CN102643337A - 具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸，具体地涉及具有抗微生物活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用多肽的方法。

Description

具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

本申请是申请日为2006年08月22日，申请号为200680030707.0(国际申请号为PCT/EP2006/065561)，名称为“具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸”的发明专利申请的分案申请。

序列表

本发明包含序列表。

发明领域

本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。

发明背景

本发明的目的是提供具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

发明简述

本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21有至少60％同一性的氨基酸序列；

(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在至少中严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；

(c)变体，其包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ IDNO：2的氨基酸1至21；和

(d)具有微生物活性的(a)或(b)的片段。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码具有抗微生物活性的多肽，所述分离的多核苷酸选自下组：

(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21有至少60％同一性的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO：1的核苷酸496至558有至少60％同一性的多核苷酸；和

(c)多核苷酸，其在至少中严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于产生这些具有抗微生物活性的多肽的方法，其包括(a)将包含核酸构建体的重组宿主细胞在有益于产生该多肽的条件下培养，所述核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及使用本发明所述多肽和多核苷酸的方法。

本发明还涉及如下方面：

1.具有抗微生物活性的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21有至少60％同一性的氨基酸序列；

(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中严紧条件下与(i)SEQID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；

(c)变体，其包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ IDNO：2的氨基酸1至21；和

(d)(a)或(b)的片段，其具有抗微生物活性。

2.项1的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21有至少65％同一性，优选至少70％同一性，更优选至少75％同一性，甚至更优选至少80％同一性，甚至更优选至少85％同一性，最优选至少90％同一性，或至少95％同一性。

3.项1的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

4.项1的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：2或其具有抗微生物活性的片段组成。

5.项4的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：2组成。

6.项4的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21组成。

7.项1的多肽，所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中-高严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交。

8.项1的多肽，所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交。

9.项1的多肽，其中所述多肽是变体，其包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2的氨基酸1至21。

10.分离的多核苷酸，其包含编码项1-9任一项的多肽的核苷酸序列。

11.项10的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变的核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21组成的多肽。

12.核酸构建体，其包含项10的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个在表达宿主中指导所述多肽产生的调控序列可操作地连接。

13.重组表达载体，其包含项12的核酸构建体。

14.重组宿主细胞，其包含项12的核酸构建体。

15.用于产生项1-10任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；或在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

16.分离的多核苷酸，其通过如下获得：(a)在中-高严紧条件下，将DNA群体与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和(b)分离杂交的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有抗微生物活性的多肽。

17.根据项16的分离的多核苷酸，其通过如下获得：(a)在高严紧条件下，将DNA群体与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和(b)分离杂交的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有抗微生物活性的多肽。

18.用于产生具有突变核苷酸序列的多核苷酸的方法，其包括(a)将至少一种突变引入SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，其中所述突变的核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21组成的多肽；和(b)回收包含所述突变核苷酸序列的多核苷酸。

19.由项18的方法产生的突变的多核苷酸。

20.用于产生多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下，培养包含编码所述多肽的项19的突变多核苷酸的细胞；和(b)回收所述多肽。

21.用于产生项1-10任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下，培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明的具有抗微生物活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

22.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用编码项1-10任一项的多肽的多核苷酸转化。

23.组合物，其包含如项1-10任一项所限定的抗微生物多肽和可药用媒介物。

24.用于杀死或抑制微生物细胞生长的方法，其包括将所述微生物细胞与项1-10任一项所限定的抗微生物多肽接触。

25.项1-10任一项所限定的抗微生物多肽，其用作药物，或抗微生物的兽用或人用治疗剂或预防剂。

26.项1-10任一项所限定的抗微生物多肽在制备兽用或人用治疗剂中的用途，所述治疗剂用于治疗微生物感染或用于预防用途。

27.项1-10任一项所限定的至少一种抗微生物多肽在动物饲料中的用途。

定义

抗微生物活性：术语“抗微生物活性”在本文中定义为能够杀死或抑制微生物细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语“抗微生物”的意思指存在杀细菌的(bactericidal)和/或抑细菌的(bacteriostatic)和/或杀真菌的(fungicidal)和/或抑真菌的(fungistatic)作用和/或杀病毒的作用，其中应将术语“杀细菌的”理解为能够杀死细菌细胞。应将术语“抑细菌的”理解为能够抑制细菌生长，即，抑制生长的细菌细胞。应将术语“杀真菌的”理解为能够杀死真菌细胞。应将术语“抑真菌的”理解为能够抑制真菌生长，即，抑制生长的真菌细胞。应将术语“杀病毒的”理解为能够使病毒失活。术语“微生物细胞”代表细菌或真菌细胞(包括酵母)。

在本发明的上下文中，术语“抑制微生物细胞的生长”的意思指细胞处于非生长的状态，即，它们不能增殖。

就本发明而言，可根据Lehrer et al.，Journal of Immunological Methods，Vol.137(2)pp.167-174(1991)所描述的方法测定抗微生物活性。或者，抗微生物活性可根据CLSI(临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)；先前称为国家临床和实验室标准委员会(National committee forClinical and Laboratory Standards))的NCCLS准则测定。

在具有抗微生物活性的多肽的25％(重量/重量)水溶液中，优选在10％(重量/重量)的水溶液中，更优选在5％(重量/重量)的水溶液中，甚至更优选在1％(重量/重量)的水溶液中，最优选在0.5％(重量/重量)的水溶液中，并且特别是在0.1％(重量/重量)的水溶液中，于20℃温育24小时之后(优选12小时之后，更优选8小时之后，更优选4小时之后，更优选2小时之后，最优选1小时之后，并且特别是30分钟之后)，具有抗微生物活性的多肽可能能够将大肠杆菌(DSM 1576)的活细胞数减少至1/100。

当以1000ppm的浓度添加时，优选当以500ppm的浓度添加时，更优选当以250ppm的浓度添加时，甚至更优选当以100ppm的浓度添加时，最优选当以50ppm的浓度添加时，并且特别是当以25ppm的浓度添加时，具有抗微生物活性的多肽可能还能够于25℃在微生物的生长底物(growth substrate)中将大肠杆菌(DSM 1576)的生长晕(outgrowth)抑制24小时。

在具有抗微生物活性的多肽的25％(重量/重量)水溶液中，优选在10％(重量/重量)的水溶液中，更优选在5％(重量/重量)的水溶液中，甚至更优选在1％(重量/重量)的水溶液中，最优选在0.5％(重量/重量)的水溶液中，并且特别是在0.1％(重量/重量)的水溶液中，于20℃温育24小时之后(优选12小时之后，更优选8小时之后，更优选4小时之后，更优选2小时之后，最优选1小时之后，并且特别是30分钟之后)，具有抗微生物活性的多肽可能能够将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC 6633)的活细胞数减少至1/100。

