KR102108455B1 - 노제마병 진단을 위한 유전자 마커 및 이를 이용한 노제마병의 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 꿀벌 등 곤충에 대한 감염병인 노제마병을 진단하기 위한 유전자 마커 및 이를 이용한 노제마병 진단 방법에 대한 것으로, 곤충이 노제마 아피스(Nosema apis)에 감염된 이후 특정 유전자의 발현 수준이 변화되는 것을 통하여 질병을 감염 초기에 진단하여 병의 확산을 조기에 방지할 수 있으며, 양봉 농가에 경제적으로 기여할 수 있다.

Description

노제마병 진단을 위한 유전자 마커 및 이를 이용한 노제마병의 진단 방법 {Genetic Marker for Diagnosis of Nosema disease and Diagnostic Method of Nosema disease}

본 발명은 꿀벌 등 곤충에 대한 감염병인 노제마병을 진단하기 위한 유전자 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 단세포 원생동물인 Nosema apis에 감염된 이후 변화하는 특정 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 유전자 마커 및 이를 이용한 노제마병의 진단 방법에 관한 것이다.

생태계에서 꿀벌은 필수불가결한 존재이다. 특히 꿀벌은 식물의 수분 과정에서 큰 역활을 하고 있다. 하지만 꿀벌의 병원체에 의하여 꿀벌의 개체수가 꾸준히 줄어 들고 있으며, 이로 인하여 많은 문제점이 야기되고 있다.

꿀벌에서 감염병을 일으키는 병원균에는 대표적으로 노제마병을 일으키는 노제마 아피스(Nosema apis)나, 미국부저병을 일으키는 패니바실러스 라배( Paenibacillus larvae), 백묵병을 일으키는 아스코스페라 아피스(Ascosphaera apis)등이 있다.

노제마 아피스(Nosema apis)는 꿀벌 성충에 감염하는 미포자충목 중 하나로 이로 발생하는 꿀벌의 질병인 노제마병은 노제마 아피스(Nosema apis)에 의해 꿀벌 성충의 소화기 및 부속기에 감염되어 기생하고 발병되는 질병 중 하나이다. 노제마 아피스(Nosema apis)의 포자는 외부환경에서 수년간 생존 가능하며 꿀벌 체내에서 증식한다. 병원균의 유입은 꿀벌의 먹이 섭취 과정을 통해 이루어지며 장에서 포자가 발아하여 발병된다. 발아한지 4-5일이 지나면 복제된 포자가 세포 밖으로 나와 주변세포에서 다시 발아한다.

노제마병을 방제를 하기 위한 연구자들의 노력은 많았으나, 이를 효율적으로 방제하기 위한 방법을 찾기 어려운 실정이며, 따라서 노제마병을 조기에 진단하여 감염된 곤충을 처리하는 방법은 노제마병 방제에 매우 필요한 과정이다. 기존에는 노제마병 진단을 위한 특별한 방법이 없어, 이미 감염된 곤충으로부터 병원균을 분리하거나, 아니면 감염된 곤충이 사멸할 때까지 기다리는 수 밖에 없었다. 즉, 노제마병을 조기 진단하여 이에 대처할 수 있는 방안이 양봉 농가에서는 매우 필요한 실정이다.

본 발명은 전술한바와 같이, 꿀벌에 노제마병을 유발하는 원인균인 노제마 아피스(Nosema apis)의 감염 및 확산 문제를 해결하고자 효과적으로 노제마 아피스(Nosema apis)의 감염 여부를 진단할 수 있는, 노제마병 진단용 유전자 마커에 관한 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 곤충의 노제마병을 효과적으로 진단할 수 있는 진단 마커 및 이를 포함하는 노제마병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은, 상기 본 발명의 진단 마커 또는 조성물을 이용한 곤충에서의 노제마병 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 암호화하는 유전자 중 하나 이상을 선택하여 포함하는, 노제마병 진단용 마커 및 이를 포함하는 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 유전자 마커를 이용하여 노제마병을 진단하는 방법을 제공한다.

이하 본원 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 달리 규정되지 않는 한, 본 발명에 사용된 기술적 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.

본 발명은 곤충, 특히 꿀벌에서 발병되는 노제마병을 진단할 수 있는, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자 중 하나 이상을 선택하여 포함하는, 노제마병 진단용 마커에 관한 것이다. 상기 유전자는 이에 제한되는 것은 아니나, 각각 서열번호 6 내지 10의 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있다. 본 발명에서 노제마병이 발병된 꿀벌의 경우, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 5의 단백질의 발현 정도가 양적으로 현저하게 변동되는 것을 확인하였으며, 이를 코딩하는 유전자의 Cq 값을 실험적으로 측정한 결과, 정상군과 비교하여 그 값이 변화하는 것을 관찰할 수 있었다.

