CN1468963A - 表达Harpin蛋白的大肠杆菌基因工程菌株构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过基因工程手段构建的工程菌株CCTCC M202026 E.Coli BL21(pETHa)、工程菌株的构建方法和用途。该菌株是将人工分段合成连接的Harpin基因与pET表达载体连接，构成含harpin基因的表达载体，转化至E.Coli BL21菌体所得。该菌株可以在IPTG的诱导下表达Harpin基因工程蛋白，用该蛋白研究研制出安康肽植物抗菌抑菌剂，用于植物细菌、真菌、病毒、线虫等病虫害的防治，并可促进植物的生长发育。

Description

表达Harpin蛋白的大肠杆菌基因工程菌株构建及其应用

本发明涉及在原核生物中表达Harpin蛋白，含有Harpin蛋白基因的载体，用这种载体转化的原核生物(优选大肠杆菌)，在大肠杆菌中产生Harpin蛋白的方法，以及这种蛋白质作为植物抗菌抑菌剂在农业生产中的应用。

Harpin蛋白是引起苹果、梨子等玫瑰香植物火烧病的病原菌Erwiniaamylovora hrp基因簇编码的一种蛋白。它是细菌对寄主植物致病性必须的一种蛋白，但对非寄主植物，它可引起植物的超敏感反应(Hypersensitive response)，其表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡，这就限制病原菌进一步扩散的可能性。超敏感反应是植物自身具有的一种保护反应，类似与高等植物所具有的广谱抗病菌虫害的免疫反应。Harpin蛋白本身对细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫无杀灭或抑制作用，而是通过与植物受体结合后产生某种信号，刺激或诱导植物自身的免疫机制来保护植物。因此用Harpin蛋白作为抗菌抑菌剂具有不污染环境、不产生抗性等优点，具有很大的市场潜力。Harpin蛋白可以增强植物的光合作用，利于营养物质的摄取，因此可以促进种子萌发和植株发育，提高作物的产量和质量，增大植株个体，利于植物的早熟和结实。

本发明涉及的Harpin蛋白可用两种方式获得；(1)从病原菌Erwiniaamylovora中分离；(2)基因工程方法生产。从病原菌中分离Harpin蛋白，成本高、产量小、不能大面积推广使用。本发明采用基因工程方法生产Harpin蛋白，如在大肠杆菌中可以高效表达Harpin蛋白。大肠杆菌发酵液经过超声波破碎后，可以得到具有生物活性的基因工程Harpin蛋白，作为有效成分可广泛的应用于病虫害防治和植物保护。

本发明的目的是提供一种新型的含有Harpin蛋白基因的工程菌株，该菌株的构建方法，该菌株生产Harpin蛋白的方法，以及该蛋白在植物保护中的应用。

本发明所涉及的Harpin蛋白氨基酸序列如图一所示，其编码的核苷酸序列如图二所示。蛋白质全长403个核苷酸，富含甘氨酸和丝氨酸，对热稳定。此基因片段的获取可以有以下两种方式：(1)PCR(聚合酶链式反应)扩增：设计引物用PCR的方法从病原菌Erwiniaamylovora的基因组中或者含有Harpin蛋白的cDNA基因组文库中扩增目的基因。(2)人工合成：根据Harpin蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列人工合成核苷酸片段，然后经过分离纯化得到含有Harpin基因的DNA片段。

本发明所涉及的Harpin基因的核苷酸或氨基酸序列可以进行人为的突变或修饰。如缺失或增加某些氨基酸残基，但这些改变并不影响蛋白质的二级结构，不影响蛋白质的功能。比如可以在Harpin蛋白的N端加入一端信号肽，以利于蛋白质的表达和纯化。

本发明设计一种在原核生物中表达Harpin蛋白的方法。大肠杆菌(E.coli)因其安全、表达量高、表达产物易于分离纯化等优点为首选的原核表达系统。

本发明涉及一种构建原核表达载体在大肠杆菌中表达Harpin蛋白的方法。将本发明涉及的Harpin基因连接到表达载体中即可在大肠杆菌中表达Harpin蛋白。可供选择的表达载体系统有很多种，如pUC系列载体、pET系列载体、噬菌体系列载体等。这些载体共有的特征是：

(1)原核表达启动子：这是一段特殊的DNA序列，是RNA聚合酶与DNA的结合位点，只有当RNA聚合酶与DNA结合以后，mRNA的合成才能开始。原核、真核表达载体具有不同的启动子结构特点。根据表达量的多少原核表达启动子有强弱之分，常用的强启动子有T7启动子，Lac启动子、trp启动子、recA启动子等；

