CN118064343A - 一种产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用 - Google Patents
一种产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用，属于微生物工程技术领域。该菌株包含如SEQ ID NO.1所示的多串联表达盒，能高效表达天蚕素A、天蚕素B、蜜蜂肽Ia和鲎肽素I。本发明构建了一种多串联表达抗菌肽的枯草芽孢杆菌工程菌，在实现稳定遗传的同时提高抗菌肽的表达量，为发展抗菌肽作为新型替抗药物提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，特别是涉及一种产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用。
背景技术
抗生素是人类对抗各类致病菌的首选利器，早期为防治密集养殖业中的各种细菌病害，国内养殖场大量使用抗生素，致使耐药细菌不断出现。如今，抗生素滥用引发的药物残留、环境污染及微生物耐药性等问题日益严峻，对人类与动物健康造成严重的威胁。因此，开发新型的抗生素替代产品已迫在眉睫。抗菌肽是一类具有广谱抑菌活性并能调节免疫功能的小分子蛋白，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌和病毒均有抑制作用。有研究证实，抗菌肽因其特殊的抑菌机制而不易产生耐药性，被认为是对抗细菌感染的最具前途的候选药物之一。
抗菌肽的获取方法有直接提取法、化学合成法及生物合成法，前二者产量低、成本高，难以规模化生产。生物合成法则具有成本低、效率高的优点，因而被广泛采用。常见的异源蛋白表达系统包括大肠杆菌表达系统及枯草芽孢杆菌表达系统。其中，大肠杆菌为革兰氏阴性菌，操作简单、传代时间短，但因其含有内毒素，需要进行昂贵的脱毒处理。
发明内容
本发明的目的是提供一种产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明一方面提供一株产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌，该菌株包含如SEQIDNO.1所示的多串联表达盒。
本发明另一方面提供所述重组枯草芽孢杆菌的制备方法，串联天蚕素A、天蚕素B、蜜蜂肽Ia(apidaecin)和鲎肽素I的基因序列，并添加T7启动子、核糖体结合位点及信号肽促进分泌表达，获得多串联表达盒，再将多串联表达盒插入枯草芽孢杆菌中，即可得到所述重组枯草芽孢杆菌。
本发明再一方面提供一种生产抗菌肽的方法，利用所述重组枯草芽孢杆菌生产抗菌肽。
基于上述技术方案，本发明具有以下技术效果：
本发明构建了一种多串联表达抗菌肽的枯草芽孢杆菌工程菌，该工程菌株能实现在枯草芽孢杆菌系统中高效表达抗菌肽，发酵产生的产物能对革兰氏阴性菌大肠杆菌有明显的抑制效果，具有一定的应用价值，为发展抗菌肽作为新型替抗药物提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为多串联表达盒示意图，其中，PT7，T7启动子；SD，核糖体结合位点；CPA，cecropin A；CPB，cecropin B；SP、SacB、AP、dacB均为信号肽；
图2为pWJX04表达载体的构建；
图3为pWJX04质粒构建菌落PCR检测，其中，M为DL2000标准分子量DNAMarker；
图4为游离态载体表达抗菌肽的生长曲线，其中，pHT254为添加携带pHT254空载体BS168发酵液上清的大肠杆菌生长曲线；pWJX04为添加携带pWJX04载体BS168发酵液上清的大肠杆菌生长曲线；
图5为产四种抗菌肽枯草芽孢杆菌工程菌的构建，其中，a为抗菌肽多串联表达盒敲入载体示意图，b为一次重组菌株电泳鉴定，泳道1为上游盒内外引物扩增片段，泳道2为下游盒内外引物扩增片段，M为DL2000标准分子量DNA Marker；
图6为发酵上清的抑菌效果验证，其中，a中D10为工程菌发酵上清抑菌圈，另设无菌水及BS168发酵上清为对照，上样量为200μL，b为工程菌发酵上清抑制大肠杆菌生长的生长曲线；
图7为目的抗菌肽的二级质谱鉴定，其中，(a)为cecropin A肽段，(b)为cecropinB肽段，(c)为apidaecin肽段。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