따라서, 본 발명에서는 상기 유전자 마커의 발현량을 정상군과 비교함으로써, 노제마병의 발병 여부를 노제마 아피스(Nosema Apis) 감염 초기에 진단할 수 있도록 하는 유전자 마커를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 노제마병 진단용 유전자 마커는 서열번호 11 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제1프라이머, 서열번호 16 내지 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제2프라이머를 포함하며, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함하는 노제마병 진단 및 증폭용 조성물을 포함할 수 있으며, 상기 조성물은 노제마병 진단용 마커 유전자의 PCR 증폭 키트로 구성할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 노제마병 진단용 마커 유전자의 PCR 증폭 키트는 상기 서열번호 11 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1프라이머를 정방향 프라이머로, 상기 서열번호 16 내지 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2프라이머를 역방향 프라이머로 하여, 각각의 프라이머 세트로 조합하여 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 유전자 마커를 이용한 노제마병의 진단 방법은, 피검 곤충으로부터 RNA를 분리하여 준비하는 단계; 상기 준비된 RNA로부터 노제마병에 특이적인 서열번호 1 내지 서열번호 5의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 서열번호 1 내지 서열번호 5의 단백질을 코딩하는 유전자 중 1이상의 유전자의 발현 여부, 발현 정도 및 정상군과의 발현 정도의 차이를 분석하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용한 노제마병의 진단 방법은, 피검 곤충으로부터 RNA를 분리하여 준비하는 단계; 상기 준비된 RNA를 주형으로 사용하고, 노제마병에 특이적인 서열번호 1 내지 서열번호 5의 단백질을 코딩하는 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; RT-PCR 증폭 산물에 대한 전기영동을 수행하여 노제마병에 특이적인 서열번호 1 내지 서열번호 5의 단백질을 코딩하는 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함한다.

상기 프라이머 세트를 이용한 노제마병의 진단 방법에서, 상기 프라이머는 서열번호 11 내지 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 프라이머 일 수 있으며, 서열번호 11 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머, 상기 서열번호 16 내지 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 역방향 프라이머를 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명은 꿀벌 등 곤충에 대한 감염병인 노제마병을 진단하기 위한 유전자 마커 및 이를 이용한 노제마병 진단 방법에 대한 것으로, 곤충이 노제마 아피스(Nosema apis)에 감염된 이후 특정 유전자의 발현 수준이 변화됨을 통하여 노제마병에 감염된 곤충을 감염 초기에 진단하고 이를 분리하여 병의 확산을 조기에 방지할 수 있는 효과를 가진다.

도 1는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 유전자 마커(마커 1)의 프라이머 쌍의 melting temperature (Tm)을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 2은 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 유전자 마커(마커 2)의 프라이머 쌍의 melting temperature (Tm)을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 3은 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 유전자 마커(마커 3)의 프라이머 쌍의 melting temperature (Tm)을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 4는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 유전자 마커(마커 4)의 프라이머 쌍의 melting temperature (Tm)을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 5은 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 유전자 마커(마커 5)의 프라이머 쌍의 melting temperature (Tm)을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 프라이머 쌍과 꿀벌의 cDNA를 이용하여 유전자 마커 1의 발현량 차이를 확인한 것이다. Cq값이 낮은 순서로 노제마 감염군, 정상 대조군, 프라이머만 넣은 대조군이다.
도 7은 본 발명의 프라이머 쌍과 꿀벌의 cDNA를 이용하여 해당 유전자 마커 2의 발현량 차이를 확인한 것이다. Cq값이 낮은 순서로 노제마 감염군, 정상 대조군, 프라이머만 넣은 대조군이다.
도 8은 본 발명의 프라이머 쌍과 꿀벌의 cDNA를 이용하여 해당 유전자 마커 3의 발현량 차이를 확인한 것이다. Cq값이 낮은 순서로 노제마 감염군, 정상 대조군, 프라이머만 넣은 대조군이다.
도 9는 본 발명의 프라이머 쌍과 꿀벌의 cDNA를 이용하여 해당 유전자 마커 4의 발현량 차이를 확인한 것이다. Cq값이 낮은 순서로 노제마 감염군, 정상 대조군, 프라이머만 넣은 대조군이다.
도 10은 본 발명의 프라이머 쌍과 꿀벌의 cDNA를 이용하여 해당 유전자 마커 5의 발현량 차이를 확인한 것이다. Cq값이 낮은 순서로 노제마 감염군, 정상 대조군, 프라이머만 넣은 대조군이다.
도 11는 본 발명의 일 실험예에 따른 노제마병 감염 여부에 따른 마커 유전자의 발현량 변화를 막대그래프로 나타낸 결과이다. Control은 정상대조군, Infected는 감염 꿀벌군을 의미한다.
도 12은 본 발명의 일 실험예에 따른 노제마병 감염 여부에 따른 마커 유전자의 발현량 변화를 막대그래프로 나타낸 결과이다. Control은 정상대조군, Infected는 감염 꿀벌군을 의미한다.
도 13는 본 발명의 일 실험예에 따른 노제마병 감염 여부에 따른 마커 유전자의 발현량 변화를 막대그래프로 나타낸 결과이다. Control은 정상대조군, Infected는 감염 꿀벌군을 의미한다.
도 14는 본 발명의 일 실험예에 따른 노제마병 감염 여부에 따른 마커 유전자의 발현량 변화를 막대그래프로 나타낸 결과이다. Control은 정상대조군, Infected는 감염 꿀벌군을 의미한다.
도 15은 본 발명의 일 실험예에 따른 노제마병 감염 여부에 따른 마커 유전자의 발현량 변화를 막대그래프로 나타낸 결과이다. Control은 정상대조군, Infected는 감염 꿀벌군을 의미한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다. 본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

<실시예 1> 시료 준비

본 실험예에서 사용된 모든 꿀벌 시료는 질병의 진단을 위하여 농촌진흥청으로부터 위탁된 것으로 Nosema apis 및 꿀벌 성충을 사용하였다. 위탁받은 꿀벌로부터 노제마병에 걸린 꿀벌군을 얻기 위해 50% 설탕물에 Nosema apis를 섞고 10일간 섭취하도록 했다. 정상대조군은 50% 설탕물만을 섭취하도록 하였다. 10일동안 28℃의 암실에서 키웠다. 노제마병에 걸린 일부 벌들에서 Nosema apis를 다시 얻음으로써 노제마병에 걸렸음을 확인하였다. 얻은 꿀벌은 사용시까지 -70℃에서 보관되었다.

