KR101362710B1 - 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드 및 이들을 암호화한폴리뉴클레오타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균 활성을 지닌 분리된 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 암호화한 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물, 벡터, 및 숙주 세포에 관한 것이며, 상기 폴리펩타이드의 생산 및 사용 방법에 관한 것이다.

항생제, 항균 활성, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 구조물

Description

항균 활성을 지닌 폴리펩타이드 및 이들을 암호화한 폴리뉴클레오타이드{POLYPEPTIDES HAVING ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME}

서열목록

본 발명은 서열 목록을 포함한다.

본 발명은 항균 활성을 지닌 분리된 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 암호화한 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물, 벡터, 및 숙주 세포 및 상기 폴리펩타이드의 생산 및 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은:

(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21과 적어도 60% 일치하는 아미노산 서열을 지니는 폴리펩타이드;

(b) 적어도 중간의 긴축 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 496 내지 558, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1 내지 558에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보 가닥과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화된 폴리펩타이드;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21 중 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체; 및

(d) 항균 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 절편

으로 구성되는 군에서 선택된 항균 활성을 지닌 분리된 폴리펩타이드에 관한 것이다.

또한 본 발명은:

(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21과 적어도 60% 일치하는 아미노산 서열을 지니는 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드;

(b) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 496 내지 558와 적어도 60% 일치하는 폴리뉴클레오타이드; 및

(c) 적어도 중간의 긴축 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 496 내지 558, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1 내지 558에 함유된 cDNA 서열 , 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보 가닥와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드

로 구성된 군에서 선택된 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화한 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함한 핵산 구조물, 재조합 발현 벡터, 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) 폴리펩타이드 생산에 도움이 되는 조건 하에서 상기 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 항균 활성을 지닌 이러한 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

정의

항균 활성: "항균 활성"이라는 용어는 본 명세서에서 미생물 세포의 성장 억제 또는 사멸시킬 수 있는 활성으로 정의된다. 본 발명의 명세서에서 "항균"이라는 용어는 살균 및/또는 세균 발육 저지 및/또는 진균사멸 및/또는 진균 발육 저지 효과 및/또는 바이러스사멸 효과가 있다는 것을 의미하는 것이며, 여기서, "살균"이라는 용어는 박테리아 세포를 사멸시킬 수 있는 것으로 이해하여야한다. "세균 발육 저지"라는 용어는 박테리아 성장 억제, 즉, 박테리아 세포의 성장을 억제할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. "진균사멸"이라는 용어는 진균 세포를 사멸할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. "진균 발육 저지"라는 용어는 진균 성장 억제, 즉, 진균 세포 성장을 억제할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. "바이러스사멸"이란 용어는 바이러스를 불활성화시킬 수 있는 것으로 이해하여야 한다. "미생물 세포"라는 용어는 박테리아 또는 진균 세포(효모 포함)를 의미하는 것이다.

본 발명의 명세서에서 "미생물 세포의 성장 억제"라는 용어는 세포가 비성장 상태에 있는 것, 즉, 이들이 번식을 할 수 없는 상태를 의미하는 것으로 의도되었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991)에 기재된 실험 절차에 따라 항균 활성을 측정하였다. 또한 다른 방법으로서, 항균 활성은 CLSI(임상 및 실험 표준 협회(Clinical and Laboratory Standards Institute); 종전에 국립 임상 및 실험 표준 위원회(National Committee for Clinical and Laboratory Standards)로 알려짐)의 NCCLS 지침에 따라 측정하였다.

항균 활성을 지닌 폴리펩타이드는 상기 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드의 25%(w/w) 수용액; 바람직하게는 10%(w/w) 수용액; 더 바람직하게는 5%(w/w) 수용액; 더욱 더 바람직하게는 1 %(w/w) 수용액; 가장 바람직하게는 0.5%(w/w) 수용액; 특히 0.1 %(w/w)수용액 상에서 20℃로 24 시간(바람직하게는 12 시간 후, 더 바람직하게는 8 시간 후, 더 바람직하게는 4 시간 후, 더 바람직하게는 2 시간 후, 가장 바람직하게는 1 시간 후, 및 특히 30 분 후) 배양 후 에셔리시아 콜리(Escherichia coli, DSM 1576)의 생존 세포의 수를 1/100로 감소시킬 수 있다.

항균 활성을 지닌 폴리펩타이드는 미생물 성장 배지에 상기 펩타이드를 1000 ppm의 농도로; 바람직하게는 500 ppm의 농도로; 더 바람직하게는 250 ppm의 농도로; 더욱 더 바람직하게는 100 ppm의 농도로; 가장 바람직하게는 50 ppm의 농도로; 및 특히 25 ppm의 농도로 첨가시, 25℃에서 24시간 동안 에셔리시아 콜리(Escherichia coli, DSM 1576)의 성장을 억제할 수 있다.

항균 활성을 지닌 폴리펩타이드는 상기 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드의 25%(w/w) 수용액; 바람직하게는 10%(w/w) 수용액; 더 바람직하게는 5%(w/w) 수용액; 더욱 더 바람직하게는 1 %(w/w) 수용액; 가장 바람직하게는 0.5%(w/w) 수용액; 특히 0.1 %(w/w)수용액 상에서 20℃로 24 시간(바람직하게는 12 시간 후, 더 바람직하게는 8 시간 후, 더 바람직하게는 4 시간 후, 더 바람직하게는 2 시간 후, 가장 바람직하게는 1 시간 후, 및 특히 30 분 후) 배양 후 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis, ATCC 6633)의 생존 세포의 수를 1/100로 감소시킬 수 있다.

항균 활성을 지닌 폴리펩타이드는 미생물 성장 배지에 상기 펩타이드를 1000 ppm의 농도로; 바람직하게는 500 ppm의 농도로; 더 바람직하게는 250 ppm의 농도로; 더욱 더 바람직하게는 100 ppm의 농도로; 가장 바람직하게는 50 ppm의 농도로; 및 특히 25 ppm의 농도로 첨가시, 25℃에서 24시간 동안 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis, ATCC 6633)의 성장을 억제할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 및 더 가장 바람직하게는 적어도 100%의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드의 항균활성을 가진다.

분리된 폴리펩타이드: 본 명세서에서 사용된 "분리된 폴리펩타이드"라는 용어는 SDS-PAGE로 측정시 적어도 20% 순수, 바람직하게는 적어도 40% 순수, 더 바람직하게는 적어도 60% 순수, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수, 및 더 가장 바람직하게는 적어도 95% 순수한 폴리펩타이드를 나타낸다.

실질적으로 순수한 폴리펩타이드: 본 명세서에서 사용된 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드"라는 용어는 천연상태에서 혼합된 다른 폴리펩타이드 물질이 많아야 10%, 바람직하게는 많아야 8%, 더 바람직하게는 많아야 6%, 더 바람직하게는 많아야 5%, 더 바람직하게는 많아야 4%, 많아야 3%, 더욱 더 바람직하게는 많아야 2%, 가장 바람직하게는 많아야 1 %, 및 더 가장 바람직하게는 많아야 0.5% 중량부로 함유한 폴리펩타이드 제품을 의미한다. 따라서, 실질적으로 순수 폴리펩타이드는 제품 내에 존재하는 총 폴리펩타이드 물질이 중량부로 적어도 92% 순수, 바람직하게는 적어도 94% 순수, 더 바람직하게는 적어도 95% 순수, 더 바람직하게는 적어도 96% 순수, 더 바람직하게는 적어도 96% 순수, 더 바람직하게는 적어도 97% 순수, 더 바람직하게는 적어도 98% 순수, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 적어도 99.5% 순수, 및 더 가장 바람직하게는 100% 순수한 것이 양호하다.

본 발명의 폴리펩타이드는 실질적 순수 형태인 것이 바람직하다. 더 자세히 살펴보면, 폴리펩타이드는 "필수적으로 순수한 형태", 즉, 상기 폴리펩타이드 제품에 천연상태에서 혼합된 다른 폴리펩타이드 물질이 필수적으로 부재하는 것이 바람직하다. 이는 예를 들면, 잘 알려진 재조합 기법 또는 전통적인 정제 기법에 의한 폴리펩타이드 생산에 의하여 달성될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드"라는 용어는 "분리된 폴리펩타이드" 및 "분리된 형태의 폴리펩타이드"라는 용어와 동의어이다.

일치: 두 아미노산 서열 간 또는 두 뉴클레오타이드 서열 간의 관계성은 "일치"라는 변수로 설명하였다

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 두 아미노산 서열 간의 일치도는 FASTA 프로그램 패키지의 버전 2.Ox에 포함된 프로그램 FASTA를 사용하여 측정하였다(W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; 및 W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98를 참조). 사용된 측정 행렬(scoring matrix)은 BLOSUM50 이었고, 갭 감점(gap penalty)는 -12 이었으며, 갭 확장 감점(gap 확장 penalty)은 -2 이었다.

두 뉴클레오타이드 서열 간의 일치도는 전술한 것과 동일한 알고리즘 및 소프트웨어 패키지를 사용하여 측정하였다. 사용된 측정 행렬은 일치 행렬이고, 갭 감점은 -16이었으며, 및 갭 확장 감점은 -4이었다. 또한, 두 아미노산 서열의 정렬은 EMBOSS 패키지(http://emboss.org) 버전 2.8.0의 니들(Needle) 프로그램을 사용하여 측정하였다. 이 니들 프로그램은 문헌 Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453에 기재된 포괄적인 정렬 알고리즘을 수행한다. 사용된 치환 행렬은 BLOSUM62이었고, 갭 개방 감점(gap opening penalty)은 10이었으며, 갭 확장 감점은 0.5이었다. 본 발명의 아미노산 서열(예컨대 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 43)과 다른 아미노산 서열 간의 일치도는 두 서열의 정렬 내의 정확히 합치된 수를 본 발명의 서열의 길이(아미노산 잔기의 수)로 나눈 값으로 계산되거나; 또는 "최장 일치"로 표지된 니들 결과가 일치 백분율로 사용되며, 다음과 같이 계산된다: (일치 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 내의 갭의 수). 이 결과는 일치 백분율로 표시되었다.

폴리펩타이드 절편: 본 명세서에서 사용된 "폴리펩타이드 절편"이라는 용어는 SEQ ID NO:2의 아미노 및/또는 카르복실 말단이 결실된 하나 이상의 아미노산을 보유한 폴리펩타이드 또는 이들과 상동인 서열로 정의되며, 여기서, 상기 절편은 항균 활성을 갖는다. 일 실시 태양에서, 상기 절편은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18, 가장 바람직하게는 적어도 19, 및 특히 적어도 20 개의 SEQ ID NO:2의 인접하는 아미노산을 포함한다.

내부서열: 본 명세서에서 사용된 "내부서열"이라는 용어는 SEQ ID NO:1의 5' 및/또는 3' 말단이 결실된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 보유한 뉴클레오타이드 서열 또는 이들과 상동인 서열로 정의되며, 여기서, 상기 내부서열은 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드 절편을 암호화한다.

대립 변이체: 본 명세서에서 사용된 "대립 변이체"라는 용어는 동일한 염색체 유전좌를 점유하는 유전자의 하나 이상의 모든 대체 형태를 의미한다. 대립 변이는 돌연변이를 통하여 자연 발생되며, 개체군 내에서 다형성이 되기도 한다. 유전자 돌연변이는 잠복(암호화된 폴리펩타이드 내에서 무변화)이 되거나 또는 변경된 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 폴리펩타이드의 대립 변이체는 유전자의 대립 변이체에 의하여 암호화된 폴리펩타이드이다.

실질적으로 순수한 폴리뉴클레오타이드: 본 명세서에서 사용된 "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 다른 외래 또는 불필요한 뉴클레오타이드가 부재한, 및 유전자 조작 단백질 생산 시스템 내에서 사용하기 적합한 형태의 폴리뉴클레오타이드 제품을 의미한다. 따라서, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오타이드는 천연 상태에서 혼합된 다른 폴리뉴클레오타이드 물질을 많아야 10%, 바람직하게는 많아야 8%, 더 바람직하게는 많아야 6%, 더 바람직하게는 많아야 5%, 더 바람직하게는 많아야 4%, 더 바람직하게는 많아야 3%, 더욱 더 바람직하게는 많아야 2%, 가장 바람직하게는 많아야 1 %, 및 더 가장 바람직하게는 많아야 0.5% 중량부로 함유한다. 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오타이드는, 그러나, 자연 발생적 5' 및 3' 비번역 영역, 예컨대 프로모터 및 종료자(terminator)를 포함한다. 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오타이드는 중량부로 적어도 90% 순수, 바람직하게는 적어도 92% 순수, 더 바람직하게는 적어도 94% 순수, 더 바람직하게는 적어도 95% 순수, 더 바람직하게는 적어도 96% 순수, 더 바람직하게는 적어도 97% 순수, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 99%, 및 더 가장 바람직하게는 적어도 99.5% 순수한 것이 양호하다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 순수한 형태인 것이 바람직하다. 더 살펴보면, 본 명세서의 폴리뉴클레오타이드는 "필수적으로 순수한 형태", 즉, 천연 상태에서 혼합된 다른 폴리뉴클레오타이드 물질이 필수적으로 부재한 폴리뉴클레오타이드 제품인 것이 양호하다. 본 명세서에서, "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 "분리된 폴리뉴클레오타이드" 및 "분리된 형태의 폴리뉴클레오타이드"라는 용어와 동의어이다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 게놈, cDNA, RNA, 반합성, 합성에 기원한 것, 또는 이들의 모든 조합일 수 있다.

cDNA: 본 명세서에서 사용된 "cDNA"라는 용어는 진핵 세포에서 획득한 성숙된, 스플라이스된 mRNA 분자로부터 역전사하여 생산된 DNA 분자로 정의된다. cDNA 일반적으로 이에 상응하는 게놈 DNA에 존재하는 인트론 서열이 부존재한다. 개시, 1차 RNA 전사는 성숙한 스플라이스된 mRNA로 나타나기 전에 일련의 단계를 통하여 처리되는 mRNA의 전구체이다. 이러한 단계에는 스플라이싱이라고 하는 처리절차에 의한 인트론 서열의 제거가 포함된다. 따라서, mRNA에서 유도된 cDNA에는 모든 인트론 서열이 부존재한다.

핵산 구조물: 본 명세서에서 사용된 "핵산 구조물"이라는 용어는 자연 발생적 유전자에서 분리되거나 또는 자연 상에서 존재하지 않는 핵산의 조각을 함유하도록 개질된 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자를 의미한다. 상기 핵산 구조물이라는 용어는 핵산 구조물이 본 발명의 암호화 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 함유하는 경우, "발현 카세트"라는 용어와 동의어이다.

조절 서열: 본 명세서에서 사용된 "조절 서열"이라는 용어에는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드의 발현에 필수적이거나 또는 유리한 모든 성분을 포함한다. 각 조절 서열은 상기 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 자신의 것이거나 또는 외래의 것일 수 있다. 이러한 조절 서열은 선도, 폴리아데닐화 서열, 펩타이드전구체 서열, 프로모터, 신호 펩타이드 서열, 및 전사 종료자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 최소한, 상기 조절 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 상기 조절 서열에는 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열의 암호화 영역을 지닌 조절 서열의 결찰을 촉진하는 특이적 제한 부위를 도입하기 위한 링커가 제공될 수 있다.

작동가능하게 결합된: 본 명세서에서 사용된 "작동가능하게 결합된"이라는 용어는 조절 서열이 폴리뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열에 대한 적절한 부위에 위치하여 상기 조절 서열이 폴리펩타이드의 암호화 서열을 발현하게 하는 입체구조를 의미한다.

암호화 서열: 본 명세서에서 사용된 "암호화 서열"이라는 용어는 이들의 단백질 산물의 아미노산 서열에 직접열거된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 ATG 개시 코돈 또는 다른 개시 코돈인 예컨대 GTG 및 TTG로 시작되는 개방 해독틀(open reading frame)에 의하여 일반적으로 결정된다. 상기 암호화 서열 DNA, cDNA, 또는 재조합 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

발현 : "발현"이라는 용어는 전사, 전사-후 수식화, 번역, 번역-후 수식화, 및 분비를 포함하나 이에 한정되지 않는 폴리펩타이드의 생산과 관계된 모든 단계를 포함한다.