当以1000ppm的浓度添加时，优选当以500ppm的浓度添加时，更优选当以250ppm的浓度添加时，甚至更优选当以100ppm的浓度添加时，最优选当以50ppm的浓度添加时，并且特别是当以25ppm的浓度添加时，具有抗微生物活性的多肽可能还能够于25℃在微生物的生长底物中将枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的生长晕抑制24小时。

本发明的多肽具有至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％的由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21所示氨基酸序列组成的多肽的抗微生物活性。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指，如通过SDS-PAGE测定的，其为至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，并且甚至最优选至少95％纯的多肽。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计是至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。

本发明的多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多肽制备物基本上不含与其天然结合的其它多肽材料。这能够通过以下方法实现，例如，通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。

在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度通过使用包括在FASTA程序包版本2.0x中的程序FASTA(参见W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS85：2444-2448；和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA″，Methods in Enzymology 183：63-98)来测定。使用的计分矩阵是BLOSUM50，缺口罚分(gap penalty)是-12，并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是-2。

两个核苷酸序列之间的同一性程度使用与上述相同的算法和软件包来测定。使用的计分矩阵是同一性矩阵，缺口罚分是-16，并且缺口延伸罚分是-4。

可供选择的是，两个氨基酸序列的比对通过使用EMBOSS软件包(http://emboss.org)版本2.8.0的Needle程序来测定。Needle程序执行总体比对算法(global alignment algorithm)，所述算法描述于Needleman，S.B.andWunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中。使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开启罚分(gap opening penalty)是10，并且缺口延伸罚分是0.5。本发明的氨基酸序列(如SEQ ID NO：2的氨基酸1至43)和不同的氨基酸序列之间的同一性程度，是以两个序列的比对中精确匹配的数目，除以“本发明序列”的长度(氨基酸残基数)来计算；或者使用Needle标记为“最长同一性”的输出作为百分比同一性，如下计算：(同一残基x100)/(比对的长度-比对中缺口数)。结果以百分比同一性表示。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO：2的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽或其同源序列，其中所述片段具有抗微生物活性。在实施方式中，所述片段包括至少15，优选至少16，更优选至少17，甚至更优选至少18，最优选至少19并且特别是至少20个连续的SEQ ID NO：2的氨基酸。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1的5’和/或3’端缺失一个或多个核苷酸的核苷酸序列或其同源序列，其中所述亚序列编码具有抗微生物活性的多肽片段。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指无其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质产生体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选在本文公开的多核苷酸是“基本上纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然结合的其它多核苷酸材料。在本文中，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。所述多核苷酸可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成的来源，或它们的任何组合。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。源自mRNA的cDNA因而没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的片段。当所述核酸构建体含有本发明的编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各种调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的合适位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是对由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码这种多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸以及取代一个或多个氨基酸侧链；或在氨基酸序列中使用具有相似特性的非天然氨基酸。具体而言所述修饰可以是酰胺化，例如C末端的酰胺化。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有抗微生物活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1的修饰的核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)通过修饰公开于SEQ ID NO：1的核苷酸序列来获得。

发明详述

具有抗微生物活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21(即，成熟多肽)有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少97％的同一性程度的氨基酸序列(下文中的“同源多肽”)。在优选的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21相差10个氨基酸，优选5个氨基酸，更优选4个氨基酸，甚至更优选3个氨基酸，最优选2个氨基酸，并且甚至最优选1个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有抗微生物活性的片段。在优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至21，或其等位变体；或它们的具有抗微生物活性的片段。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至21。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有抗微生物活性的片段组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21或其等位变体；或它们的具有抗微生物活性的片段组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21组成。

在第二个方面，本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件下，更优选中严紧条件下，更优选中-高严紧条件下，甚至更优选高严紧条件下，并且最优选非常高严紧条件下与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可以编码具有抗微生物活性的多肽片段。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可以用以设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有抗微生物活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针可以是至少200个核苷酸，优选至少270个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有抗微生物活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它适合的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与对应于SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列的标记的核酸探针、它的互补链或它们的亚序列杂交。可使用X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与所述核酸探针杂交的分子。

在优选的方面，核酸探针是多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码SEQID NO：2的多肽或其亚序列。在另外的优选方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另外的优选方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中预杂交和杂交，并且对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行最佳12至24小时处理。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)得出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9MNaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)、1mM磷酸二氢钠(sodium monobasicphosphate)、0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算的T_m低5℃至10℃的温度下洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2或其成熟多肽。优选氨基酸改变对性质是不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约10个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，例如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，抗微生物活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton et al.，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见，例如，de Vos et al.，1992，Science 255：306-312；Smith et al.，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的同一性也能够从与多肽的同一性分析推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson and Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowieand Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来进行和测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman et al.，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire et al.，1986，Gene 46：145；Ner et al.，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单独氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2的氨基酸1至21的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选至多5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

在实施方式中，本发明的多肽包括至少4个半胱氨酸残基，优选所述多肽精确地包括4个半胱氨酸残基。在另外的实施方式中，所述多肽是环式多肽(cyclic polypeptides)。

N-末端延伸

本发明所述多肽的N-末端延伸可以适合地由1-50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，特别是3-15个氨基酸组成。在一个实施方式中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另外的实施方式中，N-末端延伸包含将在下文进一步定义的kex2或kex2-样切割位点。在优选的实施方式中，N-末端延伸是肽，其包含至少两个Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸残基，例如包含以下序列之一的N-末端延伸：EAE，EE，DE和DD。

Kex2位点

Kex2位点(参见，例如，Methods in Enzymology Vol 185，ed.D.Goeddel，Academic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，“Gene Expression Technology”)和kex2-样位点是存在于某些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间的二元(di-basic)识别位点(即，切割位点)。

在某些情况下kex2位点或kex2-样位点的插入显示改进了在前肽切割位点处正确的内肽酶加工，致使增加的蛋白质分泌水平。

在本发明的上下文中，kex2位点或kex2-样位点的插入导致在N-末端延伸的特定位置获得切割的可能性，所述切割导致与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21所示的成熟多肽相比得到延伸的抗微生物多肽。

融合多肽

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合在本发明所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。通过将编码另外多肽的核苷酸序列(或其部分)融合至本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

