CN116240216B - 以菌液为模板的抗体构建测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以菌液为模板的抗体构建测序方法，将已知氨基酸序列的抗体分析后转变成核苷酸序列，将抗体的核苷酸序列连接到表达载体中；将表达载体转化到表达宿主菌中，挑取单株菌落于液体培养基中，置于恒温摇床中扩繁2h以上；以扩繁后的菌液为模板，加入Taq酶、上游引物和下游引物、Buffer进行PCR扩增反应，磁珠对PCR扩增反应产物进行纯化，洗脱磁珠上吸附的PCR扩增反应产物；提取核酸；对核酸进行测序，获得抗体基因的序列。本发明以构建的菌液为模板，只需要经过几个小时的短暂培养，然后采用优化的PCR反应体系，通过Taq酶进行扩增，扩增产物可以直接作为测序模板，从而大大缩减了此类型的样品测序时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种以菌液为模板的抗体构建测序方法，属于基因测序技术领域。
背景技术
虽然一代测序可以测序PCR产物和质粒，但是更多的实验选择还是将PCR产物装入特定的载体中，再配以转化技术制备小抽级别的质粒模板进行测序，此方法存在模板制备时间长，步骤繁琐的情况。尤其是小抽级别的质粒模板制备，需要经过16h的培养还有复杂的裂解工艺，整体时间约20小时。如果培养不当，容易造成菌液污染等。
现有的菌液测序方法更多的是使用Phi29等温扩增方法，成本较高，时间较长。
本发明以构建的菌液为模板，只需要经过几个小时的短暂培养，然后通过Taq酶的扩增，就可以获得优质的测序模板。优化的时间方案和便宜的试剂使得其更具备重组抗体实验测序的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种以菌液为模板的抗体构建测序方法，可以做到在6个小时内制备出和质粒同一级别的测序模板。
本发明采用的技术方案为：
一种以菌液为模板的抗体构建测序方法，其步骤包括：
(1)将已知氨基酸序列的抗体分析后转变成核苷酸序列，将抗体的核苷酸序列连接到表达载体中；
(2)将构建好的表达载体转化到表达宿主菌中，涂布在带有抗性的平板上，过夜培养；
(3)挑取单株菌落于液体培养基中，置于恒温摇床中扩繁2h以上；
(4)以扩繁后的菌液为模板，加入Taq Plus DNA Polymerase、上游引物和下游引物、PCR Buffer进行PCR扩增反应，其中上游引物和下游引物均针对表达载体设计，上游引物位于表达载体连接抗体的核苷酸序列的5’端的位置处上游，下游引物位于表达载体连接抗体的核苷酸序列的3’端的位置处下游，使得扩增产物包含抗体的核苷酸序列；
(5)用磁珠对PCR扩增反应产物进行纯化，洗脱磁珠上吸附的PCR扩增反应产物；
(6)提取核酸；
(7)对核酸进行测序，获得抗体基因的序列。
优选的，步骤(1)中所述液体培养基为TB培养基。
优选的，步骤(2)中的PCR扩增反应体系为：
优选的，步骤(2)中的PCR扩增反应程序为：
优选的，步骤(3)具体为：
3.1在LPCR产物中加入Buffer GN和磁珠，混匀；
3.2加入结合液，混合3min，吸磁3min，温度37℃；
3.3加入清洗液，混合2min，吸磁75s，重复清洗步骤，风干磁珠；
3.4加入洗脱液，混合1min，吸磁1min。
优选的，步骤(4)中采用全自动核酸提取仪提取洗脱液中的核酸。
本发明以构建的菌液为模板，只需要经过几个小时的短暂培养，然后采用优化的PCR反应体系，通过Taq酶进行扩增，扩增产物可以直接作为测序模板，从而大大缩减了此类型的样品测序时间。优化的时间方案和便宜的试剂使得其更具备重组抗体实验测序的需求。
附图说明
图1：探索PCR反应条件时，PCR产物的电泳结果图。
图2：探索PCR反应条件时，PCR产物的电泳结果图。
图3：2022年11月28日批次的PCR产物电泳结果图。
图4：2022年11月23日批次的质粒与PCR产物的测序信息比对。
图5：2022年11月28日批次的质粒与PCR产物的测序信息比对。
图6：2022年11月29日批次的质粒与PCR产物的测序信息比对。
图7：2022年12月5日批次的质粒与PCR产物的测序信息比对。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
实施例1
1、PCR扩增目的序列
1.1通过已发现的抗体氨基酸序列分析后转变成核苷酸序列，并通过DNAworks软件设计成寡核苷酸链式引物.