발현 벡터: 본 명세서에서 사용된 "발현 벡터"라는 용어는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 이들의 발현에 제공되는 부가 뉴클레오타이드에 작동가능하게 결합된 선형 또는 고리형 DNA 분자로 정의된다.

숙주 세포: 본 명세서에서 사용된 "숙주 세포"라는 용어는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물이 형질전환, 전달감염, 형질도입, 등을 하기 쉬운 모든 유형의 세포를 포함한다.

수식화 : 본 명세서에서 사용된 "수식화"라는 용어는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21로 구성된 폴리펩타이드의 모든 화학적 변형 및 폴리펩타이드를 암호화한 DNA의 유전자 조작을 의미한다. 상기 수식화(들)은 상기 아미노산(들)의 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들) 및 아미노산 측쇄(들)의 치환; 또는 아미노산 서열 내에 유사한 특성을 지닌 인공 아미노산의 사용이 될 수 있다. 특히 상기 수식화(들)은 아미드화, 예컨대 C- 말단의 아미드화가 될 수 있다.

인공 변이체: 본 명세서에서 사용된 "인공 변이체"라는 용어는 SEQ ID NO:1의 수식화된 뉴클레오타이드 서열을 발현하는 유기체에 의하여 생성된 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 수식화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:1에 개시된 뉴클레오타이드 서열의 수식화에 의한 인간 개입에 의하여 획득한 것이다.

발명의 상세한 설명

항균 활성을 지닌 폴리펩타이드

본 발명의 첫 번째 실시 상태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21(즉, 성숙한 폴리펩타이드)과 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 및 더 가장 바람직하게는 적어도 97%의 일치도를 지닌 아미노산 서열을 보유한, 항균 활성을 지닌 분리된 폴리펩타이드("상동 폴리펩타이드")에 관한 것이다. 본 발명의 양호한 실시상태에서, 상동 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21 중의 10개의 아미노산, 바람직하게는 5개의 아미노산, 더 바람직하게는 4개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 3개의 아미노산, 가장 바람직하게는 2개의 아미노산, 및 더 가장 바람직하게는 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 지닌다.

본 발명의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 이들의 대립 변이체; 또는 항균 활성을 지닌 이들의 절편을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 양호한 실시상태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21, 또는 이들의 대립 변이체; 또는 항균 활성을 지닌 이들의 절편을 포함한다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21을 포함한다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 이들의 대립 변이체; 또는 항균 활성을 지닌 이들의 절편으로 구성된다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21 또는 이들의 대립 변이체; 또는 항균 활성을 지닌 이들의 절편으로 구성된다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21으로 구성된다.

본 발명의 두 번째 실시상태에서, 본 발명은, 초 저 긴축 조건, 바람직하게는 저 긴축 조건, 더 바람직하게는 중간의 긴축 조건, 더 바람직하게는 중간 내지 고 긴축 조건, 더욱 더 바람직하게는 고 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 초 고 긴축 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 496 내지 558, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1 내지 558에 함유된 cDNA 서열, (iii) (i) 또는 (ii)의 내부서열, 또는 (iv) (i), (ii), 또는 (iii)의 상보 가닥으로 혼성화된 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화된 항균 활성을 지닌 분리된 폴리펩타이드에 관한 것이다(J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). SEQ ID NO:1의 내부서열은 적어도 100개의 인접하는 뉴클레오타이드 또는 바람직하게는 적어도 200개의 인접하는 뉴클레오타이드를 함유한다. 더욱이, 상기 내부서열은 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드 절편을 암호화할 수 있다.

SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 내부서열, 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 이들의 절편은 핵산 프로브를 설계하는데 사용되어 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법에 따라 다른 속 또는 종의 균주의 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화한 DNA를 동정 및 클론하게 할 수 있다. 더 자세히 살펴보면, 이러한 프로브는 대상 속(genera) 또는 종(species)의 게놈 또는 cDNA로 혼성화하는데 사용될 수 있으며 표준 서던 블로팅 절차에 따라 이들 내의 대응하는 유전자를 동정 및 분리할 수 있다. 이러한 프로브는 전체 서열보다 상당히 짧으나, 적어도 14개, 바람직하게는 적어도 25개, 더 바람직하게는 적어도 35개, 및 가장 바람직하게는 적어도 70개의 뉴클레오타이드의 길이가 되어야한다. 그러나, 상기 핵산 프로브는 적어도 100개의 뉴클레오타이드의 길이인 것이 양호하다. 예를 들어, 상기 핵산 프로브는 적어도 200개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 270개의 뉴클레오타이드일 수 있다. DNA 및 RNA 프로브 둘 모두를 사용할 수 있다. 상기 프로브는 일반적으로 상응하는 유전자를 검출하기 위하여 표지된다(예를 들어, ³²P, ³H, ³⁵S, 바이오틴, 또는 아비딘). 이러한 프로브는 본 발명의 범위에 포괄된다.

다른 유기체로부터 생산된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리는, 따라서, 전술한 프로브로 혼성화되고, 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화한 DNA로 선별될 수 있다. 다른 유기체에서 유래한 게놈 또는 다른 DNA는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 다른 분리 기술에 의하여 분리될 수 있다. 라이브러리에서 유래한 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀룰로오스 또는 다른 적합한 담체 물질 상으로 전이되거나, 고정될 수 있다. SEQ ID NO:1 또는 이들의 내부서열과 상동인 클론 또는 DNA를 동정하기 위하여, 상기 담체 물질은 서던 블롯에 사용할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 혼성화는 초 저 긴축 조건 내지 초 고 긴축 조건 하에서 상기 뉴클레오타이드 서열이 SEQ ID NO:1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 표지된 핵산 프로브, 이것의 상보 가닥, 또는 이들의 내부서열과 혼성화하는 것을 나타낸다. 이러한 조건 하에서 상기 핵산 프로브와 혼성화하는 분자는 X-레이 필름을 사용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 양호한 실시상태에서, 상기 핵산 프로브는 SEQ ID NO:2의 폴리펩타이드, 또는 이들의 내부서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 상기 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1이다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 상기 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1의 성숙 폴리펩타이드 암호화 영역이다.

적어도 100 뉴클레오타이드 길이의 긴 프로브를 위하여, 초 저 긴축 조건 내지 초 고 긴축 조건은 42℃에서 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 ㎍/㎖의 전단되고 변성된 연어 정자 DNA와 각각 초 저 긴축 조건 및 저 긴축 조건을 위하여 25% 포름아미드, 중간 및 중간 내지 고 긴축 조건을 위하여 35% 포름아미드, 또는 고 긴축 및 초 고 긴축 조건을 위하여 50% 포름아미드의 용액 상에서 사전 혼성화 및 혼성화를 하고, 12 시간 내지 24 시간 동안 최적화되도록 표준 서던 블로팅 절차를 수행하는 것으로 정의된다.

적어도 100 뉴클레오타이드 길이의 긴 프로브를 위하여, 상기 담체 물질은 마지막으로 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 바람직하게는 적어도 45℃(초 저 긴축 조건), 더 바람직하게는 적어도 50℃(저 긴축 조건), 더 바람직하게는 적어도 55℃(중간의 긴축 조건), 더 바람직하게는 적어도 60℃(중간 내지 고 긴축 조건), 더욱 더 바람직하게는 적어도 65℃(고 긴축 조건), 및 가장 바람직하게는 적어도 70℃(초 고 긴축 조건)에서 각각 15분간 3회 수세되었다.

약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 70개의 뉴클레오타이드의 길이의 짧은 프로브를 위하여, 긴축 조건은 볼턴(Bolton) 및 맥커티(McCarthy)(1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)에 따른 계산법을 사용하여 계산된 T_m 이하인 약 5℃ 내지 약 10℃에서 0.9 M NaCI, 0.09 M Tris-HCI(pH 7.6), 6 mM의 EDTA, 0.5% NP-40, 1X 덴하르트 용액, 1 mM 피로인산 나트륨, 1 mM 1염기 인산 나트륨, 0.1 mM ATP, 및 0.2 mg의 효모 RNA/㎖ 용액으로 사전 혼성화, 혼성화, 및 혼성화-후 수세하고, 표준 서던 블로팅 절차를 수행하는 것으로 정의되었다.

약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 70개의 뉴클레오타이드의 길이의 짧은 프로브를 위하여, 상기 담체 물질을 6X SCC + 0.1 % SDS 용액으로 15 분간 1회 및 계산된 Tm 이하인 5℃ 내지 10℃에서 6X SSC로 각각 15 분씩 2회 수세하였다.

본 발명의 세 번째 실시 상태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2 중의 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실, 및/또는 삽입 또는 이들의 성숙한 폴리펩타이드를 포함한 인공 변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 사소한 특성으로서, 즉 단백질의 폴딩과 활성에 현저하게 영향을 미치지 못하는 보존적 아미노산 치환 또는 삽입; 일반적으로 1 내지 약 10개의 아미노산의 작은 결실; 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 확장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기; 약 20-25개의 잔기 까지의 작은 링커 펩타이드; 또는 순 전하 또는 그 밖의 기능 변화에 의해 분리정제를 촉진하는 작은 확장, 예컨대 폴리-히스티딘 영역(tract), 항원 에피토프 또는 결합 도메인이다.

보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파라긴산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 군 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변화시키지 못하는 아미노산 치환은 당해 업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York에 기재되어 있다. 가장 일반적으로 발생하는 변화는 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.

20개의 표준 아미노산이 외에, 비-표준 아미노산(예컨대 4-하이드록시프롤린, 6-N-메틸 라이신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린, 및 알파-메틸 세린)도 야생형 폴리펩타이드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 한정된 수의 비-보존적 아미노산, 유전 암호, 및 인공 아미노산에 의하여 암호화되지 않은 아미노산도 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. "인공 아미노산"은 단백질 합성 후 수식화되었거나, 및/또는 이들의 측쇄(들)의 화학적 구조가 표준 아미노산의 측쇄(들)과 다르다. 인공 아미노산은 화학적으로 합성이 가능하고, 구득하는 것이 바람직하며, 피페콜린산, 티아졸리딘 카르복실산, 디하이드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 및 3,3-디메틸프롤린을 포함한다.

또한, 상기 아미노산 변화는 폴리펩타이드의 물리화학적인 특성이 변화된 특성의 변화이다. 예를 들어, 아미노산 변화는 상기 폴리펩타이드의 열적 안정성을 향상시킬 수 있으며, 기질 특이성, 최적 pH 등을 변화시킬 수 있다.

모 폴리펩타이드 내의 필수 아미노산은 당해 기술 분야에 알려진 절차, 예컨대 위치-지향 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085)에 따라 동정될 수 있다. 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자 내의 모든 잔기에 도입될 수 있으며, 결과 돌연변이 분자의 생물학적 활성(즉, 항균 활성)을 시험하여 상기 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 동정하였다. 또한, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 : 4699-4708를 참조할 것. 생물학적 상호작용은 추정 접촉 부위의 아미노산의 돌연변이에 관하여 핵 자기 공명, 결정 분석, 전자 회절 또는 광친화도 라벨화 등의 기법으로 측정한 구조의 물리적 분석에 의하여 측정할 수 있다. 예를 들어, de Vos et al., 1992, Science 255: 306- 312; Smith et al., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64를 참조. 필수 아미노산의 일치성은 본 발명의 폴리펩타이드와 관련된 폴리펩타이드와의 일치성 분석으로 추단될 수 있다.

단일 또는 다중 아미노산 치환을 유발시킬 수 있으며 돌연변이유발, 재조합, 및/또는 셔플링의 알려진 방법으로 시험하고, 그 뒤 예컨대, 문헌 Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625에 개시된 적절한 선별 방법을 수행할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 방법에는 오류-빈발 PCR, 파지 디스플레이(예컨대, Lowman et al., 1991 , Biochem. 30:10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204), 및 영역-지향성 돌연변이유발 (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)등이 포함된다.

돌연변이유발/셔플링 방법은 숙주 세포에서 발현된 클론된 돌연변이 유발 폴리펩타이드의 활성을 검출하는 고처리량의 자동화된 선별법과 결합될 수 있다. 활성 폴리펩타이드를 암호화한 돌연변이유발 DNA 분자를 숙주 세포로부터 회수할 수 있으며 당해 기술 분야의 표준 방법을 사용하여 빠르게 서열화된다. 이러한 방법은 대상 폴리펩타이드 내의 개별 아미노산 잔기의 중요도를 빠르게 측정할 수 있으며, 및 미지의 구조를 지닌 폴리펩타이드에 적용할 수 있다.

SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21 중의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입의 총 수는 10, 바람직하게는 9, 더 바람직하게는 8, 더 바람직하게는 7, 더 바람직하게는 많아야 6, 더 바람직하게는 많아야 5, 더 바람직하게는 4, 더욱 더 바람직하게는 3, 가장 바람직하게는 2, 및 더 가장 바람직하게는 1이다.

일 실시 태양에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 4개의 시스테인 잔기를 포함하며, 바람직하게는 상기 폴리펩타이드가 정확히 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 고리형 폴리펩타이드이다.

N-말단 확장

본 발명의 폴리펩타이드의 N-말단 확장은 1 내지 50개의 아미노산, 바람직하게는 2-20개의 아미노산, 특히 3-15개의 아미노산으로 구성되는 것이 적합하다. 본 발명의 일 실시 태양에서, N-말단 펩타이드 확장은 Arg(R)을 함유하지 않는다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 N-말단 확장은 kex2 또는 kex2-유사 절단 부위를 포함하며, 이는 추가로 아래에서 정의될 것이다. 본 발명의 양호한 실시 태양에서, 상기 N-말단 확장은 적어도 두개의 GIu (E) 및/또는 Asp (D) 아미노산 잔기, 예컨대, 다음 서열 중의 하나를 포함한 N-말단 확장을 포함하는 펩타이드이다: EAE, EE, DE 및 DD.

Kex2 부위

Kex2 부위(예컨대, Methods in Enzymology VoI 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology" 참조) 및 kex2-유사 부위는 프로-펩타이드 암호화 영역과 상기 단백질의 성숙 영역 사이에서 발견되는 2염기성 인식 부위(즉, 절단 부위)이다.

kex2 부위 또는 kex2-유사 부위의 삽입은 특정한 경우에 발생하여 프로-펩타이드 절단 부위에서 정확한 펩타이드 내부분해효소 처리과정을 향상시킴으로써 단백질 분비 수준을 증가시키게 된다.

본 발명의 내용에서, kex2 또는 kex2-유사 부위의 삽입은 상기 N-말단 확장 내의 특정 위치에서 절단을 가능하게 하여 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21로 나타낸 성숙 폴리펩타이드에 비하여 항균 폴리펩타이드가 확장되는 결과를 나타내었다.

융합 폴리펩타이드

또한 본 발명의 폴리펩타이드는 다른 폴리펩타이드가 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이들의 절편의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된 융합 폴리펩타이드 또는 절단성 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 융합 폴리펩타이드는 다른 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열(또는 이들의 일부)과 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(또는 이들의 일부)을 융합하여 생산된다. 융합 폴리펩타이드의 제조 기술은 당해 업계에 알려져 있으며 상기 폴리펩타이드를 암호화 서열을 결찰하는 것을 포함하여 프레임 내에 이들을 존재하게 하고 융합 폴리펩타이드가 동일한 프로모터(들) 및 종료자의 조절 하에 발현하도록 한다.

항균 활성을 지닌 폴리펩타이드의 공급원

본 발명의 폴리펩타이드는 모든 속(genus)의 미생물로부터 획득할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 명세서에서 사용된 "~로부터 획득"이라는 용어는 소정의 공급원에 관하여 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화된 폴리펩타이드가 상기 공급원의 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 공급원 또는 균주에 의하여 발생 되었다는 것을 의미한다. 본 발명의 양호한 실시상태에서, 소정의 공급원으로부터 획득한 폴리펩타이드는 세포 밖으로 분비되었다.