具有抗微生物活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在优选的方面，获得自给定来源的所述多肽是胞外分泌的。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽；或链霉菌属(Streptomyces)多肽，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，例如，大肠杆菌或假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)多肽。

本发明的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽例如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选丝状真菌多肽例如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermnoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)多肽。

在优选的方面，所述多肽是具有抗微生物活性的卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另外的优选方面，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在另外的优选方面，所述多肽是沙躅(Arenicola marina)多肽，例如，SEQID NO：2的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)两种，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，无论它们已知的属名。本领域熟练技术人员将轻易地识别适合的等同物的同一性。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够轻易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammiung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选其它微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见上文)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸具有编码本发明多肽的核苷酸序列。在优选的方面，所述核苷酸序列示于SEQ ID NO：1。在另外的优选方面，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。本发明还包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2或其成熟多肽的氨基酸序列，由于遗传密码的简并性所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，其编码SEQ ID NO：2的具有抗微生物活性的片段。

本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码由SEQ IDNO：2的氨基酸1至21组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis et al.，1990，PCR：A Guide to Methods andApplication，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从沙躅属的株，或从其它或相关的生物体克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及具有下述核苷酸序列的编码活性多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列(即，核苷酸496至558)具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且最优选至少97％同一性的同一性程度。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQID NO：1的多肽编码区存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford et al.，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunninghamand Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定。在后一的技术中，将突变引入到分子中的每个正电残基处，并且测试所得突变分子的抗微生物活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos et al.，1992，Science 255：306-312；Smith et al.，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBSLetters 309：59-64)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在低严紧条件下，更优选中严紧条件，更优选中-高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下序列杂交：(i)SEQ IDNO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook et al.，1989，见上文)，如本文所定义的。

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下方法获得：(a)在低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸496至558，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有抗微生物活性的多肽。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截断的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteinsfrom recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook et al.，1989，见上文中有所描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截断的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos et al.，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos et al.，1992，见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相联的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列是异源的信号肽编码区。异源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可能是必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen and Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶和疏棉状腐质霉脂肪酶。

在优选的方面，信号肽编码区是SEQ ID NO：1的核苷酸1至72，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸-165至-142。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos et al.，1992，见上文，描述。

调控序列还可以是前肽(propeptide)编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化成成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。

在优选的方面，前肽编码区是SEQ ID NO：1的核苷酸73至495，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸-141至-1。

当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(next to)多肽的氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。上述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在合适的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在产生表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems et al.，1991，Gene 98：61-67；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或包括可与多核苷酸一起扩增的选择性标记基因，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝的细胞，并且由此来选择含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，将其有利地用于多肽的重组产生中。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞中，从而将该载体保留作为染色体整合体(chromosomal integrant)或作为前述的自复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同。宿主细胞的选择将很大程度依赖于编码多肽的基因和它的来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或非单细胞微生物，例如，真核生物。

有用的单细胞微生物是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于，芽孢杆菌属细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，例如，浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌属菌种。在优选的方面，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另外优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌属。

可通过如下方法实现将载体引入到细菌宿主细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology81：823-829或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler and Thorne，1987，Journalof Bacteriology 169：5771-5278)。

宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth et al.，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworthet al.，1995，见上)。

在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在更加优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另外更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth et al.，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另外的最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另外最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、或Ceriporiopsis subvermispora、灰盖鬼伞(Coprmuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、土生梭孢霉、Trametes villosa、Trametes versicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉菌株细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier et al.，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker and Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen et al.，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是沙躅属(Arenicola)细胞，并且更优选沙躅。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQID NO：1的成熟多肽编码区中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21组成的多肽，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，能够从所述培养基中直接回收该多肽。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用。例如，抗微生物活性试验(antimicrobialactivity assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，将其用编码本发明的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列转化，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyma)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组，并且繁殖所得的修饰植物或植物细胞成为转基因植物或植物细胞。

表达载体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所必需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague et al.，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck et al.，1980，Cell 21：285-294，Christensen et al.，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang et al.，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito et al.，1994，PlantMol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu et al.，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad et al.，1998，Journalof Plant Physiology 152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen et al.，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka et al.，1993，PlantPhysiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra and Higgins，1994，PlantMolecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya et al.，1995，Molecular and general genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu et al.，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源应用的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)、赤霉酸(gibberellic acid)和/或重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明的多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，将其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu et al.，1993，见上文，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

根据本领域已知的常规技术将核酸构建体并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser et al.，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto et al.，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas andSchilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil et al.，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法，是基于原生质体转化，如由Omirulleh et al.，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用以两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，其包含编码本发明具有抗微生物活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物，例如药用组合物(pharmaceutical composition)。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示使所述组合物的抗微生物活性增加，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以进一步包含其它药用活性剂，例如另外的杀生物剂或抑生物剂(biocidal or biostatic agent)，例如显示如上所定义的抗微生物活性的另外的抗微生物多肽。杀生物剂可以是抗生素，如本领域已知的。抗生素的种类包括青霉素，例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨苄青霉素(ampicillin)等；青霉素组合β-内酰胺酶抑制剂，头孢菌素，例如头孢克洛(cefaclor)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢羟羧氧酰胺(moxalactam)等；碳青霉烯类(carbapenems)；单环内酰胺类(monobactams)；氨基糖苷类(aminoglycosides)；四环素类(tetracyclines)；大环内酯类(macrolides)；林可霉素类(lincomycins)；多粘菌素类(polymyxins)；磺胺类(sulfonamides)；喹诺酮类(quinolones)；氯霉素(cloramphenical)；甲硝唑(metronidazole)；大观霉素(spectinomycin)；甲氧苄啶(trimethoprim)；万古霉素(vancomycin)等。所述杀生物剂也可以是抗真菌剂(anti-mycotic agent)，包括多烯类，例如两性霉素B(amphotericin B)，制霉菌素(nystatin)；5-氟可新(5-flucosyn)；和唑系(azoles)，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)和氟康唑(fluconazol)。

在实施方式中，杀生物剂是非酶促化学剂。在另外的实施方式中，杀生物剂是非多肽化学剂。

组合物可包含合适的载体材料。组合物还可包含合适的递送媒介物(delivery vehicle)，当将所述组合物用作药物时，该递送媒介物能够将本发明的抗微生物多肽递送至期望的位置。

所述多肽组合物可以根据本领域已知方法制备，可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒状(granulate)或微颗粒状(microgranulate)的形式。可将待包括于组合物中的多肽用本领域已知的方法来稳定。

