TWI386416B

TWI386416B - 具有抗微生物活性的多肽與編碼其之多核苷酸

Info

Publication number: TWI386416B
Application number: TW095131272A
Authority: TW
Inventors: Nikolaj Spodsberg
Original assignee: Novozymes Adenium Biotech As
Priority date: 2005-08-26
Filing date: 2006-08-25
Publication date: 2013-02-21
Also published as: JP2009507474A; ES2343586T3; JP2013100301A; RU2512525C2; MX2008002485A; NZ565926A; KR101362710B1; CA2620125A1; WO2007023163A1; EP1922333B1; CN101248085A; RS51325B; DK1922333T3; AR055394A1; ZA200801426B; PT1922333E; AU2006283904B2; DE602006013330D1; TW200734350A; KR20080048477A

Description

具有抗微生物活性的多肽與編碼其之多核苷酸

本發明包含序列表

本發明係關於具有抗微生物活性之經分離的多肽與編碼該多肽之經分離的多核苷酸。本發明亦係關於包括該多核苷酸的核酸構築體、載體、與宿主細胞，以及生產與使用該多肽的方法。

定義

抗微生物的活性： 術語「抗微生物的活性」於本文定義為一種有殺死微生物細胞或抑制微生物細胞生長的能力之活性。在本發明的背景中，術語「抗微生物的」係意欲意指有一種殺細菌的及/或一種制細菌的及/或殺真菌的及/或制真菌的效果及/或一種殺病毒的效果，其中術語「殺細菌的」應被理解為有殺死細菌細胞的能力。術語「制細菌的」應被理解為有抑制細菌的生長的能力，即抑制生長的細菌細胞。術語「殺真菌的」應被理解為有殺死真菌細胞的能力。術語「制真菌的」應被理解為有抑制真菌生長的能力，即抑制生長的真菌細胞。術語「殺病毒的」應被理解為有使病毒去活化的能力。術語「微生物細胞」代表細菌的或真菌的細胞(包括酵母菌)。

在本發明的背景中，術語「抑制微生物細胞的生長」係意欲意指細胞係於非生長狀態，即它們係無法增殖。

為了本發明的目的，抗微生物的活性可根據Lehrer等人,Journal of Immunological methods,Vol.137(2)pp.167－174(1991)所述的程序測定。或者，抗微生物的活性可根據來自CLSI(臨床與實驗室標準學會(Clinical and Laboratory Standards Institute)；之前被稱為國家臨床與實驗室標準委員會(National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的NCCLS指導方針測定。

具有抗微生物活性的多肽可為有以下的能力：在於20℃培養於具有抗微生物活性的多肽之25%(w/w)的水性溶液；較佳於10%(w/w)的水性溶液；更佳於5%(w/w)的水性溶液；甚至更佳於1%(w/w)的水性溶液；最佳於0.5%(w/w)的水性溶液；以及特別是於0.1%(w/w)的水性溶液24小時後(較佳12小時後，更加8小時後，更加4小時後，更加2小時後，最佳1小時後，且特別是30分鐘後)減少活大腸桿菌 (Escherichia coli )(DSM 1576)細胞數目至1/100。

具有抗微生物活性的多肽亦可具有以下的能力：在25℃於微生物的生長底物中，當以濃度1000 ppm加入；較佳當以濃度500 ppm加入；更佳當以濃度250 ppm加入；甚至更佳當以濃度100 ppm加入；最佳當以濃度50 ppm加入；以及特別是當以濃度25 ppm加入時，抑制大腸桿菌 (DSM 1576)的過度生長達二十四小時。

具有抗微生物活性的多肽可為具有以下的能力；在於20℃培養於具有抗微生物活性的多肽之25%(w/w)水性溶液；較佳於10%(w/w)的水性溶液；更佳於5%(w/w)的水性溶液；甚至更佳於1%(w/w)的水性溶液；最佳於0.5%(w/w)的水性溶液；以及特別是於0.1%(w/w)的水性溶液中24小時後(較佳12小時後，更加8小時後，更加4小時後，更加2小時後，最佳1小時後，且特別是30分鐘後)將活枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis )(ATCC 6633)之活細胞數目減少至1/100。

具有抗微生物活性之多肽亦可具有以下的能力：在25℃於微生物的生長底物中，當以濃度1000 ppm加入；較佳當以濃度500 ppm加入；更佳當以濃度250 ppm加入；甚至更佳當以濃度100 ppm加入；最佳當以濃度50 ppm加入；以及特別是當以濃度25 ppm加入時，抑制枯草芽孢桿菌 (ATCC 6633)的過度生長達二十四小時。

本發明的多肽具有由SEQ ID NO：2的胺基酸1至21所示之胺基酸序列所組成之多肽的至少20%，較佳至少40%，更佳至少50%，更佳至少60%，更佳至少70%，更佳至少80%，甚至更佳至少90%，最佳至少95%，或甚至最佳至少100%的抗微生物的活性。

經分離的多肽 ：術語「經分離的多肽」用於本文意指一種多肽，其至少係20%純的，較佳至少係40%純的，更佳至少係60%純的，甚至更佳至少係80%純的，最佳至少係90%純的，且甚至最佳至少係95%純的，其純度係以SDS－PAGE測定。

實質上純的多肽： 術語「實質上純的多肽」於本文代表一種多肽製備物，其包含最多10%，較佳最多8%，更佳最多6%，更佳最多5%，更佳最多4%，最多3%，甚至更佳最多2%，最佳最多1%，且甚至最佳最多0.5%以重量計的其他多肽物質，其為該多肽天然所結合的。因此，較佳地，實質上純的多肽係至少92%純的，較佳係至少94%純的，更佳係至少95%純的，更佳係至少96%純的，更佳係至少96%純的，更佳係至少97%純的，更佳係至少98%純的，甚至更佳係至少99%純的，最佳係至少99.5%純的，且甚至最佳係100%純的，其以出現在該製備物中之總多肽物質的重量計。

本發明的多肽較佳係呈實質上純的形式。特別是，較佳地，該多肽係呈「基本上地純的形式」，即，該多肽製備物係基本上不含其他其天然所結合的多肽物質。此可(例如)藉由使用廣為人知的重組方法或以典型的純化方法製備該多肽的手段而達成。

於此，術語「實質上純的多肽」係與術語「經分離的多肽」與「呈經分離的形式之多肽」同義。

一致性： 二胺基酸序列間或二核苷酸序列間的相關性係以參數「一致性」敘述。

為了本發明的目的，兩胺基酸序列間的一致性程度係藉由使用包含於FASTA套裝程式2.0x版之FASTA程式(參見W.R.Pearson與D.J.Lipman(1988),"Improved Tools for Biological Sequence Analysis",PNAS 85：2444－2448；以及W.R.Pearson(1990)"Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA",Medhods in Enzymology 183：63－98)而測定。所使用的計分矩陣係BLOSUM50，空隙罰分(gap penalty)係－12，而空隙拓展罰分(gap extension penalty)係－2。

二核苷酸序列間的一致性的程度係使用如上所述之相同的演算法與套裝軟體測定。所使用的計分矩陣係一致性矩陣，空隙罰分係－16，而空隙拓展罰分係－4。

或者，兩胺基酸序列的校準係藉由使用來自EMBOSS套裝(http：//emboss.org)2.8.0版之Needle程式測定。Needle程式執行總體校準演算法，其敘述於Needleman,S.B.與Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443－453。所使用的取代矩陣係BLOSUM62，空隙開放罰分(gap opening penalty)係10，而空隙拓展罰分係0.5。一本發明的胺基酸序列(例如SEQ ID NO：2之胺基酸1至43)與一不同的胺基酸序列間的一致性程度，係計算成在兩序列之校準中完全吻合之數目，除以本發明之序列的長度(胺基酸殘基數)；或可選擇地，標示為「最長一致」的Needle之輸出係用作百分比一致性，且係如以下計算：(相同殘基x 100)/(校準長度－校準中之空隙數目)。結果係以百分比一致性表現。

多肽片段： 術語「多肽片段」於本文係定義為一種多肽，其具有一或多胺基酸自SEQ ID NO：2、或等其同源序列的胺端及/或羧端刪除，其中該片段具有抗微生物的活性。在一個具體態樣中，該片段包括至少15個、較佳至少16個、更佳至少17個、甚至更佳至少18個、最佳至少19個、且特別是至少20個連續的SEQ ID NO：2之胺基酸。

次序列(subsequence)： 術語「次序列」於本文定義為一種核苷酸序列，其具有一或多核苷酸自SEQ ID NO：1、或其同源序列之5'及/或3'端刪除，其中該次序列編碼一個具有抗微生物活性之多肽片段。

等位基因性變異體： 術語「等位基因性變異體」於本文代表位於相同的染色體位點的一基因之二或多個選擇形式的任何任一者。等位基因性變異透過突變天然地產生，且可能在族群中導致多形性。基因突變可為沈默的(在其所編碼之多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的胺基酸序列之多肽。一多肽的等位基因性變異體係由一基因的等位基因性變異體所編碼的多肽。

實質上純的多核苷酸： 術語「實質上純的多核苷酸」用於本文意指一種多核苷酸製備物，其不含其他無關的或不想要的核苷酸，且係呈適合用於經基因性設計的蛋白質生產系統中的形式。因此，一實質上純的多核苷酸包含最多10%，較佳最多8%，更佳最多6%，更佳最多5%，更佳最多4%，更佳最多3%，甚至更佳最多2%，最佳最多1%，且甚至最佳最多0.5%以重量計的其他其天然所結合的多核苷酸物質。然而，一實質上純的多核苷酸可包括天然發生於5’與3’的未轉譯區域，例如啟動子與終止子。較佳地，實質上純的多核苷酸係至少90%純的，較佳至少92%純的，更佳至少94%純的，更佳至少95%純的，更佳至少96%純的，更佳至少97%純的，甚至更佳至少98%純的，最佳至少99%，且甚至最佳至少99.5%純的，其以重量計。本發明的多核苷酸較佳係呈實質上純的形式。特別是，較佳地，於此揭示的多核苷酸係呈「基本上地純的形式」，即，該多核苷酸製備物係基本上地不含其他其天然所結合的多核苷酸物質。於此，術語「實質上純的多核苷酸」係與術語「經分離的多核苷酸」以及「呈經分離形式的多核苷酸」同義。該多核苷酸可為基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源、或任何及組合。

cDNA： 術語「CDNA」於本文定義為一種DNA分子，其可藉由自成熟的、經剪接的、mRNA分子反轉錄而製備，該mRNA分子係獲自真核細胞。cDNA缺少通常出現於相對應的基因組DNA中的內含子序列。最初、初級RNA轉錄物係mRNA的前驅物，而mRNA在成為成熟的經剪接mRNA前透過一系列的步驟加工。這些步驟包括藉由稱為剪接的程序移去內含子序列。因此，衍生自mRNA的CDNA缺少任何內含子序列。

核酸構築體： 術語「核酸構築體」用於本文意指一種核酸分子，其可為單股或雙股，其係分離自一天然發生的基因，或其係經修改而以否則不會天然發生的方式包含核酸片段。當核酸構築體包含表現本發明的編碼序列所需之控制序列時，術語核酸構築體係與術語「表現匣」同義。

控制序列： 術語「控制序列」於本文定義成包括所有表現編碼本發明多肽之多核苷酸所需或有助於表現其的要素。每個控制序列對編碼多肽之核苷酸序列可為固有的或外來的。這些控制序列包括(但不限於)引導子、聚腺苷酸化序列、原胜肽序列、啟動子、訊號胜肽序列、以及轉錄終止子。最少，控制序列包括啟動子、以及轉錄終止訊號與轉譯終止訊號。控制序列可利用連接子來提供以導入特殊的限切位置以促進控制序列與編碼一多肽之核苷酸序列的編碼區域接合。

操作性地連結： 術語「操作性地連結」於本文代表一種結構，其中控制序列係置於一個相對於多核苷酸序列之編碼序列的適當位置，使得該控制序列指引多肽的編碼序列之表現。

編碼序列： 當於此使用時，術語「編碼序列」意指一核苷酸序列，其直接具體指定其蛋白質產物的胺基酸序列。編碼序列的邊界一般藉由開放讀框決定，而開放讀框通常以ATG起始密碼子或者例如GTG與TTG替代性起始密碼子開始。該編碼序列可為DNA、cDNA、或重組核苷酸序列。

表現： 術語「表現」包括任何包含於多肽的生產之步驟，其包括(但不限於)轉錄、轉錄後修改、轉譯、轉譯後修改、以及分泌。

表現載體： 術語「表現載體」於本文定義為一線性或環狀DNA分子，其包括編碼本發明多肽之多核苷酸，且其係操作性地連結至用於其表現之額外核苷酸。

宿主細胞： 術語「宿主細胞」(用於本文)包括任何細胞類型，其易受以包含本發明多核苷酸之核酸構築體之轉型、轉染、轉導、以及類似者的影響。

修改： 術語「修改」於本文意指任何由SEQ ID NO：2之胺基酸1至21所構成之多肽的化學修改，以及編碼該等多肽的DNA之基因操作。修改可為在該胺基酸序列的胺基酸之一或多個取代、刪除及/或插入以及胺基酸側鏈的取代；或使用具有類似特徵之非天然胺基酸。特別是，修改可為醯胺化作用，例如C端的醯胺化作用。