본 발명의 폴리펩타이드는 박테리아 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 그람 양성 박테리아 폴리펩타이드 예컨대, 바실루스(Bacillus) 폴리펩타이드, 예컨대, 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실루스 아밀로리큐에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 라우투스(Bacillus lautus), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 스테아로더모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 또는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 폴리펩타이드; 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 폴리펩타이드, 예컨대, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 또는 스트렙토마이세스 뮤리누스(Streptomyces murinus) 폴리펩타이드; 또는 그람 음성 박테리아 폴리펩타이드, 예컨대, 이. 콜리(E. coli) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 진균 폴리펩타이드일 수 있으며, 더 바람직하게는 효모 폴리펩타이드 예컨대, 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(SchizoSaccharomyces), 또는 야로위아(Yarrowia) 폴리펩타이드; 또는 더 바람직하게는 필라멘트형 진균 폴리펩타이드 예컨대, 아크레모니움(Acremonium), 아스파라길루스(Aspergillus), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 크립토코커스(Cryptococcus), 필라바시디움(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 휴미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 뮤코르(Mucor), 마이셀리오파토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 피로마이세스(Piromyces), 스키조필룸(Schizophyllum), 타라로마이세스(Talaromyces), 더모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 톨리포칼라디움(Tolypocladium), 또는 트리코데르마(Trichoderma) 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명의 양호한 실시상태에서, 상기 폴리펩타이드는 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우그라시(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세 스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 또는 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드이다.

본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 상기 폴리펩타이드는 아스파라길루스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스파라길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스파라길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스파라길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스파라길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스파라길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 큘모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티큘라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리 움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토루로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코데시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오파토라 더모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로제눔(Penicillium purpurogenum), 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌기(Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라치아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 레에세이 ( Trichoderma reesei), 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 폴리펩타이드이다.

본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 상기 폴리펩타이드는 아레니콜라 마리나(Arenicola marina) 폴리펩타이드, 예컨대, SEQ ID NO:2의 폴리펩타이드이다.

전술한 종에 있어서, 본 발명은 완전 및 불완전 상태와 다른 분류학상 동류, 예컨대, 알려진 종명과 무관한 변이주를 포괄한다는 것을 이해하여야한다. 당해 기술 분야의 숙련자들이라면 적절한 동류의 일치성을 쉽게 인식할 수 있을 것이다.

이러한 종의 균주는 미생물 기탁기관, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC), 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨트렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM), 사균 배지 중앙 보관소(Centraalbureau Voor Schimmelcultures, CBS), 및 아그리컬쳐럴 리서치 서비스 패턴트 컬쳐 컬렉션(Agricultural Research Service Patent Culture Collection), 노던 레지오널 리서치 센터(Northern Regional Research Center, NRRL) 등의 수탁 번호로 공개적으로 접근이 가능하다.

또한, 이러한 폴리펩타이드는 전술한 프로브를 사용하여 자연(예컨대, 토양, 퇴비, 물, 등)으로부터 분리된 미생물을 포함하는 다른 공급원으로부터 동정하거나 획득할 수 있다. 자연 산지로부터 미생물을 분리하는 기법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 또 다른 미생물의 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 이와 유사하게 선별하여 획득할 수 있다. 폴리폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열이 프로브(들)로 검출된 경우, 상기 폴리뉴클레오타이드는 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 기법을 활용하여 분리 또는 클론될 수 있다(예컨대, Sambrook et al., 1989 전게서 참조).

본 발명의 폴리펩타이드는 또한 다른 폴리펩타이드가 상기 폴리펩타이드 또는 이들의 절편의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된 융합 폴리펩타이드 또는 절단성 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 융합 폴리펩타이드는 다른 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열 (또는 이들의 일부)을 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(또는 이들의 일부)에 융합하여 제조한다. 융합 폴리펩타이드의 제조 기술은 당해 업계에 알려져 있으며 상기 폴리펩타이드를 암호화 서열을 결찰하는 것을 포함하여 프레임 내에 이들을 존재하게 하고 융합 폴리펩타이드가 동일한 프로모터(들) 및 종료자의 조절 하에 발현하도록 한다.

폴리뉴클레오타이드

본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열을 지닌 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 양호한 실시상태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:1 내에 나타나있다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:1의 성숙 폴리펩타이드 암호화 영역이다. 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드 또는 이들의 성숙한 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열을 포괄하며, 이는 상기 유전 암호의 퇴화에 의하여 SEQ ID NO:1와 다르다. 본 발명은 항균 활성을 지닌 SEQ ID NO:2의 절편을 암호화한 SEQ ID NO:1의 내부서열에 관한 것이다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:1의 성숙 폴리펩타이드 암호화 서열 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 상기 돌연변이 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21로 구성된 폴리펩타이드를 암호화한다.

폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 분리 또는 클론하는 기술은 당해 업계에 알려져 있으며, 게놈 DNA로부터 분리, cDNA로부터 제조, 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 게놈 DNA로부터 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 예컨대, 잘 알려진 폴리머라아제 사슬 반응(PCR) 또는 발현 라이브러리의 항체 선별을 사용하여 클로닝하는 것은 공유 구조 특성을 지닌 클론된 DNA를 검출하는 효과가 있다. 예컨대, 문헌 lnnis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York을 참조. 다른 핵산 증폭 방법, 예컨대, 리가아제 사슬 반응(LCR), 결찰 활성 전사(LAT) 및 뉴클레오타이드 서열-기초 증폭(NASBA)을 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 아레니콜라(Arenicola) 또는 다른 균주, 또는 유관 유기체로부터 클론될 수 있으며, 따라서, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 서열의 폴리펩타이드 암호화 영역의 대립 또는 종 변이체가 될 수 있다.

본 발명은 활성 폴리펩타이드를 암호화한 SEQ ID NO:1(즉, 뉴클레오타이드 496 내지 558)의 성숙 폴리펩타이드 암호화 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 97%가 일치하는 성숙 폴리펩타이드 암호화 서열을 지니는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열의 수식화는 실질적으로 상기 폴리펩타이드와 유사한 폴리펩타이드의 합성에 필수적일 수 있다. 상기 폴리펩타이드와 "실질적으로 유사한"이라는 표현은 상기 폴리펩타이드의 비자연적 형태를 나타낸다. 이러한 폴리펩타이드는 공학적 관점에서, 특이적 활성, 열적안정성, 최적 pH 등에서 차이가 있는 이들의 원 공급원, 예컨대, 인공 변이체로부터 분리된 상기 폴리펩타이드와 차이가 있다. 상기 변이체 서열은 상기 SEQ ID NO:1의 폴리펩타이드 암호화 영역, 예컨대, 이들의 내부서열로 제시된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하거나, 및/또는 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화된 폴리펩타이드의 다른 아미노산을 발생시키지는 않으나, 효소 생성을 위한 숙주 유기체의 코돈 활용에 상응하는 뉴클레오타이드 치환의 도입, 또는 아미노산 서열을 발생시키는 뉴클레오타이드 치환의 도입에 의하여 제조된다. 뉴클레오타이드 치환의 일반적인 설명을 위하여, 예컨대, 문헌 Ford et al., 1991 , Protein Expression and Purification 2: 95-107을 참조.

분자 기능의 임계적 영역 외에서 제조할 수 있으며, 이는 여전히 활성 폴리펩타이드가 된다는 것은 당해 기술 분야의 숙련자에게는 자명하다. 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되고, 따라서 바람직하게는 치환을 가하지 않은 폴리펩타이드의 활성에 필수적인 아미노산 잔기는 당해 기술 분야에 알려진 절차, 예컨대 위치-지향 돌연변이발생 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(예컨대, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081- 1085 참조)에 따라 동정될 수 있다. 후자의 기술에서, 돌연변이는 분자 내의 모든 양전하를 띤 잔기에 도입될 수 있으며, 결과 돌연변이 분자의 항미생물 활성을 시험하여 상기 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 동정하였다. 기질-효소 상호작용 부위 핵 자기 공명, 결정 분석, 전자 회절 또는 광친화도 라벨화 등의 기법으로 측정한 3차원 구조의 분석에 의하여 측정할 수 있다(예를 들어, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64를 참조).

본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 이는 전술한 바와 같이 저 긴축 조건, 바람직하게는 중간의 긴축 조건, 더 바람직하게는 중간 내지 고 긴축 조건, 더욱 더 바람직하게는 고 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 초 고 긴축 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 496 내지 558, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1 내지 558에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보 가닥; 또는 대립 변이체 및 이들의 내부서열과 혼성화한다(Sambrook et al., 1989, 전게서).

본 발명은 (a) DNA 집단이 저 긴축, 중간의 긴축, 중간 내지 고 긴축, 고 긴축, 또는 초 고 긴축 조건 하에서, (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 496 내지 558, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1 내지 558에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보 가닥과 혼성화하는 단계; (b) 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화한, 혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 분리하는 단계로써 획득한 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이기도 하다.

핵산 구조물

본 발명은 조절 서열과 융화되는 조건 하에서 적합한 숙주 세포 내의 암호화 서열의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 결합된 분리된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 분리된 폴리뉴클레오타이드는 다양한 방법으로 조작되어 상기 폴리펩타이드의 발현을 제공한다. 벡터에 삽입 전 폴리뉴클레오타이드의 서열의 조작은 발현 벡터에 의존하는 것이 바람직하거나 또는 필수적이다. 수식된 폴리뉴클레오타이드 서열을 재조합 DNA 법에 활용하는 기술은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

조절 서열은 적절한 프로모터 서열, 뉴클레오타이드 서열로서 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 숙주 세포에 의하여 인식될 수 있다. 프로모터 서열은 상기 폴리펩타이드의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이, 절단, 및 혼성 프로모터를 포함하는 선택된 숙주 세포 내의 전사 활성을 나타내는 모든 뉴클레오타이드 서열일 수 있고, 숙주 세포에 상동 또는 이종기원의 세포외 또는 세포내 폴리펩타이드를 암호화한 유전자로부터 획득할 수 있다.

특히, 박테리아 숙주 세포 내에서 본 발명의 핵산 구조물의 전사를 조절하는 적합한 프로모터의 예는 이. 콜리(E. coli) lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리콜로 르(Streptomyces coelicolor) 아가라아제 유전자(dagA), 바실루스 서브틸리 스(Bacillus subtilis) 레반슈크라아제 유전자(sacB), 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파 아밀라아제(알파-아밀라아제) 유전자(amyL), 바실 루스 스테아로더모필루스(Bacillus stearothermophilus) 말토오스형성 아밀라아제 유전자 (amyM), 바실루스 아밀로리큐에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파 아밀라아제 유전자 (amyQ), 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 페니실리나아제 유전자 (penP), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵 베타-락타마아제 유전자 (Villa-Kamaroff et ai., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731 )로부터 획득한 프로모터 및 tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21- 25)이다. 추가의 프로모터가 문헌 "Useful Proteins from Recombination bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; 및 Sambrook et al., 1989 전게서에 기재되어 있다.

필라멘트형 진균 숙주 세포 내에서 본 발명의 핵산 구조물의 전사를 조절하는 적합한 프로모터의 예는 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 리조뮤코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파틱 프로테이나아제, 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 뉴트럴 알파-아밀라아제, 아스파라길루스 니게 르(Aspergillus niger) 산 안정성 알파-아밀라아제, 아스파라길루스 니게 르(Aspergillus niger) 또는 아스파라길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라아제 (glaA), 리조뮤코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파아제, 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 알카라인 프로테아제, 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 트리오스 포스페이트 아이소머라아제, 아스파라길루스 니둘 란스(Aspergillus nidulans) 아세타미나아제, 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 아밀로글루코시다아제(WO 00/56900), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 다리아(Daria)(WO 00/56900), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 퀴인(Quinn)(WO 00/56900), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 티로신 유사 프로테아제(WO 96/00787), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 베타-글루코시다아제, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 셀로바이오하이드롤라아제 I, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 엔도뉴클레아제 I, 트리코데르마 레에세 이(Trichoderma reesei) 엔도뉴클레아제 II, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 엔도뉴클레아제 III, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 엔도뉴클레아제 IV, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 엔도뉴클레아제 V, 트리코데르 마 레에세이(Trichoderma reesei) 자일라나아제 I, 트리코데르마 레에세 이(Trichoderma reesei) 자일라나아제 II, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 베타-자일로시다아제, 및 NA2-tpi 프로모터 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 뉴트럴 알파-아밀라아제 및 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 트리오스 포스페이트 아이소머라아제의 유전자의 프로모터의 혼성화)의 유전자로부터 획득한 프로모터이고; 이들의 돌연변이, 절단, 및 혼성 프로모터이다.

효모 숙주 내에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라아제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 갈락토키나아제 (GAL1), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 알콜 디하이드로지나아제/글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나아제 (ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 트리오스 포스페이트 아이소머라아제 (TPI), 사카로마 이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 메탈로티오닌 (CU P1 ), 및 사카로마 이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 3-포스포글리세르에이트 키나아제의 유전자로부터 획득한다. 그 밖의 유용한 효모 숙주 세포의 프로모터는 Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488에 기술되어 있다.

조절 서열은 적합한 전사 종료자 서열, 즉, 숙주 세포가 전사를 종결하도록 인식하는 서열이다. 상기 종료자 서열은 상기 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 결합 되었다. 선택된 숙주 세포 내에서 기능하는 모든 종료자가 본 발명에 사용될 수 있다.

필라멘트형 진균 숙주 세포의 양호한 종료자는 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 글루코아밀라아제, 아스파라길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 안트라닐레이트 신데테이즈, 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 알파-글루코시다아제, 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 티로신-유사 프로테아제의 유전자로부터 획득한다.

효모 숙주 세포의 양호한 종료자는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라아제, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 사이토크롬 C (CYC1), 및 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나아제의 유전자로부터 획득한다. 효모 숙주 세포의 다른 유용한 종료자는 전술한 Romanos et al., 1992에 기재되어 있다.

조절 서열은 적합한 선도 서열, 즉, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역일 수 있다. 상기 선도 서열은 상기 폴리펩타이드을 암호화한 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 작동가능하게 결합된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 모든 선도 서열이 본 발명에 사용될 수 있다.

필라멘트형 진균 숙주 세포의 양호한 선도체는 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제 및 아스파라길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 트리오스 포스페이트 아이소머라아제의 유전자로부터 획득한다.

효모 숙주 세포의 적합한 선도체는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라아제 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 3-포스포글리세르에이트 키나아제, 사카로마이세스 세레비시 아(Saccharomyces cerevisiae) 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 알콜 디하이드로지나아제/글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나아제 (ADH2/GAP)의 유전자로부터 획득한다.

상기 조절 서열은 폴리아데닐화 서열, 즉 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 결합된 서열일 수 있으며, 상기 서열은 전사시 숙주 세포에 의하여 폴리아데노신 잔기에 전사된 mRNA을 부가하라는 신호로 인식된다. 선택된 숙주 세포에서 기능을 하는 모든 폴리아데닐화 서열이 본 발명에 사용될 수 있다.

필라멘트형 진균 숙주 세포를 위한 양호한 폴리아데닐화 서열은 아스파라길루 스 오리자에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 글루코아밀라아제, 아스파라길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 안트라닐염 합성효소, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 티로신-유사 프로테아제, 및 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 알파-글루코시다아제의 유전자로부터 획득한다.

효모 숙주 세포를 위한 유용한 폴리아데닐화 서열은 문헌 Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990에 기재되어 있다.

상기 조절 서열은 폴리펩타이드의 아미노 말단에 결합된 아미노산 서열의 암호이며, 암호화된 폴리펩타이드를 세포의 분비 경로로 향하게 하는 신호 펩타이드 암호화 영역일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열의 5' 말단은 번역 해독틀 내에서 분비되는 폴리펩타이드를 암호화한 암호화 영역의 일부와 자연적으로 결합된 신호 펩타이드 암호화 영역을 생래적으로 함유한다. 또한, 상기 암호화 서열의 5' 말단은 암호화 서열에 외래의 것인 신호 펩타이드 암호화 영역을 함유할 수 있다. 상기 외래 신호 펩타이드 암호화 영역은 암호화 서열이 신호 펩타이드 암호화 영역을 원래 함유하지 않았던 경우에 필요할 수 있다. 또한, 상기 외래 신호 펩타이드 암호화 영역은 신호 펩타이드 암호화 영역과 단순히 치환됨으로써 상기 폴리펩타이드의 분비를 증진하게 된다. 그러나, 상기 발현된 폴리펩타이드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 향하게 하는 모든 신호 펩타이드 암호화 영역은 본 발명에 사용될 수 있다.