在下面给出本发明多肽组合物的优选用途的实施例。本发明多肽组合物的剂量和使用所述组合物的其它条件可基于本领域已知的方法来决定。

方法和用途

本发明还涉及使用具有抗微生物活性的多肽的方法。所述抗微生物多肽在遭受细菌、真菌、酵母或藻类污染的任何位置通常都是有用的。通常而言，所述位置在含水系统中，所述含水系统例如冷却水系统、洗衣漂洗水(laundryrinse water)；油系统，例如切削油、润滑剂、油田等，其中需要将微生物杀死或必需控制它们的生长。然而，本发明也可用在已知抗微生物组合物对其是有用的所有应用中，例如保护木材、胶乳(latex)、粘合剂、胶、纸、纸板(cardboard)、纺织品、皮革、塑料、填缝材料(caulking)和饲料。

其它用途包括保存食品，饮料，化妆品例如乳液(lotion)、乳膏(cream)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、皂(soap)、香波(shampoo)、调节剂(conditioner)、止汗剂(antiperspirant)、除臭剂(deodorant)、漱口剂(mouth wash)、隐形眼镜产品，酶配制物(enzyme formulation)或食品成分。

因此，本发明的抗微生物多肽可以作为消毒剂使用，例如，用在处理眼或口的感染、皮肤感染中；在止汗剂或除臭剂中；用于清洁和消毒隐形眼镜和牙齿(口腔护理)。

一般而言，预期将本发明的抗微生物多肽用于清洁、消毒或抑制任何表面上的微生物生长。可有利地与发明的抗微生物多肽接触的表面的实例是处理设备的表面，所述处理设备用于例如乳制品厂、化学或制药加工厂、水卫生系统(water sanitation system)、炼油厂(oil processing plant)、纸浆加工厂(paperpulp processing plant)、水处理厂和冷却塔。本发明的抗微生物多肽应该以有效清洁、消毒或抑制所述表面上微生物生长的量来使用。

本发明的抗微生物多肽另外还可用于食品加工厂和任何制备或供应食品的区域例如医院、疗养院和餐馆的清洁表面和烹饪用具。

本发明的抗微生物多肽也可在基于水的涂料(paint)中用作保存剂或消毒剂。

本发明还涉及本发明的抗微生物多肽或组合物作为药物的用途。另外，本发明的抗微生物多肽或组合物也可用于制造控制或抗击微生物的药物，所述微生物例如真菌生物体或细菌，优选革兰氏阳性细菌。

本发明的组合物和抗微生物多肽也可用作抗微生物的兽用的(veterinarian)或人用治疗剂或预防剂。因此，本发明的组合物和抗微生物多肽可以用在处理微生物感染的兽用或人用治疗剂或预防剂的制备中，所述微生物感染例如细菌或真菌感染，优选革兰氏阳性细菌感染。具体而言所述微生物感染可与肺病和性传播疾病有关，所述肺病包括但不限于结核，肺炎和囊性纤维化病(cystic fibrosis)；所述性传播疾病包括但不限于淋病和衣原体。

本发明的组合物包含有效量的本发明的抗微生物多肽。

术语“有效量”在用于本文中时，意思指本发明的抗微生物多肽的量足够抑制所述微生物的生长。

本发明还涉及创伤愈合组合物(wound healing composition)或产品例如绷带、医学设备例如导管，并且进一步涉及抗头皮屑的头发产品，例如香波。

将本发明的抗微生物多肽的配制物施用于正遭受微生物感染或对微生物感染易感的宿主。施用依赖于特定的微生物可以是局部的(topical)、定位的(localized)或全身的，优选所述施用应该是局部化的(localized)。通常，本发明的抗微生物多肽的剂量将是足以通过杀死至少大约50％，通常至少1对数(1log)，并且可以是2或更多对数来将微生物群体减少。将本发明的化合物按减少微生物群体同时最小化任何副作用的剂量施用。预期所述组合物将在医师的指导下获得并且使用于体内用途。将本发明的抗微生物多肽具体地用于杀死革兰氏阴性细菌，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)；和革兰氏阳性细菌，包括链球菌(streptococci)例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)，乳房链球菌(S.uberis)，S.hyointestinalis，酿脓链球菌(S.pyogenes)和S.agalactiae；和葡萄球菌(staphylococci)例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)，模仿葡萄球菌(S.simulans)，木糖葡萄球菌(S.xylosus)和肉葡萄球菌(S.carnosus)。

可将本发明的抗微生物多肽的配制物施用于正遭受或易感于微生物的肺感染例如肺炎的宿主；或施用于正遭受或易感于微生物创伤感染例如细菌创伤感染的宿主。

还可将本发明的抗微生物多肽的配制物施用于正遭受或易感于皮肤感染的宿主，所述皮肤感染例如痤疮、遗传过敏性皮炎或脂溢性皮炎；优选所述皮肤感染是细菌皮肤感染，例如由表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、卵形糠枇孢子菌(Pityrosporum ovale)或糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)引起的细菌皮肤感染。

本发明的抗微生物多肽还用于杀死微生物的体外配制物，具体而言用在不希望引入大量常规抗生素的情况。例如，可将本发明的抗微生物多肽添加至动物和/或人的食品制备物中；或可将它们包括作为细胞体外培养的添加剂，以防止组织培养中微生物的过度生长。

具体微生物对用本发明的抗微生物多肽致死的易感性可通过体外测试来测定，详见实验部分。通常将微生物的培养物与不同浓度的抗微生物多肽组合一段足以使所述蛋白质作用的时间，通常在大约一小时和一天之间。随后将活微生物计数，并且测定致死水平。