本发明实施例一方面提供一株产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌，该菌株包含如SEQ ID NO.1所示的多串联表达盒，能高效表达天蚕素A、天蚕素B、蜜蜂肽Ia和鲎肽素I。
天蚕素A(cecropin A)和天蚕素B(cecropin B)属于天蚕素(cecropins)家族，分离鉴定于惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)的血淋巴中。Apidaecin是一类由18-20个氨基酸残基构成的富含脯氨酸的小肽，其中的蜜蜂肽Ia天然存在于蜜蜂(Honeybee)体内，通过抑制DnaK蛋白活性及结合细菌脂多糖实现抑菌效果。鲎肽素(tachyplesin)家族属于节肢动物抗菌肽，tachyplesin I分离自中华鲎(Tachypleustridentatus)，具有17个氨基酸残基及1个羧基末端的精氨酸酰胺。
本发明实施例另一方面提供所述重组枯草芽孢杆菌的制备方法，串联天蚕素A、天蚕素B、蜜蜂肽Ia和鲎肽素I的基因序列，并添加T7启动子、核糖体结合位点及信号肽促进分泌表达，获得多串联表达盒，再将多串联表达盒插入枯草芽孢杆菌中，即可得到所述重组枯草芽孢杆菌。
在一些具体的实施例中，所述信号肽包括SP、SacB、AP和dacB。
在一些具体的实施例中，所述多串联表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些具体的实施例中，串联基因amyE的同源序列、P43启动子、T7RNA聚合酶及多串联表达盒，并构建基因敲入载体，所述多串联表达盒敲入载体为pRP1028-amyE-AMPs-specr，其敲入盒序列如SEQ ID NO.2所示。
在一些具体的实施例中，所述将多串联表达盒插入枯草芽孢杆菌中具体为：将多串联表达盒敲入载体插入枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因amyE中。
本发明利用添加信号肽并串联表达的方法，使抗菌肽在发酵过程中大量积累至培养基中，其发酵上清可初步验证所选取的四种抗菌肽在枯草芽孢杆菌表达系统中的生物抑菌活性。
本发明实施例再一方面提供一种生产抗菌肽的方法，利用所述重组枯草芽孢杆菌生产抗菌肽。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为革兰氏阳性菌，可产芽孢及荚膜，是典型的好氧型细菌，其芽孢具有极强的抗逆性，能在较高温和酸性环境中存活。枯草芽孢杆菌168(BS168)菌株是芽孢杆菌属的模式菌株，重组蛋白生产中常用的WB600和WB800皆由168菌株改造而来。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌不含内毒素，具有食品级的生物安全性，是芽孢杆菌科(Bacillaceae)的模式菌株，其遗传操作系统完善，易于进行相应的基因改造。枯草芽孢杆菌完善的蛋白分泌系统，便于目的蛋白的回收与纯化。此外，枯草芽孢杆菌也可合成并分泌蛋白酶、淀粉酶及多种脂肽类抗菌肽等益生因子，能提高养殖业中的饲料营养转化率，有效拮抗饲料中的各类细菌与真菌，抑制病原菌繁殖，是性能良好的养殖业益生菌。以枯草芽孢杆菌作为宿主表达抗菌肽，无需纯化与脱毒，是生产各种蛋白质及多肽药物的理想宿主。
本发明利用三亲本接合的方法，利用实验室保存的pRP1028质粒，将大肠杆菌BL21中的T7RNA聚合酶基因、BS168中的组成型强启动子P43及amyE同源臂以及本发明中的多串联表达盒等基因元件，构建抗菌肽多串联表达盒敲入载体pRP1028-amyE-AMPs-specr。该敲入载体可在辅助质粒pSS1827-Ampr帮助下通过一次接合进入BS168，获得具有壮观霉素(spec)抗性的接合子，再在温度胁迫的条件下使pRP1028-amyE-AMPs-specr通过同源重组整合至BS168基因组中，该菌株即为可稳定遗传的产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌菌株。
抗菌肽多串联表达盒如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
