PT1922333E - Polipeptdeos que t—m actividade antimicrobiana e polinucleotdeos que codificam os polipeptdeos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

POLIPEPTÍDEOS QUE TÊM ACTIVIDADE ΑΝΤΙMICROBIANA E POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM OS POLIPEPTÍDEOS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados que têm actividade antimicrobiana e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção refere-se também a constructos de ácidos nucleicos, vectores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos assim como a métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Ovchinnikova et al. "Purification and primary structure of two isoforms of arenicin, a novel antimicrobial peptide from marine polychaeta Arenicola marina", FEBS Lett., vol. 577, pp. 209-214 (2004) descreve dois peptídeos antimicrobianos de 21 resíduos, arenicina-1 e arenicina-2, que exibem actividade contra as bactérias Gram-positivas e Gram-neqativas e funqos de coelomocytes de poliquetos marinhos Arenicola marina (lombriga). As arenicinas não têm nenhuma semelhança de estrutura nem homologia sequencial a nenhum peptídeo antimicrobiano identificado anteriormente. É um objecto da presente invenção prover polipeptídeos com actividade antimicrobiana e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo actividade antimicrobiana e tendo uma sequência de aminoácidos 1/63 que tem pelo menos um 70% de identidade com os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.

A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos que têm actividade antimicrobiana, e tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade com aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 2 . A presente invenção refere-se também a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expressão recombinantes, e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos. A presente invenção refere-se também a métodos para produzir estes polipeptídeos que têm actividade antimicrobiana que compreende (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um constructo de ácidos nucleicos que compreende um polinucleótido que codifica o polipeptídeo em condições propícias para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. A presente invenção refere-se também a métodos para usar os polipeptídeos e os polinucleotídeos da invenção.

DEFINIÇÕES

Actividade antimicrobiana: A expressão "actividade antimicrobiana" na presente invenção é definida como uma actividade que é capaz de matar ou inibir o crescimento das células microbianas. No contexto da presente invenção o termo "antimicrobiano" é destinado a significar que há um efeito bactericida e/ou um efeito bacteriostático e/ou fungicida é para

ser entendido como capaz de matar as células bacterianas. O 2/63 termo "bacteriostático" é para ser entendido como capaz de inibir o crescimento bacteriano, isto é de inibir o crescimento das células bacterianas. 0 termo "fungicida" é para ser entendido como capaz de matar as células fúngicas. 0 termo "fungistático" é para ser entendido como capaz de inibir o crescimento fúngico, isto é de inibir o crescimento das células fúngicas. 0 termo "virucida" é para ser entendido como capaz de inactivar o virus. A expressão "células microbianas" estipula células bacterianas ou células fúngicas (incluindo levedura).

No contexto da presente invenção a expressão "inibir o crescimento das células microbianas" é destinado a significar que as células estão no estado de não crescimento, isto é, que não são capazes de propagarem-se.

Para os objectivos da presente invenção, a actividade antimicrobiana pode ser determinada de acordo com o método descrito por Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991). Alternativamente, a actividade antimicrobiana pode ser determinada de acordo com as directrizes do NCCLS de CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute; anteriormente conhecido como National Committee for Clinicai and Laboratory Standards).

Os polipeptídeos que têm actividade antimicrobiana podem ser capazes de reduzir o número de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 depois de 24 horas (preferencialmente depois de 12 horas, mais preferencialmente depois de 8 horas, mais preferencialmente depois de 4 horas, mais preferencialmente depois de 2 horas, da forma mais preferível depois de 1 hora, e em particular depois de 30 minutos) de incubação a 20 °C numa solução aquosa de 25% (p/p); preferencialmente numa solução aquosa de 10% (p/p); mais preferencialmente numa solução aquosa de 5% (p/p); ainda mais preferencialmente numa solução aquosa de 1% (p/p); da forma mais preferível numa solução aquosa de 5% 3/63 (ρ/ρ) ; e em particular numa solução aquosa de 1% (p/p) dos polipeptídeos com actividade antimicrobiana.