感兴趣的微生物包括但不限于，革兰氏阴性细菌，例如：柠檬酸杆菌属菌种(Citrobacter sp.)；肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)；埃希氏菌属菌种(Escherichia sp.)，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella sp.)；摩根氏菌属菌种(Morganella sp.)；变形菌属菌种(Proteus sp.)；普罗威登斯菌属菌种(Providencia sp.)；沙门氏菌属菌种(Salmonella sp.)，例如伤寒沙门氏菌(S.typhi)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属菌种(Serratia sp.)；志贺氏菌属菌种(Shigella sp.)；假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)，例如铜绿假单胞菌；耶尔森氏菌属菌种(Yersinia sp.)，例如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)；弗朗西丝氏菌属菌种(Franciscella sp.)；巴斯德氏菌属菌种(Pasturella sp.)；弧菌属菌种(Vibrio sp.)，例如霍乱弧菌(V.cholerae)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)；弯曲杆菌属菌种(Campylobacter sp.)，例如空肠弯曲杆菌(C.jejuni)；嗜血菌属菌种(Haemophilus sp.)，例如流感嗜血菌(H.influenzae)、杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；博德特氏菌属菌种(Bordetella sp.)，例如百日咳博德特氏菌属(B.pertussis)、支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)；布鲁氏菌属菌种(Brucella sp.)；奈瑟氏球菌属菌种(Neisseria sp.)，例如淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)等。其它感兴趣的细菌包括军团菌属菌种(Legionella sp.)，例如侵肺军团菌(L.pneumophila)；利斯特氏菌属菌种(Listeriasp.)，例如单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；支原体属菌种(Mycoplasma sp.)，例如人型支原体(M.hominis)、肺炎支原体(M.pneumoniae)；分枝杆菌属菌种(Mycobacterium sp.)，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)；密螺旋体属菌种(Treponema sp.)，例如彻白密螺旋体(T.pallidum)；疏螺旋体属菌种(Borrelia sp.)，例如布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)；钩端螺旋体属(Leptospirae sp.)；立克次氏体属菌种(Rickettsiasp.)，例如立氏立克次氏体(R.rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)；衣原体属菌种(Chlamydia sp.)，例如沙眼衣原体、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；螺杆菌属菌种(Helicobacter sp.)，例如幽门螺杆菌(H.pylori)等。

感兴趣的非细菌病原体包括真菌和原生动物病原体，例如疟原虫属种(Plasmodia sp.)，例如恶性疟原虫(P.falciparum)；锥虫属种(Trypanosoma sp.)，例如布氏锥虫(T.brucei)；shistosomes；内阿米巴属种(Entaemoeba sp.)；隐球菌属菌种(Cryptococcus sp.)；念珠菌属菌种(Candida sp.)，例如白念珠菌(C.albicans)等。

可采用多种施用方法。可将所述多肽配制物口服给予，或血管内注射、皮下注射、腹膜注射、通过气溶胶注射、眼科(opthalmically)注射、膀胱内注射、局部(topically)注射等。例如，通过吸入的施用方法是本领域熟知的。所述治疗配制物的剂量将依赖于待施用的特定抗微生物多肽、疾病的性质、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除率(clearance)等而广泛地变化。最初的剂量可以较大，接着是较小的维持剂量(maintenance dose)。所述剂量可每周一次或两周一次不频繁地施用，或分成较小的剂量每日一次或每日几次、半周一次或半周几次地施用等，以维持有效剂量水平。在许多情况下，口服施用将比静脉内施用需要更高的剂量。为了口服施用时更高的稳定性，可将酰胺键以及氨基末端和羧基末端进行修饰。例如，可将羧基末端酰胺化。

剂型

可将本发明的化合物并入多种用于治疗施用的剂型。更具体地，可将本发明的化合物通过与合适的、可药用的载体或稀释剂组合配制成药用组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，例如片剂(tablet)、胶囊(capsule)、粉剂(powder)、颗粒剂(granule)、软膏(ointment)、乳膏(cream)、泡沫(foam)、溶液、栓剂(suppository)、注射剂(injection)、吸入剂(inhalant)、凝胶(gel)、微球体(microsphere)、洗剂(lotion)和气溶胶。同样地，可以多种方法完成所述化合物的施用，包括口服、颊、直肠、肠胃外、腹膜内、真皮内、透皮、气管内(intracheal)等施用。本发明的抗微生物多肽在施用之后可以是全身的，或通过使用植入物或发挥作用以在植入位点保持活性剂量的其它剂型，可将本发明的抗微生物多肽定位。

在一个实施方式中，局部使用(topical use)的剂型包含降低二价阳离子，尤其是钙和镁的有效浓度的螯合剂。例如，可包括试剂例如柠檬酸盐(citrate)、EGTA或EDTA，其中柠檬酸盐是优选的。柠檬酸盐的浓度将通常是大约1至10mM。

本发明的化合物可单独施用，彼此组合施用，或它们能够与其它已知的化合物(例如，穿孔蛋白(perforin)、抗炎剂、抗生素等)组合使用。在药物剂量形式中，所述化合物可以它们可药用的盐形式施用。以下方法和赋形剂仅作为示例性而绝非用以限制。

对于口服制备物，所述化合物能够单独使用或与合适的添加剂组合使用，以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊，例如，与常规添加剂组合使用，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂组合使用，例如结晶状纤维素(crystalline cellulose)、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩散剂(disintegrator)组合使用，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose)；与润滑剂组合使用，例如滑石或硬脂酸镁；并且如果需要的话，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合使用。

可通过将所述化合物溶解、悬浮或乳化在含水或非水的溶剂中而将所述化合物配制成用于注射的制备物，所述溶剂例如植物性或其它类似的油，合成的脂肪酸甘油酯，丙二醇或高级脂肪酸的酯类；并且如果需要的话，含有常规添加剂例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

可将所述化合物用于通过吸入施用的气溶胶剂型中。可将本发明的化合物调配在可增压推进剂(pressurized acceptable propellant)中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。

通过与常规添加剂例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起配制，可将所述化合物用作洗剂，例如预防烧伤感染的洗剂。

此外，所述化合物可通过与各种基底(base)例如乳化基底(emulsifying base)或水溶性基底(water-soluble base)混合制成栓剂。本发明的化合物可通过栓剂直肠施用。所述栓剂可包括在体温熔化而在室温固化的媒介物(vehicle)例如可可油、碳蜡和聚乙二醇。

可提供口服或直肠施用的单位剂型(unit dosage form)例如糖浆、酏剂(elixir)和悬剂，其中每剂量单位例如一茶匙(teaspoonful)、一大汤匙(tablespoonful)、片剂或栓剂含有预先确定量的组合物，该组合物中包含一种或多种本发明的化合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可在组合物中包含本发明的化合物，作为无菌水、生理盐水或其它可药用载体中的溶液。

持续释放剂型的植入物(implants for sustained release formulations)是本领域熟知的。将植入物与生物可降解或生物不可降解的聚合物一起配制成微球体(microsphere)、板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主良好耐受的易受侵蚀的聚合物(erodible polymer)。将含有本发明抗微生物多肽的植入物置于接近感染位点处，从而将活性剂的局部浓度相对于身体的其它部分增加。

