CN112724212B - 藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用 - Google Patents

藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112724212B
CN112724212B CN202011626578.XA CN202011626578A CN112724212B CN 112724212 B CN112724212 B CN 112724212B CN 202011626578 A CN202011626578 A CN 202011626578A CN 112724212 B CN112724212 B CN 112724212B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
quinoa
buffer solution
20mmol
supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011626578.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112724212A (zh
Inventor
李玉英
郭芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi University
Original Assignee
Shanxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi University filed Critical Shanxi University
Priority to CN202011626578.XA priority Critical patent/CN112724212B/zh
Publication of CN112724212A publication Critical patent/CN112724212A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112724212B publication Critical patent/CN112724212B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins

Abstract

本发明提供一种藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，所述藜麦蛋白通过如下步骤方法制得：将藜麦种子粉碎并脱脂，浸提，硫酸铵分级沉淀，再经过DEAE‑FF阴离子交换柱和Sephacry S‑200凝胶柱过滤层析两步色谱分离纯化，获得高纯度的藜麦蛋白，经质谱鉴定其氨基酸序列与部分来源不同的植物1,5‑二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基具有一定相似度。该蛋白具有显著的抑制细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)的作用，对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)也有一定的抑制作用。该抗菌蛋白制备工艺简单，可作为植物抗病菌制剂等，本发明有助于藜麦蛋白资源的开发及在农业等领域的应用。