Os polipeptídeos com actividade antimicrobiana podem também ser capazes de inibir a excrescência de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25 °C num substrato de crescimento microbiano, quando adicionado numa concentração de 1000 ppm; preferencialmente quando adicionado numa concentração de 500 ppm; mais preferencialmente quando adicionado numa concentração de 250 ppm; ainda mais preferencialmente quando adicionado numa concentração de 100 ppm; da forma mais preferível quando adicionado numa concentração de 50 ppm; e em particular quando adicionado numa concentração de 25 ppm.

Os polipeptídeos com actividade antimicrobiana podem ser capazes de reduzir o número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 depois de 24 horas (preferencialmente depois de 12 horas, mais preferencialmente depois de 8 horas, mais preferencialmente depois de 4 horas, mais preferencialmente depois de 2 horas, da forma mais preferível depois de 1 hora, e em particular depois de 30 minutos) de incubação a 20 °C numa solução aquosa de 25%(p/p); preferencialmente numa solução aquosa de 10%(p/p); mais preferencialmente numa solução aquosa de 5%(p/p); até preferencialmente numa solução aquosa de l%(p/p); da forma mais preferível numa solução aquosa de 5%(p/p); e em particular numa solução aquosa de l%(p/p) dos polipeptídeos com actividade antimicrobiana.

Os polipeptídeos com actividade antimicrobiana podem também ser capazes de inibir a excrescência de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25 °C num substrato de crescimento microbiano, quando são adicionados numa concentração de 1000 ppm; preferencialmente quando são adicionados numa concentração de 500 ppm; mais preferencialmente quando são adicionados numa concentração de 250 ppm; ainda mais preferencialmente quando são adicionados numa concentração de 100 ppm; da forma mais 4/63 preferível quando sao adicionados numa concentração de 50 ppm; e em particular quando são adicionados numa concentração de 25 ppm.

Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, da forma mais preferível pelo menos 95%, da forma mais preferível pelo menos 100% da actividade antimicrobiana do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.

Polipeptídeo isolado: A expressão "polipeptídeo isolado" como é utilizada na presente invenção refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro, preferencialmente pelo menos 40% puro, mais preferencialmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferencialmente pelo menos 80% puro, da forma mais preferível pelo menos 90% puro, e ainda mais preferível pelo menos 95% puro, de acordo com o determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: Aa expressão "polipeptídeo substancialmente puro" na presente invenção estipula uma preparação de polipeptídeos que no máximo contém 10%, preferencialmente no máximo 8%, mais preferencialmente no máximo 6%, mais preferencialmente no máximo 5%, mais preferencialmente no máximo 4%, no máximo 3%, ainda mais preferencialmente no máximo 2%, da forma mais preferível no máximo 1%, e mesmo mais preferível no máximo 0.5% em peso de outro material polipeptídeo com o qual é associado de forma nativa. Portanto, é preferido que o polipeptídeo substancialmente puro seja pelo menos 92% puro, preferencialmente pelo menos 94% puro, mais preferencialmente pelo menos 95% puro, mais preferencialmente pelo menos 96% puro, mais preferencialmente pelo menos 97% puro, mais preferencialmente pelo menos 98%, puro ainda mais 5/63 preferencialmente pelo menos 99%, da forma mais preferível pelo menos 99.5% puro, e ainda mais preferível 100% puro em peso do material polipeptídeo total presente na preparação.

Os polipeptídeos da presente invenção preferencialmente estão numa forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que os polipeptídeos estejam na "forma essencialmente pura", i.e., que a preparação de polipeptídeos essencialmente esteja livre de outro material polipeptídeo com o qual é associado de forma nativa. Isto pode por exemplo ser realizado preparando o polipeptídeo mediante métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos clássicos de purificação.

Na presente invenção, a expressão "polipeptídeo substancialmente puro" é sinónima das expressões "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo na forma isolado".

Identidade: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade".