박테리아 숙주 세포의 효과적인 신호 펩타이드 암호화 영역은 바실루스(Bacillus) NCIB 11837 말토오스생성 아밀라아제, 바실루스 스테아로더모필루스(Bacillus stearothermophilus) 알파-아밀라아제, 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 서브틸리신(subtilisin), 바실루스 리체니포르미 스(Bacillus licheniformis) 베타-락타마아제, 바실루스 스테아로더모필루스(Bacillus stear 다른 mophilus) 뉴트럴 프로테아제 (nprT, nprS, nprM), 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) prsA의 유전자로부터 획득한 신호 펩타이드 암호화 영역이다. 추가의 신호 펩타이드는 문헌 Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137에 기재되어 있다.

필라멘트형 진균 숙주 세포의 효과적인 신호 펩타이드 암호화 영역은 아스파 라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 뉴트럴 아밀라아제, 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 글루코아밀라아제, 리조뮤코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파라긴산 프로테인나아제, 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰라아제, 및 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 라파아제의 유전자로부터 획득한 신호 펩타이드 암호화 영역이다.

본 발명의 양호한 실시상태에서, 상기 신호 펩타이드 암호화 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 -165 내지 -142를 암호화환 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1 내지 72 이다.

효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩타이드는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 인버타아제의 유전자로부터 획득한다. 다른 유용한 신호 펩타이드 암호화 영역은 전술한 문헌 Romanos et al., 1992에 기재되어 있다.

상기 조절 서열은 폴리펩타이드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 함호화하는 펩타이드전구체 암호화 영역일 수 있다. 결과 폴리펩타이드는 효소전구체 또는 폴리펩타이드전구체 (또는 어떠한 경우에서는 효소원)로 알려져 있다. 폴리펩타이드전구체는 일반적으로 불활성이며, 폴리펩타이드전구체로부터 펩타이드전구체를 효소적 또는 자가효소 절단에 의하여 성숙 활성 폴리펩타이드로 전환된다. 상기 펩타이드전구체 암호화 영역은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 알카라인 프로테아제(aprE), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 뉴트럴 프로테아제(nprf), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 알파-인자, 리조뮤코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파라긴산 프로테이나아제, 및 마이셀리오파토라 더모필라(Myceliophthora thermophila) 락카아제(WO 95/33836)의 유전자로부터 획득한다.

본 발명의 양호한 실시상태에서, 상기 펩타이드전구체 암호화 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 -141 내지 -1을 암호화하는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 73 내지 495이다.

신호 펩타이드 및 펩타이드전구체 영역이 둘 다 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 상기 펩타이드전구체 영역은 폴리펩타이드의 아미노 말단의 옆에 위치하며, 상기 신호 펩타이드 영역은 펩타이드전구체 영역의 아미노 말단의 옆에 위치하게 된다. 숙주 세포의 성장에 관한 폴리펩타이드의 발현을 조절하게 하는 조절 서열을 부가하는 것이 바람직하다. 조절 시스템의 예는 화학적 또는 물지적 자극에 반응하여 유전자 발현을 작동하게 하거나 또는 중단시키는 것들로서, 조절 화합물의 존재를 포함한다. 원핵 시스템 내의 조절 시스템은 lac, tac, 및 trp 작동자 시스템을 포함한다. 효모에 있어서, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용된다. 필라멘트형 진균의 경우, TAKA 알파-아밀라아제 프로모터, 아스파라길루스 니게 르(Aspergillus niger) 글루코아밀라아제 프로모터, 및 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 글루코아밀라아제 프로모터가 조절 서열로서 사용된다. 조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 가능하게 하는 것들이다. 원핵 시스템에서, 이들은 메토트렉세이트의 존재 하에 증폭되는 이수소폴산 환원효소 유전자, 및 중금속과 함께 증폭되는 금속티오네인 유전자를 포함한다. 이러한 경우, 상기 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열은 상기 조절 서열과 작동가능하게 결합할 수 있다.

발현 벡터

본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함한 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 전술한 다양한 핵산 및 조절 서열을 서로 결합시켜 이러한 부위에 상기 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열의 삽입 또는 치환을 가능하게 하는 하나 이상의 편리한 제한 부위를 포함하는 재조합 발현 벡터를 생산한다. 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산 구조물을 발현을 위하여 적절한 벡터 내로 삽입시켜 발현시킬 수 있다. 상기 발현 벡터의 생성에 있어서, 상기 암호화 서열은 벡터 내에 위치하게 되어 발현을 위하여 암호화 서열이 적절한 조절 서열과 작동 가능하게 결합할 수 있게 한다.

상기 재조합 발현 벡터는 간편하게 재조합 DNA 방법을 가할 수 있으며, 뉴클레오타이드 서열의 발현을 발생시키는 모든 벡터(예컨대, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 일반적으로 벡터와 벡터가 도입될 숙주 세포의 적합성에 의존한다. 상기 벡터는 선형 또는 폐쇄 고리형 플라스미드일 수 있다.

상기 벡터는 자동 복제 벡터, 즉, 염색체 복제, 예컨대, 플라스미드, 염색체외 성분, 미니염색체, 또는 인공 염색체 등과 독립된 복제인 염색체외 본체(entity)로서 존재하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 자가-복제를 확실하게하는 모든 수단을 함유한다. 또한, 상기 벡터는 숙주 세포로 도입되면, 그 게놈으로 통합되어, 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 숙주 세포의 게놈에 도입되는 총 DNA를 함께 함유하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 이 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포손이 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 형질전환된 세포의 간편한 선택을 가능하게하는 하나 이상의 선택가능한 마커(marker)를 포함한다. 선택가능한 마커는 그 생산물이 살균 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양요구균주에 대한 기본영양성을 제공하는 유전자이다.

박테리아의 선택가능한 마커는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 dal 유전자, 또는 항생제 내성, 예컨대 앰피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커이다. 효모 숙주 세포의 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다. 필라멘트형 진균 숙주 세포에 사용되는 선택가능한 마커는 amdS(아세트아미다아제), argB(오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제), hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제), niaD (질산염 환원효소), pyrG (오르티딘-5'-포스페이트 디카르복실라아제), sC (황산염 아데닐트랜스퍼라아제), 및 trpC(안트라닐염 합성효소), 및 이들과 등가의 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 아스파라길루스(Aspergillus) 세포에는 아스파라길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 또는 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)의 amdS 및 pyrG 유전자 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피우스(Streptomyces hygroscopicus)의 bar 유전자를 사용하는 것이 양호하다.

본 발명의 벡터에는 바람직하게는 벡터를 숙주 세포의 게놈 내로 통합하게 하거나 또는 세포 비의존성 게놈 내의 벡터의 자가 복제를 하게 하는 성분(들)을 포함한다.

숙주 세포 게놈으로의 통합을 위하여, 상기 벡터는 상기 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드의 서열 또는 상동 또는 비상동 재조합에 의하여 게놈 내로 통합되기 위한 벡터의 다른 모든 성분에 의존한다. 또한, 상기 벡터는 염색체(들) 내에서 상동 재조합에 의하여 숙주 세포의 게놈 내의 정확한 위치(들)로 통합시키기 위한 추가적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 정확한 위치로 통합할 가능성을 증가시키기 위하여, 통합 성분은 바람직하게는 충분한 수의 핵산, 예컨대 100 내지 10,000 bp, 바람직하게는 400 내지 10,000 bp, 및 가장 바람직하게는 800 내지 10,000 bp를 함유하여야하며, 상응하는 표적 서열과 고도로 일치하여 상동 재조합의 가능성을 증진시킨다. 상기 통합 성분은 숙주 세포의 게놈 내의 표적 서열과 상동인 모든 서열일 수 있다. 또한, 상기 통합 성분은 뉴클레오타이드 서열을 비암호화 또는 암호화할 수 있다. 한편, 상기 벡터는 비-상동 재조합에 의하여 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.

자동 복제를 위하여, 상기 벡터는 문제의 숙주 세포 내에서 상기 벡터가 자동 복제할 수 있도록 하는 복제 원점을 추가로 포함할 수 있다. 복제 원점은 세포 내에서 기능하는 플라스미드 복제자 매개 자동 복제일 수 있다. 본 명세서에서 "복제 원점" 또는 "플라스미드 복제자"라는 용어는 플라스미드 또는 벡터를 생체 내에서 복제하게 만드는 뉴클레오타이드 서열로 정의된다.

박테리아 복제 원점의 예는 이. 콜리(E. coli) 내에서 복제가능한 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177, 및 pACYC184의 복제 원점, 및 바실루스(Bacillus) 내에서 복제가능한 pUB110, pE194, pTA1060, 및 pAMβ1의 복제원점이다.

효모 숙주 세포에 사용되는 복제 원점의 예는 2 미크론 복제 원점, ARS1 , ARS4, ARS1 및 CEN3의 조합, 및 ARS4 및 CEN6의 조합이다.

필라멘트형 진균 세포에 유용한 복제 원점은 AMA1 및 ANS1이다(Gems et al., 1991 , Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163- 9175; WO 00/24883). AMA1 유전자의 분리 및 상기 유전자를 포함한 플라스미드 또는 벡터의 제조는 WO 00/24883에 개시된 방법에 의하여 달성할 수 있다.

하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 카피가 숙주 세포 내로 삽입되어 유전자 산물의 생성을 증가시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 카피 수의 증가는 선택가능한 마커 유전자의 증폭된 카피를 포함하는 세포의 경우, 적어도 하나의 추가적인 카피 서열을 숙주 세포 게놈으로 통합하거나 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 지닌 증폭가능한 선택가능한 마커 유전자를 포함함으로써 획득할 수 있으며, 이로써 폴리뉴클레오타이드의 추가적인 카피는 적절한 선택가능한 약제의 존재하에 세포를 배양하여 선택할 수 있다.

전술한 성분을 결찰하는데 사용하여 본 발명의 재조합 발현 벡터를 제조하는 방법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(예컨대, Sambrook et al., 1989, 전게서 참조).

숙주 세포

본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이며, 이는 상기 폴리펩타이드의 재조합 생산에 유리하게 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함한 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어, 염색체 성분 또는 전술한 자가-복제 염색체외 벡터로 유지된다. "숙주 세포"라는 용어는 복제시 돌연변이 발생에 기인하여 모세포와 일치하지 않는 모세포의 모든 자손을 포괄한다. 숙주 세포의 선택은 상기 폴리펩타이드를 암호화한 유전자 및 이들의 공급원에 상당부분 의존하게 될 것이다.

상기 숙주 세포는 단세포 미생물, 예컨대, 원핵생물, 또는 다세포 미생물, 예컨대, 진핵생물일 수 있다.

유용한 단세포 미생물은 박테리아 세포, 예컨대 그람 양성 박테리아인, 바실루스(Bacillus) 세포, 예컨대, 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실 루스 아밀로리큐에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실루스 클라우시(Bacillus clausii), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 라우투스(Bacillus lautus), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 스테아로더모필루스(Bacillus stear다른mophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis); 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 세포, 예컨대, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 및 스트렙토마이세스 뮤리누스(Streptomyces murinus), 또는 그람 음성 박테리아, 예컨대 이. 콜리(E. coli) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 양호한 실시상태에서, 상기 박테리아 숙주 세포는 바실 루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 스테아로더모필루스(Bacillus stearothermophilus), 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포이다. 본 발명의 다른 양호한 실시상태에서, 상기 바실러스 세포는 호염기성 바실러스이다.

벡터의 박테리아 숙주 세포로의 도입은, 예컨대 원형질체 형질전환에 의하여 영향을 받으며(예컨대, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 1 11-1 15), 적격 세포 (예컨대, Young and Spizizin, 1961 , Journal of Bacteriology 81 : 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971 , Journal of Molecular Biology 56: 209-221), 전기천공 (예컨대, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechnics 6: 742-751), 또는 컨쥬게이션(예컨대, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278)를 사용한다.

상기 숙주 세포는 진핵생물, 예컨대 포유류, 곤충, 식물, 또는 진균 세포일 수 있다.

본 발명의 양호한 실시상태에서, 상기 숙주 세포는 진균 세포이다. 본 명세서에서 "진균"은 필라 아스코마이코타(phyla Ascomycota), 바시디오마이코타(Basidiomycota), 치트리디오마이코타(Chytridiomycota), 및 자이고마이코 타(Zygomycota) (Hawksworth et al., Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK에서 정의)와 오마이코타(Oomycota) (Hawksworth et al., 1995, 전게서, 171p. 인용) 및 모든 미토스포르(mitosporic) 진균 (Hawksworth et al., 1995, 전게서)를 포함한다. 더 양호한 실시 상태에서, 상기 진균 숙주 세포는 효모 세포이다. 본 명세서에서 사용된 "효모"는 유포자 효모(ascosporogenous yeast)(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자균 효모(basidiosporogenous yeast), 및 불완전 균류(Fungi Imperfecti)에 속하는 효모(블라스토마이세테스(Blastomycetes))를 포함한다. 효모의 분류군은 향후 변화할 수 있기 때문에, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 효모는 문헌 Biology and Activities of Yeast(Skinner, F.A., Passmore, S. M., and Davenport, R. R., eds, Soc . App . Bacteriol . Symposium Series No. 9, 1980)에 기술한 바에 따라 정의될 것이다.

보다 더 양호한 실시 상태에서, 상기 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세뉼라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(SchizoSaccharomyces), 또는 야로위아(Yarrowia ) 세포이다.

가장 양호한 실시 상태에서, 상기 효모 숙주 세포는 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마 이세스 도우그라시(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis) 또는 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 세포이다. 또 다른 가장 양호한 실시 상태에서, 상기 효모 숙주 세포는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 세포이다. 또 다른 가장 양호한 실시상태에서, 상기 효모 숙주 세포는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포이다.

또 다른 더 양호한 실시 상태에서, 상기 진균 숙주 세포는 필라멘트형 진균 세포이다. "필라멘트형 진균"은 모든 필라멘트형 형태의 세분류인 유마이코타(Eumycota) 및 오마이코타(Oomycota)를 포함한다(Hawksworth et al ., 1995, 전게서에서 정의). 상기 필라멘트형 진균은 일반적으로 키틴, 셀룰로오스, 글루칸, 키토산, 만난, 및 그 밖의 복합 다당류로 구성된 마이셀 세포벽에 특징이 있다. 증식 성장은 균사 신장에 의한 것이며, 탄소 이화는 필수적으로 유산소과정이다. 이와 대조적으로, 효모 예컨대 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에 의한 증식 성장은 단세포 엽상체(thallus)의 발아이며, 탄소 이화는 발효이다.

보다 더 양호한 실시 상태에서, 상기 필라멘트형 진균 숙주 세포는 아크레모니움(Acremonium), 아스파라길루스(Aspergillus), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 비예르칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 크립토코커스(Cryptococcus), 필라바시디움(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 휴미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 뮤코르(Mucor), 마이셀리오파토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 파네로차에테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레우로투스(Pleurotus), 스키조필룸(Schizophyllum), 타라로마이세스(Talaromyces), 더모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 톨리포칼라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes), 또는 트리코데르마(Trichoderma) 세포이다.

가장 양호한 실시 상태에서, 상기 필라멘트형 진균 숙주 세포는 아스파라길루 스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스파라길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스파라길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스파라길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스파라길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 또는 아스파라길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 세포이다. 또 다른 가장 양호한 실시 상태에서, 상기 필라멘트형 진균 숙주 세포는 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사 리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 큘모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium gr아민arum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티큘라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토루로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코데시오이데스(Fusarium trichothecioides), 또는 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 세포이다. 또 다른 가장 양호한 실시 상태에서, 상기 필라멘트형 진균 숙주 세포는 비예르칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에나(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베스센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 또는 세리포리옵시스 서브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오파토라 더모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로제눔(Penicillium purpurogenum), 파네 로차에테 치르이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플레우로투스 에르인기(Pleurotus eryngii), 티에라비아 테르에스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테 스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌기(Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라치아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei), 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 균주 세포이다.

