方面陈述的一切也可应用于本发明的共表达方面。
保护肽通常为寡肽或者肽，其包含通过肽键连接的许多天然的、非天然的或者经修饰的氨基酸。在具体实施方案中，组成氨基酸为天然的L-氨基酸。
通常，保护肽包含，或者由1到100、1到95、1到90、1到85、1到80、1到75、1到70、1到65、1到60、1到55、1到50、1到45、1到40、1到35、1到30、1到25、1到20、1到15、或1到10个氨基酸残基组成。
在另一具体实施方案中，保护肽包含，或者由1到100、2到100、3到100、4到100、5到100、6到100、7到100、8到100、9到100、或10到100个氨基酸残基组成。
在额外的具体实施方案中，保护肽包含，或者由1到100、2到90、3到80、4到70、5到60、5到50、5到40、5到35、5到30、5到25、或5到20个氨基酸残基组成。
这些是本发明的保护肽的非限制性实例(以常规方向，首先是N末端)：E、D、ED、DE、DDE、EED、DED、EDE、DDEEE(SEQ ID NO：92)、DDDEE(SEQ ID NO：93)、DDDDE(SEQ ID NO：94)、EEDDE(SEQ ID NO：95)、DDEED(SEQ ID NO：96)、EDEDE(SEQ ID NO：97)、DDDEEE(SEQ ID NO：98)、DEDEDE(SEQ ID NO：99)、和EEDDEE(SEQ ID NO：100)。
在具体实施方案中，保护肽选自下面的：DP、DDDDDP(SEQ ID NO：101)、EEEEEDP(SEQ ID NO：102)、E、DE、DDE、DDDE(SEQ IDNO：103)、DDDDE(SEQ ID NO：94)、DEDEDEDP(SEQ ID NO：104)、DDDGGEEEGGDDDP(SEQ ID NO：105)和DDDGGDDDPPDDDE(SEQID NO：106)。
上面的保护肽的含有E的那些保护肽本身也是可切割的连接体，因为例如，来自地衣芽孢杆菌的C-组分蛋白酶也在E的羧基末端侧切割。
上面保护肽的包含DP的那些保护肽可以通过弱酸切割，见上文。
在备选实施方案中，或者额外地，这些保护肽可以与任意适宜的切割连接体组合以使得它们产生后与抗微生物肽分离。
下表为保护肽的所选实例显示了怎样计算D和/或E残基的百分数。
保护肽   氨基酸数   D/E残基数   D/E残基百分数
  DP   2   1   50
  DDDDDP(SEQ ID NO：101)   6   5   83
  EEEEEDP(SEQ ID NO：102)   7   6   86
  DDDDE(SEQ ID NO：94)   5   5   100
  DEDEDEDP(SEQ ID NO：104)   8   7   88
  DDDGGEEEGGDDDP(SEQ ID NO：105) 14 9 64
  DDDGGDDDPPDDDE(SEQ ID NO：106) 14 10 71
可以通过如下鉴定本发明的保护肽：a)提供包含至少一个D和/或E的肽保护候选者；b)制备包含编码肽保护候选者的第一种DNA序列和编码抗微生物肽的第二种DNA序列的DNA构建体；c)用b)的DNA构建体转化宿主细胞并培养所转化的宿主细胞以得到DNA构建体的表达；d)估计所转化的宿主细胞的生存力和/或抗微生物肽的产率；和e)鉴定肽保护候选者，其当用于根据步骤b)的DNA构建体中用于转化根据步骤c)的宿主细胞时，当根据步骤d)估计时，导致宿主细胞的生存力增加，和/或抗微生物肽的产率增加。
可以如本领域公知的，例如，通过测量450或600nm，例如，450nm处的光密度(OD)可以测量所转化的宿主细胞的生存力。可以基于考马斯染色的SDS凝胶，例如，通过寻找具有预期分子量和(如果希望)条带密度的条带，可以估计抗微生物剂，例如，抗微生物肽的产率(见实施例5)。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含编码抗微生物剂的第一种核酸序列；编码酶的第二种核酸序列；启动子；和转录和翻译终止信号。
上面描述的多种核酸和控制序列可以连接在一起产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点以允许在此类位点插入或替代编码所述酶和抗微生物剂的核酸序列。备选地，通过向用于表达的适宜载体中插入所述核酸序列或者包含该序列的核酸构建体可以表达本发明的核酸序列。在产生表达载体中，编码序列位于载体中，从而编码序列有效连接用于表达的适宜的控制序列。
重组表达载体可以是可以方便地进行重组DNA步骤和可以引起所述核酸序列表达的任意载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将通常取决于载体与该载体将导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或封闭的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体，或者人工染色体。载体可以含有确保自主复制的任意工具。备选地，载体可以是当导入宿主细胞中时整合到基因组并且与它所整合的染色体一起复制的载体。此外，可以使用一种载体或质粒或者两种或多种载体或质粒，它们一起含有将要导入宿主细胞的基因组的总DNA，或者可以使用转座子。
本发明的载体优选含有一种或多种选择标记，其允许容易地选择所转化的细胞。选择标记为基因，其产物提供杀生物或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型，等等。细菌选择性标记的实例为来自枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或者四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的适宜的标记为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酸转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及它们的等价物。优选用于曲霉细胞的为构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有允许载体稳定整合到宿主细胞的基因组或者允许载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
为了整合到宿主细胞基因组，载体可以依赖编码酶的核酸序列，或者编码抗微生物剂的核酸序列，或者载体的其他元件通过同源或者非同源重组将载体稳定整合到基因组。备选地，载体可以含有额外核酸序列用于通过同源重组指导整合到宿主细胞的基因组。所述额外的核酸序列使得载体能够整合到宿主细胞基因组中染色体中的精确位置上。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件将优选含有足够数目的核酸，如100到1,500个碱基对，优选400到1,500个碱基对，最优选800到1,500个碱基对，它们与相应的靶序列高度同源以增加同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞的基因组中靶序列同源的任意序列。此外，整合元件可以是非编码或编码核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以还包含复制起点，其使得载体在所述宿主细胞中自主复制。细菌复制起点的实例为允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。用于酵母细胞的复制起点的实例为2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。复制起点可以是具有突变的复制起点，所述突变使得它在宿主细胞中的功能是温度敏感的(见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1433)。
可以将本发明的核酸序列的一个以上的拷贝插入到宿主细胞中以增加基因产物的产量。通过向宿主细胞基因组中整合所述序列的至少一个额外的拷贝或通过所述核酸序列包括可扩增的选择标记基因可以得到核酸序列的拷贝数的增加，其中可以通过在适宜的选择剂存在下培养细胞可以选择含有选择标记基因的扩增拷贝和从而含有核酸序列的额外拷贝的细胞。
用于将上述元件连接到本发明的重组表达载体构建体的方法是本领域技术人员公知的(见，例如，Sambrook等人，1989，上文)。
宿主细胞
本发明涉及重组宿主细胞，其包含编码抗微生物剂的第一种核酸序列，和编码酶的第二种异源核酸序列。
这些宿主细胞有利地用于抗微生物剂和酶的重组生产中。将包含相应核酸序列的至少一个载体导入宿主细胞，从而所述载体作为如前面描述的染色体整合体或者作为自主复制的染色体外载体保持。术语“宿主细胞”包括由于复制期间发生突变而与亲代细胞不同的亲代细胞的子代。通常，宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码抗微生物剂的基因，和/或编码所述酶的基因和其来源。例如，可以选择不受，或者仅在非常有限的程度上受到活性剂的抗微生物活性的影响的宿主细胞。在备选实施方案中，通过临时或暂时失活(淬灭)所述肽保护宿主细胞不受抗微生物活性的影响。此外，通常，优选在真菌宿主细胞中表达真菌酶，在细菌宿主细胞中表达细菌酶。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或者非单细胞微生物，例如，真核生物。
有用的单细胞细胞为细菌细胞，如革兰氏阳性细菌，包括但不限于，芽孢杆菌细胞，或者链霉菌细胞，或者乳酸细菌的细胞；或者革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌和假单胞菌乳酸变种(Pseudomonas sp.Lactic acid)细菌，包括但不限于，乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的物种。
载体向细菌宿主细胞的导入可以例如，通过原生质体转化(见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(见，例如，Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56：209-221)、电穿孔(见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6：742-751)，或接合(见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal ofBacteriology 169：5771-5278)来实现。
宿主细胞可以是真核生物，如非人动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、或者真菌细胞。
在一个具体实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌亚门(Ascomycota)、担子菌亚门(Basidiomycota)、Chytridiomycota和接合菌亚门(Zygomycota)(如Hawksworth等人，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，UniversityPress，Cambridge，UK中描述)以及Oomycota(如在Hawksworth等人，1995，上文，171页引用)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，上文)。
在另一具体实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(酵母目)、产担孢子酵母和属于半知菌(FungiImperfecti)(芽孢纲)的酵母。因为酵母的分类在将来可以改变，所以对于本发明，酵母将如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，编者，Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9，1980)所描述的定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人，1995，上文定义)。丝状真菌特征是菌丝体壁，其由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖组成。营养体生长是通过菌丝延长，碳代谢是专性需氧的。相比，酵母，如酿酒酵母的营养体生长是通过单细胞菌体的出芽，碳代谢是发酵的。