人工變異體： 當使用於此時，術語「人工變異體」意指一具有抗微生物活性的多肽，其藉由表現經修改之SEQ ID NO：1的核苷酸序列的生物生產。該經修改核苷酸序列係透過藉由揭示於SEQ ID NO：1之核苷酸序列的修改之人類干涉而獲得。

發明背景

本發明的一個目的係提供具有抗微生物活性的多肽與編碼該多肽的多核苷酸。

發明摘述

本發明係關於具有抗微生物活性之經分離的多肽，其係選自由以下者所組成的群組：(a)一種多肽，其具有與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21至少60%一致性的胺基酸序列；(b)一種由一核苷酸序列編碼的多肽，該核苷酸序列在至少中度嚴格條件下與以下者雜合(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558；或(ii)包含於SEQ ID NO：1的核苷酸1至558的cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的互補股；(c)一種變異體，其包括對SEQ ID NO：2之胺基酸1至21之一或多個胺基酸的保守性取代、刪除、及/或插入；以及(d)具有抗微生物活性之(a)或(b)的片段。

本發明亦係關於編碼具有抗微生物活性的多肽之經分離的多核苷酸，其係選自由以下者所組成的群組：(a)一種編碼具有與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21至少60%一致性的胺基酸序列的多肽之多核苷酸；(b)一種多核苷酸，其具有與SEQ ID NO：1之核苷酸496至558至少60%一致性；以及(c)一種多核苷酸，其在至少中度嚴格條件下與以下者雜合(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558；或(ii)包含於SEQ ID NO：1的核苷酸1至558的cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的互補股。

本發明亦係關於包含該多核苷酸的核酸構築體、重組表現載體、與重組宿主細胞。

本發明亦係關於生產如此具有抗微生物活性的多肽之方法，其包括(a)在有益於生產該多肽的條件下，培養包括核酸構築體的重組宿主細胞，該核酸構築體包括編碼該多肽的多核苷酸；以及(b)回收該多肽。

本發明亦係關於使用本發明之多肽與多核苷酸的方法。

發明詳述 具有抗微生物活性的多肽

在一個第一方面，本發明係關於經分離的多肽，其具有之胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21(即，成熟的多肽)具有以下程度的一致性：至少60%，較佳至少65%，更佳至少70%，更佳至少75%，更佳至少80%，更佳至少85%，甚至更佳至少90%，最佳至少95%，且甚至最佳至少97%，其具有抗微生物的活性(以下稱「同源多肽」)。在一個較佳的方面，同源多肽之胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21有十個胺基酸，較佳有五個胺基酸，更佳有四個胺基酸，甚至更佳有三個胺基酸，最佳有兩個胺基酸，且甚至最佳有一個胺基酸不同。

一本發明的多肽較佳包含SEQ ID NO：2或其等位基因性變異體；或具有抗微生物的活性之其片段之胺基酸序列。在一個較佳的方面，多肽包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列。在另一個較佳的方面，多肽包括SEQ ID NO：2之胺基酸1至21、或其等位基因性變異體；或其具有抗微生物的活性的片段。在另一個較佳的方面，多肽包括SEQ ID NO：2之胺基酸1至21。在另一個較佳的方面，多肽係由SEQ ID NO：2、或其等位基因性變異體；或具有抗微生物的活性的其等片段之胺基酸序列所組成。在另一個較佳的方面，多肽係由SEQ ID NO：2之胺基酸序列所組成。在另一個較佳的方面，多肽係由SEQ ID NO：2之胺基酸1至21；或其等等位基因性變異體；或具有抗微生物的活性的其等片段組成。在另一個較佳的方面，多肽係由SEQ ID NO：2之胺基酸1至21所組成。

在一第二方面，本發明係關於經分離的具有抗微生物活性的多肽，其係由在非常低度嚴格條件下，較佳在低度嚴格條件下，更佳在中度嚴格條件下，更佳在中度－高度嚴格條件下，甚至更佳在高度嚴格條件下，以及最佳在非常高度嚴格條件下與下列者雜合之多核苷酸所編碼：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)包含於SEQ ID NO：1、SEQ核苷酸1至558的cDNA序列，(iii)一(i)或(ii)的次序列、或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補股(J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual ,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。一SEQ ID NO：1的次序列包含至少100個連續的核苷酸或較佳包含至少200個連續的核苷酸。此外，該次序列可編碼具有抗微生物的活性之多肽片段。

SEQ ID NO：1，或其次序列的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：2或其等片段的胺基酸序列，可用於設計核酸探針，以從不同的屬或種之品系中，依照技藝中所熟知的技術鑑認並選殖編碼具有抗微生物活性的多肽的DNA。特別是，如此探針可用於與所興趣的屬或種之基因組或cDNA雜合(其依照標準南方墨點法程序)以鑑認並分離其中相對應的基因。如此探針可比完整序列短相當多，但長度應該至少為14個，較佳為至少25個，更佳為至少35個，與最佳為至少70個核苷酸。然而，較佳該核酸探針長度至少係100個核苷酸。例如，該核酸探針可為至少200個核苷酸，較佳至少為250個核苷酸。可使用DNA與RNA探針兩者。該探針典型地係經標定以用於偵測相對應的基因(例如，以32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)。如此探針係為本發明所涵蓋。

因此，可於來自如此其他生物所製備的基因組DNA或cDNA文庫中，篩選會與以上所述之探針雜合以及編碼具有抗微生物活性之多肽的DNA。來自如此其他生物之基因組或其他DNA可藉由瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳、或其他分離技術而分離。來自文庫的DNA或該經分離的DNA可轉移至並固定於硝化纖維或其他適合載運物質上。為了鑑認與SEQ ID NO：1，或其等次序列同源之殖系或DNA，該載運物質係用於南方墨點法。

為了本發明的目的，雜合意指，在非常低度至非常高度嚴格條件下，該核苷酸序列雜合至對應至SEQ ID NO：1所示者、其等互補股、或其等次序列的核苷酸序列之經標定核酸探針。該核酸探針在此條件下所雜合之分子可使用X－光底片偵測。

在一個較佳的方面，該核酸探針係多核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO：2、或其次序列之多肽。在另一個較佳的方面，該核酸探針係SEQ ID NO：1。在另一個較佳的方面，該核酸探針係SEQ ID NO：1之成熟多肽編碼區域。

對長度至少100個核苷酸的長探針，非常低度至非常高度嚴格條件係定義為預雜合與雜合於42℃，於5X SSPE、0.3% SDS、200微克/毫升經切斷並變性之鮭魚精子DNA，與25%甲醯胺(用於非常低度及低度嚴格條件)、35%甲醯胺(用於中度及中度－高度嚴格條件)、或50%甲醯胺(用於高度非常高度嚴格條件)，其依照標準南方墨點法程序最理想地進行12個至24個小時。

對長度至少100個核苷酸的長探針，載運物質最終清洗三次，每次15分鐘，其使用2X SSC、0.2% SDS，較佳於至少45℃(低度嚴格條件)，更佳於至少50℃(低度嚴格條件)，更佳係於至少55℃(中度嚴格條件)，更佳係於至少60℃(中度－高度嚴格條件)，甚至更佳係於至少65℃(高度嚴格條件)，以及最佳係於至少70℃(非常高度嚴格條件)。

對長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，嚴格條件係定義為預雜合、雜合、與雜合後清洗於低於根據Bolton與McCarthy(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)之計算而計算得之T_m 大約5℃至大約10℃，於0.9莫耳濃度NaCl、0.09莫耳濃度Tris－HCl pH 7.6、6毫莫耳濃度EDTA、0.5% NP－40、1X Denhardt氏溶液、1毫莫耳濃度焦磷酸鈉、1毫莫耳濃度單鹼磷酸鈉(Sodium monobasic phosphate)、0.1毫莫耳濃度ATP、與0.2毫克酵母菌RNA每毫升，依據標準南方墨點法程序。

對長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，載運物質係以6X SCC加上0.1% SDS清洗一次15分鐘以及使用6X SSC清理兩次各15分鐘，於低於計算所得之T_m 大約5℃至大約10℃。

在一個第三方面，本發明係關於人工變異體，其包括SEQ ID NO：2、或其等成熟多肽之一或多胺基酸的保守性取代、刪除、及/或插入。較佳地，胺基酸改變係小的，即不會明顯影響蛋白質折疊及/或活性的保守性胺基酸取代或插入；小刪除，典型係大約30個胺基酸；小胺基－或羧基－端延伸，例如胺基－端甲硫胺酸殘基；多達大約20－25個殘基的小連接子胜肽；或藉由改變整體電荷或其他官能幸(例如聚組胺酸道、抗原決定子或結合功能域)而促進純化的小延伸。

保守性取代之實例係落入鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸與組胺酸)、酸性胺基酸(麩胺酸與天冬胺酸)、極性胺基酸(麩醯胺酸與天冬醯胺酸)、疏水性胺基酸(白胺酸、異白胺酸與纈胺酸)、芳香族胺基酸(苯丙胺酸、色胺酸與酪胺酸)、與小型胺基酸(甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、羥丁胺酸與甲硫胺酸)的群組。一般不會改變特殊活性的胺基酸取代係於技藝中已知，並且係被(例如)H.Neurath與R.L.Hill,1979,於,The Proteins,Academic Press,New York敘述。最常發生的交換係Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、與Asp/Gly。

除了20個標準胺基酸外，非－標準胺基酸(例如4－羥基脯胺酸、6－N－甲基離胺酸、2－胺基異丁酸、異纈胺酸、與α－甲基絲胺酸)可用於取代野生型多肽之胺基酸殘基。一些有限數目的非－保守性胺基酸(不由基因密碼編碼的胺基酸)與非天然胺基酸可用於取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」在蛋白質合成後已經修改，及/或在其側鏈具有與標準胺基酸不同之化學結構。非天然胺基酸可被化學地合成，且較佳地係商業上可購得，且包括六氫菸生僉酸、噻唑啉羧酸、去氫脯胺酸、3－與4－甲基脯胺酸、以及3,3－二甲基脯胺酸。

或者，該胺基酸改變之本性係使多肽的物－化特性被改變例如，胺基酸改變可改善多肽的熱穩定性、改變受質專一性、改變最理想pH、以及類似者。

在根源多肽之基本胺基酸可根據於技藝中已知的程序，例如位置－針對性(site－directed)突變形成或丙胺酸－掃瞄突變形成(Cunningham與Wells,1989,Science 244：1081－1085)而鑑定。在後者的技術中，單一丙胺酸突變被導入至分子中的每個殘基，並測試結果突變分子的生物活性(即，抗微生物的活性)以鑑定對該分子的活性為基礎的胺基酸殘基。亦參見Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.271：4699－4708。生物交互作用亦可藉由物理分析結構(由例如核磁共振、結晶學、電子繞射、或光親合性標定之技術測定)，結合推定接觸位置胺基酸之突變而測定。參見(例如)de Vos等人,1992,Science 255：306－312；Smith 等人,1992,J.Mol.Biol.224：899－904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.309：59－64。基本的胺基酸的特性亦可從分析相關於根據本發明多肽之多肽的特性而推定。

可使用已知的突變形成、重組、或改組(shuffling)方法，接著藉由相關的篩選程序，例如那些Reidhaar－Olson與Sauer,1988,Science 241：53－57；Bowie與Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152－2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所敘述者，製造並測試單一或多重胺基酸取代。可使用之其他方法包括易錯(error－prone)PCR、噬菌體表現(例如，Lowman等人,1991,Biochem.30：10832－10837；美國專利案號5,223,409；WO 92/06204)、以及區域－針對性(region－directed)突變形成(Derbyshire等人,1986,Gene 46：145；Ner等人,1988,DNA 7：127)。

可結合突變形成/改組方法和高生產力、自動化篩選方法以偵測由宿主細胞所表現之經選殖的、誘變經的多肽之活性。編碼活性多肽之經誘變DNA分子可被從宿主細胞中回收並使用技藝中之標準方法快速定序。這些方法使在所興趣多肽中之個別胺基酸殘基的重要性之快速測定為可能，且可應用至結構未知的多肽。

SEQ ID NO：2之胺基酸1至21的胺基酸取代、刪除及/或插入之總數係10，較佳係9，更佳係8，更佳係7，更佳係最多6，更佳係最多5，更佳係4，甚至更佳係3，最佳係2，且甚至最佳係1。

在一個具體態樣中，本發明的多肽包括至少4個半胱胺酸殘基，較佳地該多肽包括正好4個半胱胺酸殘基。在另一個具體態樣中，本發明的多肽係環狀多肽。

N－端延伸

本發明的多肽之N－端延伸可適合地由從1至50個胺基酸，較佳2－20個胺基酸，特別地是3－15個胺基酸所組成。在一個具體態樣中，N－端胜肽延伸不包含Arg(R)。在另一個具體態樣中，該N－端延伸包括kex2或類－kex2切裂位置(其在以下進一步定義)。在一個較佳的具體態樣中，該N－端延伸係一個胜肽，包括至少兩個Glu(E)及/或Asp(D)胺基酸殘基，例如一個包括下列序列中之一者之N－端延伸：EAE、EE、DE與DD。

Kex2位置

Kex2位置(參見，例如，Methods in Enzymology Vol 185,ed.D.Goeddel,Academic Press Inc.(1990),San Diego,CA,“Gene Expression Technology”)與類－Kex2位置係在一些蛋白質的前－胜肽編碼區域與成熟的區域之間出現的雙鹼性(di－basic)辨識位置(即，切裂位置)。