진균 세포는 알려진 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 세포벽의 재생성에 관계된 공정에 의하여 형질전환될 수 있다. 아스파라길루스(Aspergillus) 및 트리코데르마(Trichoderma) 숙주 세포의 형질전환에 적합한 방법은 EP 238 023 및 Yelton et al ., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 : 1470-1474에 개시되어 있다. 적합한 푸사리움(Fusarium) 종의 형질전환 방법은 문헌 Malardier et al ., 1989, Gene 78: 147-156, 및 WO 96/00787에 기재되어 있다. 효모는 문헌 Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology , Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182- 187, Academic Press, Inc., New York; lto et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 및 Hinnen et al ., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920에 기술된 방법을 사용하여 형질전환할 수 있다.

생산 방법

본 발명은 다음을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다: (a) 상기 폴리펩타이드의 생산에 유리한 조건 하에서, 이들의 야생형 상태로 폴리펩타이드의 생산이 가능한 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계. 바람직하게는, 상기 세포는 아레니콜라(Arenicola) 속이며, 더 바람직하게는 아레니콜라 마리나(Arenicola marina)이다.

본 발명은 또한 다음을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다: (a) 상기 폴리펩타이드의 생산에 유리한 조건 하에서, 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계.

본 발명은 또한 다음을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다: (a) 상기 폴리펩타이드의 생산에 유리한 조건 하에서, 숙주 세포를 배양하는 단계(여기서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:1의 성숙 폴리펩타이드 암호화 영역 내에서 적아도 하나의 돌연변이를 지닌 돌연변이 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서, 상기 돌연변이 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21로 구성된 폴리펩타이드를 암호화한다), 및 (b) 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계.

본 발명의 생산 방법에서, 상기 세포는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 상기 폴리펩타이드를 생산하기 위한 적합한 영양 배지 내에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 적합한 배지 및 상기 폴리펩타이드를 발현 및/또는 분리할 수 있는 조건 하에서 진탕 플라스크 배양, 및 작은-스케일 또는 큰-스케일의 발효 (계속적, 배치, 페드-배치, 또는 고체상 발효를 포함)에 의하여 실험실 또는 공업용 발효기에서 배양된다. 상기 배양은 당해 기술 분야에 알려진 절차를 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염류를 포함하는 적합한 영양 배지 내에서 발생한다. 적합한 배지는 판매 업자에게 구득하거나 또는 공지된 조성물로 생산할 수 있다(예컨대, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그). 상기 폴리펩타이드가 영양 배지 내로 분비되는 경우, 상기 폴리펩타이드를 배지로부터 직접 회수할 수 있다. 상기 폴리펩타이드가 분비되지 않는 경우, 세포를 용해시켜 회수할 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드에 특이적인 당해 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 이러한 검출 방법은 특이적 항체의 사용을 포함한다. 예를 들어, 항균 활성 측정법은 본 명세서에 기재한 폴리펩타이드의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.

결과 폴리펩타이드는 당해 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발, 또는 침전을 포함하나 이에 한정되지 않는 종래의 방법에 의하여 영양 배지로부터 회수할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기영동법(예컨대, 예비 등전 집속), 용해도차(예컨대, 황산 암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출(예컨대, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)를 포함하나 이에 한정되지 않는 당해 기술 분야에 알려진 다양한 절차에 의하여 분리 정제할 수 있다.

식물

본 발명은 본 발명의 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열로 형질전환되어 회수가능한 양으로 상기 폴리펩타이드를 생산 및 발현할 수 있는 유전자삽입 식물, 식물 일부, 또는 식물 세포에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드는 식물 또는 식물 일부로부터 회수할 수 있다. 또한, 재조합 폴리펩타이드를 함유한 상기 식물 또는 식물 일부가 사용되어 식품 또는 사료의 질을 향상시킬 수 있으며, 예컨대, 영양가, 감칠맛(palatability), 및 유동성을 향상시키거나, 또는 영양저해 인자를 파괴한다.

상기 유전자삽입 식물은 쌍자엽(쌍떡잎) 또는 단자엽(외떡잎)일 수 있다. 외떡잎 식물의 예는 초본, 예컨대 왕포아풀(blue grass, Poa), 마초(forage grass) 예컨대 김의털(Festuca), 쥐보리(Lolium), 온지형 초본, 예컨대 풍지초(Agrostis), 및 시리얼(cereals), 예컨대, 밀, 오트(oats), 호밀(rye), 보리(barley), 벼, 사탕수수(sorghum), 및 옥수수(corn)이다.

쌍떡잎 식물의 예는 담배(tobacco), 콩(legume)과 식물, 예컨대 루핀(lupins), 감자, 사탕무(sugar beet), 완두콩, 강낭콩 및 대두, 및 십자화과 식물 (갓과, family Brassicaceae), 예컨대 콜리플라워(cauliflower), 평지종실, 및 밀접 유관 모델 유기체인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana, 애기장대)이다.

식물 일부의 예는 줄기, 유합조직, 잎, 뿌리, 과육, 종자, 및 덩이줄기(tubers) 및 이러한 부분을 포함하는 개개의 조직, 예컨대, 표피, 잎살, 실질(parenchyme), 관다발 조직, 분열조직이다. 특이적 식물 세포 구획, 예컨대 엽록체원형질(chloroplasts), 아포플라스트(apoplasts), 미토콘드리아, 액포, 퍼옥시좀 및 세포질이 식물 일부로 고려된다. 또한, 모든 식물 세포가, 조직 기원을 불문하고, 식물 일부로서 고려된다. 이와 같이, 본 발명의 활용을 촉진하고자 분리된 식물 일부, 예컨대 특이적 조직 및 세포도 식물 일부로서 고려되며, 예컨대, 배아, 배젓, 호분(aleurone) 및 종자 껍질이다.

또한 본 발명의 범위 내에는 이러한 식물, 식물 일부, 및 식물 세포의 자손이 포함된다.

본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 상기 유전자삽입 식물 또는 식물 세포를 당해 기술 분야에 알려진 방법에 따라 생산할 수 있다. 간략히 말하면, 상기 식물 또는 식물 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 하나 이상의 발현 구조체를 식물 숙주 게놈 내로 통합하고, 그 결과로 수식화된 식물 또는 식물 세포를 유전자삽입 식물 또는 식물 세포에 전달하여 생산한다.

상기 발현 구조체는 선택된 식물 또는 식물 일부 내에서 상기 뉴클레오타이드 서열을 발현시키기 위하여 필요한 적절한 조절 서열과 작동가능하게 결합된 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물이다. 또한, 발현 구조체는 상기 발현 구조체가 통합될 숙주 세포를 동정하기에 유용한 선택가능한 마커, 및 상기 구조체를 문제의 식물로 도입하기 위하여 필요한 DNA 서열을 포함할 수 있다(후자는 사용된 DNA 도입법에 따라 달라진다).

조절 서열, 예컨대 프로모터 및 종료자 서열, 및 선택적 신호 또는 임시 서열의 선택은 상기 폴리펩타이드가 언제, 어디서 및 어떻게 발현되는가를 바라는가에 다라 달라진다. 예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 유전자의 발현은 구조적이거나 또는 유도성이거나, 또는 발달적, 단계 또는 조직 특이적일 수 있으며, 및 상기 유전자 산물은 특이적 조직 또는 식물 일부, 예컨대 종자 또는 잎을 표적화할 수 있다. 조절 서열은, 예를 들어, Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506에 기재되어 있다.

구조적 발현을 위하여, 35S-CaMV, 옥수수 유비퀴틴 1(maize ubiquitin 1), 및 벼 액틴 1(rice actin 1) 프로모터가 사용되었다(Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mo . Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991 , Plant Cell 3: 1155-1165). 기관-특이적 프로모터는, 예를 들어, 저장 잠식 조직 예컨대 종자, 감자 덩이줄기, 및 과육의 프로모터(Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev . Genet. 24: 275-303), 또는 대사적 잠식 조직 예컨대 분열조직의 프로모터 (Ito et al., 1994, Plant Mol . Biol. 24: 863-878), 종자 특이적 프로모터 예컨대, 벼의 글루텔린, 프롤라민, 글로블린, 또는 알부민 프로모터(Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), 비치아 파바(Vicia faba)의 레구민 B4 및 미발견 종자 단백질 유전자의 비치아 파바(Vicia faba) 프로모터(Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708- 711), 종자 오일 바디 단백질의 프로모터(Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), 브라씨카 나푸스(Brassica napus)의 저장 단백질 napA 프로모터, 또는 예컨대, WO 91/14772에 개시된 당해 업계에 알려진 그 밖의 모든 종자 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, 상기 프로모터는 잎 특이적 프로모터 예컨대, 벼 또는 토마토의 rbcs 프로모터(Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), 클로렐라 바이러스 아데닌 메틸트랜스퍼라아제 유전자 프로모터(Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), 또는 벼의 aldP 유전자 프로모터(Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), 또는 상처 유도성 프로모터 예컨대, 감자 pin2 프로모터(Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588)일 수 있다. 이와 같이, 상기 프로모터는 비생물학적 처리 예컨대, 온도, 염분 결핍 또는 변화에 의한 유도성일 수 있거나, 또는 프로모터 활성화 물질, 예컨대, 에탄올, 오에스트로겐, 식물 호르몬 예컨대, 에틸렌, 앱시스산, 및 지베렐린산, 및 중금속 등의 외부 도포에 의하여 유도될 수 있다.

프로모터 인헨서 성분을 사용하여 식물 내에서 본 발명의 폴리펩타이드를 고도로 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 프로모터 인헨서 성분은 프로모터와 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열 사이에 위치한 인트론일 수 있다. 예를 들어, Xu et al., 1993, 전게서는 벼 액틴 1 유전자의 제1 인트론이 발현을 증진시키는 용도를 개시하였다.

상기 선택가능한 마커 유전자 및 발현 구조체의 모든 일부는 당해 기술 분야에서 구득 가능한 것으로부터 선택할 수 있다.

상기 핵산 구조물은 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환, 바이러스-매개 형질전환, 미소주입, 미립자 충격기법, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환, 및 전기천공(Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio / Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274)를 포함하는 당해 기술 분야에 알려진 종래의 기법에 의하여 식물 게놈 내로 통합된다.

현재, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-매개 유전자 전이는 유전자삽입 쌍떡잎을 생성시키기 위한 선택법(추가 연구를 위하여, Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38를 참조)이며, 외떡잎 식물을 형질전환하기 위하여 사용될 수도 있으며, 다른 형질전환법도 이러한 식물에 사용될 수 있다. 현재, 유전자삽입 외떡잎의 생성을 위한 선택법은 배아 칼리(embryonic calli) 또는 발생 배아의 미립자 충격법(형질전환 DNA로 피복된 미세현미경적 금 또는 텅스텐 입자)이다(Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). 외떡잎의 형질전환에 대한 다른 방법은 문헌 Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21 : 415-428에 기술된 원형질체 형질전환에 기초한다.

다음의 형질전환에서, 통합된 발현 구조체를 지닌 형질전환주는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법에 따라 선택되고, 식물 전체 내로 재생성되었다. 형질전환 생산자는 재생성 과정에서 또는, 예를 들어, 두 분리된 T-DNA 구조체 보조-형질전환 또는 특이적 재조합효소에 의하여 선택 유전자의 부위 특이적 제거를 사용하여 다음의 생성과정에서 선택 유전자의 선택적 제거를 위하여 설계될 수 있다.

본 발명은 또한 다음을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다: (a) 상기 폴리펩타이드의 생산에 유리한 조건 하에서, 항균 활성을 지닌 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자삽입 식물 또는 식물 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계.

조성물

본 발명은 조성물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드를 포함한 약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 이러한 폴리펩타이드가 강화되어 있다. "강화"라는 용어는 상기 조성물의 항균 활성이 증가, 예컨대, 강화 인자가 1.1인 것을 말한다.

상기 조성물은 또 다른 약학적 활성제, 예컨대 추가적인 살균제 또는 생물 발육 저지제, 예컨대 전술한 항균 활성을 나타내는 또 다른 항균 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 살균제는 당해 기술 분야에 알려진 항생제일 수 있다. 항생제의 군은 예컨대 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 옥사실린, 카베니실린, 나프실린, 앰피실린, 등의 페니실린; 베타-락타마아제 억제제, 세팔로스포린스, 예컨대 세파클로르, 세파졸린, 세푸록심, 목살락탐, 등과 조합된 페니실린; 카바페넴스; 모노박탐; 아미노글리코사이드; 테트라사이클린; 마크로리데스; 린코마이신; 폴리마이신; 설폰아미드; 퀴놀론; 클로람페니칼; 메트로니다졸; 스펙티노마이신; 트리메토프림; 반코마이신; 등을 포함한다. 살균제는 폴리엔, 예컨대 암포테리신 B, 니스타틴; 5-플루코신; 및 아졸, 예컨대 마이코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸 및 플루코나졸을 포함하는 항진균제일 수 있다.

일 실시 태양에서, 상기 살균제는 비-효소 화학제이다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 살균제는 비-폴리펩타이드 화학제이다.

상기 조성물은 적합한 담체 물질을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상기 조성물이 치료제로 사용되는 경우 본 발명의 항균 폴리펩타이드를 소망하는 유전좌로 전달할 수 있는 적합한 전달 운반체를 포함할 수 있다.

상기 폴리펩타이드 조성물은 당해 기술 분야에 알려진 방법에 따라 생산될 수 있으며, 액상 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 조성물은 과립형 또는 미소과립형일 수 있다. 상기 조성물 내에 포함된 폴리펩타이드는 당해 기술 분야에 알려진 방법에 따라 안정화될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 조성물의 양호한 용도의 예는 아래 나타내었다. 조성물에 사용된 본 발명 폴리펩타이드 조성물의 복용량 및 다른 조건은 당해 기술 분야에 알려진 방법에 기초하여 결정될 수 있다.

방법 및 용도

본 발명은 상기 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드의 사용 방법에 관한 것이다. 상기 항균 폴리펩타이드는 일반적으로 박테리아, 진균, 효모 또는 조류에 의하여 감염되는 모든 장소에 유용하다. 일반적으로, 이러한 장소는 미생물을 사멸시켜야하거나 또는 이들의 성장을 조절할 필요가 있는 수성 시스템 예컨대 냉각수 시스템, 세탁 헹굼수, 오일 시스템 예컨대 절단 오일, 윤활제, 유전 등의 내에 있다. 그러나, 본 발명은 알려진 항균 조성물이 유용한, 예컨대 목제, 라텍스, 접착제, 풀, 종이, 판지, 섬유, 가죽, 플라스틱, 코킹, 및 사료의 보호 등의 모든 적용례에 사용될 수 있다.

다른 용도는 식품, 음료, 화장품 예컨대, 로션, 크림, 겔, 연고, 비누, 샴푸, 컨디셔너, 항발한제, 방취제, 구강 청결제, 콘택트렌즈 제품, 효소 제형, 또는 식품 성분의 보존을 포함한다.

따라서, 본 발명의 항균 폴리펩타이드는 소독제로 유용하며, 예컨대, 눈 또는 구강, 피부 감염의 치료; 항발한제 또는 방취제; 콘택트 렌즈 및 치아(구강 세척) 세정 및 소독 등에 유용하다.

일반적으로, 항균 본 발명의 폴리펩타이드는 모든 표면상의 미생물 성장을 세정, 소독 또는 억제하는데 유용하다는 것이 고려된다. 본 발명의 항균 폴리펩타이드가 접촉되는 것이 이로운 표면의 예는 예컨대 낙농, 화학 또는 약학 공정 플랜트, 수도 위생 시스템, 오일 가공 플랜트, 종이 펄프 가공 플랜트, 하수 처리 플랜트, 및 냉각탑 등에 사용되는 공정 기기의 표면이다. 본 발명의 항균 폴리펩타이드는 문제의 표면상의 미생물 성장을 세정, 소독 또는 억제하는데 효과적인 양으로 사용되어야 한다.