(2)SD序列：原核表达载体可以有或无蛋白质翻译起始位点ATG，在起始位点上游7-9个碱基处有一段Shine-Dalgamo(SD)序列，它是核糖体的结合位点，核糖体与mRNA结合后启动蛋白质的翻译；

(3)表达调控系统：不同的宿主-载体系统可以选择不同的调控方法来控制外源基因的表达。如在Lac启动子表达调控系统中，只有当诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)存在时，Lac启动子的阻遏才能被解除，才能启动外源基因的表达；

(4)选择性标记基因：不同的载体可以选择不同的基因作为筛选标记。常用抗生素抗性基因作为筛选标记，如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等。除作为筛选标记外，这些基因还可以保证在选择压力(抗生素存在)条件下表达载体质粒在宿主传代过程中不会丢失。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种工程菌株E.Coli BL21(pETHa)，它含有合成的Harpin蛋白基因，并能在原核生物中高效表达，该菌种命名为E.Coli BL21(pET-23(+)/Harpin)，已于2002年6月28日保藏于湖北省武汉大学的中国典型培养物保藏中心，登记入册号为CCTCC M202026。该重组载体主要由下列DNA元件组成：

(1)合成的Harpin蛋白基因；

(2)大肠杆菌质粒复制起始点；

(3)氨苄青霉素抗性基因；

(4)六个连续组氨酸编码区。

构建本发明的工程菌株主要所用的原始材料有如下几种：

(1)Harpin基因由本实验室合成；

(2)受体大肠杆菌E.coli BL21菌株，购自NOVAGEN公司；

(3)pUC19载体，购自Promega公司；

(4)pET-23(+)，购自Promega公司。

用来表达Harpin蛋白的载体通过基因工程方法获得，其构建方法是：

用BamHI/XhoI双酶切质粒pET-23(+)和重组质粒Puc19/Harpin，并经0.7％低熔点琼脂凝胶电泳纯化回收1.2kb目的基因片段，用T4 DNA连接酶于16℃水浴连接过夜；转化感受态细胞E.Coli BL21，经Amp(氨苄青霉素)抗性平板筛选得到E.Coli BL21(pETHa)。该工程菌株于2002年6月28日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，登记号为CCTCC M202026。该工程菌株携带Harpin蛋白基因的表达载体。

其中的重组质粒pUC19/Harpin由下面方法构建：

第一步，根据已知的Harpin基因核苷酸列，分四段合成Harpin基因。A片段(起点位置63-终位置376)；B片段(起点位置377-终点位置729)；C片段(起点位置730-终点位置1035)；D片段(起点位置1036-终点位置1288)。在A片段5′端引进Bam HI位点，D片段3′端引进XhoI位点；第二步，将上述A、B、C、D四个片段分别克隆到pUC19质粒的EcoR I-Hind III区域，克隆方向为5’端随着接EcoRI，3’端随着接Hind III。这四个质粒分别命名为PJZ23A，PJZ23B，PJZ23C和PJZ23D。第三步，EcoR I/Mut I酶切PJZ23A，回收A片段，并与经过EcoR I/BssH II酶切的质粒PJZ23B连接得到含有片段A/B的质粒PJZ23AB；PJZ23AB再经EcoR I/Sty I酶切回收A/B片段，与经过EcoR I/Sty I酶切的质粒PJZ23C连接得到含A/B/C片段的质粒PJZ23 Alpha；PJZ23 Alpha再用EcoR I/Xma I酶切回收片段A/B/C，连接到经过EcoR I/Xma I酶切的质粒PJZ23D中，最后得到含有四个片段的质粒pUC19/Harpin。

将重组获得的Harpin蛋白的工程菌株CCTCC M202026单菌落挑到内含100μg/ml Amp(氨苄青霉素)的LB培养基中(25ml)，37℃，200rpm过夜培养，以1∶20比例接种到含Amp的500ml LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD₆₀₀＝0.7-0.9时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)到终浓度1mM，于37℃，250rpm诱导表达3hr，收获菌液，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法即可获得Harpin蛋白。

利用携带Harpin蛋白基因的大肠杆菌发酵生产的Harpin蛋白可作为一种抗菌抑菌剂的有效成份用于植物保护。

本发明提供了一种Harpin蛋白工程菌株E.Coli BL21(pETHa)，该菌株的构建方法和用途，以及由此工程株生产Harpin蛋白，该菌株含有合成的Harpin全长基因，能在原核生物中复制，从而获得Harpin蛋白，可作为抗菌抑菌剂的有效成份，其作为生物杀虫剂具有广谱效力，保护植物抵抗病毒、细菌和昆虫的感染和侵害。