상기 준비된 감염체로부터, 내장을 분리하기 위하여 막자사발을 이용하여 꿀벌 장세포를 파쇄하였고, RNA mini kit (Ambion) 를 이용하여 RNA를 추출하였다.

<실시예 2> cDNA 합성 및 RT-PCR 수행

상기 실시예 1로부터 얻은 총 RNA를 동량으로 맞추고 Reverse transcriptase (Thermo) 를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

상기 합성된 cDNA를 주형으로 하여, 노제마병 감염 꿀벌로부터 발현량의 변화를 보기 위해 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이 서열번호 11 내지 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16 내지 20의 역방향 프라이머를 Bionics(Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 프라이머 제작은 본 발명의 서열번호 6 내지 10의 염기서열로 이루어진 해당 마커 유전자(마커 1 내지 마커 5)들의 개방형 해독틀을 이용하여 디자인하였다.

유전자 마커	프라이머	염기서열	Tm값
유전자 마커1	Forward	TTCAT TACAA GTTGC CTCGG (서열번호 11)	53.4℃
	Reverse	TGTAA ACTGA GTTGG TGAGG (서열번호 16)	52.5℃
유전자 마커2	Forward	GAAGA TATCA AAGTT GTGGC (서열번호 12)	49.1℃
	Reverse	TAATG CTATG TCGTT CTTCC (서열번호 17)	49.8℃
유전자 마커3	Forward	CACAA GAAGT ACACG ACCAA (서열번호 13)	53.0℃
	Reverse	CGATT CGTCG AACTC GAATG (서열번호 18)	54.5℃
유전자 마커4	Forward	CAAAT TTGTG CACCG TATGC (서열번호 14)	53.6℃
	Reverse	AATTC TCCTC GAACG ATACC (서열번호 19)	52.2℃
유전자 마커5	Forward	TGAAA CTCCG CATAT CCGTC (서열번호 15)	55.7℃
	Reverse	GACAT ATGCT GTTTG CTGTC (서열번호 20)	52.3℃

상기 프라이머의 Tm 값은 49 내지 58℃가 되도록 디자인 하였으며, 프라이머가 유전체 DNA에 특이적으로 붙는지 확인하기 위해 서열번호 6 내지 10의 마커 유전자에 대하여, 도 1 내지 5에서 각각 나타낸 바와 같이 RT-PCR을 이용하여 Tm을 확인하였다.

상기 제작된 cDNA를 주형으로 하고, qPCR master mix (Cellsafe)를 이용하여 95℃ 5분 → (95℃ 20초, 49 ~ 58℃ 20초, 72℃ 20초)를 28번 반복 → 72℃ 5분 → 4℃의 조건을 CFX Connect (Bio-rad)에서 RT-PCR을 수행하였다. 모든 RT-PCR은 3번 이상 진행되었으며, 그 결과, 도 6, 7, 8, 9, 10에 나타낸 바와 같은 결과를 얻었다.

또한, 상기 RT-PCR 결과, 각 유전자의 발현량을 정상 대조군과 비교하기 위하여, 각각의 증폭된 마커 유전자의 Cq 값을 정규화하여 비교하였다. 그 결과 도 11 내지 도 15에서 보듯이, 각 마커 유전자의 Cq 값은 정상 대조군과 비교하여, 현저하게 변화된 것을 관찰할 수 있었다.

즉, 구체적으로 살펴보면, 유전자 마커 1의 경우, 도 11에 나타낸 바와 같이 Cq값을 정규화하여 비교한 결과 유전자 마커 1의 정상대조군의 경우 0.177값을 나타내었으나, 노제마에 감염된 꿀벌에서는 3.582로 증가하였다.

유전자 마커 2는, 도 12와 같이 정상대조군의 경우 3.006값을 나타내었으나, 노제마에 감염된 꿀벌에서는 1.585로 감소하였다.

유전자 마커 3은, 도 13과 같이 정상대조군의 경우 0.986값을 나타내었으나, 노제마에 감염된 꿀벌에서는 6.041로 증가하였다.

유전자 마커 4는 도 14에 나타낸 바와 같이 정상대조군의 경우 6.562값을 나타내었으나, 노제마에 감염된 꿀벌에서는 3.662로 감소하였다.

유전자 마커 5는 도 15에 나타낸 바와 같이 정상대조군의 경우 0.057값을 나타내었으나, 노제마에 감염된 꿀벌에서는 0.273로 증가하였다.