1.2将设计的引物发往南京擎科生物合成。
1.3通过重叠PCR方法将寡核苷酸链式引物拼接成约400bp长的DNA双链产物。
1.4将形成的PCR产物通过同源重组的方法装入可表达的载体中。
1.5通过热激，冰浴等操作将连接产物装入DH5a感受态中，涂布在带有抗性的平板上，过夜培养。
1.6挑取单株菌落于400μL液体TB中，置于恒温摇床中扩繁2h，转速300rpm。1.7以扩繁后的菌液为模板，按表1探索PCR反应条件，PCR产物的电泳结果如图1所示。可以看出，实验NO1-10增加菌液量至5 6ul与NO16-20增加菌液量至2ul菌液，条带亮度差异无明显差异。NO6-10与NO11-15可以看出减少引物量，并没有改善目的条带亮度。目前80μL体系可以扩增目的条带，但是条带亮度不够，条带亮度稳定性差。可以增加酶量提高产量，但是特异性可能会下降。所以后期的优化方向在于用菌液的用量和pcr体系的配比，如表2所示，以达到体系的优化和节省成本的双向的目的。结果如图2所示，在2ul菌液/50ul pcr体系(2ul引物)的配比下约95％的孔位都有明亮单一的可回收的条带，可以达到后续实验的要求。最终得到最优PCR体系如表3所示。
表1PCR反应条件探索
表2PCR反应条件探索
1.8根据优化后的PCR反应体系进行配置，具体为向10mL离心管中依次加入3750μL无菌水、500μL10×Taq Plus Buffer、200μL Pc3-L1上游引物、200μLPcDNA3-R下游引物、100μL dNTPs、50μL Taq Plus DNA Polymerase配置一整板PCR反应Mix。
1.9向PCR反应中加入48μLMix混合液。
1.10每个PCR反应中加入2μL已扩繁2h菌液，震荡混匀。
表3PCR反应体系配置表
1.11将PCR反应板放置于PCR仪上，设置volume为50μL，PCR反应程
序如下所示：
2、PCR产物纯化
2.1将50μLPCR产物转移至方孔锥底96深孔板中，加入200μLBuffer GN，15μL磁珠混匀，将磁套棒扣置于方孔锥底96深孔板中。每升Buffer GN
包含：4M异硫氰酸胍，400ml的异丙醇，0.05mol的磷酸氢二钾，PH＝5.1。
2.2取出两个圆孔圆底96深孔板，每个反应中加入700μLW2作为清洗液。
每升W2包含20mmol氯化钠，2mmolTris-Hcl PH＝7.5 80％体积的无水乙醇。
2.3取PCR板，每个反应中加入50μL无菌水作为洗脱液。
2.4将加样完的96孔板，分别放置于全自动核酸提取仪相应位置处，开始运行。
2.5结合液混合3min，吸磁3min，体积265μL，温度37℃。
2.6W2混合2min，吸磁75s，体积700μL。
2.7W2混合2min，吸磁100s，体积700μL。风干5min。
2.8洗脱液混合1min，吸磁1min，体积50μL。
2.9全自动核酸提取仪(Thermo KINGfisher)程序运行结束后，检测洗脱液浓度，保存数据，放置-4℃冰箱。
3、测序
对于挑取的单株菌落，取一部分采用传统方法培养，提取质粒，将质粒和前述的PCR产物均送去测序。2022年11月23日进行了一批24个单菌落的实验，其中有2个样品质粒和对应的PCR产物测序没有信号，其余22个测序结果均匹配，匹配度为100％，其中一个单菌落的质粒和PCR产物的测序信号如图3所示。2022年11月28日进行了一批96个单菌落的实验，匹配度为100％，PCR产物的电泳图如图2所示，其中一个单菌落的质粒和PCR产物的测序信号如图4所示。2022年11月29日进行了一批96个单菌落的实验，匹配度为100％，其中一个单菌落的质粒和PCR产物的测序信号如图5所示。2022年12月5日进行了一批96个单菌落的实验，匹配度为100％，其中一个单菌落的质粒和PCR产物的测序信号如图6所示。可以看出，回收后的PCR产物测序信号清晰稳定，与抽提的质粒测序结果完全一致，可以达到预期的需求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种以菌液为模板的抗体构建测序方法，其特征在于其步骤包括：
(1)将已知氨基酸序列的抗体分析后转变成核苷酸序列，将抗体的核苷酸序列连接到表达载体中；
(2)将构建好的表达载体转化到表达宿主菌中，涂布在带有抗性的平板上，过夜培养；
(3)挑取单株菌落于TB液体培养基中，置于恒温摇床中扩繁2h以上；
(4)以扩繁后的菌液为模板，加入Taq Plus DNA Polymerase、上游引物和下游引物、PCR Buffer进行PCR扩增反应，其中上游引物和下游引物均针对表达载体设计，上游引物位于表达载体连接抗体的核苷酸序列的5’端的位置处上游，下游引物位于表达载体连接抗体的核苷酸序列的3’端的位置处下游，使得扩增产物包含抗体的核苷酸序列，其中PCR扩增反应体系为：
(5)用磁珠对PCR扩增反应产物进行纯化，洗脱磁珠上吸附的PCR扩增反应产物；
(6)提取核酸；
(7)对核酸进行测序，获得抗体基因的序列。
2.根据权利要求1所述的以菌液为模板的抗体构建测序方法，其特征在于步骤(2)中的PCR扩增反应程序为：
3.根据权利要求1所述的以菌液为模板的抗体构建测序方法，其特征在于步骤(3)具体为：
3.1在LPCR产物中加入Buffer GN和磁珠，混匀；
3.2加入结合液，混合3min，吸磁3min，温度37℃；
3.3加入清洗液，混合2min，吸磁75s，重复清洗步骤，风干磁珠；
3.4加入洗脱液，混合1min，吸磁1min。
4.根据权利要求1所述的以菌液为模板的抗体构建测序方法，其特征在于步骤(4)中采用全自动核酸提取仪提取洗脱液中的核酸。
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-
2023
- 2023-02-02 CN CN202310051886.1A patent/CN116240216B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116240216A (zh) | 2023-06-09 |
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