CN110747200A - 一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法 - Google Patents

一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法，该核苷酸序列为如SED ID NO.5所示，本发明通过原核表达体系表达藜麦抑制白色念珠菌蛋白，表达方法包含：(1)将全基因合成的菌种进行扩大培养，提取质粒，以该质粒为模板，采用PCR扩增引物，进行PCR扩增；(2)将目的片段回收，与PET‑30a+载体进行连接，之后进行测序分析；(3)将目的片段与表达载体连接之后转化大肠杆菌；(4)对目标菌种进行扩大培养，加入IPTG诱导蛋白表达，得到表达蛋白完成的菌液。该方法为藜麦抗白色念珠菌蛋白的大规模生产提供一种更为良好的实际应用途径。

Description

一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法
技术领域
本发明涉及一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列，具体涉及一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法。
背景技术
白色念珠菌(Candida albicans)为泌尿系统感染的主要元凶，目前主要的治疗手段是达克宁栓和克霉挫栓剂，但是往往治疗效果不好，引起反复。更严重者需要口服伊曲康唑或者氟康唑等抗真菌药物。然而，口服对肝脏有严重损伤并且真菌容易产生耐药性，这也是临床上病情反复的原因之一。
抑制白色念珠菌蛋白是一类病程相关蛋白，主要来源于作物。目前有研究表明，在富含淀粉的籽粒中通常含有对白色念珠菌具有强烈的抑制作用的蛋白。而这一类型蛋白对白色念珠菌的作用属于物理渗透性，即在适合的条件下依靠物理作用造成白色念珠菌内容物泄露而死亡，因此不会产生耐药性。
该蛋白对白色念珠菌的作用仅在玉米上有过报道，而在藜麦中尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法，通过构建表达藜麦抑制白色念珠菌蛋白的原核表达体系，为藜麦抑制白色念珠菌蛋白的大规模生产提供一种更为良好的实际应用途径。
为了达到上述目的，本发明提供了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的PCR扩增引物，该PCR扩增引物，其上游引物为如SED ID NO.1所示的核苷酸序列，其下游引物为SEDID NO.2所示的核苷酸序列；或其上游引物为如SED ID NO.3所示的核苷酸序列，其下游引物为SED ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列，该核苷酸序列为如SED ID NO.5所示。
本发明还提供了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因编码的氨基酸序列，该氨基酸序列为如SED ID NO.7所示。
本发明还提供了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因载体的构建方法，该方法包含：
(1)将核苷酸序列为如SED ID NO.5所示的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因和载体进行连接反应；
(2)将步骤(1)得到的连接产物转化到CaCl2感受态细胞中，在转化后CaCl2感受态细胞中加入预热的LB液体培养基，混匀，于恒温摇床上震荡培养；
(3)将步骤(2)得到的重组菌种涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的IPTG/X-gal平板上，于恒温过夜培养，若蓝斑不明显将平板于4℃冻存；
(4)在ITPG/X-gal平板上挑选白色单菌落，将其置于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在温度为37℃条件下振荡培养，获得含有藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的载体菌种。
本发明还提供了一种含有所述的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列的克隆载体。
优选地，该克隆载体为pET-30a+。
本发明还提供了一种原核生物中表达的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因核苷酸序列，该核苷酸序列为如SED ID NO.6所示。
本发明还提供了一种原核生物中表达的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的PCR扩增引物，该PCR扩增引物，其上游引物为如SED ID NO.8所示的核苷酸序列，其下游引物为SEDID NO.9所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种原核表达体系表达藜麦抑制白色念珠菌蛋白的方法，该方法包含：
(1)将全基因合成的菌种进行扩大培养，提取质粒，该质粒的基因序列如SED IDNO.10所示，以该质粒为模板，采用如权利要求8中所述的PCR扩增引物，进行PCR扩增；
(2)将目的片段回收，与PET-30a+载体进行连接；