본 발명의 항균 폴리펩타이드는 추가적으로 식품 가공 플랜트 및 식품이 조리되고 제공되는 모든 장소, 예컨대 병원, 요양소 및 식당 내의 조리 기구의 표면을 세정하는데 사용할 수도 있다.

이는 수성계 페인트의 보존제 또는 소독제로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항균 폴리펩타이드 또는 조성물을 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 항균 폴리펩타이드 또는 조성물은 미생물, 예컨대 진균 유기체 또는 박테리아, 바람직하게는 그람 양성 박테리아를 조절 또는 제거하는 약품의 제조에 사용할 수 있다.

상기 조성물 및 본 발명의 항균 폴리펩타이드는 항균 수의학적 또는 인간 치료 또는 예방제로서 사용될 수 있다. 따라서, 상기 조성물 및 본 발명의 항균 폴리펩타이드는 미생물 감염, 예컨대 박테리아 또는 진균 감염, 바람직하게는 그람 양성 박테리아 감염을 치료하는 수의학적 또는 인간 치료제 또는 예방제의 제품에 사용될 수 있다. 특히, 미생물 감염은 폐 결핵, 폐렴 및 낭포성 섬유증을 포함하나 이에 한정되지 않는 폐 질환; 및 임질 및 클라미디아를 포함하나 이에 한정되지 않는 성병에 관련된 것이다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 항균 폴리펩타이드의 유효량을 포함한다. 본 명세서에서 "유효량"이라는 용어는 문제의 미생물의 성장을 억제하기 충분한 본 발명의 항균 폴리펩타이드의 양을 의미한다.

본 발명은 상처 치유 조성물 또는 예컨대, 붕대, 의료 기구 예컨대, 예컨대, 카데터 등의 제품에 관한 것이며, 추가적으로, 비듬방지 제품, 예컨대 샴푸 등에 관한 것이다.

본 발명의 항균 폴리펩타이드의 조성물은 미생물 감염되었거나 또는 소인이 있는 숙주에 투여된다. 투여는 특이적 미생물에 따라 국소, 국부 또는 전신일 수 있으며, 바람직하게는 국부적이다. 일반적으로 본 발명의 항균 폴리펩타이드의 복용량은 미생물 개체수가 적어도 약 50%, 일반적으로 적어도 1 로그, 및 2 이상의 로그로 사멸되어 감소하기 충분한 것이다. 본 발명의 화합물은 부작용을 최소화하면서, 미생물 개체수를 감소시키는 복용량으로 투여된다. 상기 조성물은 생체 내 사용을 위한 외과적 지침하에서 획득하고 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 본 발명의 항균 폴리펩타이드는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis)를 포함하는 그람 음성 박테리아; 및 스트렙토 코커스(streptococci) 예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스트렙토코커스 유베리스(S. uberis), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(S. hyointestinalis), 스트렙토코커스 피오지네스(S. pyogenes) 및 스트렙토코커스 아갈락티아에(S. agalactiae); 및 스타필로코커스(staphylococci) 예컨대, 스타필로코커 스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(S. epidermidis), 스타필로코커스 시뮬란스(S. simulans), 스타필로코커스 자일로수스(S. xylosus) 및 스타필로코커스 카르노수스(S. carnosus)를 포함하는 그람 양성 박테리아의 사멸에 특히 유용하다.

본 발명의 항균 폴리펩타이드의 제형은 미생물 폐 감염, 예컨대 폐렴; 또는 미생물 상처 감염, 예컨대, 박테리아 상처 감염이 되었거나 또는 소인이 있는 숙주에 투여될 수 있다.

본 발명의 항균 폴리펩타이드의 제형은 피부 감염, 예컨대 여드름, 아토피 피부염 또는 지루성 피부염 등에 감염이 되었거나 또는 소인이 있는 숙주에 투여될 수 있으며; 바람직하게는 상기 피부 감염은 예컨대, 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 피티로스포룸 오 발레(Pityrosporum ovale) 또는 말라사에지아 푸르푸르(Malassezia furfur)에 의하여 유발된 박테리아 피부 감염이다.

본 발명의 항균 폴리펩타이드는 병원균을 사멸시키는 생체 외 제형으로 유용하며, 특히, 종래의 항생제의 양을 도입하기를 원치 않는 경우에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 항균 폴리펩타이드는 동물 및/또는 인간용 식품 제품에 첨가될 수 있거나; 또는 이들은 조직 배양액 내의 병원균의 과잉 성장을 억제하기 위하여 생체 외 배양시 첨가제로서 포함될 수도 있다.

본 발명의 항균 폴리펩타이드로 사멸되는 특정 병원균의 감수성은 실험 섹션에서 자세히 소개할 생체 외 실험에 의하여 측정된다. 일반적으로 병원균의 배양액은 단백질이 일반적으로 약 한 시간에서 1일간 활동하도록 충분한 시간 동안 다양한 농도에서 항균 폴리펩타이드와 결합된다. 그 다음 생균을 계수하였으며, 사멸 수준을 측정하였다.

대상 병원균은 그람 음성 박테리아, 예를 들어: 시트로박터 종(Citrobacter sp.); 엔테로박터 종(Enterobacter sp.); 에셔리시아 종(Escherichia sp.), 예컨대 에셔리시아 콜리(E. coli); 클레브시엘라 종(Klebsiella sp.); 모르가넬라 종(Morganella sp.); 프로테우스 종(Proteus sp.); 프로비덴시아 종(Providencia sp.); 살모넬라 종(Salmonella sp.), 예컨대, 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium); 세라티아 종(Serratia sp.); 시겔라 종(Shigella sp.); 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 예컨대, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa); 여시니아 종(Yersinia sp.), 예컨대, 여시니아 페스티스(Y. pestis), 여시니아 슈도투베르큘로시스(Y. pseudotuberculosis), 여시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica); 프란시스셀라 종(Franciscella sp.); 파스튜렐라 종(Pasturella sp.); 비브리오 종(Vibrio sp.), 예컨대, 비브리오 콜레라(V. cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(V. parahemolyticus); 캄필로박터 종(Campylobacter sp.), 예컨대, 캄필로박터 제주니(C. jejuni); 하에모필루스 종(Haemophilus sp.), 예컨대, 하에모필루스 인플루엔자(H. influenzae), 하에모필루스 듀크레이(H. ducreyi); 보르데텔라 종(Bordetella sp.), 예컨대, 보르데텔라 페르튜시스(B. pertussis), 보르데텔라 브론치셉티카(B. bronchiseptica), 보르데텔라 파라테르투시스(B. parapertussis); 브루셀라 종(Brucella sp.), 네이세리아 종(Neisseria sp.), 예컨대, 네이세리아 고노르로에아(N. gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티디스(N. meningitidis), 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 대상 박테리아는 레기오넬라 종(Legionella sp.), 예컨대, 레기오넬라 뉴모필라(L. pneumophila); 리스테리아 종(Listeria sp.), 예컨대, 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes); 마이코플라스마 종(Mycoplasma sp.), 예컨대, 마이코플라스마 호미니스(M. hominis), 마이코플라스마 뉴모니아(M. pnumoniae); 마이코박테리움 종(Mycobacterium sp.), 예컨대, 마이코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 레프라(M. leprae); 트레포네마 종(Treponema sp.), 예컨대, 트레포네마 팔리둠(T. pallidum); 보렐리아 종(Borrelia sp.), 예컨대, 보렐리아 부르그도르페리(B. burgdorferi); 렙토스피라 종(Leptospirae sp.); 리케차 종(Rickettsia sp.), 예컨대, 리케차 리케치(R. rickettsii), 리케차 티피(R. typhi); 클라미디아 종(Chlamydia sp.), 예컨대, 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis), 클라미디아 뉴모니아(C. pneumoniae), 클라미디아 프시타시(C. psittaci); 헬리코박터 종(Helicobacter sp.), 예컨대, 헬리코박터 파이로리(H. pylori), 등을 포함한다.

대상 비-박테리아 병원체는 진균 및 원생동물 병원체, 예컨대, 플라스모디아 종(Plasmodia sp.), 예컨대, 플라스모디아 팔시파룸(P. falciparum), 트리파노소마 종(Trypanosoma sp.), 예컨대, 트리파노소마 브루세이(T. brucei); 시스토소메스(shistosomes); 엔타에모에바 종(Entaemoeba sp.), 크립토코커스 종(Cryptococcus sp.), 칸디다 종(Candida sp.), 예컨대, 칸디다 알비칸스(C. albicans); 등을 포함한다.

다양한 투여 방법이 사용될 수 있다. 상기 폴리펩타이드 제형은 경구형태로 제공되거나, 또는 에어로졸, 안약, 방광 주입, 국소적으로 혈관 내, 피하조직, 복막에 투여될 수 있다. 예를 들어, 흡입 투여 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 치료 제형의 복용량은 투여되는 특이적 항균 폴리펩타이드, 질병의 특성, 투여 빈도, 투여 방법, 숙주로부터의 상기 약제의 제거율 등에 따라 매우 다양하다. 초기 복용량은 더 많을 수 있으며, 이후 유지 복용량은 적게 된다. 상기 복용량은 빈번하지 않게 주마다 또는 2주마다 투여할 수 있거나, 또는 더 작은 양으로 나누어져 매일, 주2회 등으로 1회 또는 수회 투여하여 효과적인 복용량 수준을 유지하게 된다. 많은 경우, 경구 투여는 혈관 투여보다 많은 양이 요구된다. 아미드 결합, 및 아미노 및 카르복시 말단은 경구 투여시 더 큰 안정성을 위하여 수식화될 수 있다. 예를 들어, 카르복시 말단은 아미드화될 수 있다.

제형

본 발명의 화합물은 치료적 투여를 위하여 다양한 제형으로 통합될 수 있다. 더 상세히 살펴보면, 본 발명의 화합물은 적절한, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제등과 조합하여 약학적 조성물로 통합될 수 있으며, 고형, 반고형, 액상 또는 기체형, 예컨대, 타블렛, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 크림, 폼, 용액, 좌약, 주사액, 흡입제, 겔, 마이크로스피어, 로션, 및 에어로졸 형태의 제품으로 제형화될 수 있다.

이와 같이, 화합물의 투여는 경구, 볼점막, 직장, 비경구, 복막내, 진피내, 경피내, 기관내 등을 포함하는 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 본 발명의 항균 폴리펩타이드는 투여 후 전신에 퍼지거나, 이식 부위에서 약제 활성을 보유하는 이식 또는 다른 제형을 사용하여 국부화될 수 있다.

본 발명의 일 실시 태양에서, 국소용 제형은 2가 양이온, 특히 칼슘 및 마그네슘의 유효 농도를 감소시키기 위한 킬레이트제를 포함한다. 예를 들어, 시트르산, EGTA 또는 EDTA 등의 약제가 포함될 수 있으며, 시트르산이 양호하다. 시트르산의 농도는 일반적으로 약 1 내지 10 mM이다.

본 발명의 화합물은 단독, 서로 다른 것과 조합으로 투여될 수 있거나, 또는 이들은 다른 알려진 화합물 (예컨대, 퍼포린, 소염제, 항생제, 등.)과 조합하여 사용될 수 있다. 약학적 복용 형태로서, 상기 화합물은 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. 다음의 방법 및 부형제는 단지 예시일 뿐이며 제한적인 것은 결코 아니다.

경구용 제품으로서, 상기 화합물은 단독으로, 또는 적절한 첨가제와 조합하여 타블렛, 분말, 과립 또는 캡슐로 제조될 수 있으며, 첨가제로는, 예를 들어, 종래의 첨가제, 예컨대 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 결합제, 예컨대 결정 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 분해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 또는 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨; 윤활제, 예컨대 활석 또는 스테아르산 마그네슘; 필요하다면, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제 및 착향료가 있다.

상기 화합물은 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사 오일, 합성 지방산 글리세라이드, 고지방산 또는 프로필렌글리콜의 에스테르 등의 내에서; 필요하다면, 종래의 첨가제 예컨대 용해화제, 등장제, 현탁화제, 에멀젼화제, 안정제 및 보존제와 함께 용해, 현탁화 또는 에멀젼화시켜 주사용 제품으로 제형화할 수 있다.

상기 화합물은 에어로졸 제형으로 활용되어 흡입을 통하여 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 압입된 허용가능한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등으로 제형화될 수 있다.

상기 화합물은 종래의 첨가제 예컨대, 용해화제, 등장제, 현탁화제, 에멀젼화제, 안정제 및 보존제와 함께 제형화되어 예를 들어 화상에 의한 감염을 예방하는 로션으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 화합물은 다양한 베이스 예컨대, 에멀젼화 베이스 또는 수용성 베이스 등과 혼합하여 좌약 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은 좌약을 통하여 직장으로 투여될 수 있다. 상기 좌약은 운반체 예컨대, 체온에서 융해되나 실온에서는 고형화되는, 코코아 버터, 카보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.

경구 또는 직장 투여용 단위 투여 형태 예컨대, 시럽, 엘릭시르, 및 현탁액으로 제공될 수 있으며, 여기서, 각 투여 단위, 예를 들어, 티스푼 분량, 테이블스푼 분량, 타블렛 또는 좌약 등은 하나 이상의 본 발명의 화합물을 함유한 조성물의 소정량을 함유한다. 이와 유사하게, 주사용 또는 정맥 투여용 단위 투여 형태는 멸균수, 생리 식염수 또는 다른 약학적으로 허용가능한 담체의 용액으로서 조성물 내에 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.

지속 방출 제형의 이식은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이식은 생분해성 또는 비-생분해성 고분자와 함께 마이크로스피어, 슬래브(slabs) 등으로 제형화된다. 예를 들어, 락트산 및/또는 글리콜산의 고분자는 숙주에 의하여 잘 용인시키는 침식가능한 고분자를 형성하게 된다. 본 발명의 항균 폴리펩타이드를 함유한 이식은 감염 부위의 근처에 위치하여, 활성제의 국부 농도가 다른 신체 부위에 비하여 높게 된다.

본 명세서에서 사용된 "단위 투여 형태"라는 용어는 인간 및 동물 대상체에 단일 복용량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 본 발명의 화합물의 소정량을 함유한 단위는 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 운반체와 결합하여 소망하는 효과를 내기에 충분한 양으로 계산된다. 본 발명의 단위 투여 형태의 상세는 사용된 특정 화합물과 달성하려는 효과, 및 숙주 내에서 상기 화합물과 결합되는 약물동역학에 따라 달라진다

약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 운반체, 면역보강제, 담체 또는 희석제는 손쉽게 구득할 수 있다. 게다가, 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절 및 완충제, 긴장 조절제, 안정제, 습윤제등은 손쉽게 구득할 수 있다.

전신 투여의 전형적인 투여량은 0.1 pg 내지 100 ㎎/kg 대상체 중량/투여의 범위이다. 전형적인 투여량은 일일 2회 내지 6회 섭취하는 1정의 타블렛, 또는 활성 성분의 함량이 높은 비율로 함유된, 1일 1회 섭취하는 1정의 시간차 방출 캡슐 또는 타블렛이다. 상기 시간차 방출 효과는 다른 pH 값에서 용해되는 캡슐 재료, 삼투압에 의한 저속 방출 캡슐, 또는 알려진 모든 조절 방출 수단에 의하여 달성될 수 있다.

당해 분야의 숙련자라면 복용 수준은 특이적 화합물의 기능, 증상의 격렬함, 및 대상체의 부작용에 대한 감수성에 따라 다양해질 수 있다는 점을 쉽게 이해할 수 있다. 이러한 특이적 화합물의 일부는 다른 화합물들보다 더 효능이 있다. 주어진 화합물의 양호한 복용량은 다양한 수단으로 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여 쉽게 측정가능하다. 양호한 수단은 주어진 화합물의 생리학적 효능을 측정하는 것이다.