TAATACGACTCACTATAGGCATATAAAGGAGGAAGGATCCATGATTCAAAAACGAAAGCGGACAGTTTCGTTCAGACTTGTGCTTATGTGCACGCTGTTATTTGTCAGTTTGCCGATTACAAAAACATCAGCCATGAAATGGAAACTGTTCAAGAAGATTGAAAAAGTGGGTCAGAACATTCGCGATGGCATTATCAAAGCGGGCCCGGCCGTGGCGGTTGTTGGCCAGGCAACCCAGATTGCGAAAGGTTAGAAAAATTTGTAATTAAGAAGGAGTGATTACATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAGGCGCAACTCAAGCGTTTGCGATGGGCAACAACCGCCCGGTGTATATTCCGCAGCCGCGCCCGCCGCATCCGCGCATTTAAAAAAATTTGTAATTAAGAAGGAGTGATTACATGAGATCAAAAAAACTGTGGATTTCACTGCTGTTTGCACTGACACTGATTTTTACAATGGCAATGAAATGGAAAGTGTTTAAAAAAATTGAAAAAATGGGTCGCAACATTCGCAACGGTATTGTGAAAGCGGGCCCGGCGATTGCGGTTCTGGGCGAAGCGAAAGCGCTGGGCTAAAAAAATTTGTAATTAAGAAGGAGTGATTACATGCGCATTTTCAAAAAAGCAGTATTCGTGATCATGATTTCTTTTCTTATTGCAACCGTAAATGTGAATACAGCACATGCTATGAAATGGTGCTTCCGCGTGTGCTATCGCGGCATTTGTTATCGCCGCTGTCGCTAA。
敲入盒序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
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在本发明实施例中，枯草芽孢杆菌168(BS168)、大肠杆菌DH5α为本单位保藏；质粒pHT254、pSS4332-Kmr、pSS1827-Ampr为本单位保藏；质粒pWJX04-Amp/Cmr、pRP1028-amyE-AMPs-specr为本发明构建；质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；T4连接酶与连接酶Buffer均购于宝生物工程(大连)有限公司(Takara)；1.1×S4 Fidelity PCR Mix、2×GS Taq PCR Mix均购于广州欣凯莱生物技术有限公司；即用型无缝克隆试剂盒、限制性核酸内切酶均购于BBI生命科学有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司合成。
在本发明实施例中，大肠杆菌感受态的制备方法为：接种5mL种子液摇菌过夜，转接按1％的接种量转接到100mL培养基中；震荡培养约3h至OD600到0.35-0.4时，4℃4100rpm离心10min收集菌体；去上清，加入0.05倍体积预冷的0.1M MgCl2轻柔重悬，冰浴10min，4℃，4100rpm离心10min；去上清，加入0.05倍体积预冷0.1M CaCl2轻柔重悬，冰浴30min，4℃，4100rpm离心10min；去上清，加入0.03倍体积预冷的0.1M甘油CaCl2，悬浮沉淀；以100μL/管分装至无菌1.5mL离心管，-80℃保存备用。试剂均用高温湿热灭菌。
大肠杆菌热激转化方法为将连接体系(10-20μL)或质粒(8-10μL)加入100μL感受态细胞，轻柔混匀；混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴恢复5min；加入800-1000μL LB培养基，温和震荡培养45min；4100rpm离心5min，去800μL上清，留约100μL培养菌液，均匀涂布平板，晾干后倒置培养过夜。