(3)将目的片段与表达载体连接之后转化大肠杆菌；
(4)对目标菌种进行扩大培养：在卡那霉素终浓度为50mg/L的LB液体培养基中过夜饱和培养，然后将菌液于加入卡那霉素浓度为50mg/L的LB液体培养基中37℃振荡培养3h，使OD600达到0.4～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导蛋白表达，继续恒温振荡培养，待菌液浑浊，得到表达蛋白完成的菌液。
本发明还提供了一种含有如SED ID NO.6所示核苷酸序列的菌种。
本发明的藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法，具有以下优点：
本发明通过设计藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因扩增的引物，成功通过RT-PCR得到抑制白色念珠菌蛋白基因片段，基于pBLUE-T构建克隆载体、pET-30a+构建表达载体，转入BL21(DE3)菌株中诱导表达出藜麦抑制白色念珠菌蛋白，操作简单，培养成本较低，适合工业上大规模应用，让藜麦的优质资源得到广泛开发运用。
附图说明
图1为抑制白色念珠菌蛋白基因PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图。
图2为回收的目的基因鉴定电泳图。
图3为对白色菌落提取的质粒鉴定电泳图。
图4为挑选的单菌落的电泳图。
图5为SDS-PAGE蛋白电泳的结果图。
图6为构建的质粒图谱。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明设计了合成藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因(抑制白色念珠菌蛋白基因)的引物，设计的两对引物如下：
引物1的上游引物(F1)的核苷酸序列为：
TGCTCTAGACATCATGATCCCCTTGAA(SED ID NO.1)；
引物1的下游引物(R1)的核苷酸序列为：
CGCGGATCCTAGTTTGAATCAAGGACA(SED ID NO.2)；
引物2的上游引物(F2)的核苷酸序列为：
TGCTCTAGACATCATGATCCCCTCGAA(SED ID NO.3)；
引物2的下游引物(R2)的核苷酸序列为：
CGCGGATCCTAGCTTGAATCAAGGACA(SED ID NO.4)。
上述序列中，横线部分为限制性内切酶切割位点，限制性内切酶为BamHI和XbaI，BamHI的切割位点为g|gatcc，XbaI的切割位点为t|ctaga。
实验例1RT-PCR法克隆藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因
(1)RNA抽提
使用Total RNA Isolation Regeant试剂盒(biosharp公司)进行藜麦中总RNA提取：用剪刀剪取发芽一周的藜麦幼苗100mg，用液氮预冷后置于研钵中，加入液氮迅速研磨3～4次至呈粉末状，放入预先加入1mL TRI试剂(RNA提取试剂)的离心管中，室温静置5min。加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min后，放入预冷4℃的高速冷冻离心机中12000rpm离心15min。
吸取500μL上清液转入新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻上下颠倒，室温放置10min后，在预冷4℃的高速冷冻离心机中12000rpm离心10min，弃去上清液。
加入1mL 75％乙醇(采用DEPC水配制)后摇匀，在预冷4℃的高速冷冻离心机中7500rpm离心5min，弃去上清，再7500rpm离心1s甩一下，吸尽液体。在超净台中吹干沉淀，加入20μL DEPC水溶解，超低温冰箱-70℃保存备用。
(2)反转录反应
首先取灭菌的0.5μL微量离心管，加入11μL提取的藜麦总RNA，然后加入10μMOligo(dT)12-181μL，混匀后离心。70℃加热10min，立即将离心管插入冰盒中冰浴1min，然后加入混合好的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNASynthesis试剂盒(购自GIBICOL公司)混合物，混合物成分如表1所示。
表1 试剂盒混合物
轻轻混匀SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNASynthesis试剂盒(购自GIBICOL公司)，离心。在PCR仪中42℃条件下孵育2～5min。
加入Superscript Ⅱ试剂(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)1μL，42℃恒温水浴锅中水浴孵育50min，然后再在水浴中70℃加热15min至终止反应。最后，将管插入冰盒中冰浴，然后加入RNase H试剂(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)1μL，37℃保温20min，以使降解残留的RNA，最后置于冰箱-20℃保存。
(3)目的基因PCR
以反转录得到的cDNA为模板，使用设计好的两对特异性引物分别进行PCR扩增。在离心管中配置100μL反应体系，如下表2所示，为PCR反应体系。
表2 PCR反应体系(25μL)
Figure BDA0002270232060000052
按照下列程序进行PCR扩增，如下表3：