丝状真菌宿主细胞的实例为，但不限于，枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、草根霉菌属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)的细胞。
通过一种方法可以转化真菌细胞，所述方法包括原生质体形成、转化原生质体和以本身已知的方式再生细胞壁。用于转化曲霉属宿主细胞的适宜的方法在EP 238023和Yelton等人1984，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属物种的适宜方法由Malardier等人，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编者，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，卷194，182-187页，Academic Press，New York；Ito等人，1983，Journal ofBacteriology 153：163；和Hinnen等人，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920所描述的转化酵母。
在具体实施方案中，宿主细胞是微生物宿主细胞，其包括如上定义的细菌宿主细胞和真菌宿主细胞。
产生方法
本发明还涉及产生酶和抗微生物剂的方法，所述方法包括(a)在诱导产生所述酶和抗微生物剂的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述酶和/或抗微生物剂。
在本发明的产生方法中，用本领域已知的方法在适于产生所述酶和抗微生物剂的营养培养基中培养细胞。例如，可通过摇瓶培养，在实验室或工业发酵罐中于合适的培养基中并在使得该多肽表达和/或分离的条件下进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、馈料分批或固态发酵)培养细胞。在包含碳源、氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域公知的方法进行培养。合适的培养基可从供应商购得或可根据公开的成分制备(如在美国典型培养物保藏中心的目录中)。
如果该酶和抗微生物剂分泌至营养培养基中，则可直接从培养基中回收它们。如果它们不分泌，则从细胞裂解物中回收它们。
可用本领域公知的、特异用于该酶的方法检测该酶。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。如可使用酶测试法来测定此处所述酶的活性。可以使用针对所述肽上的一个或多个表位的抗体检测抗微生物剂，或者可以使用抗微生物活性检测所述肽。
下面为通常在上面称作“酶和肽”的产物的实例。
a)融合产物，其可以简单地称作AMP-ENZ，然而，如在上面解释的，AMP和ENZ的顺序可以颠倒，并且各自AMP和ENZ实体的数目和种类可以改变；
b)AMP和ENZ为分开的实体(如上面解释的不同数目，不同种类)；
c)AMP-Q和ENZ为分开的实体，表述AMP-Q指保护性(淬灭)结构域连接到AMP分子(再次，不同数目，不同种类，如上解释)；和
d)融合产物AMP-Q-ENZ(如上解释，不同数目、种类、相对位置等等)。
如所希望的，可以仅回收酶，仅回收抗微生物剂，或者回收两种产物。
可以通过本领域已知的方法回收这些产物。例如，可以通过常规方法回收它们，所述方法包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或者沉淀。
可以通过本领域已知的多种方法纯化产物，所述方法包括，但不限于，层析法(如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、聚焦色谱和大小排阻)、电泳法(如制备等电聚焦电泳)、不同的溶解度(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取法(参见如Protein Purification，J.C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers，纽约，1989)。
当所述酶和抗微生物剂以两种不同产物表达时，可以通过例如，凝胶过滤分离它们，然后如果希望或者需要，可以按照如上述的常规方法进一步纯化一种或两种这些产物。
在用于产生所述酶和抗微生物剂的方法的一个具体实施方案中，所述方法包括切割融合产物，即分离融合产物的抗微生物剂和酶部分。这可以使用适宜的切割剂进行，切割剂的实例在上面描述。可以在回收步骤之前、期间或者之后进行切割步骤，或者可以在回收后任意时间进行切割，例如，由融合产物的最终用户或者购买者进行，例如，仅在所述产物的计划的最终使用前，或者作为制备中间产物，例如，动物饲料添加剂的方法中一个步骤进行。
在另一实施方案中，与融合产物在动物饲料中的用途有关，融合产物在动物摄入前根本不切割，但是所述动物的消化系统中的消化性蛋白酶和/或化学/生理条件进行切割，因此所述活性酶和抗微生物剂分子仅当动物消化时才在体内释放。消化性蛋白酶是此类实施方案的适宜切割剂的实例。
在本发明方法的另一实施方案中，在切割步骤中保护肽或者其部分与抗微生物肽分离，所述切割步骤可以与上述切割步骤相同，或者为单独的、额外的切割步骤。
本发明方法的另一具体实施方案包括向从回收步骤得到的产物加入额外的酶和/或抗微生物剂分子的步骤。这可以是为了得到在抗微生物剂和酶之间具有所希望的摩尔比的产物。
植物
本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，它们已经用编码酶和抗微生物剂的核酸序列转化以便以可回收的量表达和产生这些。可以从植物或植物部分回收所述酶和抗微生物剂。备选地，含有这些产物的植物或者植物部分可以用于提高食品或饲料的质量，例如，提高营养价值、风味和流变性质，或者破坏抗营养因子。
在具体实施方案中，所述酶和抗微生物剂靶向种子中胚乳贮存泡。这可以通过将它作为具有适宜信号肽的前体合成来实现，见Horvath等人，PNAS，Feb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或者其工程化变体。单子叶植物的实例为禾本科植物，如草坪草(blue grass，早熟禾属)，饲料草，如羊茅属(festuca)、黑麦草属(lolium)、温带草，如Agrostis，和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高梁、黑小麦(小麦(小麦属)和黑麦(黑麦属)的稳定杂种)，和玉米。双子叶植物的实例为烟草、豆科植物，如向日葵(向日葵属)、棉花(棉属)、羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、豆和大豆，和十字花科植物(十字花科)，如花椰菜、油菜籽，和密切相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。如在美国专利号5,689,054和美国专利号6,111,168中描述的低肌醇六磷酸植物是工程化植物的实例。
植物部分的实例为茎干、愈伤组织、叶子、根、果实、种子和块茎。还认为特定植物组织，如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质是植物部分。此外，认为任意植物细胞，不管其组织来源，都是植物部分。
本发明的范围还包括此类植物、植物部分和植物细胞的后代。
可以根据本发明已知的方法构建表达本发明的抗微生物剂和酶的转基因植物或植物细胞。简言之，通过向植物宿主基因组整合编码所述酶和抗微生物剂的一个或多个表达构建体并将所得经修饰的植物或者植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞来构建植物或植物细胞。
方便地，表达构建体为核酸构建体，其包含编码所述酶的核酸序列和编码所述抗微生物剂的核酸序列，所述核酸序列有效连接其在所选植物或植物部分中表达所需的适宜的调节序列。此外，表达构建体可以包含用于鉴定已经整合表达构建体的宿主细胞的选择标记和将构建体导入所述植物必要的DNA序列(其取决于所用的DNA导入方法)。
例如，基于希望所述抗微生物剂和酶何时、何处和怎样表达，可以确定调节序列，如启动子和终止子序列和任选地信号或者转运序列的选择。例如，基因的表达可以是组成型或者可诱导的，或者可以是发育、阶段或者组织特异的，并且基因产物可以靶定特定组织或者植物部分，如种子或者叶子。调节序列例如，由Tague等人，1988，Plant Physiology 86：506描述。
对于组成型表达，可应用35S-CaMV启动子(Franck等人，1980，Cell21：285-294)。器官特异启动子可为，例如来自储存库(sink)组织如种子、马铃薯块茎及果实(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)或来自代谢库组织如分生组织(Ito等人，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)的启动子，种子特异启动子如来自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等人，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)、来自蚕豆的豆球蛋白B4及未知种子蛋白质基因的蚕豆(Viciafaba)启动子(Conrad等人，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)、来自种子油体蛋白质的启动子(Chen等人，1998，Plant and CellPhysiology 39：935-941)、来自欧洲油菜(Brassica napus)储藏蛋白质的napA启动子或本领域已知的任意其它特异启动子，例如在WO91/14772中描述。此外，启动子可为叶特异启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiology 102：991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology26：85-93)或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等人，1995，Molecular andGeneral Genetics 248：668-674)或创伤诱导型启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等人，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。
启动子增强子元件也可以用于实现酶和抗微生物剂在植物中的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子和编码本发明的多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等人，1993，上文公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一个内含子增强表达。
此外，可以为所述植物物种优化密码子选择以提高表达(见上面提到的Horvath等人)。
选择标记基因及表达构建体的任意其它部分可自本领域可获得的选择标记基因及表达构建体中选择。
根据本领域已知的常规技术，将核酸构建体整合到植物基因组中，所述技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化及电穿孔(Gasser等人，1990，Science 244：1993；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等人，1989，Nature 338：274)。