리포좀을 전달 운반체로 사용하는 것이 중요한 일 방법이다. 리포좀은 표적 부위의 세포와 융합하고, 세포 내에서 루멘의 함유물을 전달한다. 상기 리포좀은, 예컨대 분리, 결합제 등의 접촉을 유지시킬 다양한 수단을 사용하여 융합에 충분한 시간 동안 세포와 접촉한 상태로 유지된다. 본 발명의 일 실시 상태에서, 리포좀은 폐 투여용으로 에어로졸화 되도록 설계된다. 리포좀은 예컨대 센다이(Sendai) 바이러스 또는 인플루엔자(influenza) 바이러스 등의 멤브레인 융합을 매개하는 분리정제된 단백질 또는 펩타이드로 제조된다. 지질은 양이온 또는 2가이온 지질, 예컨대 포스파티딜콜린을 포함하는 알려진 리포좀 형성 지질의 모든 유용한 조합이 될 수 있다. 잔여 지질은 일반적으로 중성 또는 산성 지질, 예컨대 콜레스테롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤 등이 될 것이다.

상기 리포좀을 제조하기 위하여, 방법은 Kato et al. (1991) J. Biol . Chem. 266:3361에 기술된 것이 사용되었다. 간단히 말하면, 펩타이드를 함유한 상기 지질 및 루멘 조성물은 적절한 수성 배지, 총 고체량이 약 1-10 중량%의 범위인 알맞는 식염수 배지에 결합된다. 약 5-60초의 짧은 시간 동안의 집중적인 교반 후, 시험관을 약 25- 40℃의 온수조에 넣는 주기를 약 5-10회 반복한다. 상기 조성물은 그 다음 필요한 시간, 일반적으로 약 1-10 초 동안 초음파 분쇄되며, 추가로 와동(vortexing)시켜 교반할 수 있다. 부피는 수성 배지의 첨가에 의하여, 일반적으로 약 1-2배 증가하여 확대되었으며, 그 다음 진탕 및 냉각시킨다. 이 방법에 의하여 고분자량 분자가 루멘으로 통합된다

다른 활성제를 포함한 제형

본 방법을 이용하기 위하여, 본 발명의 항균 폴리펩타이드는 다른 약학적으로 활성제, 특히, 다른 항균제로 제형화될 수 있다. 다른 대상 약제는 당해 기술 분야에 알려진 매우 다양한 항생제를 포함한다. 항생제의 군은 페니실린, 예컨대 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 옥사실린, 카베니실린, 나프실린, 앰피실린 등; 베타-락타마아제 억제제, 세팔로스포린스과 조합된 페니실린, 예컨대 세파클로르, 세파졸린, 세푸록심, 목살락탐, 등; 카바페넴스; 모노박탐스; 아미노글리코사이드; 테트라사이클린; 마크로리데스; 린코마이신스; 폴리마이신스; 설폰아미드; 퀴놀론; 클로람페니칼; 메트로니다졸; 스펙티노마이신; 트리메토프림; 반코마이신; 등을 포함한다.

항진균제도 또한 유용하며, 폴리엔, 예컨대 암포테리신 B, 니스타틴; 5-플루코신; 및 아졸, 예컨대, 마이코나졸, 케타코나졸, 이타로코나졸 및 플루코나졸을 포함한다. 항폐결핵 약제는 이소니아지드, 에탐부톨, 스트렙토마이신 및 리팜핀을 포함한다. 사이토카인이 본 발명의 항균 폴리펩타이드의 제형 내에 포함될 수도 있으며 예컨대, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파, 인터류킨 12, 등을 포함한다.

생체 외 합성

본 발명의 항균 펩타이드는 당해 기술 분야에 알려진 종래의 방법을 사용하여 생체 외 합성에 의하여 제조될 수 있다. 다양한 상업용 합성 기구를 사용할 수 있으며, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템사(Applied Biosystems Inc., Beckman), 등의 자동화된 합성기가 있다. 합성기를 사용하여, 천연 아미노산은 인공 아미노산, 특히 D-이성질체(또는 D-형) 예컨대 D-알라닌 및 D-이소류신, 부분이성질체, 길이가 다르거나 또는 기능이 다른 측쇄 등으로 치환될 수도 있다. 특정 서열 및 생산 방법은 필요한 편의, 경제성, 순도 등에 의하여 결정될 것이다.

화학 결합은, 예컨대, 아미드 또는 치환 아민 형성, 예컨대 환원성 아미노화를 위한 아미노기, 티올에테르 또는 이황화결합 형성을 위한 티올기, 아미드 형성을 위한 카르복실기 등의 편리한 결합 작용기를 포함하는 다양한 펩타이드 또는 단백질을 제공한다

필요하다면, 다양한 작용기를 합성 또는 발현시 펩타이드에 도입할 수도 있으며, 이로써 다른 분자 또는 표면에 결합하게 한다. 따라서 시스테인은 티올에테르제조시 사용되며, 히스티딘은 금속 이온 복합체에 결합시 사용되고, 카르복실기는 아미드 또는 에스테르 형성에 사용되고, 아미노기는 아미드 등의 형성에 사용된다.

상기 폴리펩타이드는 종래의 재조합 합성법에 따라 분리 및 분리정제될 수 있다 용해질(lysate)은 발현 숙주로부터 제조되며, 상기 용해질은 HPLC, 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 또는 다른 분리 정제 기법을 사용하여 분리 정제되었다. 대부분의 경우, 제품의 생산 방법 및 이들의 분리정제와 유관된 오염원에 관하여, 사용된 상기 조성물은 소망 산물의 중량부로 적어도 20%, 더 일반적으로 적어도 약 75% 중량부, 바람직하게는 적어도 약 95% 중량부, 및 치료적 목적으로서는, 일반적으로 적어도 약 99.5% 중량부이다. 일반적으로, 백분율은 총 단백질을 기초로 한다.

동물 사료

본 발명은 동물 사료에 상기 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드를 사용하는 방법, 및 본 발명의 항균 폴리펩타이드를 포함한 사료 조성물 및 사료 첨가제에 관한 것이다.

동물이라는 용어에는 인간을 포함하는 모든 동물을 포함한다. 동물의 예는 비반추 동물, 및 반추 동물, 예컨대 소, 양 및 말이다. 본 발명의 특정 실시 태양에서, 상기 동물은 비반추 동물이다. 비반추 동물은 단위 동물, 예컨대 돼지 또는 돼지과(유아 돼지, 성장 돼지, 및 암퇘지를 포함하나 이에 한정되지 않음); 가금류 예컨대 칠면조 및 닭(구이용 영계, 암탉을 포함하나 이에 한정되지 않음); 송아지; 및 어류(연어를 포함하나 이에 한정되지 않음)이다.

사료 또는 사료 조성물이라는 용어는 모든 화합물, 제품, 혼합물, 또는 동물이 섭취하기 적합하거나 섭취하도록 의도된 조성물을 의미한다.

본 발명의 용도에 따르면, 상기 항균 폴리펩타이드는 음식과 섭취 전, 후 또는 동시에 제공될 수 있다. 후자가 양호하다.

본 발명의 특정 실시 태양에서는, 상기 항균 폴리펩타이드는 사료에 첨가되는 형태, 또는 사료 첨가제에 포함되는 경우, 잘 정의되었다. 잘 정의되었다라는 것은 상기 항균 폴리펩타이드 제품이 크기-배제 크로마토그래피(Example 12의 WO 01/58275참조)에 의하여 측정시 적어도 50% 순수함을 의미한다. 본 발명의 다른 실시 태양에서는, 상기 항균 폴리펩타이드 제품은 이러한 방법으로 측정시 적어도 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 또는 적어도 95% 순수하다.

잘 정의된 항균 폴리펩타이드 제품이 양호하다. 예를 들어, 사료에 다른 항균 폴리펩타이드의 관여 또는 오염이 필수적으로 배제된 항균 폴리펩타이드를 정확히 투여하는 것이 더 쉽다. 정확히 투여라는 용어는 특히 일정하고 일치하는 결과, 및 소망하는 효과에 기초한 최적 복용량의 성능을 얻기 위한 목적이다.

동물 사료에 사용되는 경우, 그러나, 상기 항균 폴리펩타이드는 그렇게 순수할 필요는 없다; 이는 예컨대 다른 효소를 포함할 수 있으며, 이 경우 항균 폴리펩타이드 제품으로 칭할 수 있다.

상기 항균 폴리펩타이드 제품은 (a) 사료 (또는 식물성 단백질 처리 공정에 직접 사용)에 직접 첨가되거나, 또는 (b) 하나 이상의 중간체 조성물 예컨대 사료 첨가제 또는 결과적으로 사료에 첨가(또는 처리 공정에 사용)되는 사전혼합물의 제조에 사용될 수 있다. 전술한 순수도는 상기 (a) 또는 (b)를 따른 원 항균 폴리펩타이드 제품의 순도를 나타낸다.

크기 순의 순도를 지닌 항균 폴리펩타이드 제품은 특히 재조합 제조법을 사용하여 획득이 가능하며, 상기 항균 폴리펩타이드가 기존의 발효법으로 제조된 경우에는 이들을 쉽게 획득하지 못하며, 고도의 연속(batch-to-batch) 변형을 가하여야한다.

이러한 항균 폴리펩타이드 제품은 물론 다른 효소와 혼합된다.

본 명세서에서 사용된 식물성 단백질이라는 용어는 수식화된 단백질 및 단백질-유도체를 포함하는, 식물로부터 유래한 또는 그로부터 유도한 적어도 하나의 단백질을 포함하는 모든 화합물, 조성물, 제품 또는 혼합물을 나타낸다. 특정 실시 태양에서, 상기 식물성 단백질의 단백질 함량은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% (w/w)이다.

식물성 단백질은 식물성 단백질 공급원, 예컨대 콩과 및 시리얼, 예를 들어, 파바세아(Fabaceae , Leguminosae), 크루시페라세아(Cruciferaceae), 체노포디아세아(Chenopodiaceae), 및 포아세아(Poaceae) 과 식물의 물질, 예컨대 대두분, 루핀종실분 및 평지종실분으로부터 유도될 수 있다.

본 발명의 특정 실시 태양에서는, 식물성 단백질 공급원은 하나 이상의 파바세아(Fabaceae) 과 식물, 예컨대, 대두, 루핀, 완두콩, 또는 강낭콩에서 유래한 물질이다.

본 발명의 다른 실시 태양에서는, 상기 식물성 단백질 공급원은 하나 이상의 체노포디아세아(Chenopodiaceae) 과 식물, 예컨대, 첨채, 사탕무, 시금치 또는 퀴노아 등에서 유래한 물질이다.

식물성 단백질 공급원의 다른 예는 평지종실, 및 양배추이다.

대두가 양호한 식물성 단백질 공급원이다.

식물성 단백질 공급원의 다른 예는 시리얼 예컨대, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 옥수수(콘), 벼, 및 사탄수수이다.

상기 항균 폴리펩타이드는 어떠한 형태로도 사료에 첨가할 수 있으며, 상대적으로 순수한 항균 폴리펩타이드로서 존재할 수 있거나, 또는 동물 사료에 첨가할 다른 성분, 즉, 동물 사료 첨가제의 형태, 예컨대, 소위 동물 사료용 사전 혼합물과 혼합하여 존재할 수 있다.

다른 실시 상태에서, 본 발명은 동물 사료용 조성물, 예컨대 동물 사료, 및 동물 사료 첨가제, 예컨대 사전 혼합물이다.

본 발명의 항균 폴리펩타이드와 달리, 본 발명의 동물 사료 첨가제는 적어도 하나의 지용성 비타민, 및/또는 적어도 하나의 수용성 비타민, 및/또는 적어도 하나의 미량광물질, 및/또는 적어도 하나의 다량광물질을 함유한다.

추가적, 선택적인 사료-첨가제 성분은 착색제, 방향족 화합물, 안정화제, 및/또는 파이타아제 EC 3.1.3.8 또는 3.1.3.26; 자일라나아제 EC 3.2.1.8; 갈락타나아제 EC 3.2.1.89; 및/또는 베타-글루카나아제 EC 3.2.1.4 중에서 선택된 적어도 하나의 다른 효소이다.

본 발명의 특정 실시 태양에서는 이러한 다른 효소는 잘 정의되었다(항균 폴리펩타이드 제품의 정의와 같다).

다른 항균 펩타이드(AMP)의 예는 CAP18, 류코신 A, 트리트립티신, 프로테그린-1, 타나틴, 디펜신, 오비스피린 예컨대, 노비스피린(Robert Lehrer, 2000), 및 항균 활성을 보유한 이들의 변이체 또는 절편이다.

다른 항진균 폴리펩타이드(AFP)의 예는 WO 94/01459 및 WO 02/090384에서 개시한 아스파라길루스 기간테우스(Aspergillus giganteus), 및 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger) 펩타이드, 및 항진균 활성을 보유한 이들의 변이체 또는 절편이다.

일반적으로 지용성 및 수용성 비타민, 및 미량광물질은 사료에 첨가할, 소위 사전 혼합물의 일부를 형성하는 반면, 다량광물질은 일반적으로 사료에 별도로 첨가된다. 이러한 조성물의 모든 형태는 본 발명의 항균 폴리펩타이드로 강화되는 경우, 본 발명의 동물 사료 첨가제이다.

본 발명의 특정 실시 태양에서는, 본 발명의 동물 사료 첨가제는 0.01 내지 10.0%; 더 특정하자면 0.05 내지 5.0%; 또는 0.2 내지 1.0% (%는 100g 사료당 첨가제의 g 이다)의 수준으로 동물 음식물 또는 사료에 포함(또는 포함되도록 처방)된다. 이는 특히 사전혼합물에 관한 것이다.

다음은 이러한 성분예의 비제한적인 열거이다:

지용성 비타민의 예는 비타민 A, 비타민 D3, 비타민 E, 및 비타민 K, 예컨대 비타민 K3이다.

수용성 비타민의 예는 비타민 B12, 바이오틴 및 콜린, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니아신, 폴산 및 판토텐산, 예컨대 Ca-D-판토텐산이다.

미량광물질의 예는 망간, 아연, 철, 구리, 요오드, 셀레늄, 및 코발트이다.

다량광물질의 예는 칼슘, 인 및 나트륨이다.

이러한 성분의 영양요구성(가금류 및 유아 돼지/돼지를 예시함)은 WO 01/58275의 표 A에 열거되었다. 영양요구성은 이러한 성분이 적시한 농도로 음식물에 제공되어야 한다는 것을 의미한다.

다른 실시 상태에서, 본 발명의 동물 사료 첨가제는 WO 01/58275의 표 A에 특정된 적어도 하나의 개별 성분을 포함한다. 적어도 하나라는 것은, 하나 이상의, 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷 등에서 13 또는 15까지의 개별 성분을 의미한다. 더 상세히 살펴보면, 이 적어도 하나의 개별 성분은 상기 표 A의 컬럼 4 또는 컬럼 5 또는 컬럼 6에 적시한 범위 내의 사료 농도로 제공되는 양으로 본 발명의 첨가제에 포함된다.

본 발명은 동물 사료 조성물에 관한 것이다. 동물 사료 조성물 또는 식품은 상대적으로 고함량의 단백질을 포함한다. 가금류 및 돼지류의 식품은 WO 01/58275의 표 B, 컬럼 2-3에 적시한 바와 같이 특정될 수 있다. 어류 식품은 이 표 B의 컬럼 4에 적시한 바와 같이 특정될 수 있다. 또한 이러한 어류 음식물은 일반적으로 조지방 함량이 200-310 g/kg이다.

본 발명에 따른 동물 사료 조성물은 조단백질 함량이 50-800 g/kg이며, 또한 본 명세서에서 청구한 적어도 하나의 항균 폴리펩타이드를 포함한다.

또한, 다른 실시 상태에서(상기 적시한 조단백질 함량), 본 발명의 동물 사료 조성물은 대사가능 에너지 함량이 10-30 MJ/kg; 및/또는 칼슘 함량이 0.1-200 g/kg; 및/또는 활용가능한 인 함량이 0.1-200 g/kg; 및/또는 메티오닌 함량이 0.1-100 g/kg; 및/또는 메티오닌 + 시스테인 함량이 0.1-150 g/kg; 및/또는 라이신 함량이 0.5-50 g/kg이다.

