CN112724212A - 藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，所述藜麦蛋白通过如下步骤方法制得：将藜麦种子粉碎并脱脂，浸提，硫酸铵分级沉淀，再经过DEAE‑FF阴离子交换柱和Sephacry S‑200凝胶柱过滤层析两步色谱分离纯化，获得高纯度的藜麦蛋白，经质谱鉴定其氨基酸序列与部分来源不同的植物1,5‑二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基具有一定相似度。该蛋白具有显著的抑制细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)的作用，对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)也有一定的抑制作用。该抗菌蛋白制备工艺简单，可作为植物抗病菌制剂等，本发明有助于藜麦蛋白资源的开发及在农业等领域的应用。

Description

藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用
技术领域
本发明涉及植物蛋白的制备和应用，具体属于藜麦蛋白的制备及其在抗植物病菌中的应用。
背景技术
藜麦[Chenopodium quinoa willd]，又称南美藜，印第安麦，金谷子。属于藜科藜属植物。原产于南美州安第斯山脉，有着5000-7000年的种植历史。由于其丰富的营养价值，养育着印加人民，古印加人称之为“粮食之母”(mother grain)。藜麦中富含丰富的完全蛋白及多种氨基酸，其中包含人体必需的9种氨基酸，尤其富含植物中缺乏的赖氨酸，这些化学成分与补充营养、增强机体功能、修复体质、提高机体免疫力、预防疾病、抗癌等功能有密切联系。目前大多数研究关注于藜麦多酚、黄酮、皂苷等活性成分，而对其蛋白质方面的研究还很少，尤其是其抗病菌活性方面的研究尚未见报道。
链格孢属(Alternaria Nees)真菌为世界性分布，具有腐生、内生和致病性，能侵染危害多种农作物，可单独致病，也可以与其他病菌一起混合侵染宿主。链格孢属真菌适应环境能力强，可在田间、运输及贮存过程中引发霉变，种级特征变异较大，其致病机理因侵染方式及所处生态环境不同又有差异，导致病害防治非常困难。细极链格孢菌(Alternariatenuissima)是引起农作物尤其是枣黑腐病的主要病原菌之一。茄腐镰刀菌是一类能产生毒素,引起动物和人类中毒、癌变和菌体寄生导致流产、角膜及皮肤溃疡的真菌。
发明内容
本发明的目的在于提供藜麦蛋白的制备方法和在抗植物病菌中的应用。
为实现上述目的，采用的技术方案如下：
本发明提供的藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，所述藜麦蛋白通过如下步骤的方法制得：
(1)将藜麦种子粉碎并脱脂，称取一定量的脱脂藜麦粉，按照料液比(W/V)1：5-20溶于20mmol/L pH 4.5的乙酸-乙酸铵缓冲液中，在4℃下搅拌浸提10-20小时，之后将上述样品于12000r/min离心30min，收集上清弃沉淀，即得到藜麦种子蛋白粗提液；
(2)将粗提液在4℃条件下缓慢加入一定量的饱和度为80％硫酸铵，边加边搅拌，待硫酸铵完全溶解后放入4℃冰箱中静置沉淀4h以上，12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液将其溶解，用相同的缓冲液在4℃下透析20h，期间更换3-4次缓冲液，之后4℃12000r/min离心30min，收集上清液；
(3)将上述上清液上样于AKTA PURIFIER蛋白纯化系统，DEAE-FF阴离子柱预先用20mmol/L、pH为7.0PBS缓冲液平衡好，每次上样20mL，相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，洗去未吸附的蛋白后，用含0.5mol/L的NaCl的上述缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，收集30％洗脱组分；
(4)将上述DEAE-FF阴离子交换后得到的洗脱组分用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液进行透析，之后使用浓缩管浓缩后，上样于预先用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液平衡好的Sephacry S-200凝胶过滤色谱柱上，每次上样5mL，流速为1mL/min，收集洗脱峰，冷冻干燥，即得到藜麦蛋白。
步骤(1)中所述的料液比优选为1：15；所述搅拌浸提时间优选为14.6小时。
所述的植物病菌优选为细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)或茄腐镰刀菌(Fusarium solani)。
与现有技术相比本发明的有益效果：本发明立足于藜麦种子中含丰富的完全蛋白及多种氨基酸，通过柱层析对藜麦种子进行分离纯化，得到新型的具有抗病菌活性的藜麦蛋白。本发明利用简单的分离纯化方法，便于在生产中放大，制备得到的藜麦蛋白对植物病菌特别是细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)和茄腐镰刀菌(Fusarium solani)具有显著的抗菌作用。本发明有助于藜麦资源在农药和医药等领域的开发和应用。
附图说明
图1为DEAE-FF阴离子交换层析洗脱曲线；
图2为纯化分离过程的SDS-PAGE图；其中：1、粗蛋白，2、脱盐后的总蛋白，3、DEAE阴离子柱百分之百梯度洗脱后得到的蛋白样品，4、20％梯度洗脱后得到的蛋白样品，5、30％梯度洗脱后得到的蛋白样品，6、Sephacry S-200柱凝胶层析后得到的蛋白样品；
图3为质谱鉴定结果图；
图4藜麦蛋白氨基酸序列与部分来源不同的植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基氨基酸序列比对；
图5为藜麦蛋白对细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)的抑制结果图；
图6为藜麦蛋白对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)的抑制结果图。
具体实施方式
实施例1
第一步：将藜麦种子粉碎成粉，石油醚脱脂，准确称取30g脱脂藜麦粉，按照料液比1：15溶于20mmol/L pH4.5的乙酸铵-乙酸缓冲液中，在4℃下搅拌浸提14.6h，之后将上述样品12000r/min离心30min，收集上清弃沉淀，即得到藜麦种子蛋白粗提液；
第二步：在粗提液中缓慢加入饱和度80％硫酸铵沉降后，过夜静置，12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀用20mmol/L、pH7.0 PBS缓冲液将其溶解，用相同的缓冲液在4℃下透析20h，期间更换3次缓冲液，之后4℃12000r/min离心30min，收集上清液；
第三步：将上述上清液上样于AKTA PURIFIER蛋白纯化系统，DEAE-FF阴离子柱预先用20mmol/L、pH为7.0PBS缓冲液平衡好，每次上样20mL，相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，洗去未吸附的蛋白(穿透组分A1)后，用含0.5mol/L的NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，在20％梯度洗脱时得到组分A2，在30％梯度洗脱时得到组分A3，分别收集穿透组分A1、洗脱组分A2和A3，如图1所示。
第四步：将上述DEAE-FF阴离子交换后得到的洗脱组分A2和A3分别用与上述透析步骤相同的缓冲液进行透析，之后使用浓缩管将不同的组分浓缩后，将组分A2和A3上样于预先用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液平衡好的Sephacry S-200凝胶过滤色谱柱上，每次上样5mL，流速为1mL/min，收集对应组分，经过SDS-PAGE鉴定组分A3只包含一条蛋白条带，如图2所示，即为所述藜麦抗病菌蛋白。
第五步：将此单一条带对应的蛋白进行质谱鉴定，测定N端肽段序列为：(R.PNGLLLHIHR.A)。其氨基酸序列与部分来源不同的植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基具有一定相似度，分子量为50kDa，如图3,4所示。
第六步：通过滤纸片法检测不同浓度的藜麦抗病菌蛋白对茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)、锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)、头状茎点霉菌(Phoma glomerata)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)等植物病菌的抑制作用。
接种供试真菌于PDA平板上，27℃倒置培养至真菌直径为2㎝左右，用镊子将灭好菌的滤纸片小心摆放在培养基上，在滤纸片上滴加不同稀释浓度20μl样液，样品溶剂作为对照，真菌生长可以观察到抑制生长现象时取出拍照。
图5表示藜麦蛋白对细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)有明显的抑制作用，其中1、2、3、4分别表示将不同浓度(0,5,10,15mg/mL)的藜麦蛋白滴加到滤纸片上，培养两三天后，菌丝能在滤纸片周围继续生长，在培养基上整体为圆形、且边缘整齐。在滤纸片中滴加不同浓度的藜麦蛋白，其溶液渗透到培养基中，从而抑制了附近菌丝的生长，在其周围出现了明显的抑菌圈，如图5中的2、3、4所示。
图6表示藜麦蛋白对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)的抑制作用，其中1、2、3、4分别表示将不同浓度(0,1,2,4mg/mL)藜麦蛋白滴加到滤纸片上，培养后的抑菌结果图，说明较小浓度的藜麦蛋白同样具有抑制植物病菌的作用。