制备热激感受态枯草芽孢杆菌168按照以下步骤进行：首先配制母液，10×最低盐溶液100mL(14g K2HPO4、6g KH2PO4、2g(NH4)2SO4、1g Na3C6H5O7·2H2O、0.2g MgSO4·7H2O)、50％葡萄糖50mL、5％水解酪蛋白20mL、10％酵母汁50mL、0.5M MgCl2、0.1M CaCl2，均115℃高温湿热灭菌30min，使用时混装；混装培养基GMⅠ(10×最低盐溶液9.5mL、50％葡萄糖1mL、5％水解酪蛋白0.4mL、10％酵母汁1mL、无菌水85.5mL)、GMⅡ(10×最低盐溶液10mL、50％葡萄糖1mL、5％水解酪蛋白0.08mL、10％酵母汁0.04mL、0.5M MgCl2 0.5mL、0.1M CaCl20.5mL、无菌水88mL)；BS168挑单菌落接种5mL GMⅠ种子液30℃摇菌过夜，转接取种子液2mL转接到18mL GMⅠ中，37℃，200rpm震荡培养3.5h；取10mL上述GMⅠ菌液转接到90mL GMⅡ中，37℃，200rpm震荡培养70min；取预冷的50mL离心管分装，冰浴10min，4℃，6000rpm离心5min收集菌体；倒上清，剩余约2mL左右上清，悬浮3个离心管中的菌体(总体积约2.5mL)，加700μL 50％甘油使终浓度约为11％，轻柔混匀以500μL/管分装至无菌1.5mL离心管，-80℃保存备用。
枯草芽孢杆菌热激转化的步骤为：从-80℃取出500μL感受态细胞，45℃水浴融化；加入10μL质粒，45℃热激90s，冰浴恢复1min，温和震荡培养1.5-2h；6000rpm离心5min，留200μL上清悬浮菌体均匀涂布在添加了载体抗性抗生素的平板上，30℃培养箱倒置培养过夜。
本发明实施例中使用的引物名称与序列如表1所示：
表1引物序列
实施例1枯草芽孢杆菌表达抗菌肽的可行性佐证
首先构建pWJX04-Amp/Cmr重组质粒载体。以pHT254质粒为基础，相应引物扩增信号肽-抗菌肽片段SPamyQ-cecropin A、(50μL扩增体系：模板DNA 1μL，引物各1.5μL，1.1×S4 Fidelity PCR Mix 50μL。扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，Tm±5℃退火20s，72℃延伸15s/kb，72℃延伸5min；程序循环数：30个循环。)。
本发明在设计引物时，在引物中预留了下游的XbaⅠ酶切位点及上下游同源臂，pHT254质粒用限制性内切酶BamHⅠ及XbaⅠ进行双酶切(酶切条件为：片段20μL，10×酶切buffer 10μL，BamHⅠ2.5μL，XbaⅠ2.5μL，双蒸水补至100μL，37℃孵育4h)，双酶切后载体与SPamyQ-cecropin A回收片段用无缝克隆连接(连接条件为：2×SeamLess cloning MasterMix 5μL，载体2μL，片段3μL。50℃反应20min，冰浴2min)，随后进行热激转化，对平板上的菌落进行PCR筛选(20μL扩增体系：阳性重组子菌液1μL，特殊引物各0.5μL，2×GS Taq PCRMix 10μL，双蒸水补至20μL。扩增条件：95℃预变性3min，94℃变性25s，Tm±5℃退火25s，72℃延伸15s/kb，72℃延伸2min。程序循环数：30个循环)。
pWJX04质粒构建、菌落PCR检测结果如图2-3所示。
筛选获得阳性重组子并测序无误后，命名为pWJX01-Amp/Cmr，根据质粒提取试剂盒的说明书，提取重组质粒，限制性核酸内切酶XbaⅠ消化后纯化回收备用，同样用特异引物扩增并回收SacB-apidaecin片段后，同上述的无缝克隆的方法，将SacB-apidaecin连接至线性化质粒pWJX01-Amp/Cmr上，获得的阳性转化子测序无误后命名为pWJX02-Amp/Cmr。以此类推获得分别含有1-4个抗菌肽的pWJX01、pWJX02、pWJX03、pWJX04重组质粒。
根据上文所述的热激感受态的制备与热激方法，将测序无误后的pWJX04-Cmr质粒通过热激转化导入至BS168中，涂布于含有氯霉素Cm(5μg/mL)的平板上筛选；经过菌落PCR鉴定后，确认pWJX04-Cmr质粒能转移进入BS168，并稳定复制传代。培养得到的单菌落为含有pWJX04-Cmr质粒的重组子，命名为BS168/pWJX04-Cmr。
为了检测重组质粒中抗菌肽在BS168中的表达情况，发酵100mL并收集上清进行抑菌效果验证。按1％的接种量转接到100mL无抗LB培养基中，37℃摇菌3h至OD600到0.8-1.0后添加IPTG(200μg/mL)诱导24h，4100rpm离心10min收集上清，冻干浓缩后按0.25g/mL用双蒸水重悬，12000rpm离心10min后上清过滤除菌，-20℃保存备用。