表3 PCR扩增程序
Figure BDA0002270232060000053
Figure BDA0002270232060000061
实验例2琼脂糖凝胶电泳检测
(1)首先配制1L 50×TAE缓冲液，50×TAE缓冲液包含：242g Tris、37g Na2EDTA·2H2O、57.1mL醋酸，从中取20mL母液加入980mL去离子水稀释成1L 1×TAE缓冲液工作液，在电泳槽中加入适宜量的1×TAE缓冲液工作液；
(2)润洗制胶槽、梳子，并以100mL 1×TAE缓冲液溶配制1％琼脂糖溶液，微波炉高火加热1min，冷却至60～70℃时加入5μL EB溶液，摇匀，制胶槽中制胶；
(3)等胶在制胶槽中完全凝固后，轻轻拔出梳子，将胶缓缓放入电泳槽中，保证1×TAE缓冲液能够没过琼脂糖凝胶，最后确保加样孔端位于负极一侧；
(4)将PCR扩增后得到的DNA样品用移液枪吸取后，小心地加到琼脂糖凝胶的加样孔中，另取5μL 2000DNA Marker也加入加样孔做为参比对照，从而能够确定DNA的大小；
(5)接通电泳仪电源，将电压设置为100V，恒压电泳，待溴酚蓝带迁移到胶长的1/2时，停止电泳，取出凝胶，将胶转移到凝胶成像系统中，于紫外灯下镜检摄像。
如图1所示，为抑制白色念珠菌蛋白基因PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图，PCR扩增得到的DNA的长度为750bp左右。图中A和B为引物1的PCR产物，C和D为引物2的PCR产物。从下图可以清晰地发现，两组引物都能扩增出片段，且以F2/R2为引物的明显条带要明亮一点，根据和Marker的对比结果，序列大小大约为750bp，与目的基因大小相似。
实验例3目的基因回收
(1)把琼脂糖凝胶上的目的DNA条带在蓝光切胶仪下小心地切下，然后放入干净的离心管中，并称取质量；
(2)在离心管中加入胶块中2倍体积的溶胶液，在55℃下进行10min水浴，期间尽量要不断地翻转离心管，使得保胶块能够被充分溶解；
(3)用移液枪将(2)中所得溶液转入吸附柱中，再将吸附柱置于收集管中，在12,000rpm转速下离心1min，离心完毕后，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；
(4)向吸附柱中加入600μL事先加入无水酒精的漂洗液W2(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)，12000rpm离心1min，倒掉收集管废液，重复操作，只是改为加入500μL漂洗液W2，然后空离2min，转速与之前的相同；
(5)置于室温片刻，将吸附柱放入已灭菌的离心管中，悬空滴加50μL的TE洗脱缓冲液，放置1分钟后12000rpm离心1min，收集纯化后的DNA溶液，得到目的片段。
与实验例2电泳鉴定步骤类似，不过在加样时需将样品在封口膜上与5×LoadingBuffer混合至1×，避免DNA在缓冲溶液中漂浮而无法进入加样孔，同时以Loading Buffer中的溴酚蓝来判断电泳进度，结果表明除了第一条带略暗，其余的条带均较为明亮，证明DNA回收效果较好，如图2所示，图中A和B为引物1的PCR产物，C和D为引物2的PCR产物。
实验例4藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因克隆载体的构建
(1)连接反应
使用pBLUE-T载体试剂盒(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)对实验例3回收得到的目的片段进行连接反应，连接反应体系如下表4。
表4 连接反应体系
Figure BDA0002270232060000071
具体步骤为：将上述表3中试剂全部加入完成后，用移液枪反复吹打液体使其充分混匀，然后进行低速离心收集所有在离心管底部的液体。在25℃室温下进行5～10min的连接反应，连接后的产物储存于-20℃冰箱中。
(2)感受态细胞制备
上述感受态细胞的制备方法为：
首先，配制LB培养基100mL和50mM CaCl2溶液50mL，并将各种器具，培养基等在高压蒸汽灭菌锅中灭菌完成；
然后，预先以LB培养基隔夜培养菌种(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，JM-109)于恒温摇床中37℃中，使菌液饱和，取50μL菌液转入5mL培养基中，置于气浴摇床中37℃震荡培养2.5h，使之OD600达到0.4；
最后，取1mL培养液，放入冰浴中冷冻20min让其停止生长，在4℃4000rpm条件下离心5min，弃上清，加入0.5mL预先冷却的50mM氯化钙溶液并混匀，并于冰盒中冰面上放置30min，使细胞膜通透性充分提高，再于4℃4000rpm离心5min，弃上清，加入100μL预冷的50mM氯化钙溶液混匀，液氮冷冻，放入超低温冰箱-70℃保存。
(3)连接子转化
将预先配制好LB液体培养基，灭菌后放入37℃水浴中备用。从超低温冰箱中取出先前已处理好的感受态细胞并编号，室温下稍微解冻，依次加入步骤(1)的连接产物10μL，轻轻用枪吹打匀，放置于冰浴上30min。然后在42℃水浴中热激90s后，立刻置于碎冰表面5min，等待转化完成。
向感受态细胞中加入1mL预先加热至37℃的LB液体培养基，混匀后将EP管置于37℃气浴恒温摇床上震荡(频率160)培养1h，使其表达出足够量的蛋白，以便在含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上生长菌落。