상기와 같은 변화 값으로부터, 정상군과 확연히 비교되는 결과를 노제마 감염군에서 발견할 수 있었으며, 상기 마커의 발현량 변화를 통하여 노제마 아피스의 감염 여부를 진단할 수 있다는 결과를 도출하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Kyounghee University <120> Genetic Marker for Diagnosis of Nosema disease and Diagnostic Method of Nosema disease <130> PN1812-533 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis Protein <400> 1 Met Phe Phe Asn Val Lys Asp Ile Ser Phe Phe Asn Leu Leu Leu Ile 1 5 10 15 Phe Asn Leu Ser Val Phe Ile Thr Ser Cys Leu Gly Ser Lys Leu Pro 20 25 30 Leu Pro Asp Thr Gln Ile Val Gly Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ser Gln 35 40 45 Phe Pro His Gln Leu Ser Leu Gln Thr Thr Gly His Ile Cys Gly Ala 50 55 60 Ser Val Ile Asn Ser Gln Trp Ala Ile Thr Ala Ala His Cys Val Thr 65 70 75 80 Leu Ser Ala Asn Arg Tyr His Leu Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Lys Asp 85 90 95 Gln Gly Thr Ile Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Ile Val His Pro Asn Tyr 100 105 110 Asn Ser Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Ile Ala Leu Leu Gln Ile Asp Gly 115 120 125 Thr Ile Gln Leu Asn Ser Asn Val Gln Pro Val Lys Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Glu Pro Lys Ala Gly Thr Ile Val Ile Val Thr Gly Trp Gly Ala Leu 145 150 155 160 Lys Gln Gly Gly Ser Thr Ser Ala Arg Leu Met Gln Val Ser Ile Pro 165 170 175 Ile Val Asp Arg Ala Gln Cys Gln Lys Ala Tyr Lys Asn Tyr Asn Thr 180 185 190 Ile Thr Asp Arg Met Ile Cys Ala Gly Tyr Thr Gln Gly Gly Lys Asp 195 200 205 Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Gln Gly Thr Leu 210 215 220 Tyr Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Lys Cys Ala Glu Pro Asn Tyr Pro 225 230 235 240 Gly Val Tyr Thr Asn Val Ala His Leu Arg Ser Trp Ile Lys Ser Asn 245 250 255 Ser Gly Val Phe Asn Gln Leu Val Val Gly Ser His Arg Ser Met Leu 260 265 270 Glu Met Glu Ile Lys Lys Ile Leu Pro Leu Phe Ser Leu Phe Phe Ala 275 280 285 Asp Val Leu Ala Ser Glu Asn Leu Lys Tyr Val Asn Ile Thr Asp Tyr 290 295 300 Pro Tyr His Val Ser Ile Glu Lys Tyr Gly Val His Thr Cys Ser Gly 305 310 315 320 Ala Leu Val His Glu Leu Trp Val Ile Thr Ala Ala Ser Cys Val Phe 325 330 335 Gln Ala Asp Pro Ser Thr Val Thr Val Arg Ala Arg Ser Ser Thr Leu 340 345 350 Ser Thr Asp Gly Asp Gln Leu Gln Val Asp Asn Ile Val Val His Gln 355 360 365 Asp Phe Asp Lys Tyr Val Leu Leu Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Phe 370 375 380 Lys Leu Pro Val Gln Phe Gly Ala Lys Leu Leu Pro Ile Ser Leu Pro 385 390 395 400 Glu Lys Glu Asp Glu Lys Leu Asn Asp Gly Thr Met Cys Phe Val Thr 405 410 415 Gly Trp Arg Asn Thr Leu Ala Gly Pro Val Glu Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430 Thr Ala Val Pro Leu Val Asn Gln Ser Thr Cys Ser Ser Ala Ile Pro 435 440 445 Cys Tyr Glu Pro Val Phe Gln Arg Met Leu Cys Ala Gly Asn Met Thr 450 455 460 Gln Gly Val Glu Thr Cys Gln Gly Asp Pro Gly Ala Pro Leu Met Glu 465 470 475 480 Gly Gln Thr Leu Ile Gly Val Leu Ser Tyr Gly Leu Gly Cys Lys Thr 485 490 495 Met Ile His Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp 500 505 510 Ile Ser Ala Asn Ser Asp Ile His Tyr Ile 515 520 <210> 2 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis Protein <400> 2 Met Ile Lys Lys Phe Phe Ile Phe Cys Ala Leu Ile Ala Leu Ile Asn 1 5 10 15 Ala Leu Ser Trp Asn Tyr Asn Pro Lys Ile Ile Asn Gly Glu Asp Ala 20 25 30 Lys Glu Gly Glu Ile Pro 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Ile Lys Glu Asn Ala Ile 245 250 255 <210> 3 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis Protein <400> 3 Met Ser Asn Leu Val Ala Leu Leu Ala Leu Met Ala Ser Leu Ala Ala 1 5 10 15 Gly Asn Pro Ala Asp Arg Leu Asp Met Val Gln Arg Met Asp Gly Arg 20 25 30 Ile Val Gly Gly Glu Ala Thr Thr Ile His Glu Ala Pro Tyr Gln Ile 35 40 45 Ser Leu Gln Lys Asp Gly Tyr His Ile Cys Gly Gly Ser Ile Ile Ser 50 55 60 Ala Asn Trp Val Leu Thr Ala Gly His Cys Ser Ser Tyr Pro Pro Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Lys Ile Arg Ser Gly Ser Thr Asn Val Tyr Ser Gly Gly Ser 85 90 95 Leu His Asp Val Glu Arg Ile Ile Arg His Lys Lys Tyr Thr Thr Asn 100 105 110 Gln Asn Gly Ile Pro Ser Asn Asp Ile Ala Leu Phe Arg Ile Lys Asp 115 120 125 Thr Phe Glu Phe Asp Glu Ser Thr Lys Pro Val Gln Leu Tyr Gln Gly 130 135 140 Asp Ser Ala Ser Leu Val Gly Lys Tyr Gly Leu Val Thr Gly Trp Gly 145 150 155 160 Leu Thr Asn Ile Lys Ile Pro Pro Leu Leu His Lys Val Ser Val Pro 165 170 175 Leu Val Ser Lys Arg Glu Cys Asp Arg Asp Tyr Ser Arg Phe Gly Gly 180 185 190 Val Pro Gln Gly Glu Leu Cys Ala Gly Tyr Pro Glu Gly Gly Lys Asp 195 200 205 Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Asp Gly Asn Leu 210 215 220 Val Gly Val Val Ser Trp Gly Met Gly Cys Gly Thr Pro Lys Tyr Pro 225 230 235 240 Gly Val Tyr Thr Asp Val Ala Tyr Tyr Arg Glu Trp Val Arg Glu Asn 245 250 255 Ser Glu Val <210> 4 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis Protein <400> 4 Met Asp Tyr Arg Phe Phe Ile Ile Phe Ile Phe Ile Phe Ser Thr Asn 1 5 10 15 Val Lys Cys Gln Lys Ser Thr Ser Val Glu Asp Thr Lys Ile Asn Asn 20 25 30 Ala Thr Lys Lys Ile Glu Asn Val Pro Thr Lys Glu Lys Ile Pro Thr 35 40 45 Ile Lys Leu Pro Asn Leu Cys Thr Val Cys Lys Cys Thr Asp Asp Ile 50 55 60 Ile Asp Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Tyr His Phe Gln Tyr Ser Gln 65 70 75 80 Trp Pro Asn Lys Ser Met Lys Val Val Ser Phe Glu Glu Asn Ser Leu 85 90 95 Val His Val Lys Ser Phe Pro Ala Ile Glu Ile Arg Lys Leu Ile Leu 100 105 110 Arg Lys Asn Lys Ile Thr Lys Ile Asp Asn Ser Ala Phe Lys Arg Ile 115 120 125 Ile Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Thr Thr Glu 130 135 140 Asn Leu Gln Pro Gln Val Phe Glu Gly Lys Phe Ser Pro Asp Ser Tyr 145 150 155 160 Glu Pro Leu Glu Asn Leu Val Ile Leu Asn Leu Ala Asp Asn Met Leu 165 170 175 His Ser Leu His His Asp Leu Phe Glu His Thr Thr Asn Ile Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Ser Gly Asn Leu Phe Ser Ile Leu Asp Ser Arg Ser Ile 195 200 205 Ile Ala Ile Ser Ser Leu Pro Asn Leu Glu Glu Leu Asn Leu Ser Tyr 210 215 220 Cys Gly Leu Lys Thr Ile Pro Glu Thr Ser Phe Tyr Thr Ser Lys Asn 225 230 235 240 Leu Lys Lys Leu Asn Leu Ser Gly Asn Gln Leu Thr Ile Val Pro Ser 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Ala Thr Ser Leu Glu Asn Leu Tyr Met Asp Glu Asn 260 265 270 Pro Ile Gln Ile Ile Asp Pro Glu His Ser Phe Pro Lys Met Ile Lys 275 280 285 Leu Lys Glu Leu Ser Leu Cys Cys Met Pro His Leu Thr Ile Val Gly 290 295 300 Ser Gly Ser Phe Ser Lys Leu Thr Ser Leu Glu His Leu Arg Ile Gln 305 310 315 320 Asn Cys Pro Lys Leu Glu Ser Ile His Gln Asn Ala Leu Ser Ser Trp 325 330 335 Asp Asn Asn Ser Thr Glu Thr Val Trp Pro Pro Leu Lys Arg Leu Asp 340 345 350 Leu Ser Asp Asn Ala Leu Arg Tyr Leu Pro Gln Leu Leu Ile Ser Arg 355 360 365 Trp Asp Trp Leu Glu Lys Leu Asp Leu Thr Asn Asn Lys Trp Ser Cys 370 375 380 Asp Cys Asp Asn Glu Tyr Leu Ile Asn Val Leu Leu Pro Thr Tyr Gly 385 390 395 400 Lys Arg Leu Met Gly Glu Glu Met Lys Arg Leu Val Cys Ala Ala Pro 405 410 415 Pro Glu His Glu Gly Glu Asn Leu Thr Ser Leu Phe Asp Arg Ser Leu 420 425 430 Arg Cys Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Arg Pro Glu Lys Asp Ala Met Ile 435 440 445 Leu Val Gly Ile Leu Ile Gly Ile Leu Phe Ala Ile Pro Val Cys Leu 450 455 460 Thr Thr Leu Val Leu Trp Arg Arg Gly Phe Phe Phe Cys Gly Ser Ser 465 470 475 480 Gly Pro Ala Ser Phe Ser Arg Ala Phe Tyr Lys Arg Thr Ile Asn Glu 485 490 495 Glu Ile <210> 5 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis Protein <400> 5 Met Lys Leu Arg Ile Ser Val Leu Leu Val Ala Leu Val Ala Ile Leu 1 5 10 15 Leu His Ser Ala Glu Tyr Thr Thr Ala Asn Ser Ile Cys Pro Gln Glu 20 25 30 Asn Cys Leu Asp Ser Thr Lys Cys Glu His Phe Val Val Gly Ala Thr 35 40 45 Cys Pro Arg Ser Ser Asp Thr Cys Cys Ser Ile Val Lys Ser Glu His 50 55 60 Arg Thr His Cys His His Phe Ala Gly Glu Cys Met Asp Thr Cys Thr 65 70 75 80 Leu Ser Leu Arg His Ala Val Val Asp Cys Pro Ser Asp Lys Val Cys 85 90 95 Cys Thr Leu Val 100 <210> 6 <211> 1881 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker 1 <400> 6 ttggatatat attgtttgaa tcaaagaatt tgataaaaat tagatatgtt ttttaatgtt 60 aaagatattt cttttttcaa ccttctttta atcttcaatc ttagcgtttt cattacaagt 120 tgcctcggat ccaagttacc tttaccggat actcaaatcg tgggagggac tgcggctgat 180 ataagtcagt ttcctcacca actcagttta caaactacgg gacatatatg cggcgcttca 240 gttatcaatt ctcaatgggc tatcactgca gctcattgcg tcacattatc agctaatcga 300 taccatctac gagctggtag tacatataaa gatcaaggca ctatttacac cttaaaaaga 360 attattgtac atcctaatta caattctaaa actatcgatt acgatatagc tcttctacag 420 attgatggca ccatacaatt aaactcgaat gtccaacctg taaaacttgc aacatcggaa 480 ccaaaagctg gaacaatagt gattgtaact ggttggggcg cacttaagca aggaggatca 540 acttcggctc gattgatgca agtatcgatt cctatagtgg acagagctca atgccaaaaa 600 gcctacaaaa attacaacac aatcacagac agaatgatat gcgccggtta cacccaaggt 660 ggaaaggatt cttgtcaagg ggattctggt ggccctatgg tggctcaagg gaccctctat 720 ggcatagtat catggggtta caaatgtgct gagccaaatt atcctggagt ttatacgaac 780 gtggcacatc tacgatcttg gattaagagt aacagcggag tattcaacca gttagttgtt 840 ggttctcatc gatcgatgtt ggagatggaa attaagaaaa tattaccctt attttccctt 900 tttttcgcgg atgttctcgc gtccgaaaat ttgaaatatg tgaacatcac ggattatcct 960 tatcacgtat ccatcgagaa atatggggta cacacgtgca gcggagcatt ggtgcacgaa 1020 ttgtgggtaa taaccgcggc atcctgcgtt tttcaggcag acccgtccac ggtaaccgtg 1080 cgagcgcgct cgtccacgct ttcgaccgat ggagatcaat tgcaagtgga caatatcgtt 1140 gtacatcagg attttgataa atacgttctg ctcaatgata tcgcgctaat caagttcaag 1200 ctacctgtac aatttggggc caaattatta cctatatcgc ttccggaaaa ggaagacgag 1260 aagcttaatg atggaacgat gtgtttcgtg acaggctgga gaaacacctt ggccggtcca 1320 gtggaatctc gactcacggt gacagcagtg cccctcgtga accagagtac ctgcagctcg 1380 gcgattccct gttacgagcc tgtgttccag agaatgctct