为初步探究枯草芽孢杆菌表达的抗菌肽对大肠杆菌的抑制效果，连续24h测定大肠杆菌OD600变化，并绘制生长曲线以表明发酵产物对其生长状况的抑制作用。大肠杆菌种子液摇过夜，转接按1％的接种量转接到10mL培养基中；生长曲线培养体系为100μL菌液，50μL浓缩产物，50μL LB。37℃培养24h，每1h测一次OD600，所得数据绘制生长曲线如图4所示。
实施例2产四种抗菌肽枯草芽孢杆菌工程菌的构建
以BS168总DNA为模板，引物amyEUP-F和amyEUP-R进行PCR扩增目的基因amyE的上游片段(同源臂约500bp，不包含目的基因序列)；为进一步提高抗菌肽表达量，引入P43-T7RNAPolymerase表达元件配合T7启动子起始表达盒转录；以BS168总DNA为模板，先后用引物P43-F和P43-R1、P43-R2进行PCR扩增P43启动子，以E.coli BL21总DNA为模板，引物P43-T7-F和RNAP-Sal1-R进行PCR扩增T7RNAPolymerase；由于T7RNAPolymerase序列较大，全长为2652bp，因而使用酶切连接的方法进行载体构建，在设计引物时预先引入了酶切位点，用限制性内切酶BamHⅠ及SalⅠ消化pRP1028质粒和回收T7RNAPolymerase片段，用T4连接酶连接(连接条件为：线性载体6μL，片段10μL，10×连接酶buffer 2μL，T4 DNA连接酶2μL。16℃连接3h)，随后热激转化，对平板上的菌落进行PCR筛选；筛选获得阳性重组子并测序无误后，命名为pRP1028-RNAP。
由于引物P43-F和amyEUP-R有同源序列，将amyE上游同源臂与P43片段回收后共同作为模板，通过重叠PCR的方法，用引物amyEUP-F和P43-R2进行扩增，使amyE上游同源臂、P43启动子重叠延伸成敲除盒同源臂UP；由于敲除盒同源臂UP与pRP1028-RNAP载体骨架有同源序列，将pRP1028-RNAP用BamHⅠ消化后，用无缝克隆的方法进行连接，随后热激转化，对平板上的菌落进行PCR筛选；筛选获得阳性重组子并测序无误后，命名为pRP1028-UP-RNAP。
以pWJX04重组质粒为模板，先后用引物SD-AMPs-F、PT7-SD-F、RNAP-T7-F和AMPs-1028-R进行PCR扩增得到PT7-信号肽-抗菌肽片段，由于引物RNAP-T7-F和RNAP-Sal1-R有同源序列，引物AMPs-1028-R与pRP1028-UP-RNAP载体骨架有同源序列，pRP1028-UP-RNAP经SalⅠ消化后回收与信号肽-抗菌肽片段进行无缝克隆连接，随后热激转化，对平板上的菌落进行PCR筛选；筛选获得阳性重组子并测序无误后，获得抗菌肽多串联表达盒敲入载体pRP1028-amyE-AMPs-specr。具体做法如图5所示。
本发明利用三亲接合的方法经一次基因重组后，获得能稳定遗传抗菌肽多串联表达盒的BS168工程菌株。在一次重组中，以DH5α/pRP1028-amyE-AMPs-specr为供体菌株，以BS168为受体菌株，以DH5α/pSS1827-Ampr为辅助菌株，三株菌按相应抗性摇种子液5mL过夜，转接按1％的接种量转接到5mL培养基中，使三株菌均培养至OD600约为0.8；分别取各菌液1mL，4100rpm离心8min收集菌体，用1mL无抗LB洗3次以确保洗净抗生素，分别用500μL无抗LB重悬；分别取三种菌株50μL于同一无菌离心管中，充分混匀，将该150μL混合液点在无抗平板上，自然晾干，转移至28℃培养约24h；用枪头将菌斑全部转移至干净离心管中，用200μL无抗LB重悬后，均匀涂布至含300μg/mL壮观霉素、60活性单位的多粘菌素的抗性平板上，28℃培养约12h；挑取单菌落至5mL 300μg/mL壮观霉素液体LB中28℃摇过夜；按1％的接种量转接到5mL抗性培养基中，37℃震荡8h左右，传代3次以消除BS168内未整合的敲入载体；在37℃培养目的菌落划线平板，挑取呈红色的单菌落于300μg/mL壮观霉素抗性LB中28℃摇过夜，抽提总DNA分别用上游盒内外引物UP-F、T7 in R，下游盒内外引物CPB in F、DN-R进行PCR验证，验证无误则为带有300μg/mL壮观霉素抗性的BS168单交换菌株，该菌株即为可稳定遗传的产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌菌株。
实施例3工程菌表达抗菌肽的效果验证