插入Kex2位置或類－Kex2位置在某些實例中，被顯示會改善在前－胜肽切裂位置之正確的內胜肽酶加工，而導致增加的蛋白質分泌水平。

在本發明的背景中，插入kex2或類－Kex2位置會導致在N－端延伸的某個位置獲得切裂之可能，而導致抗微生物的多肽與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21所示的成熟的多肽相比被延伸。

經融合多肽

本發明的多肽亦包括經融合多肽或可切裂融合多肽，其中一另一多肽係被融合至本發明的多肽或其片段之N－端或C－端。經融合多肽係藉由將一編碼一另一多肽之核苷酸序列(或其部分)融合至一本發明之核苷酸序列(或其部分)而生產。用於生產融合多肽的技術係於技藝中已知，且包括將編碼該等多肽的該等編碼序列接合，使其等符合讀框且使經融合多肽的表現在相同的啟動子與終止子的控制下。

具有抗微生物活性的多肽之來源

本發明的多肽可獲得自任何屬的微生物，為了本發明的目的，術語「獲得自」當與所給定來源相關時，於此處應意指由一核苷酸序列編碼之該多肽係由該來源生產，或由來自該來源的核苷酸序列已插入其中的品系所生產。在一個較佳的方面，該獲得自給定來源之多肽係被分泌至細胞外。

本發明的多肽可為細菌的多肽。例如，該多肽可為葛蘭氏陽性細菌的多肽，例如桿菌的多肽，例如，嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus )、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )、短毛乳酸桿菌、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans )、凝結芽孢桿菌、Bacillus lautus 、遲緩孢芽桿菌(Bacillus lentus )、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )、巨桿菌、脂肪嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇雲金孢芽桿菌(Bacillus thuringiensis )的多肽；或鏈黴菌的多肽，例如，變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans )或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus )的多肽；或葛蘭氏陰性細菌的多肽，例如，大腸桿菌或一假單胞菌的多肽。

本發明的多肽亦可為真菌的多肽，且更佳為酵母菌的多肽，例如假絲酵母菌、克魯維酵母菌(Kluyveromyces )、畢赤酵母菌、釀母菌、裂殖酵母菌、或耶氏酵母菌(Yarrowia )的多肽；或更佳係絲狀真菌的多肽，例如枝頂孢真菌、麴菌、短梗霉菌(Aureobasidium )、隱球菌、Filibasidium 、鐮孢(Fusarium )、軟化菌(Humicola )、Magnaporthe 、毛黴菌、毀絲黴菌(Myceliophthora )、Neocallimastix 、紅黴菌、擬青黴菌(Paecilomyces )、青黴菌、Piromyces 、裂摺菌(Schizophyllum )、籃狀菌(Talaromyces )、嗜熱子囊菌(Thermoascus )、梭孢殼菌(Thielavia )、Tolypocladium 、或木黴菌的多肽。

在一個較佳的方面，該多肽係卡爾酵母菌、啤酒酵母菌、凝聚性酒精酵母菌(Saccharomyces diastaticus )、道格拉斯酵母菌(Saccharomyces douglasii )、克魯弗酵母菌(Saccharomyces kluyveri )、諾地酵母菌(Saccharomyces norbensis )、或卵形酵母菌(Saccharomyces oviformis )的具有抗微生物活性之多肽。

在另一個較佳的方面，該多肽係棘孢麴菌(Aspergillus aculeatus )、泡盛麴菌、熏煙色麴菌、臭麴菌(Aspergillus foetidus )、日本麴菌(Aspergillus japonicus )、小巢狀麴菌、黑麴菌、米麴菌、杆孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides )、Fusarium cerealis 、Fusarium crookwellense 、大刀鐮孢(Fusarium culmorum )、禾本科鐮孢(Fusarium graminearum )、赤禾鐮孢(Fusarium graminum )、異孢鐮孢(Fusarium heterosporum )、合歡木鐮孢(Fusarium negundi )、尖鐮孢(Fusarium oxysporum )、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum )、粉紅鐮孢(Fusarium roseum )、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum )、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum )、三隔鐮孢(Fusarium sporotrichioides )、Fusarium sulphureum 、Fusarium torulosum 、Fusarium trichothecioides 、Fusarium venenatum 、Humicola insolens 、Humicola lanuginosa 、Mucor miehei 、Myceliophthora thermophila 、粗厚紅黴菌(Neurospora crassa)、產紫青黴(Penicillium purpurogenum )、哈茨木霉(Trichoderma harzianum )、康氏木霉(Trichoderma koningii )、Trichoderma longibrachiatum 、裡氏木霉(Trichoderma reesei )、或綠色木霉(Trichoderma viride )的多肽。

在另一個較佳的方面，該多肽係海洋蠕蟲 (Arenicola marina )的多肽，例如SEQ ID NO：2。

應瞭解對於以上所提及的種，本發明涵蓋完美的與不完美的狀態(state)兩者，以及其他分類的同等物，例如，無性型(anamorphs)，不論其係以何物種名稱為人知。那些熟習該項技術者會輕易地認知適合同等物的一致性。

這些物種的品系可輕易地公眾獲得自許多培養收集中心，如美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、皇家荷蘭生物科技研究所培養物保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、與農業研究服務專利培養收集中心，北區研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

此外，如此多肽可被鑑定並獲得自其他來源，包括分離自天然(例如，土壤、堆肥、水；等等)的微生物，其使用上述探針分離。用於自天然棲息地分離微生物的技術係於技藝中廣為人知。該多核苷酸可接著類似地藉由篩選其他微生物的基因組或cDNA文庫而獲得。一旦編碼一多肽的多核苷酸序列已被探針偵測到，該多核苷酸可藉由使用技藝中一般技術者熟知的技術而分離或選殖(參見，例如，Sambrook等人,1989,如上述)。

本發明的多肽亦包括經融合多肽或可切裂融合多肽，其中一另一多肽被融合至該多肽或其片段的N－端或C－端。經融合多肽係藉由融合一編碼一另一多肽的核苷酸序列(或其部分)至一本發明的核苷酸序列(或其部分)而產生。用於生產融合多肽的技術係於技藝中已知，且包括接合編碼該等多肽的該等編碼序列，使其等符合讀框並在相同的啟動子與終止子控制下表現該經融合多肽。

多核苷酸

本發明亦係關於經分離的多核苷酸，其具有編碼本發明之多肽的核苷酸序列。在一個較佳的方面，該核苷酸序列係於SEQ ID NO：1中提出。在另一個較佳的方面，該核苷酸序列係SEQ ID NO：1的成熟多肽編碼區域。本發明亦涵蓋核苷酸序列，其編碼具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的多肽或其成熟多肽，其與SEQ ID NO：1基本上為基因密碼的簡併不同。本發明亦係關於SEQ ID NO：1的次序列，其編碼SEQ ID NO：2的具有抗微生物的活性之片段。

本發明亦係關於突變多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽編碼序列中包括至少一個突變，其中該突變核苷酸序列編碼一個由SEQ ID NO：2之胺基酸1至21所組成的多肽。

用於分離或選殖編碼多肽的多核苷酸之技術於技藝中係已知，且包括自基因組DNA分離、自cDNA製備、或其組合。從如此基因組DNA選殖本發明的多核苷酸可有效地藉由，例如，使用所熟知的聚合酶連鎖反應(PCR)達成，或藉由抗體篩選表現文庫以偵測具有共同結構性的特徵之所選殖DNA片段而達成。參見，例如，Innis等人,1990,PCR：A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可使用其他核酸放大程序，例如接合酶連鎖反應(LCR)、經接合經活化轉錄(LAT)、以及基於核苷酸序列之放大(nucleotide sequence－based amplification，NASBA)。多核苷酸可選殖自蠕蟲屬 (Arenicola )品系或另一或相關生物，因此(例如)可為該核苷酸序列之多肽編碼區域的等位基因性或物種變異體。

本發明亦係關於多核苷酸，其具有與SEQ ID NO：1之成熟多肽編碼序列(即，核苷酸496至558)間具有以下程度的一致性之核苷酸序列：至少60%，較佳至少65%，更佳至少70%，更佳至少75%，更佳至少80%，更佳至少85%，更佳至少90%，甚至更佳至少95%，以及最佳至少97%一致性，其編碼一活性多肽。

修改編碼本發明多肽之核苷酸序列對合成實質上類似於該多肽的多肽可能為必須的。術語「實質上類似於」該多肽意指該多肽的非－天然發生形式。這些多肽與分離自其天然來源之多肽可具有一些經設計方式的不同，例如，在比活性、熱穩定性、最佳pH、或類似者不同的人工變異體。該變異體序列可基於以SEQ ID NO：1之多肽編碼區域表現的核苷酸序列(例如，其次序列)之基礎而構築，及/或藉由導入不會導致由該核苷酸序列編碼之多肽的另一胺基酸序列，而是對應至意欲用於生產該酵素之宿主生物所使用之密碼子的核苷酸取代而構築，或藉由導入會導致不同的胺基酸序列之核苷酸取代而構築。對核苷酸取代之一般敘述，參見，例如，Ford等人,1991,Protein Expression and Purification 2：95－107。

對那些熟習該項技術者而言以下係明顯的：如此取代可在對分子功能為關鍵之區域以外製造並仍然產生活性的多肽。對於由本發明之經分離的多核苷酸編碼的多肽之活性為基本(以及因此較佳不被取代)的胺基酸殘基可根據於技藝中已知的程序而鑑定，例如位置－針對性突變形成或丙胺酸－掃瞄突變形成(參見，例如，Cunningham與Wells,1989,Science 244：1081－1085)。在後者的技術中，突變被導入至分子中每個帶正電的殘基，並測試結果突變分子的抗微生物活性以鑑定對該分子的活性為基礎的胺基酸殘基。受質－酵素交互作用的位置亦可藉由分析由例如核磁共振分析、結晶學、或光親合性標定之技術測定的三度空間結構而測定(參見，例如，de Vos等人,1992,Science 255：306－312；Smith等人,1992,Journal of Molecular Biology 224：899－904；Wlodaver等人,1992,FEBS Letters 309：59－64)。

本發明亦係關於編碼本發明的多肽之經分離的多核苷酸，其在低度嚴格條件，較佳在中度嚴格條件，更佳在中度－高度嚴格條件，甚至更佳在高度嚴格條件，以及最佳在非常高度嚴格條件下與以下者雜合(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)包含於SEQ ID NO：1的核苷酸1至558，或(iii)(i)或(ii)的互補股；或等其位基因性變異體與其次序列(Sambrook等人,1989,如上述)，如此處所定義。

本發明亦係關於經分離的多核苷酸，其藉由以下方法獲得：(a)在低度、中度、中度－高度、高度、或非常高度嚴格條件下將一DNA族群與以下者雜合(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)包含於SEQ ID NO：1的核苷酸1至558，或(iii)(i)或(ii)的互補股；以及(b)分離該雜合多核苷酸，其編碼具有抗微生物活性之多肽。

核酸構築體

本發明亦係關於核酸構築體，其包括本發明的經分離多核苷酸，該多核苷酸操作性地連結至一或多個控制序列，其在適合宿主細胞中在與該控制序列相容的條件下引導該編碼序列的表現。

編碼本發明多肽之經分離的多核苷酸可以各種方式操作以表現多肽。在將多核苷酸插入載體前操作其序列根據表現載體可能為所欲的或必要的。使用重組DNA方法而修改多核苷酸序列之技術於技藝中係廣為人知的。

控制序列可為適合的啟動子序列，其為一核苷酸序列，其被宿主細胞辨識以表現編碼本發明多肽的多核苷酸序列。該啟動子序列包含轉錄控制序列，其介導該多肽的表現。該啟動子可為任何在所選擇之宿主細胞中顯示轉錄活性的核苷酸序列，其包括突變的、截短的、與雜合的啟動子，且可獲得自編碼對宿主細胞為同源或異源的、細胞內或細胞外的多肽之基因。

用於引導本發明之核酸構築體的轉錄(特別地於細菌宿主細胞中)的適合啟動子之實例，係獲得自以下者之啟動子：大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂分解酵素基因(dagA)、枯草芽孢桿菌菌果聚醣蔗糖基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α －澱粉酶基因(amyL)、脂肪嗜熱芽孢桿菌產麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌α －澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA與xylB基因、以及原核生物性β－內醯胺酶基因(Villa－Kamaroff等人,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727－3731)，以及tac啟動子(DeBoer 等人,1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21－25)。進一步的啟動子係敘述在"Useful proteins from recombinant bacteria"於Scientific American,1980,242：74－94；以及於Sambrook等人,1989，如上述。

用於在絲狀真菌宿主細胞引導本發明之核酸構築體轉錄之適合的啟動子之實例，係獲得自對以下者之基因的啟動子：米麴菌TAKA澱粉酶、Rhizomucor miehei天門冬胺酸蛋白質酶、黑麴菌中性α －澱粉酶、黑麴菌酸穩定性α －澱粉酶、黑麴菌或泡盛麴菌葡萄糖澱粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂酶、米麴菌鹼性蛋白酶、米麴菌丙醣磷酸異構酶、小巢狀麴菌乙醯胺酶(acetamidase)、Fusarium venenatum澱粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO00/56900)、Fusarium venenatum Quinn (WO00/56900)、尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶(WO96/00787)、裡氏木霉β－葡萄糖苷酶、裡氏木霉纖維二糖水解酶I、裡氏木霉內葡聚醣酶I、裡氏木霉內葡聚醣酶II、裡氏木霉內葡聚醣酶III、裡氏木霉內葡聚醣酶IV、裡氏木霉內葡聚醣酶V、裡氏木霉木膠多糖酶I、裡氏木霉木膠多糖酶II、裡氏木霉β－木糖苷酶、以及NA2－tpi啟動子(一來自黑麴菌中性α －澱粉酶與米麴菌丙醣磷酸異構酶之基因的啟動子之雜合)；以及其突變的、截短的、與雜合的啟動子。