특정 실시 태양에서, 대사가능 에너지, 조단백질, 칼슘, 인, 메티오닌, 메티오닌 + 시스테인, 및/또는 라이신의 함량은 WO 01/58275 (R.2-5)의 표 B 내의 2, 3, 4 또는 5의 범위의 하나에 포함된다.

조단백질은 질소 (N)에 인자 6.25를 곱하여 계산된다. 즉, 조단백질 (g/kg)= N (g/kg) x 6.25이다. 질소 함량은 켄달(Kjeldahl)법에 의하여 측정된다 (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

대사가능 에너지는 문헌 NRC publication Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D. C, pp. 2-6, 및 문헌 the European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for Poultry research and extention, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5를 기초로 계산되었다.

전체 동물 식품 내의 칼슘, 활용가능한 인 및 아미노산의 함량은 예컨대, 문헌 Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7의 사료 표를 기초로 계산되었다.

본 발명의 특정 실시 태양에서는, 본 발명의 동물 사료 조성물은 상기 정의된 적어도 하나의 식물성 단백질 또는 단백질 공급원을 함유한다.

본 발명의 또 다른 특정 실시 태양에서는, 본 발명의 동물 사료 조성물은 0-80% 옥수수; 및/또는 0-80% 사탕수수; 및/또는 0-70% 밀; 및/또는 0-70% 보리; 및/또는 0-30% 귀리; 및/또는 0-40% 대두분; 및/또는 0-10% 어류분; 및/또는 0-20% 유장을 함유한다. 동물 식품은 예컨대, 으깬 사료 (비 펠렛화) 또는 펠렛화 사료로 제조될 수 있다. 일반적으로, 압착된 사료-성분은 혼합되고 대상 종의 특이성에 따라 충분한 양의 필수 비타민과 미네랄을 첨가한다. 효소는 고체 또는 액체 효소 제형으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 고체 효소 제형은 일반적으로 혼합 단계의 전 또는 과정에 첨가되며; 액체 효소 제품은 일반적으로 펠렛화 단계 후에 첨가된다. 상기 효소는 사료 첨가제 또는 사전 혼합물 내에 포함될 수도 있다.

식품 내의 최종 효소 농도는 0.01-200 mg효소단백질/kg식품의 범위에 있으며, 예를 들어 5-30 mg효소단백질/kg동물 식품의 범위 내에 있다.

상기 항균 폴리펩타이드는 하나 이상의 다음의 양(복용량 범위)로 투여될 수 있다: 0.01-200; 또는 0.01-100; 또는 0.05-100; 또는 0.05-50; 또는 0.10-10 - 모든 이러한 범위는 mg항균폴리펩타이드단백질/kg사료(ppm)이다.

mg항균폴리펩타이드단백질/kg사료를 측정하기 위하여, 상기 항균 폴리펩타이드를 사료 조성물로부터 분리정제하였으며, 분리정제된 항균 폴리펩타이드의 특이적 활성을 적절한 측정법을 사용하여 측정하였다(항균 활성 하에서, 기질, 및 측정법을 참조). 이러한 사료 조성물의 항균 활성은 동일한 측정법을 사용하여 측정하였으며, 이러한 두 측정치를 기초로, mg항균폴리펩타이드단백질/kg사료의 복용량이 계산되었다

동일한 원칙이 사료 첨가제 내의 mg항균폴리펩타이드단백질을 측정시에도 적용된다. 물론, 시료가 사료 첨가제 또는 사료 제조에 사용된 항균 폴리펩타이드를 사용가능한 경우, 특이적 활성을 이 시료로부터 측정한다(사료 조성물 또는 첨가제의 상기 항균 폴리펩타이드를 분리정제할 필요가 없다).

신호 펩타이드 및 펩타이드전구체

본 발명은 아미노산 -165 to -142 of SEQ ID NO:2의 아미노산 -165 내지 -142로 구성된 신호 펩타이드를 암호화한 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1 내지 72로 구성된 제1 뉴클레오타이드 서열 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 -141 내지 -1로 구성된 펩타이드전구체를 암호화한 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 73 내지 495로 구성된 제2 뉴클레오타이드 서열 중의 하나 또는 둘 다와 작동가능하게 결합된 단백질을 암호화한 유전자를 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이며, 여기서, 상기 유전자는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열에 대하여 외래의 것이다.

본 발명은 이러한 핵산 구조물을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 (a) 단백질 생산에 적합한 조건 하에서 이러한 재조합 숙주 세포를 배양; 및 (b) 상기 단백질을 회수하는 것을 포함하는 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 다른 조절 서열과 함께 또는 다른 조절 서열과 조합하여 외래 유전자에 개별적으로 작동가능하게 결합될 수 있다. 이러한 다른 조절 서열은 전술하였다. 전술한 바와 같이, 신호 펩타이드 및 펩타이드전구체 영역 둘 모두가 단백질의 아미노 말단에 존재하는 경우, 상기 펩타이드전구체 영역은 단백질의 아미노 말단의 옆에 위치하게 되고, 상기 신호 펩타이드 영역은 펩타이드전구체 영역의 아미노 말단의 옆에 위치하게 된다.

상기 단백질은 숙주 세포와 동종이거나 이종일 수 있다. "단백질"이라는 용어는 본 명세서에서 암호화된 산물의 특정 길이를 나타내는 것은 아니며, 따라서, 펩타이드, 올리고펩타이드, 및 단백질을 포괄한다. "단백질"이라는 용어는 암호화된 산물을 형성하기 위하여 결합된 이 이상의 폴리펩타이드를 포괄한다. 상기 단백질은 또한 적어도 두 종의 다른 단백질로부터 획득한 폴리펩타이드 서열의 전체 또는 일부의 조합을 포함하는 혼성 폴리펩타이드를 포함한다. 여기서, 하나 이상은 숙주 세포와 동종이거나 이종일 수 있다. 단백질은 상기 언급한 단백질 및 혼성 단백질의 자연 발생적 대립 및 유전자 조작 돌연변이를 추가로 포함한다.

바람직하게는, 상기 단백질은 호르몬 또는 이들의 변이체, 효소, 수용체 또는 이들의 일부, 항체 또는 이들의 일부, 또는 정보제공체이다. 더 양호한 실시 상태에서, 상기 단백질은 옥시도환원효소, 트랜스퍼라아제, 하이드로라아제, 라이아제, 아이소머라아제, 또는 리가아제이다. 보다 더 양호한 실시 상태에서, 상기 단백질은 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키타나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라아제, 디옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, 알파-갈락토시다아제, 베타-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 알파-글루코시다아제, 베타- 글루코시다아제, 인버타아제, 락카아제, 라파아제, 만노시다아제, 뮤타나아제, 옥시다아제, 펙틴분해 효소, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질분해 효소, 리보뉴클라아제, 트랜스글루타미나아제 또는 자일라나아제이다.

상기 유전자는 원핵생물, 진핵생물, 또는 다른 모든 공급원으로부터 획득할 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예에 의하여 추가로 설명되나 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하여서는 아니된다.

완충제 및 기질로 사용된 화학물질은 적어도 시약 등급의 상업용 제품이다. 다음의 실시예에서, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21로 나타낸 상기 항균 폴리펩타이드는 "아레니신"으로 나타낸다.

실시예 1

아레니신의 항균 활성

SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21로 나타낸 항균 펩타이드를 합성 제조하였다. 최소 억제 농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)를 CLSI(임상 및 실험 표준 협회; 과거 국립 임상 및 실험 표준 위원회로 알려짐)의 프로토콜 M7-A6, vol. 20, No. 2: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically의 NCCLS 지침에 따라 아레니신의 항균 활성을 시험하여 측정하였다

본 발명의 항균 펩타이드는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에서 확보한 12 종의 박테리아 균주에 대하여 시험하였다. 표 1의 결과는 두 번의 독립된 평가의 평균값이다.

아레니신의 항균 활성

균주	수탁번호	MIC
에셔리시아 콜리	ATCC25922	0.25㎍/㎖
에셔리시아 콜리	ATCC25404	0.5㎍/㎖
엔테로박터 아에로게네스	ATCC13048	1㎍/㎖
엔테로박터 클로아카에	ATCC13047	1㎍/㎖
시겔라 손네이	ATCC11060	0.5㎍/㎖
시트로박터 프레운디	ATCC8090	1㎍/㎖
슈도모나스 아에루기노사	ATCC27853	0.5㎍/㎖
슈도모나스 아에루기노사	ATCC9027	1㎍/㎖
스테노트로포모나스 말토필라	ATCC13637	1㎍/㎖
아에로모나스 살모니시다	ATCC14174	2㎍/㎖
아시네토박터 아오피	ATCC15309	0.25㎍/㎖
모라셀라 카타루알리스	ATCC25238	<0.06㎍/㎖

실시예 2

임상적 진균에 대한 최소 억제 농도

효모 및 진균에 대한 아레니신의 최소 억제 농도가 필수적 NCCLS/CLSI(임상 및 실험 표준 협회)에 기술된 바에 따라 필수적으로 측정되었다.

요약하자면, 진균 또는 효모 현탁액 약 1 맥팔랜드 단위를 1:100로 PD 배양액(8 g/L 감자 덱스트로스) 내에서 희석하였으며, 그 성장을 연속 2배 희석된 아레니신(0.03-32 ㎍/㎖)에 대하여 측정하였다. 측정 플레이트는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 트리코피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes) 및 에피더모피톤 플록코숨(Epidermophyton floccosum)을 위하여 25-27℃에서 배양하였으며 및 칸디다 갈브라타(Candida glabrata), 피치아 파스트로이스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 아스파라길루스 니게르(Aspergillus niger)를 위하여 30℃에서 배양하였다. 성장은 배양 약 40 시간 후에 눈으로 관찰(나안, 경사조명)되었다. 결과는 아래 표 2에 나타내었다

아레니신의 항균 활성

균주	수탁 번호	MIC
칸디다 알비칸스	ATCC10231	4㎍/㎖
칸디다 알비칸스	ATCC28517	8㎍/㎖
칸디다 알비칸스	ATCC18804	8㎍/㎖
칸디다 트로피칼리스	DSM11953	2㎍/㎖
칸디다 갈브라타	DSM11226	16㎍/㎖
크립토코커스 네오포만스	DSM11959	1㎍/㎖
피치아 파스트로이스	ATCC201178	4㎍/㎖
피치아 파스트로이스	ATCC20864	2㎍/㎖
사카로마이세스 세레비시아	DSM1333	8㎍/㎖
아스파라길루스 니게르	ATCC9642	8㎍/㎖
트리코피톤 멘타그로피테스	DSM4870	8㎍/㎖

SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S <120> Polypeptides having antimicrobial activity <130> 10865.204-WO <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> Arenicola marina <220> <221> CDS <222> (1)..(558) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(72) <220> <221> mat_peptide <222> (496)..(558) <400> 1 atg gga tat tca atg aac atc gcc ctg gtt tac gcc acg gta ctt 45 Met Gly Tyr Ser Met Asn Ile Ala Leu Val Tyr Ala Thr Val Leu -165 -160 -155 att ggt gta ctg cat gtc ggc ggc ata cac tgt aac aac cag ata 90 Ile Gly Val Leu His Val Gly Gly Ile His Cys Asn Asn Gln Ile -150 -145 -140 cag gag ttt gat ttg gcg ggc gat aag ttt gtg ata gac gcc gag 135 Gln Glu Phe Asp Leu Ala Gly Asp Lys Phe Val Ile Asp Ala Glu -135 -130 -125 aac aac agg gaa gtc atc caa ctc tcg gac gga gat ctc gaa gga 180 Asn Asn Arg Glu Val Ile Gln Leu Ser Asp Gly Asp Leu Glu Gly -120 -115 -110 tct atc atg gtc atc gac cac gcc aag agt ctg att ggc tgg ttc att 228 Ser Ile Met Val Ile Asp His Ala Lys Ser Leu Ile Gly Trp Phe Ile -105 -100 -95 -90 ccg aac act gat gag tgt tac ctg att ggc ggg gtg gac agg aag ttg 276 Pro Asn Thr Asp Glu Cys Tyr Leu Ile Gly Gly Val Asp Arg Lys Leu -85 -80 -75 ctg gac tcc agg gag ctt ttg gca caa ttt caa gcc gga cag ttt aag 324 Leu Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Gln Phe Gln Ala Gly Gln Phe Lys -70 -65 -60 gaa act gcg gac gag gac gtg gag gac tcg ctg acc tac gtc aag gtc 372 Glu Thr Ala Asp Glu Asp Val Glu Asp Ser Leu Thr Tyr Val Lys Val -55 -50 -45 gac gac cgt gag gtc agt gac ctg agt ctg ttg cca aac gag ctt ctg 420 Asp Asp Arg Glu Val Ser Asp Leu Ser Leu Leu Pro Asn Glu Leu Leu -40 -35 -30 gag ccc tgc tcg gga aag gac gtc ttc tgg ctg gag agg aac aac atc 468 Glu Pro Cys Ser Gly Lys Asp Val Phe Trp Leu Glu Arg Asn Asn Ile -25 -20 -15 -10 cag aga acg ggc aat cgg cag aag aga ggt ttc tgc tgg tac gtc tgc 516 Gln Arg Thr Gly Asn Arg Gln Lys Arg Gly Phe Cys Trp Tyr Val Cys -5 -1 1 5 gtc tac agg aac gga gtc cgc gtc tgc tac cga cgg tgc aac 558 Val Tyr Arg Asn Gly Val Arg Val Cys Tyr Arg Arg Cys Asn 10 15 20 <210> 2 <211> 186 <212> PRT <213> Arenicola marina <400> 2 Met Gly Tyr Ser Met Asn Ile Ala Leu Val Tyr Ala Thr Val Leu -165 -160 -155 Ile Gly Val Leu His Val Gly Gly Ile His Cys Asn Asn Gln Ile -150 -145 -140 Gln Glu Phe Asp Leu Ala Gly Asp Lys Phe Val Ile Asp Ala Glu -135 -130 -125 Asn Asn Arg Glu Val Ile Gln Leu Ser Asp Gly Asp Leu Glu Gly -120 -115 -110 Ser Ile Met Val Ile Asp His Ala Lys Ser Leu Ile Gly Trp Phe Ile -105 -100 -95 -90 Pro Asn Thr Asp Glu Cys Tyr Leu Ile Gly Gly Val Asp Arg Lys Leu -85 -80 -75 Leu Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Gln Phe Gln Ala Gly Gln Phe Lys -70 -65 -60 Glu Thr Ala Asp Glu Asp Val Glu Asp Ser Leu Thr Tyr Val Lys Val -55 -50 -45 Asp Asp Arg Glu Val Ser Asp Leu Ser Leu Leu Pro Asn Glu Leu Leu -40 -35 -30 Glu Pro Cys Ser Gly Lys Asp Val Phe Trp Leu Glu Arg Asn Asn Ile -25 -20 -15 -10 Gln Arg Thr Gly Asn Arg Gln Lys Arg Gly Phe Cys Trp Tyr Val Cys -5 -1 1 5 Val Tyr Arg Asn Gly Val Arg Val Cys Tyr Arg Arg Cys Asn 10 15 20

Claims (27)

1. SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 21로 이루어지고 항균 활성을 지닌 폴리펩타이드.
2. 삭제
3. 제 1 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 분리된 폴리뉴클레오타이드.
4. 발현 숙주 내에서 폴리펩타이드의 생산을 조절하는 하나 이상의 조절 서열과 작동가능하게 결합된 제 3 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물.
5. 제 4 항의 핵산 구조물을 포함하는 재조합 발현 벡터.
6. 제 4 항의 핵산 구조물을 포함하는 재조합 숙주 세포.
7. (a) 제 1 항의 폴리펩타이드; 및

   (b) 약학적으로 허용되는 담체

   를 포함하는, 미생물 감염 치료용 조성물.
8. (a) 폴리펩타이드의 생산에 유리한 조건 하에서, 야생형 상태로 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 세포를 배양하거나, 또는 폴리펩타이드를 암호화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

   (b) 폴리펩타이드를 회수하는 단계

   를 포함하는 제 1 항의 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
9. 시험관 내(in vitro)에서 미생물 세포를 제 1 항의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 미생물 세포를 사멸 또는 성장 억제하는 방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
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