在IPTG/X-gal平板中格外加入了Amp(氨苄青霉素)，使未转入pBLUE-T载体的菌株无法生长。
(4)蓝白斑筛选
IPTG/X-gal平板的制备：
预先在无菌条件下配制好24mg/mL IPTG水溶液(100mM)、20mg/mL X-gal二甲基甲酰胺溶液、100mg/mL Amp溶液。然后配制LB固体培养基，与培养皿及相关器具一起灭菌。
待固体培养基冷却至50～60℃时按每100mL培养基加入100μL IPTG母液、200μLX-gal溶液和100μL Amp溶液。混匀后倒入培养皿中，室温放置一段时间，待冷凝后翻转培养皿，备用。
蓝白斑筛选，具体如下：
将步骤(3)得到的重组菌种涂布于该IPTG/X-gal平板上，于恒温生化培养箱中37℃过夜培养。观察培养结果，蓝斑不明显可将平板放入冰箱4℃冻存数小时。
用灭菌后的牙签在ITPG/X-gal平板上挑选白色单菌落或者淡蓝色单菌落，将其置于5mL含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在温度为37℃条件下振荡培养一夜，获得筛选后的重组子。
pBLUE-T载体中存在LacZ基因，该基因产物能够编码产生β-半乳糖苷酶a-片段的活性。但是，当外源DNA插入pBLUE-T载体时，会将LacZ基因的编码序列改变，使原有的β-半乳糖苷酶a-片段的活性丧失。因此，在X-gal/ITPG平板上，重组体与非重组体菌落将会有肉眼可见的不同。在此时，重组体菌落将呈现为白色，而非重组体菌落将为蓝色。有的时候插入片段太小，或插入片段没有影响LacZ基因读码框，这种情况下菌落(重组克隆)呈现淡蓝色或者在菌落中心呈现淡蓝斑点。
实验例6质粒鉴定
(1)质粒提取
对蓝白斑筛选获到的单菌落进行提取质粒，质粒提取采用质粒小量提取试剂盒(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)，按照试剂盒说明书进行质粒提取：
在使用前，首先按量向试剂盒中的漂洗液W2加入无水乙醇并混匀，隔夜培养经蓝白斑筛选获到的菌体。取2mL菌液在12000rpm离心1min，吸去上清，加入250μL溶液1(溶液1组分为：25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，50mM葡糖糖，RNaseA)并重悬菌体。加入250μL溶液2(溶液2组分为：250mM NaOH，1％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠))，翻转6～8次，使菌体裂解但不至于让DNA断裂。加入350μL溶液3(溶液3组分为：3M醋酸钾，5M醋酸)，温和翻转6～8次，出现白色絮状物。
12000rpm离心10min后，将上清液用移液器转移至套上收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉废液。加入700μL漂洗液W2，12000rpm离心1min并倒掉废液。重复操作，只不过漂洗液W2的量改为500μL。然后12000rpm空离2min，室温放置片刻，使酒精挥发。然后将吸附柱放入干净的离心管，加入80μL洗脱液，放置3min，12000rpm离心1min，收集到质粒溶液。
(2)质粒PCR鉴定
以提取的质粒为模板，以引物1和引物2对其进行PCR扩增，PCR扩增程序同表3，质粒PCR反应体系如下表5所示：
表5 质粒PCR反应体系
Figure BDA0002270232060000101
对挑取的白色菌落扩大培养后提取的质粒重新进行PCR的电泳鉴定，结果如图3所示(A-E为五个同样样品，为重复)，表明目的片段已经成功转入菌株内，并在菌体内部进行了正常质粒克隆。
对经质粒PCR验证的菌液进行保菌操作，按照每7∶3的比例加入甘油，混匀，冰箱-16℃保存，进行测序，得到目的基因的确切碱基序列。
由引物2扩增得到的DNA序列(SED ID NO.5)为：
GCCACCTTTACAGTAACAAACAACTGCCCTTACACTATTTGGGCCGGCGCAGTACCCGGTGGTGGCAAACGTATGAATACCGGTGACACATGGACTGTCACCGCCAACCCTGGCCAGACCGGTGGCCGAATTTGGCCCCGCACTGGGTGCACACCTAGTGGGGCCAATGGGCTCAAGTGCATCACAGGAGACTGTGGTGGGGTACTCCAATGCACAGCTTATGGTACACCCCCTAACACCTTAGCTGAATATGGCTTAAAACAATTTAACAACTTGGATTTCTTTGACATTTCCTTGGTTGATGGGTTCAATGTACCCATGAGTTTTTTGCCCGTAAATGGTTGTAGCAAAGGACCCACTTGCAAGGGTGACCTTATCGGCCCGTGCCCTGCTCACCTTAAGGCCCCGGGTGGATGCAACAACCCGTGCACTGCGCTCAAAGATGATAAATATTGTTGCATAAATAGTTTCAAGGATAATTGCCCTGCAACTGATTTATCTAGGTATTTTAAGGGTAAGTGCCCAGATGCTTACAGTTATCCTAAGGACGATGCTACTAGCACTTATACTTGCCCTTCTGGTACTAATTACAGGGTTACATTTTGTCCTTGA
不同生物体内tRNA上具有细微的差别，导致其对不同的密码子有着不同的亲和性。由于密码子的简并性，本发明对真核生物的cDNA序列中的密码子进行个别碱基替换，使其更适合于原核生物的蛋白表达过程。密码子的偏好性是影响蛋白表达效率的重要参数之一，基因的表达水平与密码子偏好性之间存在强相关性。因此，进行密码子优化，使之更符合大肠杆菌原核表达系统的密码子偏好性，从而优化蛋白表达。
优化后的DNA序列(SED ID NO.6)为：
GCAACATTTACCGTAACCAATAATTGTCCGTATACCATTTGGGCAGGTGCAGTACCGGGTGGTGGTAAACGTATGAATACCGGAGATACCTGGACCGTTACCGCAAATCCGGGTCAAACCGGCGGTCGCATTTGGCCGCGTACCGGTTGCACCCCTAGCGGTGCGAATGGGCTGAAATGTATTACCGGTGATTGTGGCGGGGTGCTGCAGTGTACCGCATACGGTACCCCGCCTAATACACTGGCAGAGTATGGTCTGAAACAGTTTAATAACCTGGATTTTTTCGACATTAGCCTGGTGGACGGTTTTAATGTTCCGATGTCTTTTCTGCCGGTTAACGGTTGCTCTAAAGGTCCAACTTGTAAAGGTGATCTGATCGGTCCGTGTCCGGCACATCTGAAAGCACCGGGAGGTTGTAATAATCCGTGTACCGCACTGAAAGATGATAAATATTGTTGTATCAACAGCTTCAAAGACAATTGCCCGGCAACCGACCTGTCACGCTACTTTAAAGGTAAATGTCCTGATGCATATAGCTATCCTAAAGACGATGCAACCAGCACCTACACCTGTCCGAGCGGAACCAACTACCGTGTGACCTTTTGTCCGTAA
原始序列翻译的蛋白序列(SED ID NO.7)为：
ATFTVTNNCPYTIWAGAVPGGGKRMNTGDTWTVTANPGQTGGRIWPRTGCTPSGANGLKCITGDCGGVLQCTAYGTPPNTLAEYGLKQFNNLDFFDISLVDGFNVPMSFLPVNGCSKGPTCKGDLIGPCPAHLKAPGGCNNPCTALKDDKYCCINSFKDNCPATDLSRYFKGKCPDAYSYPKDDATSTYTCPSGTNYRVTFCP*
优化后的蛋白序列与原始序列翻译的蛋白序列相同。
实验例7 原核表达体系的构建
以PET-30a+质粒为基础，将所要表达的目的基因序列进行DNA合成，然后与表达载体进行连接，构成一个完成的重组质粒。对全基因合成的菌种进行扩大培养，然后使用质粒小量提取试剂盒(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)提取质粒，如图6所示，为该质粒的质粒图谱，构建成功的完整表达载体的基因序列如SED ID NO.10所示，以该质粒为模板(Y0012443-1)进行PCR扩增，反应体系见下表6(模板Y0012443-1含有卡那霉素抗性基因)，扩增反应程序见表7，引物为QAmIf(5’-GGGAATTCCATATGCACCATC)(SED ID NO.8)和QAmIr(3’-GGAATTCGGATCCGATATC)(SED ID NO.9)，并进行琼脂糖凝胶电泳，于-20℃冰箱冻存。
表6 聚合酶链式反应体系
Figure BDA0002270232060000121
表7 扩增反应程序
Figure BDA0002270232060000122
采用CaCl2法，制备BL21菌株感受态细胞，操作过程与实验例4中感受态细胞制备相似，然后进行转化操作，过程与实验例4中连接子转化类似，得到含有克隆载体的BL21菌种。
预先称取50mg卡那霉素粉末，加入1mL DEPC处理水，无菌条件下混匀配制成卡那霉素母液备用。然后配制200mL LB固体培养基，待其灭菌后冷却至50℃，加入200mL刚才配制完成的的卡那霉素(Kan)母液混匀，在超净台中倒平板并标号，紫外灯照射半个小时。待平板冷却凝固后，按编号分别倒入转化完成的BL21菌液600μL，转动培养皿，让菌液充分覆盖于培养基表面。室温放置至平板表面略微干燥，倒置放于37℃隔水式恒温培养箱中培养8小时，观察单菌落的形成。
然后对菌种进行菌落PCR鉴定，在PCR小管中加入10μL ddH2O，挑取单菌落于其中，做好标号。100℃水浴5min，以此为模板进行PCR扩增，扩增反应程序同表7，扩增体系见下表8，按目的基因的PCR条件加入引物QAmIf、QAmIr和5×PCR Mix，进行PCR扩增反应。
表8 PCR反应体系
完成后进行电泳，观察其在凝胶成像系统下的图像。如图4所示，为挑选的单菌落的电泳图，图中A～H分别为8个随机挑选的单菌落，图中每个菌落均出现条带。
实验例8抑制白色念珠菌蛋白基因的原核表达及鉴定
对表达菌株进行扩大培养，在Kan终浓度为50mg/L的LB液体培养基中过夜饱和培养。然后取1mL菌液于100mL加入Kan浓度为50mg/L的LB液体培养基中37℃振荡培养3h，使OD600达到0.4～0.8h，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达，继续在气浴恒温振荡器中培养4h，待菌液浑浊，得到表达蛋白完成的菌液。
取200μL菌液，以12000rpm离心1min，吸去上清液，加入50μL2×SDS-PAGE loadingbuffer，混匀后在沸水浴中煮15min，使菌体被破坏，蛋白质从菌体内裂解出来。
然后进行SDS-PAGE蛋白电泳，配制1L 10×电泳缓冲液(含有：Tris30.2g、甘氨酸144.1g、SDS 10g)，并取100mL稀释至1×。
使用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒按照表9配制分离胶，注意最后加入PAGE促凝剂。混合完成后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，加至距梳齿1cm处。然后小心加上一层超纯水覆盖凝胶表面。等待聚合完成，尽量倒掉表面液体。
按照表10配制浓缩胶，也是最后加入PAGE促凝剂，在加入后立即将浓缩胶注入玻璃板中间，插入梳子。将凝胶放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，浓缩胶聚合完成后，轻轻拔出梳子，用移液枪将样依次加入加样孔中，并另加10μL蛋白buffer作为参比。
打开电泳仪首先使用60V恒压，待染料条带进入分界面，加电压至80V继续恒压电泳至染料条带到达底部结束。
表9 为12％分离胶配制(总体积10mL)
Figure BDA0002270232060000141
表10 为5％浓缩胶配制(总体积5mL)
Figure BDA0002270232060000142
取出凝胶块，使用考马斯亮蓝快染液覆盖胶块进行染色，先置于微波炉中加热几秒，然后放置过夜，第二天观察结果。
如图5所示，为SDS-PAGE蛋白电泳的结果图，在图中出现20kDa条带上方处出现明显蛋白条带，根据之前的计算，藜麦抑制白色念珠菌蛋白分子量为21.48kDa，其为本大肠杆菌表达体系表达出的目标蛋白藜麦抑制白色念珠菌蛋白。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 成都大学
<120> 一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列及引物和方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgctctagac atcatgatcc ccttgaa 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgcggatcct agtttgaatc aaggaca 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgctctagac atcatgatcc cctcgaa 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cgcggatcct agcttgaatc aaggaca 27
<210> 5
<211> 994
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gactcactat agggcgaatt gggtaccggg gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa 60
gcttgatatc gaattcccaa tacttgctct agacatcatg atcccctcga aatcactctc 120
cattttctgc gtcttcatag tccttgtttc ccttatctcc acatccaccc atgcagccac 180
ctttacagta acaaacaact gcccttacac tatttgggcc ggcgcagtac ccggtggtgg 240
caaacgtatg aataccggtg acacatggac tgtcaccgcc aaccctggcc agaccggtgg 300
ccgaatttgg ccccgcactg ggtgcacacc tagtggggcc aatgggctca agtgcatcac 360
aggagactgt ggtggggtac tccaatgcac agcttatggt acacccccta acaccttagc 420
tgaatatggc ttaaaacaat ttaacaactt ggatttcttt gacatttcct tggttgatgg 480
gttcaatgta cccatgagtt ttttgcccgt aaatggttgt agcaaaggac ccacttgcaa 540
gggtgacctt atcggcccgt gccctgctca ccttaaggcc ccgggtggat gcaacaaccc 600
gtgcactgcg ctcaaagatg ataaatattg ttgcataaat agtttcaagg ataattgccc 660
tgcaactgat ttatctaggt attttaaggg taagtgccca gatgcttaca gttatcctaa 720
ggacgatgct actagcactt atacttgccc ttctggtact aattacaggg ttacattttg 780
tccttgattc aagctaggat ccgcgagtat tgggaattcc tgcagcccgg gggatccact 840
agttctagag cggccgccac cgcggtggag ctccagcttt tgttcccttt agtgagggtt 900
aattgcgcgc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gggggaaatt gttatccgct 960
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cata 994
<210> 6
<211> 612
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gcaacattta ccgtaaccaa taattgtccg tataccattt gggcaggtgc agtaccgggt 60
ggtggtaaac gtatgaatac cggagatacc tggaccgtta ccgcaaatcc gggtcaaacc 120
ggcggtcgca tttggccgcg taccggttgc acccctagcg gtgcgaatgg gctgaaatgt 180
attaccggtg attgtggcgg ggtgctgcag tgtaccgcat acggtacccc gcctaataca 240
ctggcagagt atggtctgaa acagtttaat aacctggatt ttttcgacat tagcctggtg 300
gacggtttta atgttccgat gtcttttctg ccggttaacg gttgctctaa aggtccaact 360
tgtaaaggtg atctgatcgg tccgtgtccg gcacatctga aagcaccggg aggttgtaat 420
aatccgtgta ccgcactgaa agatgataaa tattgttgta tcaacagctt caaagacaat 480
tgcccggcaa ccgacctgtc acgctacttt aaaggtaaat gtcctgatgc atatagctat 540
cctaaagacg atgcaaccag cacctacacc tgtccgagcg gaaccaacta ccgtgtgacc 600
ttttgtccgt aa 612
<210> 7
<211> 203
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Ala Thr Phe Thr Val Thr Asn Asn Cys Pro Tyr Thr Ile Trp Ala Gly
1 5 10 15
Ala Val Pro Gly Gly Gly Lys Arg Met Asn Thr Gly Asp Thr Trp Thr
20 25 30
Val Thr Ala Asn Pro Gly Gln Thr Gly Gly Arg Ile Trp Pro Arg Thr
35 40 45
Gly Cys Thr Pro Ser Gly Ala Asn Gly Leu Lys Cys Ile Thr Gly Asp
50 55 60
Cys Gly Gly Val Leu Gln Cys Thr Ala Tyr Gly Thr Pro Pro Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Lys Gln Phe Asn Asn Leu Asp Phe Phe Asp
85 90 95
Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Val Pro Met Ser Phe Leu Pro Val
100 105 110
Asn Gly Cys Ser Lys Gly Pro Thr Cys Lys Gly Asp Leu Ile Gly Pro
115 120 125
Cys Pro Ala His Leu Lys Ala Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys Thr
130 135 140
Ala Leu Lys Asp Asp Lys Tyr Cys Cys Ile Asn Ser Phe Lys Asp Asn
145 150 155 160
Cys Pro Ala Thr Asp Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Gly Lys Cys Pro Asp
165 170 175
Ala Tyr Ser Tyr Pro Lys Asp Asp Ala Thr Ser Thr Tyr Thr Cys Pro
180 185 190
Ser Gly Thr Asn Tyr Arg Val Thr Phe Cys Pro
195 200
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gggaattcca tatgcaccat c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggaattcgga tccgatatc 19
<210> 10
<211> 771
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
catatgcacc atcatcatca tcattcttct ggtgcaacat ttaccgtaac caataattgt 60
ccgtatacca tttgggcagg tgcagtaccg ggtggtggta aacgtatgaa taccggagat 120
acctggaccg ttaccgcaaa tccgggtcaa accggcggtc gcatttggcc gcgtaccggt 180