在酵母菌宿主中，有用的啟動子係獲得自對以下者之基因：啤酒酵母菌烯醇酶(ENO－1)、啤酒酵母菌半乳糖激酶(GAL1)、啤酒酵母菌酒精去氫酶/甘油醛－3－磷酸鹽去氫酶(ADH1,ADH2/GAP)、啤酒酵母菌丙醣磷酸異構酶(TPI)、啤酒酵母菌金屬硫蛋白(metallothionine)(CUP1)、與啤酒酵母菌3－磷酸甘油酸激酶。其他對酵母菌宿主細胞有用的啟動子係敘述於Romanos等人,1992,Yeast 8：423－488。

控制序列亦可為適合的轉錄終止子序列，其係被宿主細胞辨識以終止轉錄的序列。該終止子序列係操作性地連結至編碼該多肽的核苷酸序列之3’末端。任何在所選擇的宿主細胞中起作用的終止子皆可用於本發明中。

用於絲狀真菌宿主細胞的較佳終止子係獲得自對以下者之基因：米麴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、小巢狀麴菌鄰胺苯甲酸合成酶、黑麴菌α －葡萄糖苷酶、與尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶。

用於酵母菌宿主細胞之較佳終止子係獲得自以下者之基因：啤酒酵母菌烯醇酶、啤酒酵母菌細胞色素C(CYC1)、與啤酒酵母菌甘油醛－3－磷酸鹽去氫酶。其他對酵母菌宿主細胞的有用終止子係敘述於Romanos等人,1992，如上述。

控制序列亦可為適合的領導序列(leader sequence)，其為mRNA的一未轉譯區域(其對宿主細胞之轉譯為重要)。該領導序列係操作性地連結至編碼該多肽的核苷酸序列之5’末端。任何在所選擇的宿主細胞中起作用的領導序列可用於本發明中。

用於絲狀真菌宿主細胞的較佳領導序列係獲得自對以下者之基因：米麴菌TAKA澱粉酶與小巢狀麴菌丙醣磷酸異構酶。

對酵母菌宿主細之適合引導序列係獲得自以下者之基因：啤酒酵母菌烯醇酶(ENO－1)、啤酒酵母菌3－磷酸甘油酸激酶、啤酒酵母菌α －因子、與啤酒酵母菌酒精去氫酶/甘油醛－3－磷酸鹽去氫酶(ADH2/GAP)。

控制序列亦可為聚腺苷酸化序列，其為一操作性地連結至核苷酸序列3’末端的序列，且其(當被轉錄時)被宿主細胞辨認為將聚腺嘌呤核苷殘基加至所轉錄mRNA的訊號。任何在所選擇的宿主細胞中起作用的聚腺苷酸化序列可用於本發明。

用於絲狀真菌宿主細胞之較佳聚腺苷酸化序列係獲得自以下者之基因：米麴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、小巢狀麴菌鄰胺苯甲酸合成酶、尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶、以及黑麴菌α －葡萄糖苷酶。

對酵母菌宿主細胞有用之聚腺苷酸化序列係敘述於Guo與Sherman,1995,Molecular Cellular Biology 15：5983－5990。

控制序列亦可為訊號胜肽編碼區域，其編碼一連接至一多肽的胺基末端之胺基酸序列並引導所編碼多肽至細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可天然地包含一訊號胜肽編碼區域，其天然地以符合轉譯讀框的方式與編碼該所分泌多肽之編碼區域片段連接。或者，該編碼序列的5’末端可包含一訊號胜肽編碼區域，其對該編碼序列為外來。該外來訊號胜肽編碼區域在編碼區域不天然包含一訊號胜肽編碼區域時可能係所需。或者，該外來訊號胜肽編碼區域可簡單地取代天然的訊號胜肽編碼區域以加強該多肽的分泌。然而，任何引導所表現多肽至所選擇宿主細胞之分泌途徑的訊號胜肽編碼區域皆可用於本發明。

對細菌宿主細胞有效的訊號胜肽編碼區域係獲得自以下基因的訊號胜肽編碼區域：桿菌NCIB 11837之產麥芽糖澱粉酶、脂肪嗜熱芽孢桿菌α －澱粉酶、地衣芽孢桿菌地衣芽孢桿菌素酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β－內醯胺酶、脂肪嗜熱芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、npfS、nprM)、與枯草芽孢桿菌prsA。進一步的訊號胜肽係敘述於Simonen與Palva、1993、Microbiological Reviews 57：109－137。

對絲狀真菌宿主細胞有效的訊號胜肽編碼區域係獲得自以下基因的訊號胜肽編碼區域：米麴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌中性澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、Rhizomucor miehei 天門冬胺酸蛋白酶、Humicola insolens 纖維素酶、與Humicola lanuginosa 脂酶。

在一個較佳的方面，訊號胜肽編碼區域係SEQ ID NO：1之核苷酸1至72，其編碼SEQ ID NO：2之胺基酸－165至－142。

對酵母菌宿主細胞有用的訊號胜肽係獲得自以下者的基因：啤酒酵母菌α－因子與啤酒酵母菌轉化酶。其他有用的訊號胜肽編碼區域係敘述於Romanos等人,1992，如上述。

控制序列亦可為原胜肽編碼區域，其編碼一位於一多肽之胺基末端的胺基酸序列。結果的多肽被稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些實例稱為酶原(zymogen))。多肽原一般地係不活性的，且可藉由將原胜肽自多肽原催化性地或自催化地切裂而被轉換成成熟的活性多肽。原胜肽編碼區域可獲得自以下者的基因：枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒酵母菌α－因子、Rhizomucor miehei 天門冬胺酸蛋白酶、與Myceliophthora thermophila 漆酶(WO 95/33836)。

在一個較佳的方面，原胜肽編碼區域係SEQ ID NO：1之核苷酸73至495，其編碼SEQ ID NO：2之胺基酸－141至－1。

雖然訊號胜肽與原胜肽區域兩者接出現在多肽的胺基末端，原胜肽區域係位於多肽的胺基末端之旁，而訊號胜肽區域係位於原胜肽區域之胺基末端之旁。

亦可能欲加入調節序列，其使該多肽可對應宿主細胞的生長而調節其表現。調節系統的實例係那些導致基因的表現對化學或物理刺激(包括調節性化合物的存在)反應而被打開或關閉者。在原核生物系統之調節系統包括lac、tac與trp操縱子系統。在酵母菌中，可使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可使用TAKA α－澱粉酶啟動子、黑麴菌葡萄糖澱粉酶啟動子、與米麴菌葡萄糖澱粉酶啟動子作為調節性序列。其他調節序列的實例為那些允許基因放大者。在真核系統中，這些包括二氫葉酸還原酶基因，其在甲氨蝶呤(methotrexate)存在時會被放大，以及金屬硫蛋白基因，其在重金屬存在下會被放大。在這些實例中，編碼該多肽的核苷酸序列會與調節序列操作性地連結。

表現載體

本發明亦係關於重組表現載體，其包括本發明的多核苷酸、啟動子、與轉錄與轉譯終止訊號。上述各種核酸與控制序列可被結合在一起以產生重組表現載體，其可包括一或多個例行的限制位置，以使編碼該多肽的核苷酸序列可插入或取代至如此位置。或者，本發明的核苷酸序列可藉由將包含該序列的核苷酸序列或核酸構築體插入用於表現的適合載體而表現。在創造表現載體時，該編碼序列係置於該載體，使得該編碼序列係與用於表現之適合的控制序列操作性地連結。

重組表現載體可為任何載體(例如，質體或病毒)，其可例行地接受重組DNA程序且可引起該核苷酸序列的表現。載體的選擇典型地會根據該載體與該載體被導入的宿主細胞間的相容性。該載體可為線性或封閉環狀質體。

載體可為獨立複製載體，即，為染色體外存在，且其複製獨立於染色體複製之載體，例如，質體、染色體外元件(extrachromosome element)、袖珍染色體、或人工染色體。該載體可包含用於確保自我複製之任何方式。或者，該載體可為以下者：當其被導入宿主細胞時，會併入基因組中並與其所併入的染色體一起複製。此外，可使用單一載體或質體或二個或更多個載體或質體(其一起包含要導入宿主細胞的基因組之整體DNA)、或轉位子。

本發明的載體較佳包含一或多個可選擇標記，其允許經轉型細胞之輕易選擇。可選擇標記係一基因，其產物提供殺生物的或病毒的抗性、對重金屬的抗性、自營性(prototrophy)至他營(auxotrophs)、以及類似者。

細菌的可選擇標記之實例為來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因、或給予對抗生素例如胺丫青黴素、康微素、氯黴素、或四環素抗性的標記。用於酵母菌宿主細胞的適合標記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、與URA3。用於絲狀真菌宿主細胞之可選擇標記包括(但不限於)amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥胺酸甲胺醯基轉移酶)、bar(甲基次膦酸(phosphinothricin)乙醯轉移酶)、hph(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清酸核苷－5’－磷酸去羧基酶)、sC(硫酸鹽腺苷轉移酶)、以及trpC(鄰胺苯甲酸合成酶)、以及其同等物。用於麴菌細胞之較佳者為小巢狀麴菌或米麴菌之amdS與pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus )的bar基因。

本發明的載體較佳包含一或多個元件，其允許載體併入宿主細胞的基因組或允許載體在細胞中獨立於基因組自我複製。

為了併入宿主細胞的基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸序列或任何其他載體的元件，其用於藉由同源或非同源重組併入基因組。或者，該載體可包含額外的核苷酸序列，其用於引導藉由同源重組併入至宿主細胞基因組之染色體的精確位置。為了增加併入精確位置的可能性，併入元件較佳應包含足夠數量的核酸，例如100至10,000個鹼基、較佳為400至10,000個鹼基、與最佳為800至10,000個鹼基，其與相對應的目標間具有高度一致性以增強同源重組的可能性。併入元件可為任何與該宿主細胞的基因組中之目標序列同源的序列。此外，併入元件可為非－編碼或編碼核苷酸序列。在另一方面，載體可藉由非－同源重組併入宿主細胞的基因組。

為了自我複製，載體可進一步包括使載體能在所疑問的宿主細胞中自我複製的複製起點。複製起點可為任何質體複製子(replicator)，其介導在細胞中起作用的自我複製。術語「複製起點」或「質體複製子」於本文係定義為使質體或載體能活體內複製的核苷酸序列。

細菌的複製起點之實例為以下者的複製起點：質體pBR322、pUC19、pACYC177、與pACYC184，其允許在大腸桿菌中的複製，以及pUB110、pE194、pTA1060、與pAM1，其允許在桿菌中的複製。

用於酵母菌宿主細胞之複製起點的實例係2微米(2 micron)複製起點、ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。

用於絲狀真菌細胞之複製起點的實例係AMA1與ANS1(Gems等人,1991,Gene 98：61－67；Cullen等人,1987,Nuclear Acids Research 15：9163－9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分離與包含該基因的質體或載體之構築可根據WO 00/24883所揭示的方法完成。

可將多於一個複製(copy)的本發明之多核苷酸插入至宿主細胞中以增加基因產物的生產。為增加多核苷酸的複製數，可藉由將至少一個額外的該序列之複製併入該宿主細胞基因組而獲得，或藉由使該多核苷酸包括一可放大可選擇標記基因，使細胞包含放大複製的可選擇標記基因，且因此額外複製多核苷酸可藉由在適合的選擇劑存在下培養該細胞而選擇。

用於接合上述之元件以構築本發明之重組表現載體的程序對熟習該項技術者係熟知(參見，例如，Sambrook等人,1989，如上述)。

宿主細胞

本發明亦係關於重組宿主細胞，其包括本發明的多核苷酸，且其係有助於用於多肽之重組生產。包含本發明之多核苷酸的載體係導至宿主細胞，使得該載體係維持為染色體部分(chromosomal integrant)或為自我複製染色體外載體，如上述。術語「宿主細胞」含蓋任何親代細胞的後代，其因為複製中發生的突變而與親代細胞不同。宿主細胞的選擇會大大地根據編碼多肽的基因以及其來源。

宿主細胞可為單細胞微生物，例如，原核生物、或非－單細胞微生物，例如，真核生物。

有用的單細胞微生物係細菌細胞，例如葛蘭氏陽性細菌，包括(但不限於)桿菌細胞，例如，嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短毛乳酸桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii )、凝結芽孢桿菌、Bacillus lautus 、遲緩孢芽桿菌、地衣芽孢桿菌、巨桿菌、脂肪嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、與蘇雲金孢芽桿菌；或鏈霉菌細胞，例如，變鉛青鏈霉菌與鼠灰鏈霉菌、或葛蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌與假單胞菌。在一個較佳的方面，細菌宿主細胞係遲緩孢芽桿菌、地衣芽孢桿菌、脂肪嗜熱芽孢桿菌、或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個較佳的方面，桿菌細胞係嗜鹼桿菌。