Claims (4)

1.藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，所述藜麦蛋白通过如下步骤及方法制得：
(1)将藜麦种子粉碎并脱脂，称取一定量的脱脂藜麦粉，按照料液比(W/V)1：5-20溶于20mmol/L pH 4.5的乙酸-乙酸铵缓冲液中，在4℃下搅拌浸提10-20小时，之后将上述样品于12000r/min离心30min，收集上清弃沉淀，即得到藜麦种子蛋白粗提液；
(2)将粗提液在4℃条件下缓慢加入一定量的饱和度为80％硫酸铵，边加边搅拌，待硫酸铵完全溶解后放入4℃冰箱中静置沉淀4h以上，12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液将其溶解，用相同的缓冲液在4℃下透析20h，期间更换3-4次缓冲液，之后4℃12000r/min离心30min，收集上清液；
(3)将上述上清液上样于AKTA PURIFIER蛋白纯化系统，DEAE-FF阴离子柱预先用20mmol/L、pH为7.0PBS缓冲液平衡好，每次上样20mL，相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，洗去未吸附的蛋白后，用含0.5mol/L的NaCl的上述缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，收集30％洗脱组分；
(4)将上述DEAE-FF阴离子交换后得到的洗脱组分用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液进行透析，之后使用浓缩管浓缩后，上样于预先用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液平衡好的Sephacry S-200凝胶过滤色谱柱上，每次上样5mL，流速为1mL/min，收集洗脱峰，冷冻干燥，即得到藜麦蛋白。
2.根据权利要求1所述的藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，其特征在于，步骤(1)中所述料液比为1：15。
3.根据权利要求1所述的藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，其特征在于，步骤(1)中所述搅拌浸提时间为14.6小时。
4.根据权利要求1所述的藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，其特征在于，所述的植物病菌为细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)或茄腐镰刀菌(Fusarium solani)。
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