当前，根癌农杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的所选方法(对于综述，参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant MolecularBiology 19：15-38)。然而它也可用于转化单子叶植物，尽管对于这些植物一般优选其它转化方法。当前，用于产生转基因单子叶植物的所选方法为离子轰击(用转化DNA包裹的显微金或钨颗粒)胚胎胼胝体或正发育的胚胎(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，CurrentOpinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology 10：667-674)。用于转化单子叶植物的备选方法基于如Omirulleh等人，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428描述的原生质体转化。
转化后，根据本领域公知方法对其中整合表达构建体的转化体进行选择并再生成完整植物。
本发明还涉及产生酶和抗微生物剂的方法，所述方法包括(a)在有助于产生所述抗微生物剂和酶的条件下培养包含编码核酸序列的转基因植物或者植物细胞；和(b)回收这些转基因植物或者植物细胞。
动物
本发明还涉及转基因、非人动物和其产物或成分，它们的实例为体液，如奶和血、器官、肉体和动物细胞。例如，在哺乳动物中表达蛋白质的技术是本领域公知的，见例如，手册Protein Expression：A PracticalApproach，Higgins and Hames(eds)，Oxford University Press(1999)，和该系列中与基因转录、RNA加工和翻译后加工有关的其他三种手册。一般说来，为了制备转基因动物，将所选动物的所选细胞用编码酶和抗微生物剂的核酸序列转化以便表达和产生这些酶和抗微生物剂。所述活性剂和酶可以从动物，例如，从雌性动物的奶回收，或者为了动物自身的益处表达它们，例如，以帮助动物的消化。在下面标题为“动物饲料”的小节中提及动物的实例。
为了产生转基因动物以便从动物的奶回收抗微生物剂和酶，可以将编码核酸序列插入到所述动物的受精卵，例如，通过使用转基因表达载体实现，所述载体包含适宜的奶蛋白质启动子，和所希望的目的核酸序列。将转基因表达载体微注射到受精卵中，优选永久整合到染色体中。一旦卵开始生长和分裂，就将潜在胚胎植入替代母亲，并且鉴定携带转基因的动物。然后通过常规育种可以繁殖所得动物。可以从动物奶纯化所述酶和活性剂。见例如，Meade，H.M.等人(1999)：Expression of recombinant proteins inthe milk of transgenic animals，Gene expression systems：Using nature forthe art of expression.J.M.Fernandez and J.P.Hoeffler(eds.)，AcademicPress。
在备选实施方案中，为了产生转基因非人动物，其在其体细胞和/或生殖细胞的基因组中携带包括异源转基因构建体的核酸序列，其中所述构建体包括编码所述抗微生物剂和酶的转基因，可以将所述转基因有效连接用于唾液腺特异表达的第一种调节序列，如WO 00/064247中公开。
组合物
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含抗微生物剂和酶的融合产物，如果希望，其具有如上述的保护肽(如AMP-(Q)-ENZ)。
这些组合物可以根据本发明已知的方法制备并且可以为液态或者干燥组合物的形式。例如，它们可以为粒剂或者微粒剂的形式。包括在组合物中的酶和抗微生物剂可以根据本领域已知的方法稳定。
下面给出本发明的酶和抗微生物剂的优选用途的实例。
动物饲料
术语动物包括所有动物，包括人。动物的实例为非反刍动物，和反刍动物。反刍动物包括，例如，诸如绵羊、山羊、马和牛，例如，肉牛、奶牛和牛犊。在具体实施方案中，动物为非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如，猪(包括，但不限于，小猪，成长猪，和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡)；小牛；和鱼(包括但不限于，鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物指适宜或者意在由动物摄入的任意化合物、制剂、混合物或者组合物。
在根据本发明的用途中，所述酶和抗微生物剂可以在饮食之前、之后或同时喂饲动物。优选同时喂饲。
在具体实施方案中，详细定义了所述酶和抗微生物剂加入饲料的形式或者何时包括在饲料添加剂中。详细定义指如通过大小排阻层析测定的(见WO 01/58275的实施例12)，所述制剂为至少50％纯。在其他具体实施方案中，如通过该方法确定的，制剂为至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％纯。
详细定义的制剂是有利的。例如，将基本上没有干扰或者污染性其他成分的酶和抗微生物剂的制剂正确配料(dose)于饲料容易地多。术语正确配料具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果能够优化剂量。
然而，对于用于动物饲料，酶和抗微生物剂不必那么纯；它可以例如，包括额外的酶和/或额外的活性剂。
制剂可以(a)直接加入饲料(或者直接用于蛋白质的处理过程)，或者(b)它可以用于一种或多种随后加入饲料的中间组合物，如饲料添加剂或者预混合物(或者用于处理过程中)的生产。上述纯度指根据上面的(a)或(b)使用的最初酶和抗微生物剂制剂的纯度。
动物饲料通常包含植物蛋白质，例如，来自豆科植物和谷类，例如，来自豆科、十字花科、藜科和禾本科的材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。饲料还可以包含动物蛋白质，如肉粉和骨粉，和/或鱼粉。
在具体实施方案中，植物蛋白质来自豆科的一种或多种植物，如大豆、羽扇豆、豌豆或豆。
在另一具体实施方案中，植物蛋白质来自藜科的一种或多种植物，例如，糖萝卜、甜菜、菠菜或者昆诺阿藜。
植物蛋白质来源的其他实例为油菜籽、向日葵籽、棉籽和卷心菜。
大豆为优选的植物蛋白质来源。
植物蛋白质来源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、黑小麦和高梁。
在具体实施方案中，所述酶和抗微生物剂提高动物饲料的营养价值，即例如，生长速率和/或重量增加和/或饲料转化(即，摄入的饲料的重量相对于重量增加)。
可以将酶和抗微生物剂以任意形式加入，即它为相对纯的产物，或者与意在加入到动物饲料的其他组分混合，即为动物饲料添加剂的形式，如所称作的动物饲料的预混合物。
在另一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混合物。
除了本发明的酶和抗微生物剂，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质，和/或任选地至少一种大量矿物质(macro mineral)。
此外，任选地，饲料添加剂成分为着色剂，例如，类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；多不饱和的脂肪酸；产生活性氧的种类。
通常，脂-和水-溶性维生素，以及痕量矿物质形成意在加入饲料的所称作的预混合物，而大量矿物质通常单独加入饲料。这些组合物类型，当富含本发明的酶和抗微生物剂时，是本发明的动物饲料添加剂。
下面是这些组合物的实例的非排他性列表：
脂溶性维生素的实例为维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如，维生素K3。
水溶性维生素实例为维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如，Ca-D-泛酸。
痕量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
大量矿物质的实例为钙、磷和钠。
多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚麻酸。
产生活性氧的种类的实例为化学品，如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶和合成酶。
根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白质含量，并且还包含至少一种本发明的酶和抗微生物剂。
以氮(N)乘以因数6.25计算粗蛋白质，即粗蛋白质(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通过凯氏定氮法测定氮含量(A.O.A.C.，1984，Official Methods ofAnalysis 14th ed.，Association of Official Analytical Chemists，WashingtonDC)。
在具体实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有如上定义的至少一种植物蛋白质或蛋白质来源。它还可以含有动物蛋白质，如肉和骨粉，和/或鱼粉，通常量为0-25％。
在另一具体实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％玉米；和/或0-80％高梁；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-10％鱼粉；和/或0-20％乳清。
例如，可以以醪液饲料(非沉淀的)或者沉淀的饲料生产动物膳食。通常，混合碾磨的饲料并根据关于所述种类的说明加入必需维生素和矿物质的足够量。酶和抗微生物剂可以以固体或者液体制剂加入。例如，通常在混合步骤前或期间加入固体制剂；通常在沉淀步骤之后加入液体制备物。所述酶和抗微生物剂还可以以饲料添加剂或者预混合物掺入。
这些是本发明的具体实施方案：
重组宿主细胞，其包含至少一种核酸构建体，该构建体包含i)编码肽的第一种核酸序列，所述肽a)包含不超过100个氨基酸，和b)具有抗微生物活性；和ii)编码酶的第二种核酸序列，优选地，所述重组宿主细胞包含第一种核酸构建体，和第二种核酸构建体，其中i)第一种核酸构建体包含编码所述肽的第一种核酸序列；和ii)第二种核酸构建体包含编码所述酶的第二种核酸序列；更优选地，所述重组宿主细胞包含核酸构建体，该构建体包含i)编码所述肽的第一种核酸序列，和ii)编码所述酶的第二种核酸序列。
核酸构建体，其包含编码如上定义的肽的第一种核酸序列，和编码如权利要求1中定义的酶的第二种核酸序列，所述核酸序列有效连接一种或多种控制序列，其指导所述酶和肽在适宜表达宿主中的表达。
产生如上定义的酶和肽的方法，所述方法包括：(a)培养如上述的重组宿主细胞以产生包含所述酶和所述肽的上清液；和(b)回收所述酶和/或所述肽。
融合产物，其包含酶、不超过100个氨基酸的抗微生物肽，和可切割的连接体。
动物饲料添加剂，其包含(a)至少一种如上定义的融合产物，(b)至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种痕量矿物质。
动物饲料组合物，其具有50到800g/kg的粗蛋白质含量并且包含至少一种如上定义的融合产物。
转基因植物或植物部分，其能够表达如上定义的酶和肽。
转基因、非人动物或其产物或成分，其能够表达如上定义的酶和肽。
如上定义的融合产物在动物饲料中的用途。
如上定义的肽和酶的共表达的用途，用作提高所述肽的产率和/或提高总生产经济的工具。
肽保护结构域在包含不超过100个氨基酸的抗微生物肽的重组表达中的用途，其中肽保护结构域中所含的至少50％氨基酸残基为D和/或E；其中优选地所述肽保护结构域包含1到100个氨基酸残基。
肽，优选分离的肽，其中至少50％的氨基酸残基为D(Asp)和/或E(Glu)并且其中所述肽具有肽保护活性，以及相应的核酸。
鉴定包含至少一个D(Asp)和/或E(Glu)的保护肽的方法，该方法包括：a)提供包含至少一个D和/或E的肽保护候选者的文库；b)制备DNA构建体文库，所述DNA构建体包含编码肽保护候选者文库的一个成员的第一种DNA序列和编码抗微生物肽的第二种DNA序列；c)用b)的DNA构建体文库转化宿主细胞并培养所转化的宿主细胞以得到DNA构建体的表达；d)估计和/或分析所转化的宿主细胞的生存力，和/或估计，和/或分析抗微生物肽的产率，和e)鉴定肽保护候选者，当根据步骤d)估计和/或分析时，所述肽保护候选者当用于根据步骤b)的DNA构建体来转化根据步骤c)的宿主细胞时，导致宿主细胞的生存力增加，和/或抗微生物肽的产率增加；以及通过该方法可以得到和/或得到的保护肽。