將載體導入細菌性宿主細胞可，例如，藉由原生質體轉型(參見，例如，Chang與Cohen,1979,Molecular General Genetics 168：111－115)、使用勝任細胞(參見，例如，Young與Spizizin,1961,Journal of Bacteriology 81：823－829、或Dubnau與Davidoff－Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56：209－221)、電穿孔(參見，例如，Shigekawa與Dower,1988,Biotechniques 6：742－751)、或接合(參見，例如，Koehler與Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169：5771－5278)而得到效果。

宿主細胞亦可為真核生物，例如哺乳類動物、昆蟲、植物、或真菌的細胞。

在一個較佳的方面，宿主細胞係真菌細胞。「真菌」用於本文包括子囊菌門、擔子菌門、壺菌門、與接合菌門(如Hawksworth等人,在,Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(如在Hawksworth等人,1995,如上述,第171頁所舉出)以及所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人,1995，如上述)。

在一個較佳的方面，真菌宿主細胞係酵母菌細胞。「酵母菌」用於本文包括產子囊酵母菌(內孢霉目)、產擔孢子酵母菌、與屬於不完全真菌(芽生菌目)的酵母菌。因為酵母菌的分類未來可能會改變，為了本發明的目的，酵母菌應被定義為如Biology and Activity of Yeas(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,與Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

在一個甚至較佳的方面，酵母菌宿主細胞係假絲酵母菌、漢遜酵母菌(Hansenula)、克魯維酵母酵母菌、畢赤酵母菌、釀母菌、裂殖酵母、或耶氏酵母菌細胞。

在一個最佳的方面，酵母菌宿主細胞係卡爾酵母菌、啤酒酵母菌、凝聚性酒精酵母菌、道格拉斯酵母菌、克魯弗酵母菌、諾地酵母菌或卵形酵母菌細胞。在一個其他最佳方面，該酵母菌宿主細胞係乳酸克魯維酵母菌(Kluveromyces lacits )細胞。在一個其他最佳方面，該酵母菌宿主細胞係解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica )細胞。

在另一個更佳的方面，真菌宿主細胞係絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括亞門真菌門與卵菌門(如Hawksworth等人,1995,如上述，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌一般特徵為由幾丁質、纖維素、聚葡萄糖、聚殼糖、甘露聚糖、以及其他複合多醣構成的菌絲壁。其營養生長係藉由菌絲的延長而碳代謝係必為需氧的。相反的，酵母菌(例如啤酒酵母菌)的營養生長係藉由單細胞菌體的出芽而碳代謝可係發酵性的。

在一個甚至更佳的方面，絲狀真菌宿主細胞係枝頂孢真菌、麯菌、短梗霉菌、煙管菌(Bjerkandera )、擬蠟孔菌(Ceriporiopsis )、一夜蕈、革蓋菌(Coriolus )、隱球菌、Filibasidium 、鐮孢、軟化菌、Magnaporthe 、毛黴菌、毀絲黴菌、Neocallimastix 、紅黴菌、擬青黴菌、青黴菌、顯絲菌(Phanerochaete )、射脈菌(Phlebia )、Piromyces 、側耳菌(Pleurotus )、裂摺菌、Talaromyces 、Thermoascus 、梭孢殼菌、Tolypocladium 、松慶病菌、或木黴細胞。

在一個最佳佳的方面，絲狀真菌宿主細胞係泡盛麴菌、熏煙色麴菌、臭麴菌、日本麴菌、小巢狀麴菌、黑麴菌或米麴菌細胞。在另一個最佳的方面，絲狀真菌宿主細胞係杆孢狀鐮孢、Fusarium cerealis 、Fusarium crookwellense 、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、赤禾鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、三隔鐮孢、Fusarium sulphureum 、Fusarium torulosum 、Fusarium trichothecioides 、Fusarium venenatum 細胞。在另一個最佳的方面，絲狀真菌宿主細胞係煙管菌(Bjerkandera adusta )、幹擬蠟菌(Ceriporiopsis aneirina )、Ceriporiopsis caregiea 、Ceriporiopsis gilvescens 、Ceriporiopsis pannocinta 、Ceriporiopsis rivulosa 、Ceriporiopsis subrufa 、或蟲擬蠟菌(Ceriporiopsis subvermispora )、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus )、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus )、Humicola insolens 、Humicola lanuginosa 、Muicor miehei 、Myceliophthora thermophila 、粗厚紅黴菌(Neurospora crassa )、產紫青黴、黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium )、射脈菌(Phlebia radiata )、Pleurotus eryngii 、Thielavia terrestris 、長絨毛栓菌(Trametes villosa )、彩絨栓菌(Trametes versicolor )、哈茨木霉、康氏木霉、Trichoderma longibrachiatum 、裡氏木霉、或綠色木霉品系細胞。

真菌細胞可藉由(就其本身而言為已知的方式)包括原生質體形成、原生質體之轉型、與細胞壁再生的程序而轉型。用於轉型麯菌與木黴宿主細胞之適合程序係敘述於EP 238 023以及Yelton等人,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470－1474。用於轉型鐮孢物種之適合方法係敘述於Malardier等人,1989,Gene 78：147－156,與WO 96/00787。酵母菌可使用敘述於以下者之程序轉型：Becker與Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.,editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182－187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等人,1983,Journal of Bacteriology 153：163；以及Hinnen等人,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920。

生產方法

本發明亦係關於生產本發明之多肽的方法，其包括(a)在有益於生產該多肽的條件下培養一細胞，其於野生型有生產該多肽的能力；以及(b)回收該多肽。較佳地，該細胞係蠕蟲屬 (Arenicola )，且更佳係海洋蠕蟲 (Arenicola marina )。

本發明亦係關於生產本發明之多肽的方法，其包括(a)在有益於生產該多肽的條件下培養一宿主細胞；以及(b)回收該多肽。

本發明亦係關於生產本發明之多肽的方法，其包括(a)在有益於生產該多肽的條件下培養一宿主細胞，其中該宿主細胞包括一突變核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1之成熟多肽編碼區域至少具有一個突變，其中該突變核苷酸序列編碼由SEQ ID NO：2之胺基酸1至21所組成的多肽，以及(b)回收該多肽。

在本發明的生產方法中，細胞係使用技藝中所熟知的方法培養於適合用於生產該多肽的營養培養基中。例如，該細胞可藉由搖動燒瓶培養、以及藉由在實驗室或工業用發酵器中之小規模的或大規模的發酵(包括連續性、批次(batch)、給料批次(fed－batch)、或固態發酵)於適合的培養基與在允許該多肽被表現及/或分離的條件下進行而培養。培養係在適合的營養培養基中進行，而該培養基包括碳與氮源以及無機鹽，其使用於技藝中已知的程序。適合的培養基係可購自商業提供者或可根據已出版的配方(例如，於美國菌種保存中心之形錄)而製備。若該多肽係被分泌至營養培養基中，則該多肽可直接從培養基中回收。若該多肽係非分泌性的，則其可從細胞溶胞產物中回收。

多肽可使用於技藝中已知對該多肽具有專一性的方法偵測。這些偵測方法可包括使用專一性抗體。例如，抗微生物的活性分析可用於測定如此所述之多肽的活性。

所產生的多肽可使用於技藝中已知的方法回收。例如，該多肽可從營養培養基中藉由慣例的程序(其包括，但不限於，離心、過濾、萃取、噴乾、蒸發、或沈澱)回收。

本發明的多肽可藉由各種於技藝中已知的程序純化，其包括(但不限於)色析法(例如，離子交換、親合力、疏水性、色層焦集法(chromatofocusing)以及尺寸排除(size exclusion))、電泳程序(例如，製備性等電聚焦(preparative isoelectric focusing))、差別溶解度(differential solubility，例如，硫酸銨沈澱)、SDS－PAGE、或萃取(參見，例如，Protein Purification,J.－C.Janson與Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)。

植物

本發明亦係關於基因轉殖植物、植物部分、或植物細胞，其已以編碼本發明的具有抗微生物活性之多肽的核苷酸序列轉型，使其以可回收量表現與生產該多肽。該多肽可自植物或植物部分回收。或者，該包含該重組多肽的植物或植物部分本身可被使用，以改善食物或飼料的品質，例如，改善營養價值、美味程度、以及流變特性、或摧毀抗營養因子。

基因轉殖植物可為有雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例係草，例如牧草(meadow grass，藍草(blue grass)，Poa)、牧草(forage grass)，例如牛毛草屬與黑麥草屬、溫帶禾草，例如小糠草屬、以及禾穀類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、米、高樑、與玉蜀黍(玉米)。

雙子葉植物的實例係菸草、豆類，例如羽扇豆屬植物(lupins)、馬鈴薯、甜菜、豌豆、豆莢、以及黃豆，與十字花科植物(蕓薹科)，例如白花椰菜、油菜子、與近相關典型生物阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的實例為莖、癒合組織、葉、根、果、種子、與塊莖以及組成這些部分的個別的組織，例如，表皮、葉肉、薄壁細胞、維管束組織、分生組織。特殊的植物細胞隔間，例如葉綠體、無生質體系、粒腺體、液泡、過氧化體以及細胞質亦係被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論其組織來源為何，係被認為是植物部分。類似地，植物部分(例如經分離以促進本發明之利用的特殊組織與細胞)亦係被認為是植物部分，例如，胚芽、胚乳、糊粉與種子外皮。

亦包括於本發明之範疇內者為如此植物、植物部分、與植物細胞之後代。

表現本發明多肽之基因轉殖植物或植物細胞可根據於技藝中已知的方法構築。簡單地說，該植物或植物細胞，係藉由將一或多個編碼本發明之多肽的構築體併入植物宿主基因組，並繁殖結果的經修改植物或植物細胞至基因轉殖植物或植物細胞而構築。

表現構築體係合宜地為核酸構築體，其包括編碼本發明之多肽的多核苷酸，其操作性地連結至於所選擇之植物或植物部分中表現該核苷酸序列所需之適合的調節性序列。此外，表現構築體可包括有用於鑑定表現構築體已併入其中之宿主細的可選擇標記與將構築體導入討論中的植物所需的DNA序列(後者係根據所使用的DNA導入方法)。

調節性序列(例如啟動子與終止子序列以及視需要訊號或轉位序列)之選擇係根據(例如)所欲的多肽表現之時間、位置、與方式而定。例如，編碼本發明多肽之基因的表現可為組成性的或可誘發的、或可為發育、時期或組織專一性的，以及該基因產物可被瞄準至於特殊組織或植物部分(例如種子或葉)。調節性序列係(例如)敘述於Tague等人,1988,Plant Physiology 86：506。

為了組成性表現，可使用35S－CaMV、玉米泛素1、與米肌動蛋白1啟動子(Franck等人,1980,Cell 21：285－294,Christensen等人,1992,Plant Mo.Biol.18：675－689；Zhang等人,1991,Plant Cell 3：1155－1165)。器官專一性啟動子可為(例如)來自儲存槽組織(storage sink tissues，例如種子、馬鈴薯塊經、與果)的啟動子(Edwards & Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24：275－303)、或來自代謝槽組織(metabolic sink tissues，例如分生組織)的啟動子(Ito等人,1994,Plant Mol.Biol.24：863－878)、種子專一性啟動子，例如穀蛋白、醇溶穀蛋白、球蛋白、或白蛋白啟動子，其來自米(Wu等人,1998,Plant and Cell Physiology 39：885－889)、來自豆球蛋白B4的蠶豆啟動子與來自蠶豆的未知種子蛋白質基因(Conrad等人,1998,Journal of Plant Physiology 152：708－711)、來自種子油體蛋白質的啟動子(Chen等人,1998,Pleant andCell Physiology 39：935－941)、來自西洋油菜的儲存蛋白質的napA啟動子、或任何其他於技藝中已知的種子專一性啟動子，例如，敘述於WO 91/14772中者。此外，啟動子可為葉專一性啟動子，例如來自米或蕃茄的rbcs啟動子(Kyozuka等人,1993,Plant Physiology 102：991－1000)、綠藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra與Higgins,1994,Plant Molecular Biology 26：85－93)、或來自米的aldP基因啟動子(Kagaya等人,1995,Molecular and General Genetics 248：668－674)、或損傷誘發性啟動子，例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等人,1993,Plant Molecular Biology 22：573－588)。類似地，啟動子可藉由非生物處理而誘發，例如溫度、乾旱、或在鹽性之改變，或藉由外生地施用活化該啟動子之物質，(例如乙醇、雌激素、植物激素(例如乙烯、脫落酸、與赤微酸)與重金屬)而誘發。

亦可使用啟動子增強子元件以在植物中達到本發明多肽之較高的表現。例如，啟動子增強子元件可為置於啟動子與編碼本發明多肽之核苷酸序列間的內含子。例如，Xu等人,1993，如上述，揭示使用米肌動蛋白1基因的第一內含子以增強表現。

可選擇標記基因與表現構築體的任何其他部分可選自那些於技藝中可得者。

核酸構築體係根據於技藝中已知的慣例技術併入植物基因組，該技術包括農桿菌－所介導的轉型、病毒－所介導的轉型、微注射、粒子轟擊、生物彈擊轉型(biolistic transformation)、與電穿孔(Gasser等人,1990,Science 244：1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8：535；Shimamoto等人,1989,Nature 338：274)。