gcgccggcaa catgacccag 1440 ggggtagaga cgtgtcaggg tgatccaggt gctccgctga tggaagggca gactctgatt 1500 ggcgttctat cctatggatt agggtgtaaa actatgatac atccgggcgt atacactcgt 1560 gtcagcagtt acctagcgtg gatctcggca aattccgata tccactatat ataagatgat 1620 atccgcgaaa ctacaatgtc aacattgctt tatcagaaac acgcggtacg atcaaagctt 1680 cttgtataat ttaaagatat gccgaaaaga tgagatgaaa cttctttcca tatcgtcatt 1740 gtaaatctaa aattgagatt gactaaactc tttttcctta actggaaata ttcatcgcta 1800 tattcatttg cattatatcg aatcaaaaga aaaatttaat attgaaaatg aagaaataaa 1860 aattattcta tttgcattgg a 1881 <210> 7 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker 2 <400> 7 tgatatttcg attcagttgt acatacgatt atattgcgcg tttaatcaaa taaaaaagta 60 taaaagtata attagtgaat agtgctgatc gaaacaagca tgatcaaaaa attttttatt 120 ttttgtgcat taattgcatt aattaatgca ttatcttgga attataatcc aaaaattata 180 aatggggagg atgccaaaga aggagaaatt ccttatcaag tatcactgca gaacaaattt 240 agctctttcc atttttgcgg tggatctatt ctcaatgaaa attatgtgat tactgcagcg 300 cattgcgtcc atggtaaatt ttcagaagat atcaaagttg tggcaggcac gatcaatctg 360 gccaatccaa gatacgagaa tgatgtcaat gaaatcattg ttcacgaaaa atacaacgtt 420 tcagattcgt ggaagaacga catagcatta ctcaaagtta agacatcatt tacactatcg 480 aatacaattt cctccgtccc tcttccatca ccaaacgaca tcattaagcc aaatgatttg 540 gcaactgttt ctggctgggg cagacttaga caaggaggac caacaactat ttacttacaa 600 cgagtaaaca tcctaattgc aaatcaagaa tattgtgaat taacgtataa aaaaataaat 660 tatactgttt acgaatccca aatttgtgca tactatccaa ccagtgaaaa aggatcgtgt 720 aatggtgatt ctggtggtcc cttgaccgtc aatggaaaac tcgttggtct cgtttcatgg 780 gcaatgggct gtgccctcat tgattatcca actgtctata cccgtgttga atcatatctt 840 gattggataa aagaaaatgc tatataaatt ttacaacaca cgattattaa ctctttgcgc 900 tccaacaagt gattcttggt catttggatt gatgcaacaa ttttaacaaa ctttaacaat 960 atttatttat ctttgatttt ttatttatag aatatcgcta gaaatattat tttcaaagtt 1020 atttttgagt tttgttagtg catggaacac ggtaatgaaa ttagttcaag cgaagatgag 1080 tttgatttta ttgaatgacg aaattatttc tattcataaa gaaattaacg aatagcagag 1140 aaatagagac tttaatattc aataaatttt tttctttata tataaagata tatgaagtat 1200 taaaatataa aagtcatatg cgttaatttg tatgtgaaat cataaattag ctgtaagaaa 1260 ttccacagaa tgcattggtt caaccgaatg gaacaagttt ggagtgcaaa gagttaatat 1320 catatatatg gattatgagt tactaatatg ttataatata ttatcttaaa ataaataaat 1380 taatcttagt attgtgaaaa a 1401 <210> 8 <211> 1237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker 3 <400> 8 gataaagccc tcgaaaccga ttcaagaaaa agattttaga ttagtttttt cgagatggtt 60 gatactacaa ttaacaacgt cgattttcac tataaaaacc ggcggatcga tctccactcg 120 cattccactt catcgccatc gaccaggtgg aaaagaaact ctcaacgatg agcaaccttg 180 tcgcccttct tgccctcatg gcaagcttgg ctgccggaaa cccggccgat cgtttggaca 240 tggtacagag gatggacggt cgcatagtgg ggggcgaggc gactacaatc cacgaggcgc 300 cgtaccagat ctcccttcaa aaggacggtt accacatatg cggcggtagc ataataagcg 360 ccaactgggt gctgaccgct ggccactgct cctcttaccc cccttccacc tacaagatac 420 gctccggctc gactaacgtg tactcgggcg gctcgttaca cgatgtcgag cggataatca 480 ggcacaagaa gtacacgacc aatcagaacg gcataccgtc caacgacatc gccctcttcc 540 gtatcaagga tacattcgag ttcgacgaat cgacgaaacc tgtccaactt taccaagggg 600 actcggcctc actcgtcggt aaatacggtt tggtgaccgg ctggggactg accaacatca 660 agattcctcc cctcctccac aaagtctcgg tccccctcgt ctcgaagagg gaatgcgaca 720 gggattactc gaggttcggc ggcgttcccc agggcgaatt gtgcgccgga tacccggagg 780 ggggcaagga ctcctgccag ggggattcgg gtgggccgtt ggtcgtcgat ggaaatttgg 840 tcggagtggt ctcttggggg atgggttgcg gaacacctaa ataccccggc gtgtacacgg 900 acgtggctta ttacagggaa tgggtgaggg agaacagcga agtctgacac gaaaatttgg 960 atactttggc acgtttggaa ttggcgatga aggatactgc ttaaaggatt aactcgatcg 1020 ggcgaaatga ttctttctat tcttatcggt agaacgttaa gttttaaggt taagtaattt 1080 tcgaagtatg gtaatgtaat tttaaaaagt cgatttcaag atgagacaat tgtatatata 1140 tgtatatgtg taaaaagtat attaattata gcgtgtaaat aaaaattgta taaactaaat 1200 aaaactaaat aaaaattttt cgtatttatc tatggaa 1237 <210> 9 <211> 1909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker 4 <400> 9 gatacaggaa aggtctcgca ttcacagtgt aagattctac cggcacggat ttcgtgagaa 60 atcatggatt accgtttttt cattattttt attttcatct tttcgacaaa tgtcaagtgc 120 caaaaatcaa cctccgttga agacaccaaa attaataatg caacaaaaaa aattgaaaat 180 gtaccgacaa aggagaaaat acctacgatt aaacttccaa atttgtgcac cgtatgcaaa 240 tgtacagatg acatcataga ttgcgataaa agaaatttga cgtaccactt ccaatattcc 300 caatggccga acaaatctat gaaagtggta tcgttcgagg agaattcgtt ggttcacgtg 360 aaatcgttcc cggcaataga gatcaggaaa ttgatattaa ggaagaacaa aatcaccaag 420 atcgataaca gcgccttcaa gaggataatc aatctgaccg aattggatct aagccataat 480 caactcacga cagaaaattt gcaaccccaa gtgtttgagg gtaaattttc accggatagt 540 tacgaaccgt tggagaatct ggtaatttta aatttggccg ataacatgct tcactcgttg 600 catcatgatc tgttcgagca cacgacgaac ataaaagtat tggatctttc tggaaatcta 660 ttctcaattc tcgacagccg ctcgatcata gcgatcagct ctcttccgaa tttggaagag 720 ttgaacttga gttactgtgg gctgaagaca attccggaaa catcgttcta