tgcaccccta gcggtgcgaa tgggctgaaa tgtattaccg gtgattgtgg cggggtgctg 240
cagtgtaccg catacggtac cccgcctaat acactggcag agtatggtct gaaacagttt 300
aataacctgg attttttcga cattagcctg gtggacggtt ttaatgttcc gatgtctttt 360
ctgccggtta acggttgctc taaaggtcca acttgtaaag gtgatctgat cggtccgtgt 420
ccggcacatc tgaaagcacc gggaggttgt aataatccgt gtaccgcact gaaagatgat 480
aaatattgtt gtatcaacag cttcaaagac aattgcccgg caaccgacct gtcacgctac 540
tttaaaggta aatgtcctga tgcatatagc tatcctaaag acgatgcaac cagcacctac 600
acctgtccga gcggaaccaa ctaccgtgtg accttttgtc cgtaactggt gccacgcggt 660
tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat 720
ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg gctgatatcg gatccgaatt c 771

Claims (10)

1.一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的PCR扩增引物，其特征在于，该PCR扩增引物，其上游引物为如SED ID NO.1所示的核苷酸序列，其下游引物为SED ID NO.2所示的核苷酸序列；或其上游引物为如SED ID NO.3所示的核苷酸序列，其下游引物为SED ID NO.4所示的核苷酸序列。
2.一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列为如SED ID NO.5所示。
3.一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因编码的氨基酸序列，其特征在于，该氨基酸序列为如SED ID NO.7所示。
4.一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因载体的构建方法，其特征在于，该方法包含：
(1)将核苷酸序列为如SED ID NO.5所示的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因和载体进行连接反应；
(2)将步骤(1)得到的连接产物转化到CaCl2感受态细胞中，在转化后CaCl2感受态细胞中加入预热的LB液体培养基，混匀，于恒温摇床上震荡培养；
(3)将步骤(2)得到的重组菌种涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的IPTG/X-gal平板上，于恒温过夜培养，若蓝斑不明显将平板于4℃冻存；
(4)在ITPG/X-gal平板上挑选白色单菌落，将其置于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在温度为37℃条件下振荡培养，获得含有藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的载体菌种。
5.一种含有如权利要求2所述的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列的克隆载体。
6.根据权利要求5所述的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列的克隆载体，其特征在于，该克隆载体为pET-30a+。
7.一种原核生物中表达的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列为如SED ID NO.6所示。
8.一种原核生物中表达的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的PCR扩增引物，其特征在于，该PCR扩增引物，其上游引物为如SED ID NO.8所示的核苷酸序列，其下游引物为SED IDNO.9所示的核苷酸序列。
9.一种原核表达体系表达藜麦抑制白色念珠菌蛋白的方法，其特征在于，该方法包含：
(1)将全基因合成的菌种进行扩大培养，提取质粒，该质粒的基因序列如SED ID NO.10所示，以该质粒为模板，采用如权利要求8中所述的PCR扩增引物，进行PCR扩增；
(2)将目的片段回收，与PET-30a+载体进行连接；
(3)将目的片段与表达载体连接之后转化大肠杆菌；
(4)对目标菌种进行扩大培养：在卡那霉素终浓度为50mg/L的LB液体培养基中过夜饱和培养，然后将菌液于加入卡那霉素浓度为50mg/L的LB液体培养基中37℃振荡培养3h，使OD600达到0.4～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导蛋白表达，继续恒温振荡培养，待菌液浑浊，得到表达蛋白完成的菌液。
10.一种含有如SED ID NO.6所示核苷酸序列的菌种。
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