术语“单位剂型”用于本文指适合作为人和动物受试者单位剂量的物理上的离散单位(physically discrete unit)，每单位含有预定量的本发明化合物，所计算的量足以使本发明的化合物与可药用的稀释剂、载体或媒介物联合以产生期望效果。对本发明的单位剂型的规格(specification)依赖于所采用的具体化合物、待达到的效果和在宿主中与所述化合物有关的药物动力学。

可药用的赋形剂，诸如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，对于公众是易于获得的。此外，可药用的辅助物质(auxiliary substance)，诸如pH调节和缓冲剂、渗压调节剂(tonicity adjusting agent)、稳定剂、润湿剂等，对于公众是易于获得的。

对于全身施用的通常剂量范围是每次施用从0.1皮克至100毫克每千克受试者重量。通常剂量可以是每日2至6次服用一个片剂，或每日一次服用一个含有较高比例活性成分含量经时释放(time-release)胶囊或片剂。所述经时释放效果可以通过在不同pH值溶解的胶囊材料、通过按照渗透压缓慢释放的胶囊或通过任何其它已知的控制释放的方法来获得。

本领域技术人员易于理解的是，剂量水平可作为特定化合物、症状的严重性和受试者对副作用的敏感性的函数而改变。某些特定的化合物比其它化合物更有效。对于指定化合物的优选剂量，本领域技术人员可通过各种方法容易地决定。优选的方法是测量指定化合物的生理效价(physiologicalpotency)。

使用脂质体作为递送媒介物是一种感兴趣的方法。脂质体与靶位点的细胞融合，并且在细胞内递送腔室(lumen)的内容物。将脂质体保持与细胞接触一段足够融合的时间，使用各种方法以保持接触，例如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，将脂质体设计成气溶胶化用于肺部施用。脂质体可与介导膜融合的纯化蛋白或肽，例如仙台(Sendai)病毒或流感病毒等一起制备。脂质可以是形成脂质的已知的脂质体的任何有用的组合，包括阳离子或两性离子的脂质，例如磷脂酰胆碱。剩余的脂质通常将是中性或酸性脂质，例如胆固醇、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰甘油等。

对于制备脂质体，可使用由Kato et al.(1991)J.Biol.Chem.266：3361描述的方法。简而言之，将包含肽的腔室组合物和脂质在适当的含水介质中组合，方便地是盐水介质，其中总固体将在约1-10重量百分比的范围内。在剧烈搅拌一段短时间之后(约5-60秒)，将试管置于温(warm)水浴中(约25-40℃)，并且重复这个循环约5-10次。然后将组合物超声处理一段合宜的时间(一般约1-10秒)，并可通过涡旋震荡进一步搅拌。接着通过加入含水介质扩张体积，一般增加约1-2倍体积，然后摇动并且冷却。这种方法使得高分子量分子并入至腔室中。

具有其它活性剂的配制物

为了用于本发明的方法，可将本发明的抗微生物多肽与其它医药上的活性剂一起配制，具体而言，与其它抗微生物剂一起配制。感兴趣的其它剂包括本领域内已知的各种抗生素。抗生素的种类包括青霉素，例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素、苯唑西林、羧苄青霉素、萘夫西林、氨苄青霉素等；青霉素组合β-内酰胺酶抑制剂、头孢菌素，例如头孢克洛、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢羟羧氧酰胺等；碳青霉烯类；单环内酰胺类；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类；氯霉素(cloramphenical)；甲硝唑；大观霉素；甲氧苄啶；万古霉素等。

抗真菌剂也是有用的，包括多烯类，例如两性霉素B、制霉菌素；5-氟可新；和唑系，例如咪康唑、酮康唑、伊曲康唑和氟康唑。抗结核药物包括异烟肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素和利福平(rifampin)。也可将细胞因子纳入本发明的抗微生物多肽配制物中，例如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素12等。

体外合成

本发明的抗微生物肽可以使用本领域已知的常规方法通过体外合成制备。可使用多种商业合成设备，例如Applied Biosystems Inc.，Beckman的自动合成仪等。通过使用合成仪，可将天然存在的氨基酸用非天然氨基酸取代，尤其是用D-异构体(或D型)例如D-丙氨酸和D-异亮氨酸、非对应异构体、具有不同长度或官能度(functionality)的侧链等来取代。具体的序列和制备的方式将由简便性、经济性、所需纯度等来决定。

可将化学连接提供至多种肽或蛋白质，其包含便于键合的官能度，例如用于酰胺或取代胺类形成(例如还原胺化)的氨基；用于硫醚或二硫化物形成的硫醇基；用于酰胺形成的羧基等。

如果需要，可在合成期间或表达期间将多种基团引入肽中，其允许对其它分子或表面的连接。因此，半胱氨酸能够用来制备硫醚、用于连接至金属离子复合体的组氨酸；用于形成酰胺或酯的羧基；用于形成酰胺的氨基等。

还可根据重组合成的常规方法将多肽进行分离和纯化。可制备表达宿主的裂解物，并且使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术来纯化所述裂解物。在极大程度上，与涉及产品制备及其纯化方法的污染物相比，所用组合物将包含按重量计至少20％的期望产品，更通常的情况是包含按重量计至少大约75％的期望产品，优选包含按重量计至少大约95％的期望产品，并且对于治疗目的通常包含按重量计至少大约99.5％的期望产品。通常而言，所述百分数将以总蛋白质为基础。

动物饲料

本发明还涉及用于将具有抗微生物活性的多肽用于动物饲料的方法，以及包含本发明的抗微生物多肽的饲料组合物和饲料添加剂。

术语“动物”包括所有动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物，例如牛、羊和马。在具体的实施方式中，动物是非反刍类动物。非反刍类动物包括单胃动物，例如猪(pig)或猪(swine)(包括但不限于小猪、成长中的猪(growing pig)和母猪(sows))；家禽例如火鸡和鸡(包括但不限于雏鸡(broiler chick)、蛋鸡(layer))；小牛(young calves)；和鱼类(包括但不限于鲑鱼)。

术语“饲料”或“饲料组合物”的意思是适合于动物摄入或旨在供给动物摄入的任何化合物、制备物、混合物或组合物。

在根据本发明的用途中，可将抗微生物多肽在饮食之前、之后或与之同时地喂给动物。后者是优选的。

在具体的实施方式中，添加至饲料中的形式的抗微生物多肽、或包括在饲料添加物中时的抗微生物多肽是定义明确的。定义明确意味着所述抗微生物多肽制备物由大小排阻层析测定是至少50％纯的(参见WO 01/58275的实施例12)。在另外的具体实施方式中，抗微生物多肽制备物由此方法测定是至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％纯的。