Description

藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用
技术领域
本发明涉及植物蛋白的制备和应用，具体属于藜麦蛋白的制备及其在抗植物病菌中的应用。
背景技术
藜麦[Chenopodium quinoa willd]，又称南美藜，印第安麦，金谷子。属于藜科藜属植物。原产于南美州安第斯山脉，有着5000-7000年的种植历史。由于其丰富的营养价值，养育着印加人民，古印加人称之为“粮食之母”(mother grain)。藜麦中富含丰富的完全蛋白及多种氨基酸，其中包含人体必需的9种氨基酸，尤其富含植物中缺乏的赖氨酸，这些化学成分与补充营养、增强机体功能、修复体质、提高机体免疫力、预防疾病、抗癌等功能有密切联系。目前大多数研究关注于藜麦多酚、黄酮、皂苷等活性成分，而对其蛋白质方面的研究还很少，尤其是其抗病菌活性方面的研究尚未见报道。
链格孢属(Alternaria Nees)真菌为世界性分布，具有腐生、内生和致病性，能侵染危害多种农作物，可单独致病，也可以与其他病菌一起混合侵染宿主。链格孢属真菌适应环境能力强，可在田间、运输及贮存过程中引发霉变，种级特征变异较大，其致病机理因侵染方式及所处生态环境不同又有差异，导致病害防治非常困难。细极链格孢菌(Alternariatenuissima)是引起农作物尤其是枣黑腐病的主要病原菌之一。茄腐镰刀菌是一类能产生毒素,引起动物和人类中毒、癌变和菌体寄生导致流产、角膜及皮肤溃疡的真菌。
发明内容
本发明的目的在于提供藜麦蛋白的制备方法和在抗植物病菌中的应用。
为实现上述目的，采用的技术方案如下：
本发明提供的藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，所述藜麦蛋白通过如下步骤的方法制得：
(1)将藜麦种子粉碎并脱脂，称取一定量的脱脂藜麦粉，按照料液比(W/V)1：5-20溶于20mmol/L pH 4.5的乙酸-乙酸铵缓冲液中，在4℃下搅拌浸提10-20小时，之后将上述样品于12000r/min离心30min，收集上清弃沉淀，即得到藜麦种子蛋白粗提液；
(2)将粗提液在4℃条件下缓慢加入一定量的饱和度为80％硫酸铵，边加边搅拌，待硫酸铵完全溶解后放入4℃冰箱中静置沉淀4h以上，12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液将其溶解，用相同的缓冲液在4℃下透析20h，期间更换3-4次缓冲液，之后4℃12000r/min离心30min，收集上清液；
(3)将上述上清液上样于AKTA PURIFIER蛋白纯化系统，DEAE-FF阴离子柱预先用20mmol/L、pH为7.0PBS缓冲液平衡好，每次上样20mL，相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，洗去未吸附的蛋白后，用含0.5mol/L的NaCl的上述缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，收集30％洗脱组分；
(4)将上述DEAE-FF阴离子交换后得到的洗脱组分用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液进行透析，之后使用浓缩管浓缩后，上样于预先用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液平衡好的Sephacry S-200凝胶过滤色谱柱上，每次上样5mL，流速为1mL/min，收集洗脱峰，冷冻干燥，即得到藜麦蛋白。
步骤(1)中所述的料液比优选为1：15；所述搅拌浸提时间优选为14.6小时。
所述的植物病菌优选为细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)或茄腐镰刀菌(Fusarium solani)。
与现有技术相比本发明的有益效果：本发明立足于藜麦种子中含丰富的完全蛋白及多种氨基酸，通过柱层析对藜麦种子进行分离纯化，得到新型的具有抗病菌活性的藜麦蛋白。本发明利用简单的分离纯化方法，便于在生产中放大，制备得到的藜麦蛋白对植物病菌特别是细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)和茄腐镰刀菌(Fusarium solani)具有显著的抗菌作用。本发明有助于藜麦资源在农药和医药等领域的开发和应用。
附图说明
图1为DEAE-FF阴离子交换层析洗脱曲线；
图2为纯化分离过程的SDS-PAGE图；其中：1、粗蛋白，2、脱盐后的总蛋白，3、DEAE阴离子柱百分之百梯度洗脱后得到的蛋白样品，4、20％梯度洗脱后得到的蛋白样品，5、30％梯度洗脱后得到的蛋白样品，6、Sephacry S-200柱凝胶层析后得到的蛋白样品；
图3为质谱鉴定结果图；
图4藜麦蛋白氨基酸序列与部分来源不同的植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基氨基酸序列比对；
图5为藜麦蛋白对细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)的抑制结果图；
图6为藜麦蛋白对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)的抑制结果图。
具体实施方式
实施例1
第一步：将藜麦种子粉碎成粉，石油醚脱脂，准确称取30g脱脂藜麦粉，按照料液比1：15溶于20mmol/L pH4.5的乙酸铵-乙酸缓冲液中，在4℃下搅拌浸提14.6h，之后将上述样品12000r/min离心30min，收集上清弃沉淀，即得到藜麦种子蛋白粗提液；
第二步：在粗提液中缓慢加入饱和度80％硫酸铵沉降后，过夜静置，12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀用20mmol/L、pH7.0 PBS缓冲液将其溶解，用相同的缓冲液在4℃下透析20h，期间更换3次缓冲液，之后4℃12000r/min离心30min，收集上清液；
第三步：将上述上清液上样于AKTA PURIFIER蛋白纯化系统，DEAE-FF阴离子柱预先用20mmol/L、pH为7.0PBS缓冲液平衡好，每次上样20mL，相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，洗去未吸附的蛋白(穿透组分A1)后，用含0.5mol/L的NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，在20％梯度洗脱时得到组分A2，在30％梯度洗脱时得到组分A3，分别收集穿透组分A1、洗脱组分A2和A3，如图1所示。
第四步：将上述DEAE-FF阴离子交换后得到的洗脱组分A2和A3分别用与上述透析步骤相同的缓冲液进行透析，之后使用浓缩管将不同的组分浓缩后，将组分A2和A3上样于预先用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液平衡好的Sephacry S-200凝胶过滤色谱柱上，每次上样5mL，流速为1mL/min，收集对应组分，经过SDS-PAGE鉴定组分A3只包含一条蛋白条带，如图2所示，即为所述藜麦抗病菌蛋白。
第五步：将此单一条带对应的蛋白进行质谱鉴定，测定N端肽段序列为：(R.PNGLLLHIHR.A)。其氨基酸序列与部分来源不同的植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基具有一定相似度，分子量为50kDa，如图3,4所示。
第六步：通过滤纸片法检测不同浓度的藜麦抗病菌蛋白对茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)、锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)、头状茎点霉菌(Phoma glomerata)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)等植物病菌的抑制作用。
接种供试真菌于PDA平板上，27℃倒置培养至真菌直径为2㎝左右，用镊子将灭好菌的滤纸片小心摆放在培养基上，在滤纸片上滴加不同稀释浓度20μl样液，样品溶剂作为对照，真菌生长可以观察到抑制生长现象时取出拍照。
图5表示藜麦蛋白对细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)有明显的抑制作用，其中1、2、3、4分别表示将不同浓度(0,5,10,15mg/mL)的藜麦蛋白滴加到滤纸片上，培养两三天后，菌丝能在滤纸片周围继续生长，在培养基上整体为圆形、且边缘整齐。在滤纸片中滴加不同浓度的藜麦蛋白，其溶液渗透到培养基中，从而抑制了附近菌丝的生长，在其周围出现了明显的抑菌圈，如图5中的2、3、4所示。
图6表示藜麦蛋白对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)的抑制作用，其中1、2、3、4分别表示将不同浓度(0,1,2,4mg/mL)藜麦蛋白滴加到滤纸片上，培养后的抑菌结果图，说明较小浓度的藜麦蛋白同样具有抑制植物病菌的作用。

Claims (1)