本发明涉及基因工程Harpin蛋白可以作为抗菌抑菌剂的有效成份广泛的应用于作物保护，特别是单子叶植物和双子叶植物。比如：苜蓿、大米、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、玉米、花生、甘薯、大豆、豌豆、莴苣、大蒜、甘蓝、甜菜、萝卜、菠菜、洋葱、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、黄瓜、苹果、梨子、柑橘、草莓、葡萄、菠萝、烟草、番茄、高粱、甘蔗等。装饰性植物：非洲堇、矮牵牛花、天竺葵、猩猩木、菊花、康乃馨、百日菊等。

本发明涉及基因工程Harpin蛋白可以作为抗菌抑菌剂的有效成份用于防治假单胞菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属等引起的植物细菌类疾病；镰孢属、疫霉属等引起的植物真菌类疾病；烟草花叶病毒和番茄花叶病毒等植物病毒类疾病。此外，对于农作物、蔬菜害虫如棉铃虫、甜菜夜蛾、菜青虫等也有一定的趋避和控制作用。

以下结合附图和具体的实施方案对本发明的技术方案作进一步的说明，这些实施方案无意于以任何方式限制本发明权利要求所要求的范围。

(一)Harpin基因的人工合成

Harpin基因分四个片段进行人工合成，合成由美国MIDLANDCertified Regent公司完成。

(二)Harpin基因DNA片段克隆

1、Harpin基因片段的连接，按顺序连接Harpin基因四个片段，方法参见分子克隆实验室手册(Sambrook等，冷泉港，1989)，在灭菌的0.5ml离心管中：

(1)加入基因片段各1μg，

(2)10×缓冲液化4μl，

(3)0.1mM的ATP2μl，

(4)T₄ DNA连接酶10μ，

(5)补加去离子水至40μl，

37℃水浴30min，加入2μl0.5M EDTA终止反应。加40μl苯酚∶氯仿∶异戊醇振荡1min，8,000rpm离心2min，再用氯仿∶异戊醇抽提1次，转移上清水相至一干净离心管，加入1/10体积3M乙酸钠，2倍体积无水乙醇，混匀，置于20℃过夜，12,000rpm离心20min，弃上清，自然干燥，重悬DNA于20μl TE缓冲液。

2、连接Harpin基因pUC19质粒

按Promega公司的pGEM-T载体操作手册并参见Sambrook等在“分子克隆“，实验室手册，(冷泉港，1989)，在已灭菌干净的0.5ml离心管中，加入

(1)10×T₄ DNA连接酶缓冲液1μl，

(2)20ng/μl的pUC19载体，1μl，

(3)约50ng的上述处理样品DNA，

(4)3Weiss units/μl T4 DNA连接酶1μl，

(5)补加去离子水至10μl，

混匀合置4℃连接过夜。

3、连接产物转化E.coli TG1，通过BamHI或XhoI单酶切双酶切鉴定其中的重组质粒DNA的正确结构，确定该工程菌株E.coli TG1(pUC19/Harpin)正确建立。

(三)Harpin基因1.2kb片段的克隆

使用常规技术(参见Sambrook等在分子克隆，实验室手册，冷泉港，1989)，分离提纯质粒pET-23(+)、pUC19/Harpin。用XhoI和BamHI双酶切pUC19/Harpin获得1.2kb片段，通过低熔点琼脂糖回收该片段。将该片段连接到XhoI和BamHI双酶切的表达载体pET-23(+)中，转化E.coli BL21，方法如下：

(1)大肠杆菌BL21菌株感受态细胞的制备和转化

从37℃培养16-20hr的新鲜LB平板中取E.coli BL21单菌落，置3ml LB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶100比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr(OD₆₀₀＝0.3-0.4)，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至℃时，4,000rpm离心10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl₂重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重悬细胞。所制感受态细胞置4℃，并在12-24hr内使用。

在100μl E.coli BL21菌株感受态细胞中加入8μl待转化的连接产物DNA(DNA≤50ng)，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃冰浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入90μl SOC培养液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl10ml，5M NaOH调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌。临用前加5ml已灭菌的2MMgCl₂，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm培养12-16小时后观察转化结果。

(2)重组工程菌株E.Coli BL21(pETHa)的酶切鉴定

将小量提取的重组质粒pETHa用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切和BamHI或XhoI单酶切消化，用0.7％琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后观察，通过与分子量比较DNA片段大小的方法进一步鉴定。

(四)SDS-PAGE电泳分析表达质粒中外源基因的表达

1、凝胶的灌制

参照参见Sambrook等“分子克隆“(实验室手册，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混匀开灌胶，封一层0.1％SDS(二烷基硫酸钠)覆盖液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。