本文描述和要求保护的本发明不限制本文公开的特定实施方案的范围，因为这些实施方案意在阐明本发明的一些方面。任何等价实施方案意在本发明的范围内。实际上，除了本文显示和描述的那些，根据前面的描述，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的。这些修饰也意在属于所附权利要求的范围内。对于冲突的情况，本公开(包括定义)将起支配作用。
本文引用了多种参考文献，将它们的公开完整引入本文作为参考。
实施例
通常，对于用于本实验部分的多种标准方案，参考Sambrook，Fritsch，和Maniatis，1989。
实施例1：抗微生物活性测定法
该测定法尤其可用于Novispirin和PR39的抗微生物活性的测定。它基于Lehrer等人(1991)，J.Immunol.Methods 137：167-173的方案。
将所选的靶细菌，例如，大肠杆菌ATCC 10536或者枯草芽孢杆菌ATCC 6633(106个菌落形成单位(CFU))加入到10ml衬层(underlay)琼脂(1％低电内渗琼脂，0.03％胰胨豆胨培养液，10mM磷酸钠，pH 7.4，37℃)。在INTEGRID培养皿(Becton Dickinson Labware，NJ)中固定化悬浮液。用3mm Gel Puncher在衬层琼脂(Amersham Pharmacia Biotech，Sweden)中打孔。将预计显示出抗微生物活性的样品加入孔中并在37℃孵育3小时。将衬层(LB培养基，7.5％琼脂)倒入顶部并将平板在37℃过夜孵育。可以在孔周围看到表明为抗微生物活性的亮区(clearing zone)。通过加入10ml，0.2mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物；噻唑基蓝)复染活细胞。
实施例2：使用淬灭结构域在大肠杆菌中以内含体表达抗微生物剂
PR39为基于抗微生物活性最初从猪肠分离的富含脯氨酸-和精氨酸的肽(Agerberth，B.等人，Eur.J.Biochem.202，849-54(1991))。PR39的成熟形式由下面的39个氨基酸组成：RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP(SEQ ID NO：65)。
因为还未完全了解的原因，已经证明抗微生物肽，像PR39以内含体表达是困难的。在该实验中，我们使用本发明的多种肽保护结构域评估对表达水平的影响。
在pET31b+表达载体系统中产生下面的融合构建体(通过商业途径从NOVAGEN获得)：
PHM300：KSI-NG-PR39
PHM370：KSI-DP-PR39
PHM360：KSI-DDDDDP(SEQ ID NO：101)-PR39(SEQ ID NO：65)
PHM350：KSI-EEEEEDP(SEQ ID NO：102)-PR39(SEQ ID NO：65)
KSI是类固酮异构酶的不溶性片段，已知其促进本发明的肽或蛋白质以不溶性内含体表达。KSI形成pET31b+表达载体系统的部分。
PR39指成熟PR39肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)。
DP(Asp-Pro)，DDDDDP(Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Pro)(SEQ ID NO：101)，和EEEEEDP(Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Asp-Pro)(SEQ ID NO：102)是本发明的肽保护结构域的实例。
NG(Asn-Gly)为不是本发明的保护结构域的连接体的实例。
将重组质粒转化到大肠杆菌株系BL21-DE3(形成pET31b+试剂盒的部分)并通过IPTG诱导和SDS-PAGE评估PR39的表达。结果清楚地表明与PHM300相比从构建体PHM 370、360和350的表达增加。此外，与构建体PHM360和PHM370相比，构建体PHM350的表达水平明显增加，与构建体PHM370相比，构建体PHM360的表达水平明显增加。
表达后，可以通过用弱酸(切割位点：D-/-P)处理切割所得融合产物，从而抗微生物肽再次得到其抗微生物活性。
实施例3：大肠杆菌自杀表达系统中抗微生物剂的表达中淬灭结构域的使用
该实施例利用WO 00/73433(尤其见实施例1)中描述的自杀表达系统(SES)。
所用的宿主细胞是大肠杆菌TOP10，其可以通过商业途径从Invitrogen得到(araBADC-，araEFGH+)。
pHH系列的质粒(使用质粒pBAD/gIIIA)允许将抗微生物肽输出到大肠杆菌的周质空间，在周质空间，所述肽可以与细胞膜相互作用。质粒pBAD/gIIIA可以通过商业途径从Invitrogen获得。它是pUC来源的表达质粒，经设计用于在大肠杆菌中受紧密调节的重组蛋白质表达。该质粒允许克隆对大肠杆菌有毒的肽和蛋白质，因为在生长培养基中缺少诱导物时所述重组肽不表达。然后，转录和肽合成可以受到广泛诱导。在pHH系列中，pBAD/gIIIA中的基因III信号位于可诱导的启动子前面以便介导所述肽/蛋白质的分泌。基因III编码pIII——来自丝状噬菌体fd的次要衣壳蛋白质之一。pIII以具有18个氨基酸的N-末端信号序列合成，并且需要细菌Sec系统来插入到膜中。穿过内膜后除去信号序列，从而剩下成熟肽。NcoI限制位点紧邻信号序列切割位点之后。
编码一种或多种抗微生物肽的一种或多种基因以NcoI-XbaI片段插入到pHH系列的质粒中。对于PR39，这导致在所述肽的N-末端(CCATGG)导入氨基酸MA。保留天然密码子选择。
构建PR39的5种不同的N-末端延伸，即E、DE、DDE、DDDE(SEQID NO：103)和DDDDE(SEQ ID NO：94)。
通过PCR以标准PCR反应，使用在下面给出的特异正向引物结合一般的反向引物pBAD-Rev制备这些PR39衍生物。PCR模板为编码野生型PR39(wt PR39)，SEQ ID NO：65的pHH质粒。
将PCR片段纯化，用Ncol和Xbal限制性消化，并克隆到pHH中相应位点。通过DNA测序，使用引物pBAD-forw和pBAD-rev(见下面)验证这些构建体的序列。
从SES系统中测试的结果为5种PR39衍生物的每一种导致与wtPR-39的抑制相比抑制减小。抑制的减小表明抗微生物活性的减小并因此表明有效淬灭。而且，在下面系列的N-末端延伸中观察到逐渐减小的抑制：E、DE、DDE、DDDE(SEQ ID NO：103)和DDDDE(SEQ ID NO：94)。换句话说，用E观察到最大抑制，然后是DE，然后是DDE，接着是DDDE(SEQ ID NO：103)，而DDDDE(SEQ ID NO：94)在该实验中显示出最小抑制。
这些是用于扩增5种PR-39衍生物的序列的引物：
pHH1531(E-PR39)
引物pHH1531-Forw：
catagcaccatggaaaggagacgtccccgacccccatatttgcc(SEQ ID NO：66)
pHH1532(DE-PR39)
引物pHH1532-Forw：
catagcaccatggatgaaaggagacgtccccgacccccatatttgcc(SEQ ID NO：67)
pHH1533(DDE-PR39)
引物pHH1533-Forw：
catagcaccatggacgatgaaaggagacgtccccgacccccatatttgcc(SEQ  ID  NO：68)
pHH1534(DDDE-PR39)
引物pHH1534-Forw：
catagcaccatggatgacgatgaaaggagacgtccccgacccccatatttgcc(SEQ ID NO：69)
pHH1535(DDDDE-PR39)
引物pHH1535-Forw：
catagcaccatggacgatgacgatgaaaggagacgtccccgacccccatatttgcc(SEQ IDNO：70)
pBAD-forw：
CCATAAGATTAGCGGATCCTACC(SEQ ID NO：71)
pBAD-rev：
CTCTCATCCGCCAAAACAGCC(SEQ ID NO：72)
实施例4：在酵母中抗微生物剂的表达和分泌中使用淬灭结构域
该实施例阐明使用特异淬灭结构域，在酿酒酵母中两种不同的抗微生物肽Novispirin和PR39的表达和分泌。
Novispirin G10是由下面的氨基酸：KNLRRIIRKGIHIIKKYG(SEQID NO：73)组成的抗微生物肽。
制备前5种不同的PR39融合构建体，即E-PR39、DE-PR39、DDE-PR39、DDDE(SEQ ID NO：103)-PR39和DDDDE(SEQ ID NO：94)-PR39。
由于一些蛋白酶在谷氨酸残基(E)后特异切割，所以可以从AMP释放所加入的淬灭结构域，允许监视AMP的抗微生物活性。
用在下面指出的特异正向引物和一般的反向引物pBAD-rev用标准PCR反应扩增PR39-衍生物。所用的PCR模板为实施例3中产生的那些模板。
  衍生物   PCR模板   正向引物   反向引物
  pHH3857(E-PR39)   pHH1531   pHH3857fwd   pBAD rev
  pHH3858(DE-PR39) pHH1532 pHH3858fwd pBAD rev
  pHH3859(DDE-PR39) pHH1533 pHH3859fwd pBAD rev
  pHH3860(DDDE-PR39 pHH1534 pHH3860fwd pBAD rev
  pHH3861(DDDDE-PR39) pHH1535 pHH3861fwd pBAD rev
引物序列
pHH3857fwd：
AGGGGTATCGATGGCTAAGAGAGAAGCCGAAAGGAGACGTCCCCGACCCCC(SEQ ID NO：74)
pHH3858fwd：
AGGGGTATCGATGGCTAAGAGAGAAGCCGATGAAAGGAGACGTCCCCGACCCCC(SEQ ID NO：75)
pHH3859fwd：
AGGGGTATCGATGGCTAAGAGAGAAGCCGACGATGAAAGGAGACGTCCCCGACCCCC(SEQ ID NO：76)
pHH3860fwd：
AGGGGTATCGATGGCTAAGAGAGAAGCCGATGACGATGAAAGGAGACGTCCCCGACCCCC(SEQ ID NO：77)
pHH3861fwd：
AGGGGTATCGATGGCTAAGAGAGAAGCCGACGATGACGATGAAAGGAGACGTCCCCGACCCCC(SEQ ID NO：78)
将所得5种PCR片段纯化，用ClaI和XbaI限制性消化并克隆到适宜的酵母表达载体，如通过商业途径可获得的载体pYES2中。通过DNA测序验证5种衍生物，并使用PEG/LiAc方案转化到酿酒酵母的适宜菌株中。
在5种培养物的每一种中都观察到具有预期分子量的明显带，表明所述肽的表达。再次看起来淬灭结构域越长，产生的抗微生物肽的量越大，有效性以E＜DE＜DDE＜DDDE＜DDDDE增加。在含有对照质粒(没有抗微生物肽)的酵母细胞的上清液中没有观察到肽。
编码PR-39的样品在Tricine SDS-PAGE凝胶(Schagger & Von Jagow(87)Anal.Bioch.166，368-379)上显示出预期大小的明显带。
用C-组分蛋白酶消化前，在如实施例1中描述的用于分析抗微生物活性的上清液中没有检测到抗微生物活性。但是从抗微生物肽分离淬灭结构域后，在编码PR39的样品中观察到亮区。在对照样品中没有检测到亮区。
以与上面描述的相同方式，在酵母中产生了其他构建体并且发现它们可以得到满意的表达和抗微生物肽的分泌。所述其他构建体如下：
pHH3864：E-Novispirin(SEQ ID NO：73)
pHH3865：DDE-Novispirin(SEQ ID NO：73)
pHH3866：DDDDE(SEQ ID NO：94)-Novispirin(SEQ ID NO：73)
pHH3879：DEDEDEDP(SEQ ID NO：104)-Novispirin(SEQ ID NO：73)
pHH3880：DEDEDEDP(SEQ ID NO：104)-PR-39(SEQ ID NO：65)
pHH3883：DDDGGEEEGGDDDP(SEQ ID NO：105)-PR-39(SEQ IDNO：65)
pHH3884：DDDGGDDDPPDDDE(SEQ ID NO：106)-PR-39(SEQ IDNO：65).
实施例5：研究淬灭结构域和抗微生物剂之间的距离
为了研究抗微生物肽和淬灭结构域之间的翻译距离，产生了两种新的构建体。使用类似于实施例4中描述的表达设置，即pYES2来源的载体，其利用α-前导序列允许所产生的肽的分泌。
在一种构建体pHH3891中，在PR-39(SEQ ID NO：65)和淬灭结构域DDDDE(SEQ ID NO：94)之间插入8个氨基酸甘氨酸连接体。在另一构建体pHH3892中，使用12个氨基酸甘氨酸连接体。通过标准分子生物学方法构建质粒，并通过DNA测序验证并如实施例4描述的转化到酵母中。
pHH3891(SEQ ID NO：117)：
DDDDE-GGGGGGGGE-RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP
pHH3892(SEQ ID NO：118)：
DDDDE-GGGGGGGGGGGGE-RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP
在补加2％葡萄糖的酵母基本培养基SC(见，Dan Burke的Methods inYeast Genetics 2000 A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual，ISBN 0-87969-588-9/0879695889的第174页)中生长两种构建体的每一种的两种独立的转化体并在摇动下35℃孵育3天。收获上清液并在Bis-Tris凝胶上按照生产商(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)推荐的进行分析。
所有四种上清液都含有具有6kDa的表观和预期大小的肽。在pHH3891和pHH3892中产生的肽分别具有6006Da和6234Da的理论分子量(MW)。
结果表明关于AMP和淬灭结构域(保护肽)之间翻译距离的灵活性。
实施例6：酶和抗微生物剂的共表达
该实施例阐明果胶酸裂合酶和两种抗微生物肽任一种作为融合蛋白质在重组细菌中的共表达和从所述重组细菌的分泌。
制备编码来自地衣芽孢杆菌的果胶酸裂合酶(WO 00/75344的SEQID NO：2的氨基酸28-341)和a)来自巨大曲霉(Aspergillus giganteus)的抗真菌肽(AFP)(WO 94/01459的SEQ ID NO：2)，或b)称作G10 novispirin的抗微生物肽(美国专利号6,492,328的具有SEQ ID NO：17的人工肽)的基因并将其与氯霉素抗性基因cat一起插入到枯草芽孢杆菌的染色体上的amyE基因座。所用的枯草芽孢杆菌宿主株系为称作WB600asn的蛋白酶缺陷株(枯草芽孢杆菌株WB600的氯霉素敏感衍生物，在J.Bact.1991.p.4952-4958中描述)。根据a)和b)的两种融合蛋白质都分泌到培养液中。
表达盒为cryIIIA启动子前的来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的amyQ启动子加上来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的mRNA稳定元件。(见美国专利号6,255,076，尤其其图19中所示的pDG268neo系统)。
制备下面的DNA片段：
(A)Shine Delgarno序列(SD)和信号肽来自地衣芽孢杆菌(ATCC14580)的amyL基因，即通过下面的具有Sac1和Pst1尾的引物1和2扩增的PCR片段：
引物1：tatagagctCCATTGAAAGGGGAGGAGAATC-3’(SEQ IDNO：107)
引物2：tataCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGATGAGC-3’(SEQID NO：108)；
(B)果胶酸裂合酶基因的编码区来自地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)，即通过下面的具有Pst1和Nhe1尾的引物3和4扩增的PCR片段：
引物3：tataCTGCAGCCGCGGCAGCTTCTGCCTTAAAC-3’(SEQID NO：109)
引物4：tataGCTAGCTGGATTGATTTTGCCGACTCCG-3’(SEQID NO：110)；
(C1)含有AFP序列的编码区(SEQ ID NO：111的核苷酸1066-1218)、具有Nhe1和Mlu1尾的合成基因。
引物5：tataacgcgTCTAGCAGTGGCACTTG-3’(SEQ ID NO：113)
(C2)含有G10 novispirin序列(SEQ ID NO：114的核苷酸1236-1289)的编码区、具有Nhe1和Mlu1尾的合成基因。
引物6：tataacgcgTTATCCGTATTTCTTAATG-3’(SEQ ID NO：116)
所述三个片段((A)+(B)+(C1))，或((A)+(B)+(C2))在限制酶消化(Pst1+Nhe1)、DNA连接和PCR扩增(PP1223-9PCR引物1+引物5，DNA模板：片段(A)+(B)+(C1)的连接)，(PP1331-2PCR引物1+引物6，DNA模板：片段(A)+(B)+(C2)的连接)后装配，并最后作为Sac1Mlu1片段插入到pDG268neo质粒的载体部分(唯一的Mlu1位点位于pDG268neo质粒的Savinase基因的C-末端部分)。
然后将具有上面的表达盒和侧翼为amyE序列的cat基因的质粒转移到枯草芽孢杆菌WB600的感受态细胞中。在氯霉素抗性转化体中，将具有插入到amyE基因的正确表达盒的菌落分离，并通过DNA测序证实所插入的果胶酸裂合酶融合肽的基因序列。
在PP1223-9枯草芽孢杆菌株系中，果胶酸裂合酶基因融合到编码来自巨大曲霉的AFP的DNA序列的框内。通过在SDS PAGE凝胶上电泳培养液将从PP1223-9分泌的融合蛋白质(SEQ ID NO：112的氨基酸1-368)鉴定为正确大小(40kDal)的主要条带：
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAAAAASALNSGKVNPLADFSLKGFAALNGGTTGGEGGQTVTVTTGDQLIAALKNKNANTPLKIYVNGTITTSNTSASKIDVKDVSNVSIVGSGTKGELKGIGIKIWRANNIIIRNLKIHEVASGDKDAIGIEGPSKNIWVDHNELYHSLNVDKDYYDGLFDVKRDAEYITFSWNYVHDGWKSMLMGSSDSDNYNRTITFHHNWFENLNSRVPSFRFGEGHIYNNYFNKIIDSGINSRMGARIRIENNLFENAKDPIVSWYSSSPGYWHVSNNKFVNSRGSMPTTSTTTYNPPYSYSLDNVDNVKSIVKQNAGVGKINPASE ATYPGKCYKKDNICKYKAQSGKTGICKCYVKRCPRDGAK CDLDSYKGKCHC(SEQ ID NO：112).对应于SEQ ID NO：112的DNA片段为SEQ ID NO：111的PP1223-9Sac1 Mlu1 DNA片段。
在成熟融合肽的分泌前切除SEQ ID NO：112的N-末端信号肽部分(带下划线)。带下划线的C-末端尾区为AFP。以斜体显示成熟果胶酸裂合酶部分。
在PP1331-2枯草芽孢杆菌株系中，果胶酸裂合酶基因融合到编码较大连接体(带负电荷的氨基酸的一段序列)和G10novispirin的DNA序列的框内。通过在SDS PAGE凝胶上电泳培养液将从PP1331-2分泌的融合蛋白质(SEQ ID NO：115的氨基酸1-392)鉴定为具有正确大小(43kDal)的主要条带：
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAAAAASALNSGKVNPLADFSLKGFAALNGGTTGGEGGQTVTVTTGDQLIAALKNKNANTPLKIYVNGTITTSNTSASKIDVKDVSNVSIVGSGTKGELKGIGIKIWRANNIIIRNLKIHEVASGDKDAIGIEGPSKNIWVDHNELYHSLNVDKDYYDGLFDVKRDAEYITFSWNYVHDGWKSMLMGSSDSDNYNRTITFHHNWFENLNSRVSSFRFGEGHIYNNYFNKIIDSGINSRMGARIRIENNLFENAKDPIVSWYSSSPGYWHVSNNKFVNSRGSMPTTSTTTYNPPYSYSLDNVDNVKSIVKQNAGVGKINPASLDKREAEACEEERNAEEERRDEPDERDAQVEHNAREAEADAEAVGPEAFADEDLDPWE KNLRRIIRKGIHIIKKYG(SEQ ID NO：115)。
SEQ ID NO：115的N-末端信号肽部分(带下划线)在成熟融合肽的分泌前切除。带下划线的C-末端尾区为G10 novispirin。成熟果胶酸裂合酶以斜体显示。对应于SEQ ID NO：115的DNA片段为SEQ ID NO：114的PP1331-2 Sac1 Mlu1 DNA片段。
序列表
<110>诺和酶股份有限公司
<120>抗微生物剂的重组产生
<130>10486
<160>118
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)
<220>
<221>DISULFID
<222>(2)..(19)
<400>1
Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser
1               5                   10                  15
Ile Thr Cys Val
            20
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>2位Cys的巯基被阻断
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>19位Cys的巯基被阻断
<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)
<400>2
Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser
1               5                   10                  15
Ile Thr Cys Val
            20
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)
<220>
<221>DISULFID
<222>(2)..(19)
<400>3
Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro
1               5                   10                  15
Val Ser Cys Ile
            20
<210>4
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>2位Cys的巯基被阻断
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>19位Cys的巯基被阻断
<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)
<400>4
Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro
1               5                   10                  15
Val Ser Cys Ile
            20
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<400>5
Arg Trp Gln Trp Arg
1               5
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<400>6
Arg Arg Gln Trp Arg
1               5
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<400>7
Lys Val Ser Trp Arg
1               5
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<400>8
Arg Asn Met Arg Lys
1               5
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<400>9
Arg Trp Gln Glu Lys
1                  5
<210>10
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<400>10
Arg Arg Trp Gln Trp Arg
1                   5
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<400>11
Arg Arg Arg Gln Trp Arg
1                   5
<210>12
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<400>12
Lys Thr Val Ser Trp Arg
1                   5
<210>13
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<400>13
Lys Arg Asn Met Arg Lys
1                   5
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<400>14
Arg Trp Gln Glu Met Lys
1                   5
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>15
Lys Thr Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys
1               5                   10
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>16
Lys Ser Arg Arg Arg Gln Trp Arg Met Lys Lys
1               5                   10
<210>17
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>17
Lys Thr Val Ser Trp Gln Thr Tyr Met Lys Lys
1               5                   10
<210>18
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>18
Lys Thr Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys
1               5                   10
<210>19
<211>11
<212>PRT
<213>合成的
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>19
Lys Thr Leu Arg Trp Gln Asn Glu Met Arg Lys
1               5                   10
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<400>20
Phe Gln Trp Gln Arg Asn
1               5
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<400>21
Phe Gln Trp Gln Arg
1               5
<210>22
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(4)
<400>22
Gln Trp Gln Arg
1
<210>23
<211>3
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(3)
<400>23
Trp Gln Arg
1
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<400>24
Arg Arg Trp Gln Trp
1               5
<210>25
<211>4
<212>PRT
<213>合成的
<220>
<221>肽
<222>(1)..(4)
<400>25
Arg Arg Trp Gln
1
<210>26
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(4)
<400>26
Trp Gln Trp Arg
1
<210>27
<211>3
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(3)
<400>27
Gln Trp Arg
1
<210>28
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(3)
<400>28
Leu Arg Trp Gln Asn Asp
1               5
<210>29
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<400>29
Leu Arg Trp Gln Asn
1               5
<210>30
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(4)
<400>30
Leu Arg Trp Gln
1
<210>31
<211>3
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(3)
<400>31
Arg Trp Gln
1
<210>32
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(25)
<400>32
Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe
            20                  25
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>33
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Met Lys Lys
1               5                   10
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>34
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Met Arg Lys
1               5                   10
<210>35
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>35
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Arg
1               5
<210>36
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>36
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Arg
1               5
<210>37
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>37
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Lys
1               5
<210>38
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>38
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Lys
1               5
<210>39
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>39
Arg Xaa Xaa Xaa Arg
1               5
<210>40
<211>5
<212>PRT
<213>合成的
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>40
Lys Xaa Xaa Xaa Arg
1               5
<210>41
<211>5
<212>PRT
<213>合成的
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>41
Arg Xaa Xaa Xaa Lys
1               5
<210>42
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(38)
<400>42
Lys Asn Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Gln Pro Glu Trp Phe Lys Cys
1               5                   10                  15
Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr
            20                  25                  30
Cys Val Arg Arg Ala Phe
        35
<210>43
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(32)
<400>43
Thr Ile Ser Gln Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg
1               5                   10                  15
Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe
            20                  25                  30
<210>44
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(36)
<400>44
Val Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met
1               5                   10                  15
Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro
            20                  25                  30
Ile Gln Cys Ile
        35
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>45
Lys Xaa Xaa Xaa Lys
1               5
<210>46
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>46
Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala
1               5                   10
<210>47
<211>50
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(50)
<400>47
Ala Pro Arg Lys Asn Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Gln Pro Glu Trp
1               5                   10                  15
Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro
            20                  25                  30
Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Ala Leu Glu Cys Ile Arg Ala
        35                  40                  45
Ile Ala
    50
<210>48
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(18)
<400>48
Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu
1               5                   10                  15
Gly Ala
<210>49
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(15)
<400>49
Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
<210>50
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(14)
<400>50
Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala
1               5                       10
<210>51
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(13)
<400>51
Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala
1               5                   10
<210>52
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(12)
<400>52
Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala
1               5                   10
<210>53
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(15)
<400>53
Lys Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
<210>54
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(15)
<400>54
Phe Lys Cys Phe Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
<210>55
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(15)
<400>55
Lys Lys Cys Phe Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
<210>56
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(14)
<400>56
Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly
1               5                   10
<210>57
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(19)
<400>57
Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile
1               5                   10                  15
Thr Cys Val
<210>58
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(6)
<400>58
Arg Arg Trp Gln Trp Arg
1               5
<210>59
<211>188
<212>PRT
<213>Nocardiopsis sp.