cacatccaag 780 aatcttaaga agctgaactt gagcgggaat cagctgacga ttgtgccgag cgctctcaaa 840 gaggcaacgt ccctggagaa cctgtacatg gatgaaaatc cgattcagat tatcgatccg 900 gagcactcgt tcccaaaaat gattaagctg aaagagttga gcctgtgctg catgccacat 960 ttgacaatag ttggatcggg ctccttctcg aaattgacat cgctcgagca tcttcgaata 1020 caaaattgtc caaaactgga atcgatccac caaaacgctc tttcgtcatg ggataataat 1080 tctacggaaa cagtgtggcc gccacttaag aggctcgatt tatcggataa cgccctgcga 1140 tatttgcctc agctattgat atcaaggtgg gattggctcg aaaaattgga tctgacgaac 1200 aacaaatgga gctgcgattg cgataatgaa tatctgatca acgttttgct gccaacgtac 1260 gggaaaaggt tgatgggcga agaaatgaag aggctggtgt gcgcggcacc gcccgagcac 1320 gagggtgaaa atctgacgtc gttgttcgat cgaagcctac gctgcctgga tctgtacaac 1380 gcgaggccgg aaaaagacgc gatgatcctc gtgggtatat tgatcggtat attgttcgcg 1440 attccggtct gcctcaccac cctcgtgctc tggcgccgcg gtttcttctt ctgcggcagt 1500 tccggcccgg ccagtttctc ccgagcattt tacaaaagga ccattaacga agaaatttga 1560 acctctctct ctctttgctt cgaagaattt gatgatgaga ggatcgattt ggatgtaatc 1620 gttatagaag gaggaatgaa gataattgaa agggaagagt tattagaata aagaataaga 1680 tttcgatcgt tcagattgat atgtaagatt gatatacaga gttacaatat ataatataaa 1740 cgttggagat ggaaggagaa aattttatat tttgtacgcc gtggatttta atttatgtaa 1800 taagatgtag cgataagatt aagcgaattt aattattaca cgtgtgttat acgtatatat 1860 ttttataacg atgcaatgtc tcaataaatt agatctagaa acaataaaa 1909 <210> 10 <211> 1971 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker 5 <400> 10 aagaagtatt tacattgtga cgagattaaa catcaatccg ttcgtttaac ttgagcaata 60 cgtttgttta ttcgcctggg gaggggaagt acgaaggaga tccggaaatc accgatcgat 120 ccgtttcaaa acagaagcaa acgacggcgt acattcgtac atcatcgttc gctggtgaag 180 ataatgaaat gcacggcgac gaaatgggtg gacgcgtgcg tctgtgtgcg taacgctgct 240 cgcttactcg tttatataat gccagacccg ggaaagtgag acaccattga atcgtcgacc 300 gtcaaacagg cacgcgtttc tgtccgattc gaacgacatg aaactccgca tatccgtcct 360 tctcgtcgcc ctcgtggcca ttcttctgca ctctgccgaa tacacgacag caaacagcat 420 atgtccccaa gagaattgcc tcgattcgac aaagtgcgag cattttgtgg tgggcgctac 480 gtgtccacga tcgagtgaca cgtgttgcag cattgtgaaa tcggaacaca gaacccattg 540 ccaccacttc gcgggcgagt gcatggacac ctgcaccctg tctctgcgtc acgcggtcgt 600 cgattgtcca tcggacaaag tgtgttgcac gttggtttaa tccgtgaaga gaggaagaaa 660 aaaacgagag gtcagcatcc gaacaatagc gttaatgtaa caccgattac tcgagtctcg 720 acatccggcc gatctatgaa tgtacgaatc atctgttcgc agcacacggt agaaaagcga 780 gttttaatcg attttacaac agcgacgaat ggttggcgcg cgcgtgtgga ctgtagcgcg 840 tcacgaaaaa tggcgtgcgc cgcttgataa ttgtgaacac gttgcgacac aagcgagtga 900 aattagtgcg aatgtgaaaa gttccgcgaa tatgcacttg ctccgttcgt ttccagtgaa 960 aatgagaaaa tgtagtagtt agaagggtgt tcgttttaac gaagcatgcg tgtttgagtg 1020 tggaaatttg aacgatcgat gattttatat gttattaaac aattttctct tcaatgttct 1080 tgcattattc ttagtagtcg atgatctatg aacgatatat ctttaattgg gtagttttct 1140 ctttttatca aacttacgag acactagaag aaactagtcg aacgatattc aaataatttt 1200 gagacgatca attgtcgtat ataatacaat tcgaaattaa tcgataatta atttctagaa 1260 aaagaagaag attaacctct ttccatccct ttcgcaatca atcgatcaat taaattaaat 1320 taaatctttc tcaaataaat aagtagcgaa taattcgagt agaagagaag gaagaatagg 1380 aagaaataag aagtggatgt ggaagaggga gagaagaggg gggcacgtat cgccgcgggc 1440 aatgcaggac ggtttgacgg tgagggaacg cacgcacgga agatttagcg tcgtgttggt 1500 cagccctgga gggtcactcg aagaatcgtg gcgcgcgaga gagaaagggg aacagctcga 1560 ggctccctct atcgtcggcc atctctcgcc gagatgtaag agagcgcggg acggtgacgc 1620 attcgtcaat gcgaattacg aacgtgttgt aaagcgttag ctcgagacga gagtaacgag 1680 cgagcgaggg atatatcgct cggattcttc gcgcacgcgg ggaggagaag agggaagcga 1740 gagaaggaag agataccttg cccgaggcca gacacgagga acatgtgaca ctaaatatag 1800 aaacacgcca cggaggaatt cttcgaaagg taacgaaaca aacattctcg tttcgacaag 1860 aaatactaaa taacacgtga cgtgatcgct ggctcggtca aaagcaactt tcctgataga 1920 tgatagaaga cgcttacgat atttaaatcg aaataaacga tctccttctt a 1971 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene forward primer <400> 11 ttcattacaa gttgcctcgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker forward primer <400> 12 gaagatatca aagttgtggc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker forward primer <400> 13 cacaagaagt acacgaccaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker forward primer <400> 14 caaatttgtg caccgtatgc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker forward primer <400> 15 tgaaactccg catatccgtc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker reverse primer <400> 16 tgtaaactga gttggtgagg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker reverse primer <400> 17 taatgctatg tcgttcttcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker reverse primer <400> 18 cgattcgtcg aactcgaatg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker reverse primer <400> 19 aattctcctc gaacgatacc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apis gene marker reverse primer <400> 20 gacatatgct gtttgctgtc 20