2、蛋白质样品的制备

挑含有重组表达载体的细菌BL21(pETHa)单菌落在100μg/ml Amp的LB培养基中37℃过夜活化，然后以1∶20稀释接种到含100μg/mlAmp的LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD₆₀₀＝0.7-0.9时，取出未经诱导的细菌对照。加入IPTG至终浓度1mM，于42℃，200rpm培养30min后，降至37℃继续摇床培养5hr后收获细菌，4,000rpm离心10min，收集菌体沉淀，加入适量去离子水重悬菌体，置-20℃保存备用。

3、上样及电泳

在样品中加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚兰进分离胶，提高电压至150V，当溴酚兰到达底部前约1cm处结束电泳(约需4hr)。

4、固定、染色和脱色

剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜(至少4小时以上)，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相。

(五)纯化表达质粒中目的基因表达产物

目的基因的表达：

挑含待表达质粒的细菌BL21(pETHa)单菌落在含100μg/ml的Amp的25ml LB培养基中37℃，200rpm过夜活化，然后以1∶20比例接种到含100μg/ml Amp LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD₆₀₀＝0.7-0.9时，加入IPTG至终浓度1mM，于42℃，200rpm诱导表达30min后，降至37℃，继续培养5hr，收获菌液，4,000rpm离心10min，收集菌体沉淀，在细菌沉淀中加入2-5倍体积的声波处理液，反复冻融3次，置于冰中用超声波破碎细胞。保存于-20℃备用。

(六)田间应用

以Harpin蛋白作为活性成分的抗菌抑菌剂中工程蛋白有效含量为3％，将其配置成粉剂或乳剂均匀的喷洒于植物表面即可达到对细菌、真菌、病毒性植物病害广谱的预防和控制作用。

在一组田间实验中，以Harpin蛋白作为活性成分的抗菌抑菌剂对真菌引起的茄子棉疫病防治效果达到72％，而常用的化学农药只有43％；对黄瓜细菌性角斑病的防治效果超过90％，远远超过化学农药的40％；对黄瓜花叶病毒引起的病毒性病害，本发明的抗菌抑菌剂几乎可以完全控制病害发生，而化学农药只能达到78.8％的防治效果。

图面说明：图一、Harpin蛋白的氨基酸序列。图二、Harpin基因的核苷酸序列。图三、重组质粒pETHa构建示意图。图四、基因工程菌株BL21(pETHa)表达的Harpin蛋白SDS-PAGE电泳图；1：蛋白质Marker；2：对照菌(BL21)；3：工程菌未加IPTG；4：工程菌诱导2小时；5：工程菌诱导3小时；6：工程菌诱导4小时；7：工程菌诱导5小时。

Claims (7)

1、一种在原核生物中表达Harpin蛋白的方法，其特征在于获得的基因工程Harpin蛋白具有引发植物超敏感反应的生物功能。

2、根据权利要求1构建的一种工程菌株E.Coli BL21(pETHa)，该工程菌株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC M202026。

3、根据权利要求2所述的工程菌株，其特征在于：这种菌株含Harpin蛋白基因，并能在原核生物中表达。该基因具有《说明书附图》图一所示的氨基酸序列，其编码的DNA分子具有《说明书附图》图二所示的氨基酸序列。

4、根据权利要求1-3或所述的工程菌株，其特征在于所含的重组表达载体由下列DNA元件构成：

(1)Harpin蛋白基因；

(2)大肠杆菌质粒复制起始点；

(3)氨苄青霉素抗性基因；

(4)六个连续组氨酸编码区。

5、一种构建权利要求2-4任意一项所述的工程菌株的方法，其特征在于：用BamH I/Xho I双酶切质粒pET-23(+)和重组质粒pUC19/Harpin，并经0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收1.2kb目的基因片段，用T4 DNA连接酶于16℃水浴连接过夜；转化感受态细胞E.Coli BL21，经氨苄青霉素抗性平板筛选得到E.Coli BL21(pETHa)。

6、一种用权利要求1-4所述的工程菌株生产Harpin蛋白的方法，其特征在于：将重组获得的携带Harpin蛋白的工程菌株CCTCC M202026单菌落挑到内含100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养，以1∶20比例接种到含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7-0.9时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，于37℃，200rpm诱导表达5hr，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法即可获得Harpin蛋白。

7、权利要求1-4所述的工程菌株或其产生的基因工程Harpin蛋白，作为抗菌抑菌剂的有效成份用于植物保护，可以抵抗细菌、真菌、病毒、线虫等对植物的危害。起特征在于：无污染、不产生抗性、广谱高效，并可促进植物的生长发育。

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