1.藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用，所述藜麦蛋白通过如下步骤及方法制得：
(1)将藜麦种子粉碎并脱脂，称取一定量的脱脂藜麦粉，按照料液比(W/V)1：15溶于20mmol/L pH 4.5的乙酸-乙酸铵缓冲液中，在4℃下搅拌浸提14.6小时，之后将上述样品于12000r/min离心30min，收集上清弃沉淀，即得到藜麦种子蛋白粗提液；
(2)将粗提液在4℃条件下缓慢加入一定量的饱和度为80％硫酸铵，边加边搅拌，待硫酸铵完全溶解后放入4℃冰箱中静置沉淀4h以上，12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液将其溶解，用相同的缓冲液在4℃下透析20h，期间更换3-4次缓冲液，之后4℃12000r/min离心30min，收集上清液；
(3)将上述上清液上样于AKTA PURIFIER蛋白纯化系统，DEAE-FF阴离子柱预先用20mmol/L、pH为7.0PBS缓冲液平衡好，每次上样20mL，相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，洗去未吸附的蛋白后，用含0.5mol/L的NaCl的上述缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，收集30％洗脱组分；
(4)将上述DEAE-FF阴离子交换后得到的洗脱组分用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液进行透析，之后使用浓缩管浓缩后，上样于预先用20mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液平衡好的Sephacry S-200凝胶过滤色谱柱上，每次上样5mL，流速为1mL/min，收集洗脱峰，冷冻干燥，即得到藜麦蛋白；
所述的植物病菌为细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)或茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)。
CN202011626578.XA 2020-12-30 2020-12-30 藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用 Active CN112724212B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011626578.XA CN112724212B (zh) 2020-12-30 2020-12-30 藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011626578.XA CN112724212B (zh) 2020-12-30 2020-12-30 藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112724212A CN112724212A (zh) 2021-04-30
CN112724212B true CN112724212B (zh) 2022-03-18

Family

ID=75607944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011626578.XA Active CN112724212B (zh) 2020-12-30 2020-12-30 藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112724212B (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1249310A (zh) * 1998-09-28 2000-04-05 周国庆 一种在植物中表达抗微生物的阳离子多肽技术
NZ555039A (en) * 2004-11-12 2009-09-25 Novozymes As Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same
BR112012023037A2 (pt) * 2010-03-12 2015-09-22 Univ Louisiana State peptídios defensivos de plantas.
AU2015257287A1 (en) * 2014-05-04 2016-11-10 Forrest Innovations Ltd. Compositions and methods for reducing pathogen-induced citrus greening
CN110747200A (zh) * 2019-11-12 2020-02-04 成都大学 一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112724212A (zh) 2021-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201321338A (zh) 從植物製造多胺組成物之方法
CN112724212B (zh) 藜麦蛋白在抗植物病菌中的应用
KR20080080127A (ko) 파세러스 불가리스 추출물, 그 용도 및 이를 함유하는배합물
CN113142214B (zh) 甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法
CN110713550B (zh) 一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法
CN113308378B (zh) 高产麦角硫因的灵芝菌株及其应用
CN105713069B (zh) 一种溶杆菌素的纯化方法
CN109468359B (zh) 一种人参皂苷Rk6的制备方法
CN104892730B (zh) 一种带鱼肝脏抗菌肽
CN111533781A (zh) 非特异受体结合型真菌靶向抗菌肽及其制备方法和应用
Porter et al. The nutrition of Staphylococcus aureus: The influence of biotin, bios IIB and vitamin H on the growth of several strains
Prentice et al. Emetic material associated with Fusarium species in cereal grains and artificial media
RU2621860C1 (ru) Ингибитор вируса табачной мозаики и способ его получения
CN114426955B (zh) 抗虫蛋白Cry 3Bb杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用
CN111748024A (zh) 美洲大蠊多肽的制备方法
CN110698548B (zh) 一种蛹虫草活性蛋白CMPr及其制备方法与应用
CN101781364A (zh) 一种白细胞介素-1受体拮抗剂
CN112159782B (zh) 一种产几丁质酶的枯草芽孢杆菌菌株sh21、生产几丁质酶的方法、微生物制剂及应用
CN110590918B (zh) 一种用于哈维氏弧菌群体感应的抑制肽及其制备方法和应用
CN110100945B (zh) 一种汉麻降血脂肽组合物及其应用
CN114031498A (zh) 膜分离法提取高纯度金银花绿原酸的方法
CN109321555B (zh) 一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用
JPH0544480B2 (zh)
CN110938582A (zh) 一种可提高细胞增殖活性的培养基及其制备方法
CN109852653A (zh) 重组尘螨II型变应原Der p2和Der f2蛋白的制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant