ES2343586T3 - Polipeptidos con actividad antimicrobiana y polinucleotidos que codifican los mismos. - Google Patents

Abstract

Polipéptido con actividad antimicrobiana, comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

Description

Polipéptidos con actividad antimicrobiana y polinucleótidos que codifican los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad antimicrobiana y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes comprendiendo los polinucleótidos al igual que a métodos para producir y usar los polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Ovchinnikova et al. "Purification and primary structure of two isoforms of arenicin, a novel antimicrobial peptide from marine polychaeta Arenicola marina", FEBS Lett., vol. 577, págs. 209-214 (2004) divulgó dos péptidos antimicrobianos de 21 residuos, arenicina-1 y arenicina-2, exhibiendo actividad contra bacterias gram-positivas y gram-negativas y hongos de coelomocytes de poliquetos marinos Arenicola marina (lombriz). Arenicinas no tienen ninguna similitud de estructura ni homología secuencial a ningún péptido antimicrobiano identificado previamente.

Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos con actividad antimicrobiana y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados teniendo actividad antimicrobiana y teniendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos teniendo actividad antimicrobiana, y teniendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, y células huéspedes recombinantes comprendiendo los polinucleótidos.

La presente invención también se refiere a métodos para producir tales polipéptidos teniendo actividad antimicrobiana comprendiendo (a) cultivar una célula huésped recombinante comprendiendo un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo un polinucleótido que codifica el polipéptido en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

La presente invención también se refiere a métodos para usar los polipéptidos y polinucleótidos de la invención.

Definiciones

Actividad antimicrobiana: el término "actividad antimicrobiana" se define aquí como una actividad que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de células microbianas. En el contexto de la presente invención el término "antimicrobiano" se destina a significar que hay un efecto bactericida y/o un efecto bacteriostático y/o fungicida y/o fungistático y/o virucida, donde el término "bactericida" ha de entenderse como capaz de matar células bacterianas. El término "bacteriostático" ha de entenderse como capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, es decir inhibir el crecimiento de células bacterianas. El término "fungicida" ha de entenderse como capaz de matar células fúngicas. El término "fungistático" ha de entenderse como capaz de inhibir el crecimiento fúngico, es decir inhibir el crecimiento de células fúngicas. El término "virucida" ha de entenderse como capaz de inactivar el virus. El término "células microbianas" denota células bacterianas o células fúngicas (incluyendo levaduras).

En el contexto de la presente invención el término "inhibir el crecimiento de células microbianas" se destina a significar que las células están en el estado de no crecimiento, es decir, que no son capaces de propagarse.

Para objetivos de la presente invención, actividad antimicrobiana puede ser determinada según el procedimiento descrito por Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, vol. 137 (2) págs. 167-174 (1991). Alternativamente, la actividad antimicrobiana puede ser determinada según las directrices del NCCLS de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute; antiguamente conocido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards).

Polipéptidos teniendo actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 después de 24 horas (preferiblemente después de 12 horas, más preferiblemente después de 8 horas, más preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa de un 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de un 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de un 5%(p/p); aún más preferiblemente en una solución acuosa de un 1%(p/p); de la forma más preferible en una solución acuosa de un 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa de un 0,1%(p/p) de los polipéptidos con actividad antimicrobiana.

Los polipéptidos con actividad antimicrobiana también puede ser capaz de inhibir la excrecencia de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se añade en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente cuando se añade en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 250 ppm; aún más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible cuando se añade en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm.

Polipéptidos con actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después de 24 horas (preferiblemente después de 12 horas, más preferiblemente después de 8 horas, más preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa de un 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de un 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de un 5%(p/p); aún más preferiblemente en una solución acuosa de un 1%(p/p); de la forma más preferible en una solución acuosa de un 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa de un 0,1%(p/p) de los polipéptidos con actividad antimicrobiana.

Polipéptidos con actividad antimicrobiana pueden también ser capaces de inhibir la excrecencia de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se añade en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente cuando se añade en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 250 ppm; aún más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible cuando se añade en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm.

Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos un 20%, preferiblemente al menos un 40%, más preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, aún más preferiblemente al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, aún más preferiblemente al menos un 100% de la actividad antimicrobiana del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

Polipéptido aislado: el término "polipéptido aislado" como se utiliza en este caso se refiere a un polipéptido que es al menos un 20% puro, preferiblemente al menos un 40% puro, más preferiblemente al menos un 60% puro, aún más preferiblemente al menos un 80% puro, de la forma más preferible al menos un 90% puro, y aún más preferiblemente al menos un 95% puro, según es determinado por SDS-PAGE.

Polipéptido sustancialmente puro: el término "polipéptido sustancialmente puro" denota aquí una preparación de polipéptidos que contiene como mucho un 10%, preferiblemente como mucho un 8%, más preferiblemente como mucho un 6%, más preferiblemente como mucho un 5%, más preferiblemente como mucho un 4%, como mucho un 3%, aún más preferiblemente como mucho un 2%, de la forma más preferible como mucho un 1%, y aún más preferible como mucho un 0,5% en peso de otro material polipéptido con el que se asocia de forma nativa. Es, por lo tanto, preferido que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos un 92% puro, preferiblemente al menos un 94% puro, más preferiblemente al menos un 95% puro, más preferiblemente al menos un 96% puro, más preferiblemente al menos un 96% puro, más preferiblemente al menos un 97% puro, más preferiblemente al menos un 98%, puro aún más preferiblemente al menos un 99%, de la forma más preferible al menos un 99,5% puro, y aún más preferiblemente un 100% puro en peso del material polipéptido total presente en la preparación.

Los polipéptidos de la presente invención preferiblemente están en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polipéptidos esencialmente esté libre de otro material polipéptido con el que se asocia de forma nativa. Esto se puede realizar, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o por métodos clásicos de purificación.

Aquí, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada".

Identidad: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad".

A los efectos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el programa FASTA incluido en la versión 2.0x del paquete del programa FASTA (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). La matriz de puntuación usada fue BLOSUM50, la penalización de gap fue -12, y la penalización por extensión de gap fue -2.

El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el mismo algoritmo y paquete de software como se ha descrito anteriormente. La matriz de puntuación usada fue la matriz de la identidad, la penalización de gap fue -16, y la penalización por extensión de gap fue -4.

Alternativamente, una alineación de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de la alineación global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización por abertura de gap es 10, y la penalización por extensión de gap es 0,5. El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención (tal como aminoácidos 1 a 43 de la SEC ID NO:2) y una secuencia de aminoácidos diferente se calcula como el número de coincidencias exactas en una alineación de las dos secuencias, dividido por la longitud (número de residuos de aminoácidos) de la secuencia de la presente invención; o alternativamente la salida de Needle marcada como "la identidad más larga" se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera: (residuos idénticos x 100)/(longitud de alineación - número de gaps en alineación). El resultado se expresa en porcentaje de identidad.

Fragmento de polipéptido: el término "fragmento de polipéptido" se define aquí como un polipéptido teniendo uno o más aminoácidos delecionados del término amino y/o carboxilo de la SEC ID NO:2 o una secuencia homologa de la misma, donde el fragmento tiene actividad antimicrobiana. En una forma de realización el fragmento incluye al menos 15, preferiblemente al menos 16, más preferiblemente al menos 17, incluso más preferiblemente al menos 18, de la forma más preferible al menos 19 y en particular al menos 20 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:2.

Subsecuencia: el término "subsecuencia" se define aquí como una secuencia de nucleótidos teniendo uno o más nucleótidos delecionados del extremo 5' y/o 3' de la SEC ID NO:1 o una secuencia homologa de la misma, donde la subsecuencia codifica un fragmento del polipéptido teniendo actividad antimicrobiana.

Variante alélica: el término "variante alélica" denota aquí cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones. Mutaciones en el gen pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" como se utiliza en este caso se refiere a una preparación polinucleótida libre de otros nucleótidos extraños o indeseados y en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de producción de proteína creada genéticamente. Por lo tanto, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como mucho un 10%, preferiblemente como mucho un 8%, más preferiblemente como mucho un 6%, más preferiblemente como mucho un 5%, más preferiblemente como mucho un 4%, más preferiblemente como mucho un 3%, aún más preferiblemente como mucho un 2%, y de la forma más preferible como mucho un 1%, y aún más preferiblemente como mucho un 0,5% en peso de otro material polinucleótido con el que se asocia de forma nativa. Un polinucleótido sustancialmente puro puede, no obstante, incluir regiones no codificantes y no traducidas de origen natural 5' y 3', tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos un 90% puro, preferiblemente al menos un 92% puro, más preferiblemente al menos un 94% puro, más preferiblemente al menos un 95% puro, más preferiblemente al menos un 96% puro, más preferiblemente al menos un 97% puro, aún más preferiblemente al menos un 98% puro, de la forma más preferible al menos un 99%, aún más preferiblemente al menos un 99,5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención preferiblemente están en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucleótidos descritos aquí estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación polinucleótida esencialmente esté libre de otro material polinucleótido con el que se asocia de forma nativa. Aquí, el término "polinucleótido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polinucleótido aislado" y "polinucleótido en forma aislada". Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos.

ADNc: el término "ADNc" se define aquí como una molécula de ADN que puede ser preparada por transcripción inversa de una molécula de ARNm madura, empalmada, obtenida de una célula eucariótica. ADNc carece de secuencias de intrones que normalmente están presentes en el ADN genómico correspondiente. La transcripción de ARN inicial, primaria es un precursor de ARNm que se procesa a través de una serie de fases antes de aparecer como ARNm maduro empalmado. Estas fases incluyen la eliminación de secuencias de intrones por un proceso que se llama empalme. ADNc derivado de ARNm carece de, por lo tanto, cualquier secuencia de intrón.

Constructo de ácidos nucleicos: el término "constructo de ácidos nucleicos" como se utiliza en este caso se refiere a una molécula de ácidos nucleicos, bien monocatenaria o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera que de lo contrario no existiría en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término "cassette de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

Secuencia de control: el término "secuencias de control" se define aquí para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o foránea a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Secuencias de control de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, de poliadenilación, secuencia de propéptido, de promotor, secuencia de péptido señal, y de terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las secuencias de control pueden ser provistas de enlazadores a fin de introducir sitios de restricción específicos facilitando la ligadura de las secuencias de control con la región de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

Operativamente enlazado: el término "operativamente enlazado" denota aquí una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada en relación con la secuencia codificante de la secuencia polinucleótida de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

Secuencia codificante: cuando se usa aquí el término "secuencia codificante" significa una secuencia de nucleótidos, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto de la proteína. Los límites de la secuencia codificante generalmente son determinados por un marco de lectura abierto, que normalmente se inicia con el codón de iniciación ATG o codones de iniciación alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser una secuencia de ADN, de ADNc, o de nucleótidos recombinante.

Expresión: el término "expresión" incluye cualquier fase implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero de forma no limitativa, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

Vector de expresión: el término "vector de expresión" se define aquí como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, y que está operativamente enlazada a nucleótidos adicionales que proveen su expresión.

Célula huésped: el término "célula huésped", como se utiliza en este caso, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción, y similares con un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo un polinucleótido de la presente invención.

Modificación: el término "modificación" aquí significa cualquier modificación química del polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2 al igual que la manipulación genética del ADN que codifica este polipéptido. La(s) modificación (es) puede(n) ser sustitución(es), deleción(es) y/o inserción(es) de(l) (los) aminoácido(s)
al igual que sustitución(es) de cadena(s) laterales de aminoácidos; o uso de aminoácidos no naturales con características similares en la secuencia de aminoácidos. En particular la(s) modificación(es) puede(n) ser amidaciones, tales como amidación del C-término.

Variante artificial: cuando se usa aquí, el término "variante artificial" significa un polipéptido con actividad antimicrobiana producida por un organismo que expresa una secuencia de nucleótidos modificada de la SEC ID NO:1. La secuencia de nucleótidos modificada se obtiene a través de intervención humana por modificación de la secuencia de nucleótidos descrita en la SEC ID NO:1.

Descripción detallada de la invención Polipéptidos con actividad antimicrobiana

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2 (es decir, el polipéptido maduro) de al menos un 70%, preferiblemente al menos un 75%, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, aún más preferiblemente al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, y de la forma aún más preferible al menos un 97%, que tienen actividad antimicrobiana (de ahora en adelante "polipéptidos homólogos"). En un aspecto preferido, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por diez aminoácidos, preferiblemente por cinco aminoácidos, más preferiblemente por cuatro aminoácidos, aún más preferiblemente por tres aminoácidos, de la forma más preferible por dos aminoácidos, y aún más preferiblemente por un aminoácido de los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

Un polipéptido de la presente invención preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. En otro aspecto preferido, un polipéptido comprende los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2. En otro aspecto preferido, un polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. En otro aspecto preferido, un polipéptido consiste en los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

Preferiblemente, cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, de lo que lo son las sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadores que significativamente no afectan al plegamiento y/o la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 10 aminoácidos; extensiones pequeñas amino o carboxilo terminales, tal como un residuo de metionina amino terminal; un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y pequeños aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los intercambios que ocurren más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly.

Además de los 20 aminoácidos estándares, aminoácidos no estándares (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina, y alfa-metil serina) pueden ser sustituidos por residuos de aminoácidos de un polipéptido de tipo salvaje. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético, y aminoácidos no naturales pueden ser sustituidos por residuos de aminoácidos. "Aminoácidos no naturales" han sido modificados después de la síntesis de la proteína, y/o tienen una estructura química en sus cadena(s) lateral(es) diferente(s) de la de los aminoácidos estándares. Aminoácidos no naturales pueden ser químicamente sintetizados, y preferiblemente, están comercialmente disponibles, e incluyen ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, dehidroprolina, 3- y 4- metilprolina, y 3,3-dimetilprolina.

Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físico-químicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, cambios de aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares.

Aminoácidos esenciales en el polipéptido progenitor pueden ser identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, mutaciones únicas de la alanina se introducen a cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se evalúan por su actividad biológica (es decir, actividad antimicrobiana) para identificar residuos de aminoácidos que son críticas para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. La interacción biológica puede también ser determinada por análisis físico de estructura, como está determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica, o mareaje por fotoafinidad, conjuntamente con mutación de aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. Las identidades de aminoácidos esenciales pueden también ser inferidas de análisis de identidades con polipéptidos que están relacionados con un polipéptido según la invención.

Sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples pueden ser hechas y evaluadas usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o redistribución, seguido de un procedimiento de selección pertinente, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988 Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden ser usados incluyen PCR propensa a errores, exposición en el fago (p. ej., Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; patente estadounidense nº. 5,223,409; WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, gen 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

Métodos de mutagénesis/redistribución pueden ser combinados con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y mutagenizados expresados por células huéspedes. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden ser recuperadas de las células huéspedes y rápidamente secuenciadas usando métodos estándares en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden ser aplicados a polipéptidos de estructura desconocida.

El número total de sustituciones de aminoácidos, deleciones y/o inserciones de los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2 es 10, preferiblemente 9, más preferiblemente 8, más preferiblemente 7, más preferiblemente como mucho 6, más preferiblemente como mucho 5, más preferiblemente 4, aún más preferiblemente 3, de la forma más preferible 2, aún más preferiblemente 1.

En una forma de realización, los polipéptidos de la invención incluyen por lo menos 4 residuos de cisteína, preferiblemente los polipéptidos incluyen exactamente 4 residuos de cisteína. En otra forma de realización, los polipéptidos son polipéptidos cíclicos.

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Extensión N-terminal

Una extensión N-terminal de los polipéptidos de la invención puede adecuadamente consistir en de 1 a 50 aminoácidos, preferiblemente 2-20 aminoácidos, especialmente 3-15 aminoácidos. En una forma de realización la extensión del péptido N-terminal no contiene Arg (R). En otra forma de realización la extensión N-terminal comprende un sitio de ruptura kex2 o de tipo kex2 como se define más adelante. En una forma de realización preferida la extensión N-terminal es un péptido, comprendiendo al menos dos residuos de aminoácidos Glu (E) y/o Asp (D), tal como una extensión N-terminal comprendiendo una de las siguientes secuencias: EAE, EE, DE y DD.

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Sitios Kex2

Sitios Kex2 (véase, p. ej., Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") y sitios de tipo kex2 son sitios de reconocimiento di-básicos (es decir, sitios de ruptura) encontrados entre la región codificante del pro-péptido y la región madura de algunas proteínas.

La inserción de un sitio kex2 o un sitio de tipo kex2 en algunos casos ha demostrado que mejora el tratamiento de endopeptidasa correcta en el sitio de ruptura del pro-péptido dando como resultado niveles aumentados de la secreción de proteínas.

En el contexto de la invención, la inserción de un sitio kex2 o de tipo kex2 da como resultado la posibilidad de obtener la ruptura a una posición determinada en la extensión N-terminal dando como resultado un polipéptido antimicrobiano que se extiende en comparación con el polipéptido maduro mostrado como los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

Polipéptidos fusionados

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles en el que otro polipéptido se fusiona en el N-término o el C-término del polipéptido de la invención o un fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce fusionando una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) de la presente invención. Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que éstas estén en el marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del (los) mismo(s) o promotor(es) y terminador.

Fuentes de polipéptidos con actividad antimicrobiana

Un polipéptido de la presente invención puede ser obtenido de microorganismos de cualquier género. Para objetivos de la presente invención, el término "obtenido de" como se utiliza en este caso en relación con una fuente dada se entenderá que el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos se produce por la fuente o por una cepa en la que la secuencia de nucleótidos de la fuente ha sido insertada. En un aspecto preferido, el polipéptido obtenido de una fuente dada es segregado extracelularmente.

Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano gram positivo tal como un polipéptido de Bacillus, p. ej., un polipéptido de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o uno de Bacillus thuringiensis; o un polipéptido de Streptomyces, p. ej., un polipéptido de Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; o un polipéptido bacteriano gram negativo, p. ej., un polipéptido de E. coli un polipéptido de
Pseudomonas sp..

Un polipéptido de la presente invención puede también ser un polipéptido fúngico, y más preferiblemente un polipéptido de levadura tal como un polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o polipéptido de Yarrowia; o más preferiblemente un polipéptido filamentoso fúngico tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma.

En un aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Sachharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis que tiene actividad antimicrobiana.

En otro aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

En otro aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Arenicola marina, p. ej., el polipéptido de la SEC ID NO:2.

Será entendido que para las especies mencionadas anteriormente, la invención incluye tanto los estados perfectos como los estados imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, a pesar del nombre de especies por el cual se les conoce. Expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.

Cepas de estas especies son de fácil acceso para el público en un número de colecciones de cultivos, tal como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Además, tales polipéptidos pueden ser identificados y obtenidos de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., tierra, abonos, agua, etc.) usando las sondas mencionadas arriba. Técnicas para aislar microorganismos de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. El polinucleótido puede entonces ser obtenido de manera similar por la selección de una genoteca genómica o de ADNc de otro microorganismo. Una vez que ha sido detectada una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido con la(s) sonda(s), el polinucleótido puede ser aislado o clonado utilizando técnicas que son bien conocidas por aquellos con conocimientos comunes en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).

Polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles en los que otro polipéptido se fusiona en el N-término o el C-término del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce mediante la fusión de una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) de la presente invención. Técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en el marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control de(l) (los) mismo(s) promotor(es) y terminador.

Polinucleótidos

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados con una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención. En un aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos se establece en la SEC ID NO:1. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos es la región codificante del polipéptido maduro de la SEC ID NO:1. La presente invención también incluye secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o el polipéptido maduro del mismo, que difieren de la SEC ID NO:1 en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de la SEC ID NO:1 que codifican fragmentos de la SEC ID NO:2 que tienen actividad antimicrobiana.

La presente invención también se refiere a polunucleótidos mutantes comprendiendo al menos una mutación en la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEC ID NO:1, en el que la secuencia de nucleótidos mutante codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos de la presente invención de tal ADN genómico puede ser efectuada, p. ej., usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocida o seleccionando anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, p. ej., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tal como reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en secuencias de nucleótidos (NASBA) pueden ser usados. Los polinucleótidos pueden ser clonados de una cepa de Arenicola, u otro u organismo relacionado y por lo tanto, por ejemplo, puede ser una variante alélica o variante de especies de la región que codifica el polipéptido de la secuencia de nucleótidos.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos con secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEC ID NO:1 (es decir, nucleótidos 496 a 558) de al menos un 60%, preferiblemente al menos un 65%, más preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 75%, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90%, aún más preferiblemente al menos un 95%, y de la forma más preferible al menos un 97% de identidad, que codifican un polipéptido activo.

La modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas del polipéptido que no ocurren naturalmente. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna forma de ingeniería del polipéptido aislado de su fuente nativa, p. ej., variantes artificiales que difieren en actividad específica, termostabilidad, pH óptimo, o similares. La secuencia de la variante puede ser construida basándose en la secuencia de nucleótidos presentada como la región que codifica el polipéptido de la SEC ID NO:1, p. ej., una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Será evidente para los expertos en la técnica que tales sustituciones se pueden hacer fuera de las regiones fundamentales para la función de la molécula y todavía resultan en un polipéptido activo. Residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por un polinucleótido aislado de la invención, y por lo tanto preferiblemente no sujetos a sustitución, pueden ser identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (véase, p. ej., Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, las mutaciones se introducen a cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se evalúan por su actividad antimicrobiana para identificar residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción sustrato-enzima también pueden ser determinados por análisis de la estructura tridimensional según ha sido determinado por técnicas tales como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o etiquetado de fotoafinidad (véase, p. ej., De Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención, que se hibridan en condiciones de baja astringencia, preferiblemente en condiciones de astringencia media, más preferiblemente en condiciones de astringencia media a alta, aún más preferiblemente en condiciones de alta astringencia, y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy alta con (i) nucleótidos 496 a 558 de la SEC ID NO:1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 1 a 558 de la SEC ID NO:1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); o variantes alélicas y subsecuencias de las mismas (Sambrook et al., 1989, supra), tal como se define en la presente.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados obtenidos por (a) hibridación de una población de ADN en condiciones de astringencia baja, media, media alta, alta, o muy alta con (i) nucleótidos 496 a 558 de la SEC ID NO:1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 1 a 558 de la SEC ID NO:1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); y (b) el aislamiento del polinucleótido de hibridación, que codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana.

Constructos de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos comprendiendo un polinucleótido aislado de la presente invención operativamente vinculado a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser manipulado en una variedad de maneras para proveer expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias polinucleótidas utilizando métodos de ADN recombinantes son bien conocidos en la técnica.

La secuencia de control puede ser una secuencia del promotor apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia del promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede ser obtenido de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, el gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, el gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, el gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, el gen (penP) de penicilinasa de Bacillus licheniformis, los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y el gen procariótico de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Más promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa fúngica son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.

En un huésped de levadura, promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1,ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotionina (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura se describen por Romanos et al., 1992, Yeast 8:
423-488.

La secuencia de control puede también ser una secuencia de terminación de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar transcripción. La secuencia de terminación está operativamente vinculada al término 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usado en la presente invención.

Terminadores preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger; y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Terminadores preferidos para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharamyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de levadura se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control puede también ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente vinculada al término 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Líderes preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Líderes adecuados para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente vinculada al término 3' de la secuencia de nucleótidos y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes filamentosas fúngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

Secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura se describen por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control puede también ser una región codificante del péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos vinculada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede contener intrínsecamente una región codificante del péptido señal naturalmente vinculado en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido segregado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es foránea a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal foránea puede ser requerida donde la secuencia codificante no contiene naturalmente una región codificante del péptido señal. Alternativamente, la región codificante del péptido señal foránea puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para incrementar la secreción del polipéptido. No obstante, cualquier región codificante del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes bacterianas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutrales (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, y prsA de Bacillus subtilis. Más péptidos señales se describen por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes filamentosas fúngicas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa.

En un aspecto preferido, la región codificante del péptido señal es los nucleótidos 1 a 72 de la SEC ID NO:1 que codifican los aminoácidos -165 a -142 de la SEC ID NO:2.

Péptidos señales útiles para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para alfa factor de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes útiles que codifican el péptido señal se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control puede también ser una región codificante del propéptido que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede ser convertido en un polipéptido maduro activo por ruptura catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido puede ser obtenida de los genes para proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, proteasa neutra (nprT) de Bacillus subtilis, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

En un aspecto preferido, la región codificante del propéptido es los nucleótidos 73 a 495 de la SEC ID NO:1 que codifican los aminoácidos -141 a -1 de la SEC ID NO:2.

Cuando ambas regiones del péptido señal y regiones del propéptido están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.

Puede también ser deseable añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que causan que la expresión del gen sea activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac, y trp. En levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 puede ser utilizado. En hongos filamentosos, el promotor TAKA de alfa-amilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae puede ser usado como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la amplificación del gen. En sistemas eucarióticos, éstas incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de la metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido sería operativamente vinculada con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes comprendiendo un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Los diferentes ácidos nucleicos y secuencias de control que se describen arriba pueden ser unidos para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, una secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser expresada mediante la inserción de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante está operativamente vinculada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinantes y puede provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o plásmidos circulares cerrados.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, está integrado en el genoma y se replica junto con el/los cromosoma(s) en el que ha sido integrado. Además, se puede usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares.

Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol, o tetraciclina. Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Marcadores seleccionables para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Preferidos para el uso en una célula del Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces higroscopicus.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento(s) que permite(n) integración del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótidos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homologa o recombinación no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula huésped en una ubicación(es)
precisa(s) en el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales preferiblemente deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, preferiblemente 400 a 10.000 pares de bases, y de la forma más preferible 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia diana correspondiente para incrementar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homologa con la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o secuencias de nucleótidos codificantes. Por otra parte, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por recombinación no homologa.

Para replicación autónoma, el vector puede además comprender un origen de replicación permitiendo al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plásmido que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador plásmido" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite a un plásmido o vector replicarse in vivo.

Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de plásmidos pBR322; pUC19; pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110; pE194; pTA1060, y pAM\beta1 que permiten la replicación en Bacillus.

Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son los orígenes de replicación de 2 micrones, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de los hongos filamentosos son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Aislamientos del gen AMA1 y construcción de plásmidos o vectores comprendiendo el gen pueden ser realizados según los métodos descritos en WO 00/24883.

Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para aumentar la producción del producto génico. Un aumento en el número de copias del polinucleótido puede ser obtenido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con los polinucleótidos donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y de ese modo copias adicionales del polinucleótido, pueden ser seleccionadas cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).

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Células huéspedes

La presente invención también se refiere a células huéspedes recombinantes, comprendiendo un polinucleótido de la presente invención, que son ventajosamente usadas en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector comprendiendo un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se describe anteriormente. El término "célula huésped" incluye cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped en gran parte depende del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un microorganismo procariota, o un microorganismo no unicelular, p. ej., una eucariota.

Microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas incluyendo, pero de forma no limitativa, una célula de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, o Bacillus subtilis. En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico.

La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación del protoplasto (véase, p. ej., Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usar células competentes (véase, p. ej., Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, p. ej., Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, p. ej., Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

La célula huésped puede también ser una eucariota, tal como un célula de mamífero, de insecto, de planta, o fúngica.

En un aspecto preferido, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como se define por Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) al igual que el Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

En un aspecto más preferido, la célula huésped de los hongos es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascosporógena (Endomycetales), levadura basidiosporogénea, y levadura que pertenece a los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Como la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, la levadura debería ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series nº. 9, 1980).

En un aspecto aún más preferido, la célula huésped de la levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.

En un aspecto más preferido, la célula huésped de la levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

En otro aspecto más preferido, la célula huésped de los hongos es una célula de los hongos filamentosos. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos generalmente se caracterizan por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

En un aspecto aún más preferido, la célula huésped de los hongos filamentosos es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bierkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.

En un aspecto más preferido, la célula huésped de los hongos filamentosos es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de los hongos filamentosos es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotríchioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venatum. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de una célula de la cepa de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneiria, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, o Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que implica formación de los protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus y de Trichoderma se describe en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156, y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y en Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

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Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Preferiblemente, la célula es del género Arenicola, y más preferiblemente Arenicola marina.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula huésped en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula huésped en condiciones propicias para la producción del polipéptido, donde la célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos mutante que tiene al menos una mutación en la región codificante del polipéptido maduro de la SEC ID NO:1, donde la secuencia de nucleótidos mutante codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2, y (b) recuperar el polipéptido.

En los métodos de producción de la presente invención, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en matraz vibrante, y fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo, fermentación continua, discontinua, discontinua alimentada, o de estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizado en un medio adecuado y en condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, puede ser recuperado de lisatos celulares.

Los polipéptidos pueden ser detectados usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos. Por ejemplo, un ensayo de la actividad antimicrobiana puede ser usado para determinar la actividad del polipéptido como se describe en la presente.

El polipéptido resultante puede ser recuperado usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero de forma no limitativa, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, cromatografía (p. ej., de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque, y de exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción (véase, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Composiciones

La presente invención también se refiere a composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad antimicrobiana de la composición ha sido aumentada, p. ej., con un factor de enriquecimiento de 1.1.

Las composiciones pueden además comprender otro agente farmacéuticamente activo, tal como un agente biocida adicional o bioestático, tal como otro polipéptido antimicrobiano que exhibe actividad antimicrobiana tal como se ha definido anteriormente. El agente biocida puede ser un antibiótico, según se conoce en la técnica. Clases de antibióticos incluyen penicilinas, p. ej. penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta lactamasa, cefalosporinas, p. ej., cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactamo, etc.; carbapenemos; monobactamos; aminoglicósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc. El agente biocida puede también ser un agente anti-micótico, incluyendo polienos, p. ej. anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azoles, p. ej. miconazol, ketoconazol, itraconazol y fluconazol.

En una forma de realización el agente biocida es un agente químico no enzimático. En otra forma de realización el agente biocida es un agente químico no polipeptídico.

Las composiciones pueden comprender un material portador adecuado. Las composiciones pueden también comprender un vehículo de entrega adecuado capaz de entregar los polipéptidos antimicrobianos de la invención en el locus deseado cuando las composiciones son usadas como un medicamento.

Las composiciones del polipéptido pueden ser preparadas conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición del polipéptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido para ser incluido en la composición puede ser estabilizado conforme a métodos conocidos en la técnica.

A continuación se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones del polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptidos de la invención y otras condiciones en las que se usa la composición pueden ser determinadas basándose en métodos conocidos en la técnica.

Métodos y Usos

La presente invención también se dirige a métodos para usar los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana. Los polipéptidos antimicrobianos son típicamente útiles en cualquier locus sometido a contaminación por bacterias, hongos, levadura o algas. Típicamente, los loci están en sistemas acuosos tal como sistemas de agua de refrigeración, agua de enjuague de lavandería, sistemas de aceite tal como aceites de corte, lubricantes, campos de aceite y similares, donde los microorganismos tienen que ser matados o donde su crecimiento tiene que ser controlado. No obstante, la presente invención puede también ser usada en todas las aplicaciones para las que las composiciones antimicrobianas conocidas son útiles, tal como la protección de madera, látex, adhesivo, cola, papel, cartón, textil, cuero, plástico, calafateo, y pienso.

Otros usos incluyen la conservación de alimentos, bebidas, cosméticos tal como lociones, cremas, geles, pomadas, jabones, champús, acondicionadores, antitranspirantes, desodorantes, enjuagues bucales, productos para lentes de contacto, formulaciones enzimáticas, o ingredientes alimenticios.

Por lo tanto, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser útiles como un desinfectante, p. ej., en el tratamiento de infecciones oculares o bucales, infecciones cutáneas; en antitranspirantes o desodorantes; para limpieza y desinfección de lentes de contacto y dientes (cuidado oral).

En general se contempla que los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención son útiles para limpiar, desinfectar o inhibir el crecimiento microbiano en cualquier superficie. Ejemplos de superficies, que pueden ventajosamente ser contactadas con los polipéptidos antimicrobianos de la invención son superficies del equipo de proceso usado p. ej. industrias lácteas, plantas de proceso químico o farmacéutico, sistemas de saneamiento de agua, plantas de procesamiento de aceite, plantas de procesamiento de pasta de papel, plantas de tratamiento de agua, y torres de enfriamiento. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención deberían ser usados en una cantidad, que sea eficaz para limpiar, desinfectar o inhibir el crecimiento microbiano en la superficie en cuestión.

Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden adicionalmente ser usados para limpiar superficies y utensilios de cocina en plantas de procesamiento de alimentos y en cualquier área en que se preparan y se sirven alimentos tales como hospitales, clínicas y restaurantes.

Puede también ser usado como un agente de conservación o un agente de desinfección en pinturas a base de agua.

La invención también se refiere al uso de un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención como un medicamento. Además, un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención puede también ser usado para la producción de un medicamento para controlar o combatir microorganismos, tales como organismos fúngicos o bacterias, preferiblemente bacterias gram positivas.

La composición y el polipéptido antimicrobiano de la invención puede ser utilizado como un agente antimicrobiano veterinario o humano terapéutico o profiláctico. Por lo tanto, la composición y el polipéptido antimicrobiano de la invención pueden ser usados en la preparación de agentes veterinarios o humanos terapéuticos o agentes profilácticos para el tratamiento de infecciones microbianas, tales como infecciones bacterianas o fúngicas, preferiblemente infecciones bacterianas gram positivas. En particular las infecciones microbianas pueden estar asociadas a enfermedades pulmonares incluyendo, pero de forma no limitativa, tuberculosis, pulmonía y fibrosis cística; y enfermedades de transmisión sexual incluyendo, pero de forma no limitativa, gonorrea y clamidia.

La composición de la invención comprende una cantidad eficaz del polipéptido antimicrobiano de la invención.

El término "cantidad eficaz" cuando se usa en este caso debe entenderse como una cantidad de los polipéptidos antimicrobianos de la invención, que es suficiente para inhibir el crecimiento de los microorganismos en cues-
tión.

La invención también se refiere a composiciones o productos para la curación de heridas, tales como vendajes, dispositivos médicos tales como, p. ej., catéteres y además productos anticaspa para el pelo, tales como champús.

Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención se administran a un huésped que sufre de o está predispuesto a una infección microbiana. La administración puede ser tópica, localizada o sistémica, dependiendo del microorganismo específico, preferiblemente será localizada. Generalmente la dosis de los polipéptidos antimicrobianos de la invención será suficiente para reducir la población microbiana al menos aproximadamente en un 50%, normalmente al menos en 1 log, y al menos en 2 o más logs de muerte. Los compuestos de la presente invención se administran en una dosificación que reduce la población microbiana mientras se minimiza cualquier efecto secundario. Está contemplado que la composición sea obtenida y usada bajo la dirección de un médico para el uso in vivo. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención son particularmente útiles para matar bacterias gram negativas, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, y Chlamydia trachomatis; y bacterias gram-positivas, incluyendo estreptococos tal como Streptococcus pneumonia, S. uberis, S. hyointestinalis, S. pyogenes y S. agalactiae; y estafilococos tal como Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus y S. camosus.

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Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser administradas a un huésped sufriendo de o predispuesto a una infección microbiana de pulmón, tal como pulmonía; o a una infección microbiana de la herida, tal como una infección bacteriana de la herida.

Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden también ser administradas a un huésped sufriendo de o predispuesto a una infección de la piel, tal como acné, dermatitis atópica o dermatitis seborreica; preferiblemente la infección de la piel es una infección bacteriana de la piel, p. ej. provocada por Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes, Pityrosporum ovale o Malassezia furfur.

Los polipéptidos antimicrobianos de la invención también son útiles para formulaciones in vitro para matar microbios, particularmente donde no se desea introducir cantidades de antibióticos convencionales. Por ejemplo, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser añadidos a preparaciones alimenticias para animales y/o humanos; o pueden ser incluidos como un aditivo para cultivos celulares in vitro, para prevenir el crecimiento excesivo de microbios en el cultivo de tejido.

La susceptibilidad de un microbio particular para matar con los polipéptidos antimicrobianos de la invención puede ser determinada mediante pruebas in vitro, como se detalla en la sección experimental. Típicamente un cultivo del microbio se combina con el polipéptido antimicrobiano a concentraciones variables durante un periodo temporal suficiente para permitir que la proteína actúe, normalmente entre aproximadamente una hora y un día. Los microbios viables entonces son contados, y el nivel de muerte es determinado.

Microbios de interés incluyen, pero de forma no limitativa, bacterias gram-negativas, por ejemplo: Citrobacter sp.; Enterobacter sp.; Escherichia sp., p. ej. E. coli; Klebsiella sp.; Morganella sp.; Proteus sp.; Providencia sp.; Salmonella sp., p. ej. S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp., p. ej. P. aeruginosa; Yersinia sp., p. ej. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica; Franciscella sp.; Pasturella sp.; Vibrio sp., p. ej. V. cholerae, V. parahemolyticus; Campylobacter sp., p. ej. C. jejuni; Haemophilus sp., p. ej. H. influenzae, H. ducreyi; Bordetella sp., p. ej. B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis; Brucella sp., Neisseria sp., p. ej. N. gonorrhoeae, N. meningitis, etc. Otras bacterias de interés incluyen Legionella sp., p. ej. L. pneumophila; Listeria sp., p. ej. L. monocytogenes; Mycoplasma sp., p. ej. M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., p. ej. M. tuberculosis, M. leprae; Treporiema sp., p. ej. T. pallidum; Borrelia sp., p. ej. B. burgdorferi; Leptospirae sp.; Ricketsia sp., p. ej. R. rickettsii, R. typhi; Chlamydia sp., p. ej. C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci; Helicobactersp., p. ej. H. pylori, etc.

Patógenos no bacterianos de interés incluyen patógenos fúngicos y patógenos de protozoo, p. ej. Plasmodia sp., p. ej. P. falciparum, Trypanosoma sp., p. ej. T. brucel; Schistomas; Entaemoeba, Cryptococcus sp., Candida sp., p. ej. C. albicans; etc.

Se pueden emplear varios métodos para administración. La formulación del polipéptido puede ser dada oralmente, o puede ser inyectada por vía intravascular, subcutáneamente, peritonealmente, por aerosol, oftálmicamente, intra-vejiga, tópicamente, etc. Por ejemplo, métodos de administración por inhalación son bien conocidos en la técnica. La dosificación de la formulación terapéutica variará mucho, dependiendo del polipéptido antimicrobiano específico para ser administrado, la naturaleza de la enfermedad, la frecuencia de administración, la forma de administración, el aclaramiento del agente del huésped, y similares. La dosis inicial puede ser más grande, seguido de dosis de mantenimiento más pequeñas. La dosis puede ser administrada de forma tan infrecuente como semanal o bisemanal, o fraccionada en dosis más pequeñas y administrada una vez o varias veces, a diario, semi-semanal, etc. para mantener un nivel de dosificación eficaz. En muchos casos, la administración oral requerirá una dosis más alta que si se administra por vía intravenosa. Los enlaces amida, al igual que los términos amino y carboxi, pueden ser modificados para una mayor estabilidad en la administración oral. Por ejemplo, el término carboxi puede ser amidado.

Formulaciones

Los compuestos de esta invención pueden ser incorporados en una variedad de formulaciones para administración terapéutica. De forma más particuar, los compuestos de la presente invención pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas por combinación con portadores apropiados aceptables farmacéuticamente o diluyentes, y pueden ser formulados en preparaciones en formas sólidas, semi-sólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, cremas, espumas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas, lociones, y aerosoles. Como tal, la administración de los compuestos puede ser conseguida de varias maneras, incluyendo administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, etc.. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser sistémicos después de la administración o pueden ser localizados por el uso de un implante u otra formulación que actúa para retener la dosis activa en el sitio de implantación.

En una forma de realización, una formulación para uso tópico comprende un agente quelante que reduce la concentración eficaz de cationes bivalentes, particularmente calcio y magnesio. Por ejemplo, agentes tales como citrato, EGTA o EDTA pueden ser incluidos, donde se prefiere citrato. La concentración de citrato usualmente será de aproximadamente 1 a 10 mM.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados solos, en combinación entre sí, o pueden ser usados en combinación con otros compuestos conocidos (p. ej., perforina, agentes anti-inflamatorios, antibióticos, etc.). En formas de dosificación farmacéuticas, los compuestos pueden ser administrados en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables. Los siguientes métodos y excipientes son meramente ilustrativos y no son limitativos de ninguna manera.

Para preparaciones orales, los compuestos pueden ser usados solos o en combinación con aditivos apropiados para hacer comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con desintegradores, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, agentes conservantes y aromatizantes.

Los compuestos pueden ser formulados en preparaciones para inyecciones disolviendo, suspendiendo o emulsionando en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros aceites similares, glicéridos de ácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.

Los compuestos pueden ser usados en la formulación de aerosoles para ser administrados por inhalación. Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados en propulsores presurizados aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Los compuestos pueden ser usados como lociones, por ejemplo para prevenir la infección de quemaduras, por formulación con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.

Además, los compuestos pueden ser hechos en supositorios mediante la mezcla con una variedad de bases tales como bases emulsionantes o bases hidrosolubles. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados por vía rectal mediante un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras y politilenglicoles, que se funden a la temperatura corporal, pero son solidificados a temperatura ambiente.

Formas de dosificación unitaria para administración oral o rectal tal como jarabes, elixires, y suspensiones pueden ser proporcionadas donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, pastilla o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición conteniendo uno o más compuestos de la presente invención. De manera similar, formas de dosificación unitaria para inyección o administración intravenosa pueden comprender el compuesto de la presente invención en una composición como una solución en agua estéril, solución salina normal u otro portador farmacéuticamente aceptable.

Los implantes para formulaciones de liberación sostenida son bien conocidos en la técnica. Los implantes son formulados como microesferas, tiras, etc. con polímeros biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, polímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico forman un polímero erosionable que es bien tolerado por el huésped. El implante conteniendo los polipéptidos antimicrobianos de la invención se coloca en proximidad al sitio de infección, de modo que la concentración local de agente activo aumenta en relación con el resto del cuerpo.

El término "forma de dosificación unitaria", como se utiliza en este caso, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y sujetos animales, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo aceptable farmacéuticamente. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de la presente invención dependen del compuesto particular empleado y el efecto que debe ser conseguido, y la farmacodinámica asociada al compuesto en el huésped.

Los excipientes aceptables farmacéuticamente, tales como vehículos, adyuvantes, soportes o diluyentes, están fácilmente disponibles al público. Además, sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente, tales como agentes reguladores y amortiguadores del pH, agentes reguladores de la tonicidad, estabilizadores, agentes humectantes y similares, están fácilmente disponibles al público.

Dosificaciones típicas para la administración sistémica variarán de 0,1 pg a 100 miligramos por kg peso de sujeto por administración. Una dosificación típica puede ser una pastilla tomada de dos a seis veces al día, o una cápsula o pastilla de liberación gradual tomada una vez al día y conteniendo un contenido proporcionalmente más alto de ingrediente activo. El efecto de la liberación gradual puede ser obtenido por materiales de cápsula que se disuelven a valores de pH diferentes, por cápsulas que se liberan lentamente por presión osmótica, o por cualquier otro medio conocido de liberación controlada.

Aquellos con conocimientos apreciarán fácilmente que los niveles de dosis pueden variar como función del compuesto específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a efectos secundarios. Algunos de los compuestos específicos son más potentes que otros. Dosificaciones preferidas para un compuesto dado son fácilmente determinables por los expertos en la técnica por una variedad de medios. Un medio preferido es medir la potencia fisiológica de un compuesto dado.

El uso de liposomas como un vehículo de entrega es un método de interés. Los liposomas se fusionan con las células del sitio meta y entregan el contenido del lumen intracelularmente. Los liposomas se mantienen en contacto con las células durante un tiempo suficiente para la fusión, usando diferentes medios para mantener el contacto, tal como aislamiento, agentes aglutinantes, y similares. En un aspecto de la invención, los liposomas se diseñan en aerosol para administración pulmonar. Liposomas pueden ser preparados con proteínas purificadas o péptidos que median la fusión de membranas, tal como virus de Sendai o virus de la gripe, etc. Los lípidos pueden ser cualquier combinación útil de lípidos conocidos que forman liposomas, incluyendo lípidos catiónicos o zwitteriónicos, tal como la fosfatidilcolina. El lípido restante normalmente será lípidos neutros o lípidos ácidos, tal como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol, y similares.

Para preparar los liposomas, el procedimiento descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361 puede ser usado. Brevemente, los lípidos y la composición de lumen conteniendo péptidos se combinan en un medio acuoso apropiado, convenientemente un medio salino donde los sólidos totales estarán en la gama de aproximadamente un 1-10 por ciento en peso. Después de agitación intensa durante períodos cortos de tiempo, de aproximadamente 5-60 seg., el tubo se coloca en un baño de agua caliente, de aproximadamente 25-40ºC y este ciclo se repite de aproximadamente 5-10 veces. La composición luego es sonicada durante un período de tiempo conveniente, generalmente de aproximadamente 1-10 seg. y además puede ser agitada con vórtex. El volumen entonces se expande añadiendo medio acuoso, generalmente aumentando el volumen aproximadamente de 1-2 veces, seguido de agitación y enfriamiento. Este método permite la incorporación en el lumen de moléculas de alto peso molecular.

Formulaciones con otros agentes activos

Para el uso en los métodos del sujeto, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser formulados con otros agentes farmacéuticamente activos, particularmente otros agentes antimicrobianos. Otros agentes de interés incluyen una amplia variedad de antibióticos, como se conocen en la técnica. Clases de antibióticos incluyen penicilinas, p. ej. penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta-lactamasa, cefalosporinas, p. ej., cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactamo, etc.; carbapenemos; monobactamos; aminoglicósidos; tetraciclina; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc.

Agentes antimicóticos también son útiles, incluyendo polienos, p. ej. anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azoles, p. ej. miconazol, ketoconazol, itraconazol y fluconazol. Fármacos antituberculóticos incluyen isoniazida, etambutol, estreptomicina y rifampicina. Citoquinas pueden también ser incluidas en una formulación de los polipéptidos antimicrobianos de la invención, p. ej. interferón gamma, factor alfa de necrosis tumoral, interleuquina 12, etc.

Síntesis in vitro

Los péptidos antimicrobianos de la invención pueden ser preparados por síntesis in vitro, usando métodos convencionales como se conocen en la técnica. Varios aparatos comerciales sintéticos están disponibles, por ejemplo sintetizadores automatizados por Applied Biosystems Inc., Beckman, etc.. Usando sintetizadores, aminoácidos de origen natural pueden ser sustituidos por aminoácidos no naturales, particularmente D-isómeros (o D-formas) p. ej. D-alanina y D-isoleucina, diastereoisómeros, cadenas laterales que tienen longitudes o funciones diferentes, y similares. La secuencia particular y la manera de preparación será determinada por conveniencia, economía, pureza requerida, y similares.

El enlace químico puede ser proporcionado para varios péptidos o proteínas comprendiendo funciones convenientes para la unión, tal como grupos amino para formación de amida o amina sustituida, p. ej. aminación reductiva, grupos tiol para formación de tioéter o de disulfuro, grupos carboxilo para formación de amida, y similares.

Si se desea, varios grupos pueden ser introducidos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, que permiten el enlace a otras moléculas o a una superficie. Así las cisteínas pueden utilizarse para hacer tioéteres, histidinas para enlace a un complejo del ión metálico, grupos carboxilo para formar amidas o ésteres, grupos amino para formar amidas, y similares.

Los polipéptidos pueden también ser aislados y purificados conforme a métodos convencionales de síntesis recombinante. Un lisado puede ser preparado del huésped de la expresión y el lisado purificado usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis de gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de la purificación. En la mayor parte, las composiciones que son usadas comprenderán al menos un 20% en peso del producto deseado, más normalmente al menos aproximadamente un 75% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente un 95% en peso, y para fines terapéuticos, normalmente al menos aproximadamente un 99,5% en peso, en relación con contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Normalmente, los porcentajes se basarán en la proteína total.

La presente invención se describe en más detalle por los siguientes ejemplos que no deberían ser interpretados como limitativos del ámbito de la invención.

Ejemplos

Los productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de al menos grado reactivo. En los siguientes ejemplos, al polipéptido antimicrobiano mostrado como los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2 se le hace referencia como "Arenicina".

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Ejemplo 1 Actividad antimicrobiana de Arenicina

El péptido antimicrobiano mostrado como aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2 fue preparado sintéticamente. La Concentración Inhibidora Mínima (CIM) fue determinada para probar la actividad antimicrobiana de la Arenicina siguiendo las pautas de NCCLS de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute; anteriormente conocido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards) - protocolo M7-A6, vol. 20, nº. 2: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically.

El péptido antimicrobiano de la invención fue evaluado contra 12 cepas bacterianas obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC). Los resultados en la Tabla 1 son valores promedios de dos evaluaciones independientes.

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TABLA 1 Actividad antimicrobiana de la Arenicina

1

Ejemplo 2 Concentración inhibidora mínima contra hongos clínicos

Concentraciones mínimas inhibidoras de Arenicina contra levaduras y hongos fueron determinadas esencialmente como se describe por NCCLS/CLSI (Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio).

En resumen, la suspensión fúngica o de levaduras de aproximadamente 1 unidad McFarland fue diluida 1:100 en caldo PD (8 g/L dextrosa de patata) y el crecimiento fue evaluado contra diluciones de 2 veces en serie de Arenicina (0,03-32 \mug/mL). Placas de ensayo fueron incubadas a 25-27ºC para Candida albicans, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes y Epidermophyton floccosum, y a 30ºC para Candida glabrata, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus niger. El crecimiento fue registrado visualmente (a simple vista, iluminación oblicua) después de aproximadamente 40 horas de incubación. Los resultados se presentan en la Tabla 2 a continuación.

TABLA 2 Actividad antimicrobiana de la Arenicina

2

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad por eventuales errores u omisiones.

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Documentos de patente citados en la descripción

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\sqbullet WO 9533836 A [0093]

\sqbullet WO 0024883 A [0107] [0107]

\sqbullet EP 238023 A [0122]

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<110> Novozymes A/S

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<120> Polipéptidos con actividad antimicrobiana

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<130> 10865.204-WO

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<160> 2

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 558

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<212> ADN

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<213> Arenicola marina

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<220>

<221 > CCS

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<222> (1)..(558)

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<220>

<221 > sig_péptido

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<222> (1)..(72)

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<220>

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<221> mat_péptido

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<222> (496)..(558)

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<400> 1

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3

30

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<210> 2

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<211> 186

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<212> PRT

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<213> Arenicola marina

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<400> 2

4

Claims (18)

1. Polipéptido con actividad antimicrobiana, comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 75% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 80% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 85% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 95% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

7. Polipéptido según la reivindicación 1, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2.

8. Polipéptido según la reivindicación 7, que consiste en la SEC ID NO:2.

9. Polipéptido según la reivindicación 7, que consiste en los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

10. Polinucleótido aislado comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo el polinucleótido de la reivindicación 10 operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

12. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos de la reivindicación 11.

13. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos de la reivindicación 11.

14. Método para producir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 comprendiendo (a) cultivar una célula que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, o cultivar una célula huésped comprendiendo un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

15. Composición comprendiendo un polipéptido antimicrobiano como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Método in vitro para matar o inhibir el crecimiento de células microbianas, comprendiendo contactar las células microbianas con un polipéptido antimicrobiano como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

17. Polipéptido antimicrobiano como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para el uso como un medicamento.

18. Uso de un polipéptido antimicrobiano como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la preparación de un agente veterinario o agente terapéutico humano para el tratamiento de una infección microbiana.