定义明确的抗微生物多肽制备物是有利的。例如，将基本上不含其它干扰或污染抗微生物多肽的抗微生物多肽正确地剂量给药于饲料要容易得多。术语“正确地剂量给药”具体而言指获得一致的并且恒定的结果的目的，和基于期望的效果最优化剂量的能力。

然而，对于在动物饲料中的用途，抗微生物多肽不需要那么纯；例如抗微生物多肽可以包括其它酶，在这种情况下可称其为抗微生物多肽制备物。

可将抗微生物多肽制备物(a)直接添加至饲料(或直接使用在植物蛋白的处理过程中)，或(b)可将其用于产生一种或多种中间体组合物，例如后续加入到饲料中(或在处理过程中使用的)的饲料添加剂或预混合料(premix)。如上所述的纯度指原始抗微生物多肽制备物的纯度，无论用于如上的(a)或(b)。

这种数量级纯度的抗微生物多肽制备物具体而言能够使用重组产生方法来获得，而它们不是很容易获得的，并且当通过传统发酵方法产生所述抗微生物多肽时，还要经受更严重的批次变化(batch-to-batch variation)。

当然，可将这种抗微生物多肽制备物与其它酶混合。

术语“植物蛋白”用于本文指任何化合物、组合物、制备物或混合物，其包含至少一种衍生自(derived from)或起源于(originating from)植物的蛋白质，包括修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。在具体的实施方式中，植物蛋白的蛋白质含量是至少10、20、30、40、50或60％(w/w)。

植物蛋白可源自植物蛋白来源，诸如豆类和谷类，例如来自豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)植物的材料，诸如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。

在具体的实施方式中，植物蛋白来源是来自豆科的一种或多种植物的材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆。

在另外的具体实施方式中，植物蛋白来源是来自藜科的一种或多种植物的材料，例如甜菜(beet)、糖甜菜(sugar beet)、菠菜(spinach)或昆诺阿藜(quinoa)。

植物蛋白来源的其它实例是油菜籽和甘蓝。

大豆是优选的植物蛋白来源。

植物蛋白来源的其它实例是谷类诸如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻和高粱。

抗微生物多肽能够以任何形式添加至饲料，其作为相对纯的抗微生物多肽，或与有意添加至动物饲料的其它成分混合，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料的预混合料。

在另外的方面，本发明涉及在动物饲料中使用的组合物，例如动物饲料和动物饲料添加剂，例如预混合料。

除了本发明的抗微生物多肽之外，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质，和/或至少一种大量矿物质(macro mineral)。

此外，任选的饲料添加剂成分是着色剂(coloring agents)、芳香化合物(aroma compounds)、稳定剂和/或至少一种其它的酶，所述酶选自肌醇六磷酸酶EC 3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC 3.2.1.8；半乳聚糖酶EC 3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC 3.2.1.4。

在具体的实施方式中，将这些其它的酶明确定义(如上对于抗微生物多肽制备物的定义)。

其它抗微生物肽(AMPs)的实例是CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin、防卫素(Defensin)、Ovispirin例如Novispirin(RobertLehrer、2000)，和它们保留抗微生物活性的变体或片段。

其它抗真菌多肽(AFPs)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉肽，以及它们保留抗真菌活性的变体和片段，如WO 94/01459和WO02/090384中所公开。

通常脂肪和水溶性维生素、以及痕量矿物质形成有意添加至饲料的所谓的预混合料部分，而通常将大量矿物质分开添加至饲料。这些组合物类型中的任一个与本发明的抗微生物多肽一起富集(enrich)时，都是本发明的动物饲料添加剂。

在具体的实施方式中，旨在将本发明的动物饲料添加剂以0.01至10.0％；更具体而言0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％意味着克添加剂/100克饲料)的水平包括于(或规定为必需包括于)动物饮食或饲料中。尤其对于预混合料而言。

以下是这些成分实例的非限定性列表：

脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸(niacin)、叶酸和泛酸盐(panthothenate)，例如D-泛酸钙(Ca-D-panthothenate)。

痕量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

大量矿物质的实例是钙、磷和钠。

对这些成分的营养需求(用家禽和小猪/猪示例)列于WO 01/58275的表A。营养需求的意思是这些成分应该以说明的浓度在饮食中提供。

可供选择的是，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种WO 01/58275的表A中指定的单独成分。至少一种的意思是任一种、一种或多种、一种、或两种、或三种、或四种等等多至所有十三种、或多至所有十五种单独组分。更具体而言，将这样至少一种单独组分包括在本发明的添加剂中，所述组分的量提供其饲料中浓度(in-feed-concentration)在表A第4栏、第5栏或第6栏中说明的范围之内。

本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪饮食的特征可如WO 01/58275表B的第2-3栏中所说明。鱼类饮食的特征可如此表B的第4栏中所说明。此外，这些鱼类饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。

根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且进一步包含至少一种如本文中所要求的抗微生物多肽。

此外，或可供选择的是(对于上述粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量(metabolisable energy)含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的可用磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在具体的实施方式中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量在WO 01/58275(R.2-5)表B中2、3、4或5任一的范围内。

将粗蛋白计算为氮(N)乘以因子6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x 6.25。氮含量由Kjeldahl方法(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis 14th ed.，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)来测定。

可代谢能量能够基于the NRC publication Nutrient requirements in swine，ninth revised edition 1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animalnutrition，board of agriculture，national research council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6，和the European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DABeekbergen，The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5来计算。

完全动物饮食中钙、可用磷和氨基酸的饮食含量基于饲料表来计算，例如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheiden voederwaarde van voedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7。

在具体的实施方式中，本发明的动物饲料组合物包含至少一种如上所定义的植物蛋白或蛋白质来源。

在另外的具体实施方式中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％玉米；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-10％鱼粉；和/或0-20％乳清。

能够将动物饮食制造成例如醪液饲料(mash feed)(非粒状(non pelleted))或粒状饲料。通常而言，将研磨的饲料混合，并且根据所述物种的具体要求添加足够量的必要维生素和矿物质。可将酶作为固体或液体酶配制物添加。例如，固体酶配制物通常在混合步骤之前或期间添加；液体酶配制物通常在制粒步骤之后添加。也可将酶并入饲料添加剂或预混合料。

饮食中的最终酶浓度在0.01-200mg酶蛋白每kg饮食的范围内，例如在5-30mg酶蛋白每kg动物饮食的范围内。

可将抗微生物多肽按以下量(剂量范围)的一种或多种来施用：0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10——所有这些范围的单位均为mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料(ppm)。