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1 및 서열번호 3 내지 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭 및 검출할 수 있는 제제를 포함하는 꿀벌 노제마병 진단용 조성물로서,
   상기 제제는 서열번호 11 및 서열번호 13 내지 서열번호 15로 표시되는 정방향 프라이머; 및
   서열번호 16 및 서열번호 18 내지 서열번호 20으로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 것인, 꿀벌 노제마병 진단용 조성물.
4. 삭제
5. 제3항의 조성물을 포함하는 꿀벌 노제마병 진단용 키트.
6. 제5항에 있어서,
   상기 키트는 PCR 또는 RT-PCR을 수행하기 위한 키트 또는 유전자 분석용 키트인 것을 특징으로 하는 꿀벌 노제마병 진단용 키트.
7. 꿀벌로부터 RNA를 분리하여 준비하는 단계;
   상기 준비된 RNA로부터 서열번호 6 및 서열번호 8 내지 서열번호 10의 유전자의 발현 수준을, 서열번호 11 및 서열번호 13 내지 서열변호 15로 표시되는 정방향 프라이머 및, 서열번호 16 및 서열번호 18 내지 서열번호 20으로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 측정하는 단계; 및,
   상기 측정된 유전자의 발현 정도 및 정상군과의 발현 정도의 차이를 분석하는 단계;를 포함하는, 꿀벌 노제마병 진단 방법.
8. 삭제
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