目前，根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )－所介導的基因轉移係精選用於產生基因轉殖雙子葉植物的方法(回顧參見Hooykas與Schilperoort,1992,Plant Molecular Biology 19：15－38)，且亦可用於轉型單子葉植物，雖然於這些植物往往使用其他轉型方法。目前，精選用於產生基因轉殖單子葉植物的方法係胚芽癒傷組織(embryonic calli)及發育中胚芽的粒子轟擊(以轉型DNA塗覆之微小金或鎢微粒)(Christou,1992,Plant Journal 2：275－281；Shimamoto,1994,Current Opinion Biotechnology 5：158－162；Vasil等人,1992,Bio/Technology 10：667－674)。另一種用於轉型單子葉植物的方法係基於原生質體轉型，如Omirulleh等人,1993,Plant Molecular Biology 21：415－428所述。

在轉型之後，選擇已併入表現構築體之轉型產物並將之再生成整珠植物，其根據技藝中廣為人知的方法。轉型程序往往係設計以在再生期間或再生之後選擇性地排除選擇基因，其藉由使用(例如)共－轉型兩個分別的T－DNA構築體或藉由特殊重組酶位置專一性切除選擇基因。

本發明亦係關於生產本發明之多肽的方法，其包括(a)在有益於該多肽之生產的條件下培養包括編碼本發明之具有抗微生物活性之多肽的多核苷酸之基因轉殖植物或植物細胞；以及(b)回收該多肽。

組成物

本發明亦係關於組成物，例如醫藥組成物，其包括本發明的多肽。較佳地，該組成物係富於如此多肽。術語「富於」意指該組成物的抗微生物的活性已被增加，例如，以增加係數1.1增加。

組成物可進一步包括另一個醫藥活性劑，例如額外的殺生物或制生物劑，例如另一個展現抗微生物的活性的抗微生物多肽，如以上所定義。該殺生物劑可為抗生素，如於技藝中已知者。抗生素的種類包括青黴素，例如青黴素G、青黴素V、二甲苯青黴素、苯唑西林(oxacillin)、卡本西林、乙氧萘青黴素(nafcillin)、胺丫青黴素，等等；青黴素與β－內醯胺酶抑制子之結合、頭芽胞菌素，例如頭孢克羅(cefaclor)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢呋新(cefuroxime)、拉氧頭孢(moxalactam)、等等；碳青黴烯類(carbapenem)；單菌黴素類(monobactam)；胺基醣苷類；四環素；巨環內酯類；林可黴素類；多粘桿菌素類；磺胺類；唯諾酮類(quinolone)；cloramphenical；甲硝唑(metronidazole)；觀黴素；三甲氧苄嘧啶(trimethoprim)；萬古微素；等等。該殺生物劑亦可為抗－黴菌劑，包括多烯類，例如雙性殺黴素B、制黴菌素；5－flucosyn；以及吡咯環類，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazo)與氟康唑(fluconazol)。

在一個具體態樣中，殺生物劑係非酵素性化學劑。在另一個具體態樣中，殺生物劑係非多肽化學劑。

組成物可包括適合載運物質。組成物亦可包括適合的遞送載體，其當該組成物用作醫藥品時，有將本發明的抗微生物多肽遞送至所欲位置的能力。

多肽組成物可根據於技藝中已知的方法製備，並可為液體或乾燥組成物的形式。例如，多肽組成物可為顆粒(granulate)或微顆粒的形式。在組成物中所欲包括的多肽可根據於技藝中已知的方法穩定化。

本發明多肽組成物之較佳用途的實例係於以下呈現。當使用本發明多肽組成物時，該組成物的劑量與其他條件可基於技藝中已知的方法決定。

方法與用途

本發明亦係關於使用本發明之具有抗微生物活性的多肽之方法。抗微生物多肽典型地係有用於任何受細菌、真菌、酵母菌、或藻類污染的位置(locus)。典型地，位置係於水性系統中，例如冷卻水系統、洗滌潤洗水、油系統例如切割油、潤滑劑、油田與類似者，於其中需殺死微生物或於其中必須控制微生物之生長。然而，本發明亦可用於所有已知抗微生物組成物係有用的應用，例如保護木頭、乳膠、黏著劑、膠、紙、硬紙板、紡織品、皮革、塑膠、填隙、與飼料。

其他用途包括食物、飲料、化妝品例如洗劑、乳霜、凝膠、軟膏、肥皂、洗髮精、潤絲精、止汗劑、止臭劑、漱口水、隱形眼鏡產品、酵素調配物、或食物成分的保存。

因此，本發明的抗微生物多肽可被用作消毒劑，例如，用於治療眼睛或口部的感染、皮膚感染；用於止汗劑或止臭劑；用於清潔與消毒隱形眼鏡與牙齒(口部管理)。

一般的，會預期本發明的抗微生物多肽可用於在任何表面上之清潔、消毒或抑制微生物的生長。該表面(可有益地與本發明的抗微生物多肽接觸)的例子係所使用之加工設備(例如乳製品、化學品或醫藥品加工工廠、水環境衛生系統、油加工工廠、紙漿加工工廠、水處理工廠、以及冷卻塔)的表面。本發明的抗微生物多肽應以在所討論之表現上可有效地清潔、消毒、或抑制微生物的生長之量使用。

本發明的抗微生物多肽在食物加工工廠中以及在任何食物被製備或供應的區域(例如醫院、療養院、與餐廳)中，可額外地用於清潔表面與烹飪器皿。

其亦可在水基塗料中用作防腐劑或消毒劑。

本發明亦係關於本發明的抗微生物多肽或組成物作為醫藥品之用途。此外，本發明的抗微生物多肽或組成物亦可用於生產用於控制微生物(例如真菌生物或細菌，較佳為葛蘭氏陽性細菌)或與微生物戰鬥的醫藥品。

本發明的抗微生物多肽與組成物可用作抗微生物的獸醫或人類治療性或預防性劑。因此，本發明的抗微生物多肽與組成物可用於製備獸醫或人類治療性劑或預防性劑，其用於治療微生物性感染，例如細菌性或真菌性感染，較佳係葛蘭氏陽性細菌性感染。特別係該微生物性感染可係與肺病(包括(但不限於)肺結核、肺炎與囊性纖維變性)相關；以及與性傳染病(包括(但不限於)淋病與披衣菌)相關。

本發明的組成物包括有效量的本發明的抗微生物多肽。

術語「有效量」用於本文係意欲意指一種本發明的抗微生物多肽的量，其足以抑制所討論的微生物之生長。

本發明亦係關於創傷治癒組成物或產品，例如繃帶、醫療器材，例如導管，且進一步係關於抗頭皮屑頭髮產品，例如洗髮精。

本發明的抗微生物多肽的調配物係被投藥至患有微生物感染或有微生物感染之傾向的宿主。投藥可為局部的、區域性的(localized)或全身性的，其根據特殊的微生物而定，較佳其為區域性的。一般地，本發明的抗微生物多肽之劑會足以減少微生物的族群至少大約50%，通常至少1個對數(log)、且可為2個或更多個對數的殺死。本發明的化合物係以縮小微生物的族群同時最小化任何副作用的劑量投藥。會預期該組成物會自醫師獲得並於其指導下用於活體內。本發明的抗微生物多肽特別地有用於殺死葛蘭氏陰性細菌，包括綠膿桿菌、與沙眼披衣菌；以及葛蘭氏陽性細菌，包括鏈球菌，例如肺炎雙球菌、乳房鏈球菌、Streptococcus hyointestinalis 、釀膿鏈球菌及無乳鏈球菌；以及葡萄球菌例如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans )、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus )、與肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus )。

本發明的抗微生物多肽的調配物可被投藥至患有微生物性肺部感染(例如肺炎)或有微生物性肺部感染之傾向的宿主，或被投藥至患有微生物性創傷感染(例如細菌性創傷感染)或有微生物性創傷感染之傾向的宿主。

本發明的抗微生物多肽的調配物亦可被投藥至患有皮膚感染或有皮膚肺部感染之傾向的宿主，皮膚感染例如為痤瘡、異位性皮炎(atopic dermatitis)或脂溢性皮炎(seborrheic dermatitis)；較佳皮膚感染係細菌性皮膚感染，例如由表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes )、卵圓皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale )或糠疹小芽孢菌(Malassezia furfur )所造成者。

本發明的抗微生物多肽亦有用於試管內調配以殺死微生物，特別是當不想導入慣例的抗生素量時。例如，本發明的抗微生物多肽可被加入動物及/或人類食物製備物中；或其可包含於細胞之試管內培養物作為添加物，以預防在組織培養中微生物過渡生長。

一個特殊微生物對本發明的抗微生物多肽之殺菌作用的敏感性，可藉由試管內測試而測定，如在實驗部分所詳述者。典型地，微生物的培養物與各種濃度之抗微生物多肽結合一段足以允許蛋白質作用的時間，其通常介於大約一小時至一天。接著計數存活的微生物，並測定出殺死的水平。

所興趣的微生物包括(但不限於)葛蘭氏陰性菌細菌，例如：檸檬酸桿菌屬；腸內桿菌屬；大腸桿菌屬，例如大腸桿菌；克留氏菌屬；摩根氏菌屬(Morganella sp. )；變形桿菌屬；普羅威登斯菌屬(Providencia sp. )；沙門氏桿菌屬，例如傷寒沙門桿菌、鼠傷寒沙氏桿菌；沙雷氏菌屬；志賀桿菌屬；假單胞菌，例如綠膿桿菌；耶氏菌屬(Yersinia sp. )，例如鼠疫耶氏菌、假結核耶氏菌(Y.pseudotuberculosis )、小腸結腸炎耶氏菌(Y.enterocolitica )；弗朗西斯氏菌屬(Franciscella sp. )；巴斯德菌屬(Pasturella sp. )；弧菌屬，例如霍亂弧菌、腸炎弧菌(V.parahemolyticus )；曲桿菌屬，例如空腸曲桿菌；嗜血桿菌屬，例如流行性感冒桿菌、杜氏嗜血桿菌(H.ducreyi )；博德氏桿菌屬，例如百日咳博德氏桿菌、枝氣管敗血性包台拉菌、副百日咳嗜血桿菌；布氏桿菌屬；奈瑟氏球菌屬，例如淋病雙球菌、腦膜炎球菌、等等。其他有興趣的細菌包括退伍軍人桿菌屬(Legionella sp. )，例如退伍軍人桿菌；李氏菌屬，例如單核球增多性李氏菌；黴漿菌屬，例如人型黴漿菌、人肺炎黴漿菌；分枝桿菌屬，例如結核分枝桿菌、麻瘋分枝桿菌；密螺旋體屬，例如梅毒密螺旋體；螺旋體屬(Borrelia sp. )，例如伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi )；鉤端螺旋體屬(Leptospirae sp. )；立克次體屬，例如落磯山熱病原體、傷寒立克次體；披衣體屬，例如沙眼披衣菌、肺炎披衣菌(C.pneumoniae )、鸚鵡披衣菌；螺旋桿菌屬(Helicobacter sp. )，例如胃幽門螺旋桿菌(H.pylori )、等等。

所興趣的非－細菌性病原體包括真菌性與原生動物病原體，例如瘧原蟲屬(Plasmodia sp. )，例如惡性瘧(P.falciparum )、錐蟲屬，例如布氏錐蟲；shistosomes；內阿米巴屬(Entaemoeba sp. )、隱球菌屬、假絲酵母菌屬，例如白色念珠菌；等等。

可使用各種方法投藥。多肽調配物可經口給予，或可血管內地、皮下地、腹膜地注射，使用噴霧劑、眼部地(opthalmically)、膀胱內地、局部地、等等方式給予。例如，藉由吸入劑之投藥方法於技藝中係廣為人知的。治療性調配物之劑量的變化很大，其根據欲投藥的特殊抗微生物多肽、疾病的本性、投藥的頻率、投藥的方式、劑自宿主中之排除、以及類似者而定。最初的劑可較大，接使用較小的維持劑。該劑可不經常地如每週或每二週投藥、或分成較小的劑並每天或每半週等等投藥一次或多次，以維持有效劑量水平。在許多實例中，口部投藥會比靜脈內投藥需要較高的劑。醯胺鍵，以及胺基與羧基端，可經修改以在口部投藥產生較大的穩定性。例如，羧端可經醯胺化。

調配物

本發明的化合物可被併入至各種用於治療性投藥的調配物。更特別地，本發明的化合物可藉由與適合的、醫藥上可接受的載劑或稀釋劑結合而調配成醫藥組成物，且可調配成呈固體、半固體、液體或氣體形式的製備物，例如藥片、膠囊、粉末、細粒(granules)、軟膏、乳霜、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體、洗劑、以及氣溶膠。本身，化合物的投藥可藉由各種方式達成，其包括口部、頰的、直腸的、非經腸的、腹膜內的、皮內的、穿皮的、氣管內的(intracheal)、等等，投藥。本發明的抗微生物多肽在投藥後可為全身性或可藉由使用移植物或其他調配物(其作用以在植入位置保留活性劑)而區域化。

在一個具體態樣中，用於局部用途的調配物包括螯合劑，其減少二價陽離子(特別是鈣與鎂)的有效濃度。例如，可包括例如檸檬酸鹽、EGTA或EDTA的劑，其中檸檬酸鹽係較佳的。檸檬酸鹽的濃度通常會從大約1至10 mM。

本發明的化合物可被單獨投藥、彼此結合投藥、或其可與其他已知化合物(例如，穿孔素(perforin)、抗發炎劑、抗生素、等等)結合使用。於醫藥性劑量形式中，該化合物可以其醫藥上可接受的鹽類投藥。以下方法與賦形劑僅為例示性而非欲限制。

於口部製備物中，化合物可單獨使用或適合的添加物結合以製造藥片、粉末、細粒或膠囊，例如，與慣例的添加物，例如乳糖、甘露醇、玉米澱粉、或馬鈴薯澱粉結合；與接著劑，例如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠、玉米澱粉或明膠結合；與崩解劑，例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維鈉結合；與潤滑劑，例如滑石或硬脂酸鎂結合；以及若需要，與稀釋劑、緩衝劑、濕潤劑、防腐劑、與風味劑結合。

化合物可藉由溶解、懸浮、或乳化其於水性或非水性溶劑(例如蔬菜或其他類似的油、合成脂肪酸甘油酯、較高等脂肪酸之酯或丙二醇)中，以及若需要，與慣例的添加物例如助溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑與防腐劑結合，而調配成用於注射的製備物。

化合物可用於氣溶膠調配物以透過吸入投藥。本發明的化合物可被調配至加壓可接受推進劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮、與類似物。

化合物可用作洗劑以例如預防燙傷的感染，其藉由與慣例的添加物(例如助溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑與防腐劑)調配而成。

此外，化合物可藉由與各種基底(例如乳化基底或水溶性基底)混合而被製成栓劑。本發明的化合物透過栓劑而直腸內投藥。栓劑可包括載體，例如可可油、碳蠟與聚乙二醇，其在體溫會融化，但在室溫會凝固。

可提供用於口部或直腸投藥的單位劑量形式，例如糖漿、酏劑、與懸浮劑，其中每個劑量單位((例如)一茶匙的量、一大匙的量、藥片、或栓劑)包含預決定量的組成物，其包含一或多種本發明的化合物。類似的，用於注射或靜脈內投藥之單位劑量形式可包括在一組成物中的本發明的化合物，該組成物為無菌水、一般食鹽水或另一個醫藥上可接受載劑之溶液。

用於維持性釋放調配物的移植物在技藝中係廣為人知的。移植物係以生物可降解的或非生物可降解的聚合物調配為微球體、厚板(slab)、等等。例如，乳酸及/或羥基乙酸的聚合物可形成可侵蝕性聚合物，其係可良好地被宿主所容忍。包含本發明的抗微生物多肽的移植物係置於接近感染的位置，使得活性劑的局部濃度相對於身體剩下的部分係被增加。

術語「單位劑量形式」，用於本文，意指物理上地分開的單位，其適合作為用於人類和動物受藥者的單元劑量，每個單元包含預決定量的本發明的化合物，該量係經計算以足夠產生所欲的效果，其與醫藥上可接受的稀釋劑、載劑或載體結合。本發明單位劑量形式的規格係根據所使用的特殊化合物以及所欲達到的效果、以及化合物在宿主中的藥物動力學而定。

醫藥上可接受的賦形劑，例如載體、輔劑、載劑或稀釋劑，係公眾可輕易獲得的。此外，醫藥上可接受的輔助物質，例如pH調整與緩衝劑、滲透壓調整劑、穩定劑、濕潤劑、以及類似者，係公眾可輕易獲得的。

用於全身性投藥的典型劑量之範圍係從0.1 pg至100毫克每公斤受藥者體重每次投藥。典型劑量可為一每天服用二到六次之藥片，或一每天服用一次且包含成比例的較高的活性成分之含量時間釋放性(time－release)膠囊或藥片。時間釋放性效果可藉由溶於不同pH質的膠囊物質、藉由透過滲透壓緩慢釋放的膠囊、或藉由任何其他已知的控制性釋放方法而獲得。

熟習該項技術者會無困難的瞭解劑水平(dose level)可以特殊化合物、症狀的嚴重性、與受藥者易被副作用影響的程度之函數的形式變化。一些特殊化合物係比其他更有潛力。用於給定化合物之較佳劑量可無困難地被熟習該項技術者使用各種方式測定。一個較佳的方式係測量給定化合物的生理潛力。

脂質體作為遞送載體之用途係一種所興趣的方法。脂質體與目標位置的細胞融合並將內腔的內容物遞送至細胞內。脂質體係維持與細胞接觸一段足夠的時間以融合，其使用各種方法以維持接觸，例如分離、結合劑、以及類似者。在本發明的一個方面，脂質體係經設計以氣溶膠化而用於肺部投藥。脂質體可與介導膜融合的經純化蛋白質或胜肽製備，而該蛋白質或胜肽可為(例如)仙台病毒或流行性感冒病毒、等等。脂質可為任何已知形成脂質體之脂質的有用結合，而包括陽離子性或兩性離子性脂質，例如卵磷脂。剩下的脂質一般會為中性或酸性脂質，例如膽固醇、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯甘油、以及類似者。

為了製備脂質體，可使用Kato等人(1991)J.Biol.Chem.266 ：3361所敘述的程序。簡單的說，脂質與包含胜肽的內腔成分係與適合的水性基質，例行的為食鹽水基質結合，其中總固體會為大約1－10重量百分比的範圍。在短時間(大約5－60秒)激烈地攪動後，將管子置於溫水浴(從大約25－40℃)並重複此循環從大約5－10次。組成物接著被音波震盪(sonicate)一段例行的時間(一般從大約1－10秒)並可進一步藉由漩渦震盪(vortexing)而攪動。接著藉由加入水性基質擴增體積，一般增加體積大約從1－2倍，接著搖動並冷卻。此方法允許高分子量分子併入內腔中。

與其他活性劑調配

為了用於主題方法，本發明的抗微生物多肽可與其他醫藥活性劑(特別是其他抗微生物劑)一起調配。所興趣的其他劑包括廣大範圍的抗生素，如於技藝中已知的。抗生素的種類包括青黴素，例如青黴素G、青黴素V、二甲苯青黴素、苯唑西林、卡本西林、乙氧萘青黴素、胺丫青黴素、等等；青黴素與β－內醯胺酶抑制子之結合、頭芽胞菌素，例如頭孢克羅、頭孢唑林、頭孢呋新、拉氧頭孢、等等；碳青黴烯類；單菌黴素類；胺基醣苷類；四環素；巨環內酯類；林可黴素類；多粘桿菌素類；磺胺類；喹諾酮類；cloramphenical；甲硝唑；觀黴素；三甲氧苄嘧啶；萬古微素；等等。

抗－黴菌劑亦為有用，其包括多烯類，例如雙性殺黴素B、制黴菌素；5－flucosyn；以及吡咯環類，例如咪康唑、酮康唑、伊曲康唑、與氟康唑。抗結核藥物包括異菸肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、鏈黴素、與利福平(rifampin)。細胞介素亦可包括於本發明的抗微生物多肽之調配物中，例如干擾素γ、腫瘤壞死因子α、介白素12、等等。

試管內合成

本發明的抗微生物胜肽可藉由技藝中已知的例行方法試管內合成。各種商業合成設備係可獲得的，例如Applied Biosystems Inc.,Beckman等等的自動化合成儀。藉由使用合成儀，可以非天然胺基酸，特別是以D－同型異構物(或D－型)例如D－丙胺酸與D－異白胺酸、非鏡像異構物、具有不同長度或官能基的側鏈、以及類似者取代天然產生的胺基酸。製備的特殊順序與方式會依據方便性、經濟因素、所需純度、以及類似者而定。

可將化學結合提供給各種胜肽或蛋白質，其包括例行的用於鍵結之官能機，例如用於形成醯胺或經取代胺(例如還原性胺化)的胺基團、用於形成硫醚或雙硫鍵的硫醇基團、用於形成醯胺的羧基團、以及類似者。

若需要，可在合成中或在表現中將各種基團導入至胜肽中，其允許結合至其他分子或至一表面。因此，可使用半胱胺酸以製造硫醚，使用組胺酸以連結至金屬離子錯合物，使用羧基團以形成醯胺或脂，使用胺基團以形成醯胺、以及類似者。

多肽亦可根據慣例的重組合成方法而被分離與純化。可製備表現宿主的胞溶物，而該胞溶物使用HPLC、排除色析法、凝膠電泳、親和力色析法、或其他純化技術純化。在大多數情況下，所使用的組成物會包括至少20重量百分比的所欲產物，更通常為至少大約75重量百分比，較佳為至少大約95重量百分比，以及為了治療性目的，通常至少為大約99.5重量百分比，其係相對於關於產物之製備與其純化的方法之污染。通常，該百分比會基於總蛋白質。

動物飼料

本發明亦係關於在動物飼料使用具有抗微生物活性的多肽的方法，以及包括本發明的抗微生物多肽的飼料組成物與飼料添加物。

術語動物包括所有動物，其包括人類。動物的實例為非反芻動物、與反芻動物，例如牛、綿羊、與馬。在一個特殊的具體態樣中，該動物為非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物，例如豬(pig)或豬(swine)(包括(但不限於)小豬、生長中的豬、以及牝豬)；家禽，例如火雞與雞(包括(但不限於)肉雞、蛋雞)；犢牛；以及魚(包括(但不限於)鮭魚)。

術語飼料或飼料組成物意指任何化合物、製備物、混合物、或組成物，其適合用於、或意欲被動物攝取。

在根據本發明的用途中，抗微生物多肽可被在進餐之前、之後、或同時餵養給動物，後者係較佳的。

在一個特殊的具體態樣中，抗微生物的多肽，以被加入飼料中的形式、或當被包含於飼料添加物中時，係良好地界定的。良好地界定意指該抗微生物多肽製備物係至少50%純的，其由尺寸排除色析法所測定(參見WO 01/58275的實施例12)。在其他特殊的具體態樣中，抗微生物多肽製備物係至少60、70、80、85、88、90、92、94、或至少95%純的，如以此方法所測定。

良好地界定的抗微生物多肽製備物係有益的。例如，正確地將基本上不含干擾性或污染性之其他抗微生物多肽之抗微生物多肽按劑量加至飼料其係遠更容易的。術語正確地按劑量特別意指獲得一致性與固定性結果的目標，以及基於所欲結果最佳化劑量的能力。

然而，為了用於動物飼料，抗微生物多肽不需要為那麼純的；其可(例如)包括其他酵素，在此情況中其可被稱為抗微生物多肽製備物。

抗微生物多肽製備物可被(a)直接加入飼料(或直接用於蔬菜蛋白質的處理過程中)、或(b)其可用於生產一或多個中間組成物，例如飼料添加物或預混合物，其接著被加入飼料中(或用於處理過程)。上述的純度意指原始抗微生物多肽製備物的純度，無論是按照以上(a)或(b)使用。

鑑於當抗微生物多肽以傳統發酵方式生產時其並非如此容易獲得且亦受到更高的批次－至－批次變化，具有此數量級純度的抗微生物多肽製備物特別係可使用重組方法生產獲得。

如此抗微生物多肽製備物當然可與其他酵素混合。

術語蔬菜蛋白質用於本文意指任何化合物、組成物、製備物或混合物，其包括至少一種衍生自或來源自蔬菜的蛋白質，其包括經修改蛋白質與蛋白質衍生物。在特別的具體態樣中，蔬菜蛋白質的蛋白質含量係至少10、20、30、40、50、或60%(w/w)。

蔬菜蛋白質可係衍生自蔬菜蛋白質來源，例如豆類與穀類，例如來自豆科、十字花科、藜科、與禾本科植物的物質，例如大豆粗粉、羽扇豆屬植物粗粉、與油菜籽粗粉。

在一個特殊的具體態樣中，蔬菜蛋白質來源係來自一或多種豆科植物，例如大豆、羽扇豆屬植物、豌豆、或豆莢的物質。

在另一個特殊具體態樣中，蔬菜蛋白質來源係來自一或多種藜科植物，例如甜菜(beet)、甜菜(sugar beet)、菠菜或鵝腳藜的物質。

蔬菜蛋白質來源的其他實例為油菜籽、與甘藍菜。

大豆係較佳的蔬菜蛋白質來源。

蔬菜蛋白質來源的其他實例為穀類，例如大麥、小麥、裸麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、米、與高樑。

抗微生物多肽可以任何形式加入飼料，無論係以相對純的抗微生物多肽、或以與其他意欲用於加入動物飼料的化合物之混合物，即以動物飼料添加物(例如被稱作用於動物飼料之預混合物)的形式。

在一個進一步的方面，本發明係關於用於動物飼料(例如動物飼料)與動物飼料添加物(例如預混合物)的組成物。

除了本發明的抗微生物多肽之外，本發明的動物飼料添加物包含至少一種脂溶性維生素，及/或至少一種水溶性維生素，及/或至少一種微量礦物質，及/或至少一種巨礦物質(macro mineral)。

進一步，視需要地，飼料添加物成分係著色劑、氣味化合物、穩定劑、及/或至少一種其他酵素，其選自纖維醣磷酸鹽酶EC 3.1.3.8或3.1.3.26；木膠多糖酶EC 3.2.1.8；半乳聚糖酶EC 3.2.1.89；及/或β －聚葡萄糖酶EC 3.2.1.4中。

在一個特殊的具體態樣中，這些其他酵素係良好地界定的(如以上對抗微生物多肽製備物所界定者)。

其他抗微生物胜肽(AMP)的實例係CAP18、明串珠菌素A(Leucocin A)、Tritrpticin、Protegrin－1、死亡素(Thanatin)、防禦素、Ovispirin例如Novispirin(Robert Lehrer,2000)、以及其保留抗微生物活性的變異體或片段。

其他抗真菌多肽(AFP)的實例係巨麴菌(Aspergillus giganteus )與黑麴菌胜肽，以及其保留抗真菌活性的變異體與片段，如WO 94/01459與WO 02/090384所揭示者。

通常脂與水溶性維生素，以及微量礦物質形成意欲加至飼料的所謂預混合物之部分，而巨礦物質通常係分開地加至飼料。當富於本發明的抗微生物多肽時，這些組成物種類的任一種皆係本發明的動物飼料添加物。

在一個特殊的具體態樣中，本發明的動物飼料添加物係意欲為以(或指定為必須以)0.01至10.0%；更特別地為0.05至5.0%；或0.2至1.0%(%意指g添加物每100 g飼料)的水平包括於動物飲食或飼料中。此對預混合物特別是如此。

以下係這些成分的非排除性列表之實例：脂溶性維生素之實例為維生素A、維生素D3、維生素E、與維生素K、例如維生素K3。

水溶性維生素之實例為維生素B12、生物素與膽鹼、維生素B1、維生素B2、維生素B6、菸鹼酸、葉酸與泛酸鹽，例如D－泛酸鈣。

微量礦物質的實例係鎂、鋅、鐵、銅、碘、硒、與鈷。

巨礦物質的實例為鈣、磷、與鈉。

這些成分(例如家禽與豬/小豬)的營養性需要係列於WO 01/58275的表A。營養性需要意指這些成分以所指定的濃度應被提供於飲食中。

或者，本發明的動物飼料添加物包括至少一個於WO 01/58275表A中所具體指明的個別成分。至少一個意指一或多個、一個、或二個、或三個、或四個以及如此往上達十三個、或上達所有十五個個別的成分。更特別的，此至少一個別的成分係以一種量包括於本發明的添加物中，以提供於表A之欄四、或欄五、或欄六所指之範圍之飼料內濃度。

本發明亦係關於動物飼料組成物。動物飼料組成物或飲食具有相對高含量的蛋白質。家禽與豬飲食之特徵可如於WO 01/58275之表B，欄2－3指出。魚食物之特徵可如於表B欄4指出。此外，如此魚食物通常具有200－310 g/kg的粗脂肪含量。

根據本發明的動物飼料組成物具有粗蛋白質含量50－800 g/kg，且此外包括至少一於此所請求的抗微生物多肽。

此外、或或者(對以上所指明之粗蛋白質含量)，本發明組成物的動物飼料具有可代謝能量含量10－30 MJ/kg；及/或鈣含量0.1－200 g/kg；及/或可利用磷含量0.1－200 g/kg；及/或甲硫胺酸含量0.1－100 g/kg；及/或甲硫胺酸加上半胱胺酸含量0.1－150 g/kg；及/或離胺酸含量0.5－50 g/kg。

在特別的具體態樣中，可代謝能量、粗蛋白質、鈣、磷、甲硫胺酸、甲硫胺酸加上半胱胺酸、及/或離胺酸之含量係於WO 01/58275表B之2、3、4、或5欄任何一者的範圍之內。

粗蛋白質係計算為氮(N)乘以因數6.25，即粗蛋白質(g/kg)＝N(g/kg)x 6.25。氮含量係藉由Kjeldahl方法測定(A.O.A.C.,1984,Official Methlds of Analysis 14th ed.,Association of Official Analytical Chemists,Washington DC)。

可代謝能量可基於以下者而計算：國家研究議會(national research council)農業部(board of agriculture)動物營養委員會(committee on animal nutrition)豬營養次委員會(subcommittee on swine nutrition)之NRC出版品豬的營養需求(Nutrient needs in swine)第九修訂版1988(國家研究院出版社(National Academy Press),華盛頓特區)第2－6頁，以及Spelderholt家禽研究與延伸中心(Spelderholt centre for poultry research and extension,7361 DA Beekbergen,荷蘭)的歐洲家禽飼料－原料能量值表(European Table of Energy Values for Poultry Feed－stuffs)。Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv,Wageningen。ISBN 90－71463－12－5。

在完整動物飲食中鈣、可利用磷與胺基酸的飲食含量係基於例如以下飼料表計算：Veevoedertabel 1997,gegevens over chemische samenstelling,vvrteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg 6,8219 pk LeLystad.ISBN 90－72839－13－7。

在一個特殊的具體態樣中，本發明組成物的動物飼料包含至少一種如以上定義的蔬菜蛋白質或蛋白質來源。

在仍進一步的特殊具體態樣中，本發明的組成物的動物飼料包含0－80%玉蜀黍；及/或0－80%高樑；及/或0－70%小麥；及/或0－70%大麥；及/或0－30%燕麥；及/或0－40%大豆粗粉；及/或0－10%魚粗粉；及/或0－20%乳清。動物飲食可(例如)被製造成糊狀飼料(非丸狀化)或丸狀化飼料。典型地，磨成粉的飼料原料經混合，並按照所討論的物種之規格加入足夠量的基本維生素與礦物質。酵素可以固體或液體酵素調配物加入。例如，固體酵素調配物典型地係在混合步驟之前或之中加入；以及液體酵素製備物典型地係在丸狀化步驟之後加入。酵素亦可被併入飼料添加物或預混合物中。

飲食中最終酵素濃度係在0.01－200毫克酵素蛋白質每公斤飲食的範圍內，例如在5－30毫克酵素蛋白質每公斤動物飲食的範圍。

抗微生物多肽可以一或多的以下量(劑量範圍)施用：0.01－200；或0.01－100；或0.05－100；或0.05－50；或0.10－10－所有這些範圍皆為毫克抗微生物多肽蛋白質每公斤飼料(ppm)。

為了測定毫克抗微生物多肽蛋白質每公斤飼料，抗微生物多肽係自飼料組成物中純化，且經純化抗微生物多肽的比活性係使用相關分析而測定(參見抗微生物的活性、基質、與分析)。飼料組成物的抗微生物活性本身亦係使用相同的分析而測定，且基於者兩個測定，可計算劑量之毫克抗微生物多肽蛋白質每公斤飼料。

相同的原則係用於測定飼料添加物中的毫克抗微生物多肽蛋白質。當然，若用於製備飼料添加物或飼料的抗微生物多肽的樣本係可得，則比活性係自此樣本中測定(不需從飼料組成物或添加物中純化抗微生物多肽)。

訊號胜肽與原胜肽

本發明亦係關於核酸構築體，其包括編碼一蛋白質的基因，該基因操作性地連結以下者之一或兩者：i)由編碼SEQ ID NO：2之胺基酸－165至－142所組成的訊號胜肽之SEQ ID NO：1之核苷酸1至72所組成的第一核苷酸序列，以及ii)由編碼SEQ ID NO：2之胺基酸－141至－1所組成的原胜肽之SEQ ID NO：1之核苷酸73至495所組成的第二核苷酸序列；其中該基因對第一與第二核苷酸序列為外來。

本發明亦係關於重組表現載體與重組宿主細胞，其包括如此核酸構築體。

本發明亦係關於用於生產一蛋白質的方法，其包括(a)在適合生產該蛋白質的條件下培養如此重組宿主細胞；以及(b)回收該蛋白質。

該第一與第二核苷酸序列可操作性地連結至外來基因，各自與其他控制序列或與其他控制序列結合。如此其他控制序列係如上述。如之前所述，雖然訊號胜肽與原胜肽區域兩者皆係出現在一蛋白質的胺基末端，原胜肽區域係置於蛋白質胺基末端之旁而訊號胜肽區域係置於原胜肽區域胺基末端之旁。

蛋白質對宿主細胞而言可為原有的或外來的。術語「蛋白質」於本文並非意指一所編碼產物的特殊長度且，因此涵蓋胜肽、寡胜肽、與蛋白質。術語「蛋白質」亦涵蓋二或多個多肽，其結合以形成所編碼產物。蛋白質亦包括雜合多肽，其包括獲得自至少二種不同蛋白質之部分或完整多肽序列的結合，其中一或多種蛋白質可對宿主細胞為異源性或原有的。蛋白質進一步包括以上提及之蛋白質與雜合蛋白質天然產生的等位基因性與經設計變化。

較佳地，蛋白質係激素或其變異體、酵素、受體或其部分、抗體或其部分、或報導子。在一個更佳的方面，蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、同分異構酶、或接合酶。在一個甚至更佳的方面，蛋白質係胺基胜肽酶、澱粉酶、解糖酶、羧肽水解酶、觸酶、纖維素酶、殼質酶、角質酶、環糊精葡萄糖基轉移酶、去氧核糖核酸酶、酯酶、α－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、α－葡萄糖苷酶、β－葡萄糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂酶、甘露醇酶、mutanase、氧化酶、解果膠酵素(pectinolytic enzyme)、過氧化氫酶、植酸酶、多酚氧化酶(polyphenoloxidase)、蛋白質水解性酵素、核糖核酸酶、轉麩醯胺醯酶(transglutaminase)或木膠多糖酶。

基因可獲得自任何原核的、真核的、或其他來源。

本發明進一步以以下實施例敘述，其不應被理解為限制本發明的範圍。

實施例

用作緩衝溶液和基質的化學品係至少為試劑等級的商業產物。在以下實施例中，由SEQ ID NO：2的胺基酸1至21所示的抗微生物多肽稱為「Arenicin」。

實施例1 Arenicin之抗微生物活性

如SEQ ID NO：2的胺基酸1至21所示之抗微生物肽係合成地製備。測定最小抑制濃度(Minimal Inhibitory Concentration(MIC))以測試Arenicin之抗微生物活性，其依照來自CLSI(臨床與實驗室標準學會(Clinical and Laboratory Standards Institute)，之前稱為國家臨床與實驗室標準委員會(National Committee for Clinical and Laboratory Standards))之NCCLS指引－議定書M7－A6，第20卷，No.2：用於需氧生長的細菌之稀釋抗微生物敏感性測試之方法(Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically)。

本發明的抗微生物肽係對12個獲得自美國菌種保存中心(ATCC)的細菌品系作測試。表1的結果係兩次獨立評估的平均值。

實施例2 對臨床真菌之最小抑制濃度

Arenicin對酵母菌與真菌之最小抑制濃度基本上係藉由NCCLS/CLSI(臨床與實驗室標準學會)所述者進行。

簡而言之，大約1 McFarland單位之真菌或酵母菌懸浮液被以於PD液體培養基(8 g/L馬鈴薯右旋糖)以1：100稀釋，而生長係對Arenicin之連續2倍稀釋(0.03－32 μg/mL)測試。對白色念珠菌 、熱帶念珠菌 、新型隱球菌 、髮瘡髮癬菌(Trichophyton mentagrophytes) 與絮狀表皮癬菌 之分析盤係培養於25－27℃，以及對Candida glabrata 、Pichia pastoris 、啤潛釀母菌 和黑麴菌 係培養於30℃。在培養大約40小時後，視覺地記錄生長(裸視、斜角照射)。結果係如下表二所示。

<110> 諾佛酵素公司<120> 具有抗微生物活性的多肽與編碼其之多核苷酸<130> 10865.204－WO <160> 2 <170> PatentIn 3.3版<210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> 海洋蠕蟲<220> <221> CDS <222> (1)..(558) <220> <221> 訊號胜肽<222> (1)..(72) <220> <221> 成熟胜肽<222> (496)..(558) <400> 1 <210> 2 <211> 186 <212> PRT <213> 海洋蠕蟲<400> 2

Claims

一種具有抗微生物活性的多肽，其包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21具有至少70%一致性之胺基酸序列。
根據申請專利範圍第1項的多肽，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21具有至少75%一致性。
根據申請專利範圍第1至2項中任一項的多肽，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21具有至少80%一致性。
根據申請專利範圍第1至2項中任一項的多肽，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21具有至少85%一致性。
根據申請專利範圍第1至2項中任一項的多肽，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21具有至少90%一致性。
根據申請專利範圍第1至2項中任一項的多肽，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸1至21具有至少95%一致性。
根據申請專利範圍第1項的多肽，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
根據申請專利範圍第7項的多肽，其係由SEQ ID NO：2所組成。
根據申請專利範圍第7項的多肽，其係由SEQ ID NO：2之胺基酸1至21所組成。
一種經分離的多核苷酸，其包含編碼根據申請專利範圍第1至9項中任一項的多肽的核苷酸序列。
一種核酸構築體，其包含根據申請專利範圍第10項的多核苷酸，該多核苷酸操作性地連結至一或多個控制序列，該控制序列引導該多肽在表現宿主中的生產。
一種重組表現載體，其包含根據申請專利範圍第11項的核酸構築體。
一種重組宿主細胞，其包含根據申請專利範圍第11項的核酸構築體。
一種用於生產根據申請專利範圍第1至9項中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益於該多肽之生產的條件下，培養於野生型有生產該多肽的能力之細胞，或培養包括包含編碼該多肽的核苷酸序列的核酸構築體之宿主細胞；以及(b)回收該多肽。
一種組成物，其包括根據申請專利範圍第1至9項中任一項所定義的抗微生物多肽以及醫藥上可接受的載體。
一種於試管中用於殺死微生物細胞或抑制微生物細胞之生長的方法，其包括將該微生物細胞與根據申請專利範圍第1至9項中任一項所定義的抗微生物多肽接觸。
一種用作醫藥品之根據申請專利範圍第1至9項中任一項所定義的抗微生物多肽。
一種根據申請專利範圍第1至9項中任一項所定義的抗微生物多肽之用途，其係用於製備用於治療微生物感染的獸醫或人類治療性劑。