本发明构建了高效表达多种抗菌肽并能稳定遗传的BS168工程菌，该菌株能够由P43启动，分泌表达4种抗菌肽，将其发酵上清冷冻浓缩即为抗菌肽粗提物，具体操作如下。挑取单菌落至无抗LB摇种子液过夜，按1％的接种量转接到100mL无抗LB培养基中，28℃发酵48h，4100rpm离心11min收集上清，冻干浓缩后按0.25g/mL用双蒸水重悬，12000rpm离心10min后上清过滤除菌，-20℃保存备用。
由于所选取的是特异性拮抗革兰氏阴性的抗菌肽，因此在进行抑菌效果验证时仅考虑用革兰氏阴性模式菌大肠杆菌。抑菌圈实验主要是通过药物对受试菌产生的透明溶菌圈直径大小来评判其抑菌效果；大肠杆菌种子液摇过夜，取1mL稀释至10-3的菌液均匀涂布于无抗平板，使用蓝枪头在琼脂上打孔，并设置无菌水及野生型BS168发酵冻干重悬液为对照，样品各上样150μL，设置三个平行，自然晾干后转入37℃培养8h；生长曲线按实例1中方法进行测定。
结果如图6所示，(a)中D10为添加产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌菌株发酵上清抑菌圈，另设无菌水及BS168发酵上清为对照，上样量为200μL；(b)为工程菌发酵上清抑制大肠杆菌生长的生长曲线，CK为添加无菌水的大肠杆菌生长曲线；168为添加野生型BS168发酵上清的大肠杆菌生长曲线；D10为添加产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌菌株发酵上清的大肠杆菌生长曲线；由(a)观察可知仅D10实验组出现透明抑菌圈，表示工程菌发酵上清对大肠杆菌有较好的抑制效果。(b)中168组大肠杆菌生长状况与空白对照组一致，表明野生型枯草芽孢杆菌发酵上清对大肠杆菌无抑制作用；而D10实验组大肠杆菌随着时间的推移几乎不生长，表明重组枯草芽孢杆菌菌株发酵上清对大肠杆菌有明显抑制作用，进而证明重组工程菌表达的抗菌肽具有良好的抑菌活性。
实施例4目的抗菌肽的分子鉴定
取3mL工程菌浓缩发酵上清进行质谱实验，采用SDT裂解法提取蛋白质，用胰蛋白酶进行蛋白质酶解，采用HPLC进行分离。经色谱分离后的样品采用高分辨率质谱仪进行质谱分析，采用Maxquant软件进行查库鉴定及定量分析。
鉴定结果如图7所示，(a)为天蚕素A肽段；(b)为天蚕素B肽段；(c)为蜜蜂肽Ia肽段。由此可以证明重组枯草芽孢杆菌菌株实现了多种抗菌肽的表达。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术用户来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株产四种抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，该菌株包含如SEQ ID NO.1所示的多串联表达盒。
2.如权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，串联天蚕素A、天蚕素B、蜜蜂肽Ia和鲎肽素I的基因序列，并添加T7启动子、核糖体结合位点及信号肽促进分泌表达，获得多串联表达盒，再将多串联表达盒插入枯草芽孢杆菌中，即可得到所述重组枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述信号肽包括SP、SacB、AP和dacB。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多串联表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，串联基因amyE的同源序列、P43启动子、T7RNA聚合酶及多串联表达盒，并构建基因敲入载体，所述多串联表达盒敲入载体为pRP1028-amyE-AMPs-specr，其敲入盒序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述将多串联表达盒插入枯草芽孢杆菌中具体为：将多串联表达盒敲入载体插入枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因amyE中。
7.一种生产抗菌肽的方法，其特征在于，利用权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌生产抗菌肽。
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