为了测定mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料，将抗微生物多肽从饲料组合物中纯化，并且使用相关的试验(参见抗微生物活性、底物和试验)来测定纯化的抗微生物多肽的比活。饲料组合物的抗微生物活性同样也使用相同的试验来测定，并且基于这两种测定，计算出以mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料表示的剂量。

相同原理应用于测定饲料添加剂中的mg抗微生物多肽蛋白。当然，如果用于制备饲料添加剂或饲料的抗微生物多肽的样品可用，则从此样品测定比活(无需从饲料组合物或添加剂中纯化所述抗微生物多肽)。

信号肽和前肽

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，其与第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之一或二者可操作地连接；所述第一核苷酸序列由SEQ ID NO：1的核苷酸1至72组成，其编码由SEQ ID NO：2的氨基酸-165至-142组成的信号肽；所述第二核苷酸序列由SEQ ID NO：1的核苷酸73至495组成，其编码由SEQ ID NO：2的氨基酸-141至-1组成的前肽；其中所述基因对于第一和第二核苷酸序列是外源的。

本发明还涉及包含这些核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，其包括(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这样的重组表达细胞；和(b)回收所述蛋白质。

可将第一和第二核苷酸序列单独地或组合地同其它调控序列一起可操作地与外源基因连接。这些其它调控序列如上所述。如早前所述，当信号肽和前肽区二者均存在于蛋白质的氨基末端时，前肽区位置紧接着蛋白质的氨基末端，并且信号肽区位置紧接着前肽区的氨基末端。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文不意指特定长度的编码产物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包含组合以形成编码产物的两种或更多种多肽。蛋白质还包括杂合多肽，其包含从至少两种不同蛋白质获得的部分或全部多肽序列的组合，其中一种或多种蛋白质对于宿主细胞可以是异源的或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白的天然存在的等位基因变异和工程变异。

优选地，所述蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报告分子(reporter)。在更优选的方面，蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在甚至更优选的方面，蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

所述基因可以获得自任何原核的、真核的和其它的来源。

本发明进一步通过以下实施例来描述，而不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

用作缓冲液和底物的化学药品是至少试剂级的商业产品。在以下实施例中，将如SEQ ID NO：2的氨基酸1至21所示的抗微生物多肽称为″Arenicin″。

实施例1

Arenicin的抗微生物活性

合成制备如SEQ ID NO：2的氨基酸1至21所示的抗微生物肽。根据CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute；先前称为National Committee forClinical and Laboratory Standards)的NCCLS准则-规程M7-A6，vol.20，No.2：Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That GrowAerobically，来测定Minimal Inhibitory Concentration(MIC；最小抑制浓度)以测试Arenicin的抗微生物活性。

针对从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的12种细菌菌株来测试本发明的抗微生物肽。表1中的结果是两个独立评估的平均值。

菌株

保藏号

MIC

大肠杆菌	ATCC 25922	0.25μg/mL
			大肠杆菌	ATCC 25404	0.5μg/mL
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)	ATCC 13048	1μg/mL
			阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)	ATCC 13047	1μg/mL
索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)	ATCC 11060	0.5μg/mL
			弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)	ATCC 8090	1μg/mL
铜绿假单胞菌	ATCC 27853	0.5μg/mL
			铜绿假单胞菌	ATCC 9027	1μg/mL
嗜麦芽糖寡氧单胞菌(Stenotrophomonas maltophlila)	ATCC 13637	1μg/mL
			杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)	ATCC 14174	2μg/mL
Acinetobacter iwoffii	ATCC 15309	0.25μg/mL
			粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)	ATCC 25238	＜0.06μg/mL

表1.Arenicin的抗微生物活性

实施例2

针对临床真菌的最小抑制浓度

针对酵母和真菌的Arenicin的最小抑制活性的测定基本上如NCCLS/CLSI(临床和试验室标准协会)所述。

概括而言，将大约1McFarland单位的真菌或酵母悬液以1∶100稀释在PD培养液(8g/L马铃薯葡萄糖(potato dextrose))中，并且相对于2倍系列稀释的Arenicin(0.03-32μg/mL)测试其生长。对于白念珠菌、热带念珠菌(Candidatropicalis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、须发藓菌(Trichophytonmentagrophytes)和絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)，将试验平板在25-27℃温育；而对于光滑念珠菌(Candida glabrata)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母和黑曲霉，将试验平板在30℃温育。在大约40小时的温育之后，凭视觉观察(肉眼，倾斜照明(oblique illumination))记录生长。结果示于下表2。

菌株	保藏号	MIC
			白念珠菌	ATCC 10231	4μg/mL
白念珠菌	ATCC 28517	8μg/mL
			白念珠菌	ATCC 18804	8μg/mL
热带念珠菌	DSM 11953	2μg/mL
			光滑念珠菌	DSM 11226	16μg/mL
新型隐球菌	DSM 11959	1μg/mL

巴斯德毕赤酵母	ATCC 201178	4μg/mL
			巴斯德毕赤酵母	ATCC 20864	2μg/mL
酿酒酵母	DSM 1333	8μg/mL
			黑曲霉	ATCC9642	8μg/mL
须发藓菌	DSM 4870	8μg/mL

表2.Arenicin的抗微生物活性

Claims (18)

1.具有抗微生物活性的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21具有至少70％同一性。

2.权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21具有至少75％同一性。

3.权利要求1-2中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21具有至少80％同一性。

4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21具有至少85％同一性。

5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21具有至少90％同一性。

6.权利要求1-5中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至21具有至少95％同一性。

7.权利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

8.权利要求7的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：2组成。

9.权利要求7的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸1至21组成。

10.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-9中任一项的多肽的核苷酸序列。

11.核酸构建体，其包含权利要求10的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个在表达宿主中指导所述多肽产生的调控序列可操作地连接。

12.重组表达载体，其包含权利要求11的核酸构建体。

13.重组宿主细胞，其包含权利要求11的核酸构建体。

14.用于产生权利要求1-9中任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；或在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

15.组合物，其包含如权利要求1-9中任一项所限定的抗微生物多肽和可药用媒介物。

16.用于杀死或抑制微生物细胞生长的体外方法，其包括将所述微生物细胞与权利要求1-9中任一项所限定的抗微生物多肽接触。

17.权利要求1-9中任一项所限定的抗微生物多肽，其用作药物。

18.权利要求1-9中任一项所限定的抗微生物多肽在制备兽用或人用治疗剂中的用途，所述治疗剂用于治疗微生物感染。