<220>
<221>mat_peptide
<222>(1)..(188)
<400>59
Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr
            20                  25                  30
Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly
        35                  40                  45
Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe
    50                  55                  60
Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Ala Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile
                85                  90                  95
Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly
            100                 105                 110
Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val
        115                 120                 125
Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr
                165                 170                 175
Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr
            180                 185
<210>60
<211>354
<212>PRT
<213>Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei
<220>
<221>mat_peptide
<222>(167)..(354)
<400>60
Ala Pro  Ala Pro Val Pro Gln  Thr Pro Val Ala Asp  Asp Ser Ala
    -165                 -160                 -155
Ala Ser  Met Thr Glu Ala Leu  Lys Arg Asp Leu Asp  Leu Thr Ser
    -150                 -145                 -140
Ala Glu  Ala Glu Glu Leu Leu  Ser Ala Gln Glu Ala  Ala Ile Glu
    -135                 -130                 -125
Thr Asp  Ala Glu Ala Thr Glu  Ala Ala Gly Glu Ala  Tyr Gly Gly
    -120                 -115                 -110
Ser Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp
    -105                 -100                 -95
Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gln Ala Thr Val
-90                 -85                 -80                 -75
Val Ser His Gly Thr Glu Gly Leu Thr Glu Val Val Glu Asp Leu Asn
                -70                 -65                 -60
Gly Ala Glu Val Pro Glu Ser Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu
            -55                 -50                 -45
Ser Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val
        -40                 -35                 -30
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ser Ser Ser Val Arg Val
    -25                 -20                 -15
Glu Glu Ala Glu Glu Ala Pro Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly
-10                 -5              -1  1               5
Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr
            10                  15                  20
Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr
        25                  30                  35
Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Thr Gly Thr Phe Gln Asn
    40                  45                  50
Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn
55                  60                  65                  70
Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Gln
                75                  80                  85
Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg
            90                  95                  100
Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn
        105                 110                 115
Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr
    120                 125                 130
Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly
135                 140                 145                 150
Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Val
                155                 160                 165
Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Ile Asn Ser Trp
            170                 175                 180
Gly Val Arg Ile Arg Thr
        185
<210>61
<211>355
<212>PRT
<213>Nocardiopsis alba
<220>
<221>mat_peptide
<222>(168)..(355)
<400>61
Ala Thr Gly  Pro Leu Pro Gln Ser  Pro Thr Pro Asp Glu  Ala Glu
        -165                 -160                 -155
Ala Thr Thr  Met Val Glu Ala Leu  Gln Arg Asp Leu Gly  Leu Ser
        -150                 -145                 -140
Pro Ser Gln  Ala Asp Glu Leu Leu  Glu Ala Gln Ala Glu  Ser Phe
        -135                 -130                 -125
Glu Ile Asp  Glu Ala Ala Thr Ala  Ala Ala Ala Asp Ser  Tyr Gly
        -120                 -115                 -110
Gly Ser Ile  Phe Asp Thr Asp Ser  Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr
        -105                 -100                 -95
Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys
    -90                 -85                 -80
Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu
-75                 -70                 -65                 -60
Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile
                -55                 -50                 -45
His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp
            -40                 -35                 -30
Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys
        -25                 -20                 -15
Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly
    -10                 -5              -1  1               5
Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala
                10                  15                  20
Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly
            25                  30                  35
Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu
        40                  45                  50
Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser
    55                  60                  65
Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr
70                  75                  80                  85
Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys
                90                  95                  100
Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg
            105                 110                 115
Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg
        120                 125                 130
Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser
    135                 140                 145
Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser
150                 155                 160                 165
Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser
                170                 175                 180
Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr
            185
<210>62
<211>353
<212>PRT
<213>Nocardiopsis prasina
<220>
<221>mat_peptide
<222>(166)..(353)
<400>62
Ala  Thr Gly Pro Leu Pro  Gln Ser Pro Thr Pro  Glu Ala Asp Ala
-165                 -160                 -155
Val  Ser Met Gln Glu Ala  Leu Gln Arg Asp Leu  Gly Leu Thr Pro
-150                 -145                 -140
Leu  Glu Ala Asp Glu Leu  Leu Ala Ala Gln Asp  Thr Ala Phe Glu
-135                 -130                 -125
Val  Asp Glu Ala Ala Ala  Ala Ala Ala Gly Asp  Ala Tyr Gly Gly
-120                 -115                 -110
Ser  Val Phe Asp Thr Glu  Thr Leu Glu Leu Thr Val  Leu Val Thr Asp
-105                 -100                 -95                 -90
Ala Ala Ser Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu
                -85                 -80                 -75
Val Ser Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asp Glu Ile Ile Gln Asp Leu Asn
            -70                 -65                 -60
Ala Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala
        -55                 -50                 -45
Gly Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val
    -40                 -35                 -30
Ser Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val
-25                 -20                 -15                 -10
Thr Ser Ser Ala Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu
                -5              -1  1               5
Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn
        10                  15                  20
Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val
    25                  30                  35
Gly Thr Gln Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu Gln Ser
40                  45                  50                  55
Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
                60                  65                  70
Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr
            75                  80                  85
Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser
        90                  95                  100
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln
    105                 110                 115
Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr
120                 125                 130                 135
Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Asn
                140                 145                 150
Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly
            155                 160                 165
Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly
        170                 175                 180
Val Arg Leu Arg Thr
    185
<210>63
<211>353
<212>PRT
<213>Nocardiopsis prasina
<220>
<221>mat_peptide
<222>(166)..(353)
<400>63
Ala  Thr Gly Pro Leu Pro  Gln Ser Pro Thr Pro  Glu Ala Asp Ala
-165                 -160                 -155
Val  Ser Met Gln Glu Ala  Leu Gln Arg Asp Leu  Gly Leu Thr Pro
-150                 -145                 -140
Leu  Glu Ala Asp Glu Leu  Leu Ala Ala Gln Asp  Thr Ala Phe Glu
-135                 -130                 -125
Val  Asp Glu Ala Ala Ala  Glu Ala Ala Gly Asp  Ala Tyr Gly Gly
-120                 -115                 -110
Ser  Val Phe Asp Thr Glu  Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp
-105                 -100                 -95                 -90
Ser Ala Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu
                -85                 -80                 -75
Val Ser Tyr Gly Ile Thr Gly Leu Asp Glu Ile Val Glu Glu Leu Asn
            -70                 -65                 -60
Ala Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala
        -55                 -50                 -45
Gly Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val
    -40                 -35                 -30
Gly Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val
-25                 -20                 -15                 -10
Thr Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu
                -5                  -1  1           5
Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn
        10                  15                  20
Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val
    25                  30                  35
Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser
40                  45                  50                  55
Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
                60                  65                  70
Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr
            75                  80                  85
Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser
        90                  95                  100
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln
    105                 110                 115
Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr
120                 125                 130                 135
Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Asn
                140                 145                 150
Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly
            155                 160                 165
Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly
        170                 175                 180
Val Arg Leu Arg Thr
    185
<210>64
<211>439
<212>PRT
<213>Peniophora lycii
<220>
<221>mat_peptide
<222>(31)..(439)
<400>64
Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser
-30                 -25                 -20                 -15
Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro
                -10                 -5              -1  1
Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe
        5                   10                  15
Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln
    20                  25                  30
Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala
35                  40                  45                  50
Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro
                55                  60                  65
Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe
            70                  75                  80
Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr
        85                  90                  95
Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp
    100                 105                 110
Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser
115                 120                 125                 130
Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu
                135                 140                 145
Pro Thr Leu Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys
            150                 155                 160
Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp
        165                 170                 175
Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala
    180                 185                 190
Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met
195                 200                 205                 210
Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp
                215                 220                 225
Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu
            230                 235                 240
Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln
        245                 250                 255
Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala
    260                 265                 270
Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala
275                 280                 285                 290
Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn
                295                 300                 305
Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala
            310                 315                 320
Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys
        325                 330                 335
Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser
    340                 345                 350
Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu
355                 360                 365                 370
Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val
                375                 380                 385
Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys
            390                 395                 400
Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu
        405
<210>65
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(39)
<400>65
Arg Arg Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Pro
1               5                   10                  15
Phe Phe Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro Gly Phe Pro Pro
            20                  25                  30
Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro
        35
<210>66
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>66
catagcacca tggaaaggag acgtccccga cccccatatt tgcc                       44
<210>67
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>67
catagcacca tggatgaaag gagacgtccc cgacccccat atttgcc                    47
<210>68
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>68
catagcacca tggacgatga aaggagacgt ccccgacccc catatttgcc                 50
<210>69
<211>53
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>69
catagcacca tggatgacga tgaaaggaga cgtccccgac ccccatattt gcc             53
<210>70
<211>56
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>70
catagcacca tggacgatga cgatgaaagg agacgtcccc gacccccata tttgcc          56
<210>71
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>71
ccataagatt agcggatcct acc                                              23
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>72
ctctcatccg ccaaaacagc c                                                21
<210>73
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(18)
<400>73
Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile His Ile Ile Lys Lys
1               5                   10                  15
Tyr Gly
<210>74
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>74
aggggtatcg atggctaaga gagaagccga aaggagacgt ccccgacccc c               51
<210>75
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>75
aggggtatcg atggctaaga gagaagccga tgaaaggaga cgtccccgac cccc            54
<210>76
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>76
aggggtatcg atggctaaga gagaagccga cgatgaaagg agacgtcccc gaccccc         57
<210>77
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>77
aggggtatcg atggctaaga gagaagccga tgacgatgaa aggagacgtc cccgaccccc      60
<210>78
<211>63
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>78
aggggtatcg atggctaaga gagaagccga cgatgacgat gaaaggagac gtccccgacc      60
ccc                                                                    63
<210>79
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>连接体
<400>79
Pro Glu Pro Thr
1
<210>80
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>连接体
<400>80
Glu Pro Thr Pro
1
<210>81
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>连接体
<400>81
Pro Thr Glu Pro
1
<210>82
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>连接体
<400>82
Thr Pro Glu Pro
1
<210>83
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>连接体
<400>83
Ile Glu Gly Arg
1
<210>84
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>延伸
<400>84
Gln Ser His Val Gln Ser Ala Pro
1               5
<210>85
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>延伸
<400>85
Gln Ser Ala Pro
1
<210>86
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>切割连接体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>86
Xaa Asp Asp Asp Lys Xaa
1               5
<210>87
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>切割连接体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>87
Xaa Lys Arg Xaa
1
<210>88
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>切割连接体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>88
Xaa Ile Glu Gly Arg Xaa
1               5
<210>89
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>切割连接体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>89
Pro Xaa Gly Pro Xaa Xaa
1               5
<210>90
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>切割连接体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>90
Xaa Gly Val Arg Gly Pro Arg Xaa
1               5
<210>91
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>切割连接体
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>91
Ser Asn Gly Xaa
1
<210>92
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>92
Asp Asp Glu Glu Glu
1               5
<210>93
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>93
Asp Asp Asp Glu Glu
1               5
<210>94
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>94
Asp Asp Asp Asp Glu
1               5
<210>95
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>95
Glu Glu Asp Asp Glu
1               5
<210>96
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>96
Asp Asp Glu Glu Asp
1               5
<210>97
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>97
Glu Asp Glu Asp Glu
1               5
<210>98
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>98
Asp Asp Asp Glu Glu Glu
1               5
<210>99
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>99
Asp Glu Asp Glu Asp Glu
1               5
<210>100
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>100
Glu Glu Asp Asp Glu Glu
1               5
<210>101
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>101
Asp Asp Asp Asp Asp Pro
1               5
<210>102
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>102
Glu Glu Glu Glu Glu Asp Pro
1               5
<210>103
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>103
Asp Asp Asp Glu
1
<210>104
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>104
Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Pro
1               5
<210>105
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>105
Asp Asp Asp Gly Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Asp Asp Pro
1               5                   10
<210>106
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>保护肽
<400>106
Asp Asp Asp Gly Gly Asp Asp Asp Pro Pro Asp Asp Asp Glu
1               5                   10
<210>107
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>107
tatagagctc cattgaaagg ggaggagaat c                                     31
<210>108
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>108
tatactgcag aatgaggcag caagaagatg agc                                   33
<210>109
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>109
tatactgcag ccgcggcagc ttctgcctta aac                                   33
<210>110
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>110
tatagctagc tggattgatt ttgccgactc cg                                    32
<210>111
<211>1227
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA片段(PP1223-9 Sac1 Mlu1)
<220>
<221>CDS
<222>(28)..(1218)
<220>
<221>misc_feature
<222>(115)..(1056)
<223>果胶酸裂合酶
<220>
<221>mat_peptide
<222>(115)..()
<220>
<221>misc_feature
<222>(1066)..(1218)
<223>AFP
<400>111
gagctccatt gaaaggggag gagaatc atg aaa caa caa aaa cgg ctt tac gcc      54
                              Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala
                                              -25
cga ttg ctg acg ctg tta ttt gcg ctc atc ttc ttg ctg cct cat tct       102
Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser
-20                 -15                 -10                 -5
gca gcc gcg gca gct tct gcc tta aac tcg ggc aaa gta aat ccg ctt    150
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu
            -1  1               5                   10
gcc gac ttc agc tta aaa ggc ttt gcc gca cta aac ggc gga aca acg    198
Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr
        15                  20                  25
ggc gga gaa ggc ggt cag acg gta acc gta aca acg gga gat cag ctg    246
Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu
    30                  35                  40
att gcg gca tta aaa aat aag aat gca aat acg cct tta aaa att tat    294
Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr
45                  50                  55                  60
gtc aac ggc acc att aca aca tca aat aca tcc gca tca aag att gac    342
Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp
                65                  70                  75
gtc aaa gac gtg tca aac gta tcg att gtc gga tca ggg acc aaa ggg    390
Val Lys Asp Val Ser Asn Val Ser Ile Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly
            80                  85                  90
gaa ctc aaa ggg atc ggc atc aaa ata tgg cgg gcc aac aac atc atc    438
Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile Lys Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile
        95                  100                 105
atc cgc aac ttg aaa att cac gag gtc gcc tca ggc gat aaa gac gcg    486
Ile Arg Asn Leu Lys Ile His Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala
    110                 115                 120
atc ggc att gaa ggc cct tct aaa aac att tgg gtt gat cat aat gag    534
Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu
125                 130                 135                 140
ctt tac cac agc ctg aac gtt gac aaa gat tac tat gac gga tta ttt    582
Leu Tyr His Ser Leu Asn Val Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe
                145                 150                 155
gac gtc aaa aga gat gcg gaa tat att aca ttc tct tgg aac tat gtg    630
Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val
            160                 165                 170
cac gat gga tgg aaa tca atg ctg atg ggt tca tcg gac agc gat aat    678
His Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn
        175                 180                 185
tac aac agg acg att aca ttc cat cat aac tgg ttt gag aat ctg aat    726
Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn
    190                 195                 200
tcg cgt gtg ccg tca ttc cgt ttc gga gaa ggc cat att tac aac aac    774
Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg Phe Gly Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn
205                 210                 215                 220
tat ttc aat aaa atc atc gac agc gga att aat tcg agg atg ggc gcg    822
Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp Ser Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala
                225                 230                 235
cgc atc aga att gag aac aac ctc ttt gaa aac gcc aaa gat ccg att    870
Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn Leu Phe Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile
            240                 245                 250
gtc tct tgg tac agc agt tca ccg ggc tat tgg cat gta tcc aac aac    918
Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn
        255                 260                 265
aaa ttt gta aac tct agg ggc agt atg ccg act acc tct act aca acc    966
Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr
    270                 275                 280
tat aat ccg cca tac agc tac tca ctc gac aat gtc gac aat gta aaa    1014
Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val Lys
285                 290                 295                 300
tca atc gtc aag caa aat gcc gga gtc ggc aaa atc aat cca gct agc    1062
Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala Gly Val Gly Lys Ile Asn Pro Ala Ser
                305                 310                 315
gaa gcc acc tac ccc ggc aag tgc tac aag aag gac aac atc tgc aag    1110
Glu Ala Thr Tyr Pro Gly Lys Cys Tyr Lys Lys Asp Asn Ile Cys Lys
            320                 325                 330
tac aag gcc cag tcc ggc aag acc ggc atc tgc aag tgc tac gtc aag    1158
Tyr Lys Ala Gln Ser Gly Lys Thr Gly Ile Cys Lys Cys Tyr Val Lys
        335                 340                 345
cgc tgc ccc cgc gac ggc gcc aag tgc gac ctc gac tcc tac aag ggc    1206
Arg Cys Pro Arg Asp Gly Ala Lys Cys Asp Leu Asp Ser Tyr Lys Gly
    350                 355                 360
aag tgc cac tgc tagacgcgt                                          1227
Lys Cys His Cys
365
<210>112
<211>397
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的构建体
<400>112
Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe
                -25                 -20                 -15
Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala
            -10                 -5              -1  1
Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly
    5                   10                  15
Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr
20                  25                  30                  35
Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys
                40                  45                  50
Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr
            55                  60                  65
Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val
        70                  75                  80
Ser Ile Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile
    85                  90                  95
Lys Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His
100                 105                 110                 115
Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser
                120                 125                 130
Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val
            135                 140                 145
Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu
        150                 155                 160
Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met
    165                 170                 175
Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe
180                 185                 190                 195
His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg
                200                 205                 210
Phe Gly Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp
            215                 220                 225
Ser Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn
        230                 235                 240
Leu Phe Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser
    245                 250                 255
Pro Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly
260                 265                 270                 275
Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr
                280                 285                 290
Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala
            295                 300                 305
Gly Val Gly Lys Ile Asn Pro Ala Ser Glu Ala Thr Tyr Pro Gly Lys
        310                 315                 320
Cys Tyr Lys Lys Asp Asn Ile Cys Lys Tyr Lys Ala Gln Ser Gly Lys
    325                 330                 335
Thr Gly Ile Cys Lys Cys Tyr Val Lys Arg Cys Pro Arg Asp Gly Ala
340                 345                 350                 355
Lys Cys Asp Leu Asp Ser Tyr Lys Gly Lys Cys His Cys
                360                 365
<210>113
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>113
tataacgcgt ctagcagtgg cacttg                                               26
<210>114
<211>1297
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA片段(PP1331-2Sac1Mlu1)
<220>
<221>CDS
<222>(27)..(1289)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(114)..(1289)
<220>
<221>misc_feature
<222>(114)..(1055)
<223>果胶酸裂合酶
<220>
<221>misc_feature
<222>(1236)..(1289)
<223>G10 novispirin
<400>114
gagctcattg aaaggggagg agaatc atg aaa caa caa aaa cgg ctt tac gcc   53
                             Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala
                                             -25
cga ttg ctg acg ctg tta ttt gcg ctc atc ttc ttg ctg cct cat tct    101
Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser
-20                 -15                 -10                 -5
gca gcc gcg gca gct tct gcc tta aac tcg ggc aaa gta aat ccg ctt    149
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu
            -1  1               5                   10
gcc gac ttc agc tta aaa ggc ttt gcc gca cta aac ggc gga aca acg    197
Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr
        15                  20                  25
ggc gga gaa ggc ggt cag acg gta acc gta aca acg gga gat cag ctg    245
Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu
    30                  35                  40
att gcg gca tta aaa aat aag aat gca aat acg cct tta aaa att tat    293
Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr
45                  50                  55                  60
gtc aac ggc acc att aca aca tca aat aca tcc gca tca aag att gac    341
Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp
                65                  70                  75
gtc aaa gac gtg tca aac gta tcg att gtc gga tca ggg acc aaa ggg    389
Val Lys Asp Val Ser Asn Val Ser Ile Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly
            80                  85                  90
gaa ctc aaa ggg atc ggc atc aaa ata tgg cgg gcc aat aac atc atc    437
Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile Lys Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile
        95                  100                 105
atc cgc aac ttg aaa att cac gag gtc gcc tca ggc gat aaa gac gcg    485
Ile Arg Asn Leu Lys Ile His Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala
    110                 115                 120
atc ggc att gaa ggc cct tct aaa aac att tgg gtt gat cat aat gag    533
Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu
125                 130                 135                 140
ctt tac cac agc ctg aac gtt gac aaa gat tac tat gac gga tta ttt    581
Leu Tyr His Ser Leu Asn Val Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe
                145                 150                 155
gac gtc aaa aga gat gcg gaa tat att aca ttc tct tgg aac tat gtg    629
Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val
            160                 165                 170
cac gat gga tgg aaa tca atg ctg atg ggt tca tcg gac agc gat aat    677
His Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn
        175                 180                 185
tac aac agg acg att aca ttc cat cat aac tgg ttt gag aat ctg aat    725
Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn
    190                 195                 200
tcg cgt gtg tcg tca ttc cgt ttc gga gaa ggc cat att tac aac aac    773
Ser Arg Val Ser Ser Phe Arg Phe Gly Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn
205                 210                 215                 220
tat ttc aat aaa atc atc gac agc gga att aat tcg agg atg ggc gcg    821
Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp Ser Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala
                225                 230                 235
cgc atc aga att gag aac aac ctc ttt gaa aac gcc aaa gat ccg att    869
Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn Leu Phe Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile
            240                 245                 250
gtc tct tgg tac agc agt tca ccg ggc tat tgg cat gta tcc aac aac    917
Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn
        255                 260                 265
aaa ttt gta aac tct agg ggc agt atg ccg act acc tct act aca acc    965
Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr
    270                 275                 280
tat aat ccg cca tac agc tac tca ctc gac aat gtc gac aat gta aaa    1013
Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val Lys
285                 290                 295                 300
tca atc gtc aag caa aat gcc gga gtc ggc aaa atc aat cca gct agc    1061
Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala Gly Val Gly Lys Ile Asn Pro Ala Ser
                305                 310                 315
ttg gat aaa aga gag gct gaa gct tgt gag gaa gag aga aat gca gaa    1109
Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala Cys Glu Glu Glu Arg Asn Ala Glu
            320                 325                 330
gaa gaa aga aga gat gaa cca gat gaa agg gat gct caa gtg gaa cat    1157
Glu Glu Arg Arg Asp Glu Pro Asp Glu Arg Asp Ala Gln Val Glu His
        335                 340                 345
aat gcg cgc gag gct gaa gct gat gcg gaa gcg gtg ggc ccg gaa gcg    1205
Asn Ala Arg Glu Ala Glu Ala Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala
    350                 355                 360
ttt gcg gat gaa gat ctg gat cca tgg gaa aag aac ctc aga cga atc    1253
Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp Pro Trp Glu Lys Asn Leu Arg Arg Ile
365                 370                 375                 380
ata agg aaa ggt ata cac atc att aag aaa tac gga taacgcgt              1297
Ile Arg Lys Gly Ile His Ile Ile Lys Lys Tyr Gly
                385                 390
<210>115
<211>421
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的构建体
<400>115
Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe
                -25                 -20                 -15
Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala
            -10                 -5              -1  1
Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly
    5                   10                  15
Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr
20                  25                  30                  35
Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys
                40                  45                  50
Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr
            55                  60                  65
Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val
        70                  75                  80
Ser Ile Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile
    85                  90                  95
Lys Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His
100                 105                 110                 115
Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser
                120                 125                 130
Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val
            135                 140                 145
Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu
        150                 155                 160
Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met
    165                 170                 175
Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe
180                 185                 190                 195
His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Ser Ser Phe Arg
                200                 205                 210
Phe Gly Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp
            215                 220                 225
Ser Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn
        230                 235                 240
Leu Phe Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser
    245                 250                 255
Pro Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly
260                 265                 270                 275
Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr
                280                 285                 290
Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala
            295                 300                 305
Gly Val Gly Lys Ile Asn Pro Ala Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu
        310                 315                 320
Ala Cys Glu Glu Glu Arg Asn Ala Glu Glu Glu Arg Arg Asp Glu Pro
    325                 330                 335
Asp Glu Arg Asp Ala Gln Val Glu His Asn Ala Arg Glu Ala Glu Ala
340                 345                 350                 355
Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp
                360                 365                 370
Pro Trp Glu Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile His Ile
            375                 380                 385
Ile Lys Lys Tyr Gly
        390
<210>116
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>116
tataacgcgt tatccgtatt tcttaatg                                28
<210>117
<211>53
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>淬灭结构域
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(14)
<223>连接体
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..()
<223>PR39
<400>117
Asp Asp Asp Asp Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Pro Phe Phe
            20                  25                  30
Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro Gly Phe Pro Pro Arg Phe
        35                  40                  45
Pro Pro Arg Phe Pro
    50
<210>118
<211>57
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>淬灭结构域
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(18)
<223>连接体
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..()
<223>PR39
<400>118
Asp Asp Asp Asp Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Glu Arg Arg Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro
            20                  25                  30
Pro Pro Phe Phe Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro Gly Phe
        35                  40                  45
Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro
    50                  55

Claims (21)

1.重组微生物宿主细胞，其包含编码抗微生物剂的第一种核酸序列和编码酶的第二种异源核酸序列。
2.权利要求1的宿主细胞，其中所述第一和/或第二种核酸序列整合到宿主细胞的染色体中。
3.权利要求1的宿主细胞，其含有掺入所述第一和第二种核酸序列的DNA构建体。
4.权利要求1的宿主细胞，其中第一种核酸序列掺入到第一种DNA构建体，第二种核酸序列掺入到第二种DNA构建体中。
5.权利要求4的宿主细胞，其还包含掺入所述第一和第二种核酸序列的第三种DNA构建体。
6.核酸构建体，其包含编码抗微生物剂的第一种核酸序列，和编码酶的第二种核酸序列，所述核酸序列有效连接指导所述酶和所述抗微生物剂在适宜的表达宿主中表达的一种或多种控制序列，其中所述第二种核酸序列为表达宿主异源的。
7.产生酶和/或抗微生物剂的方法，所述方法包括：(a)培养权利要求1-5任一项的重组宿主细胞以产生包含所述酶和所述抗微生物剂的上清液；和(b)回收所述酶和/或所述抗微生物剂。
8.融合产物，其包含酶、抗微生物剂和可切割的连接体。
9.动物饲料添加剂，其包含
(a)至少一种权利要求8的融合产物，
(b)至少一种脂溶性维生素，和/或
(c)至少一种水溶性维生素，和/或
(d)至少一种痕量矿物质。
10.动物饲料组合物，其具有50到800g/kg的粗蛋白质含量并且包含至少一种权利要求8的融合产物。
11.转基因非人动物、或者其产物或成分，所述转基因非人动物、或者其产物或成分能够表达酶和抗微生物剂。
12.权利要求8的融合产物的用途，用于动物饲料中。
13.抗微生物剂和酶的共表达的用途，用作提高所述抗微生物剂的产率和/或提高总生产经济的工具。
14.保护肽在抗微生物肽的重组表达中的用途，其中所述保护肽中包含的氨基酸残基的至少50％为D(Asp)和/或E(Glu)。
15.鉴定包含至少一个D(Asp)和/或E(Glu)的保护肽的方法，该方法包括：
a)提供包含至少一个D和/或E的肽保护候选者；
b)制备包含编码所述肽保护候选者的第一种DNA序列和编码抗微生物肽的第二种DNA序列的DNA构建体；
c)用b)的DNA构建体转化宿主细胞并培养所转化的宿主细胞以得到DNA构建体的表达；
d)估计所转化的宿主细胞的生存力和/或抗微生物肽的产率；和
e)鉴定肽保护候选者，其当用于根据步骤b)的DNA构建体中来转化根据步骤c)的宿主细胞时，当根据步骤d)评估时，导致该宿主细胞的生存力增加和/或抗微生物肽的产率增加。
16.通过权利要求15的方法鉴定的保护肽的用途，用于抗微生物肽的重组表达。
17.权利要求1到5任一项的宿主细胞，其还包含编码保护肽的DNA序列。
18.权利要求6的核酸构建体，其还包含编码保护肽的DNA序列。
19.权利要求7的方法，其中所述重组宿主细胞是根据权利要求17。
20.权利要求8的融合产物，其还包含保护肽。
21.权利要求13的用途，其还包含保护肽的使用。
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