Para os objectivos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o programa FASTA incluída a versão 2. Ox do pacote do programa FASTA (ver W. R. Pearson & D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; e W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). A matriz de pontuação usada foi BLOSUM50, a penalidade de abertura foi -12, e a penalidade por extensão de abertura foi -2. O grau de identidade entre duas sequências de nucleotídeos foi determinada usando o mesmo algoritmo e pacote de software como o acima descrito. A matriz de pontuação usada foi a matriz da identidade, a penalidade de abertura foi -16, e a penalidade por extensão de abertura foi -4. 6/63

Alternativamente, um alinhamento de duas sequências de aminoácidos é determinado usando o programa Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. 0 programa Needle implementa o algoritmo do alinhamento global descrito por Needleman, S. B. & Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443- 453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, a penalidade por abertura de abertura é 10, e a penalidade por extensão de abertura é 0.5. 0 grau de identidade entre uma sequência de aminoácidos da presente invenção (tal como aminoácidos 1 a 43 da SEQ ID NO:2) e uma sequência de aminoácidos diferente é calculada como o número de concordâncias exactas num alinhamento das duas sequências, dividido pelo comprimento (número de resíduos de aminoácidos) da sequência da presente invenção; ou alternativamente a saída de Needle marcada como "a identidade mais comprida" é usada como a percentagem de identidade e é calculada da seguinte maneira: (resíduos idênticos x 100)/(comprimento de alinhamento - número de aberturas no alinhamento). 0 resultado é expresso em percentagem de identidade.

Fragmento de polipeptídeo: A expressão "fragmento de polipeptídeo" é na presente invenção definido como um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos deleccionados do terminal amino e/ou carboxil da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga da mesma, em que o fragmento tem actividade antimicrobiana. Numa forma de realizar a invenção o fragmento inclui pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 16, mais preferencialmente pelo menos 17, ainda mais preferencialmente pelo menos 18, da forma mais preferível pelo menos 19 e em particular pelo menos 20 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:2.

Subsequência: 0 termo "subsequência" é na presente invenção definido como uma sequência de nucleotídeos com um ou mais

nucleotídeos deleccionados da extremidade 5' e/ou 3' da SEQ ID NO:l ou uma sequência homóloga da mesma, em que a subsequência 7/63 codifica um fragmento do polipeptídeo com actividade antimicrobiana.

Variante alélica: A expressão "variante alélica" estipula na presente invenção quaisquer das duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossómico. A variação alélica surge naturalmente através da mutação, e pode resultar em polimorfismo nas populações. As mutações no gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptideo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo substancialmente puro: A expressão "polinucleotídeo substancialmente puro" como é utilizada na presente invenção refere-se a uma preparação polinucleotídea livre de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e numa forma adequada para ser usado nos sistemas de produção de proteína criada geneticamente. Portanto, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, preferencialmente no máximo 8%, mais preferencialmente no máximo 6%, mais preferencialmente no máximo 5%, mais preferencialmente no máximo 4%, mais preferencialmente no máximo 3%, ainda mais preferencialmente no máximo 2%, e da forma mais preferível no máximo 1%, e ainda mais preferível no máximo 0.5% em peso de outro material polinucleotídeo com o qual é associado de forma nativa. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões não codificantes e não traduzidas de origem natural 5' e 3', tais como promotores e terminadores. É preferido que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, preferencialmente pelo menos 92% puro, mais preferencialmente pelo menos 94% puro, mais preferencialmente pelo menos 95% puro, mais preferencialmente pelo menos 96% puro, mais preferencialmente pelo menos 97% puro, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% puro, da forma mais preferível pelo menos 99%, ainda o mais preferível pelo menos 99.5% puro em 8/63 peso. Preferencialmente os polinucleotídeos da presente invenção estão numa forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que os polinucleotídeos descritos na presente invenção estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que a preparação polinucleotídea esteja essencialmente livre de outro material polinucleotídeo com o qual é associado de forma nativa. Aqui, a expressão "polinucleotídeo substancialmente puro" é sinónimo das expressões "polinucleotídeo isolado" e "polinucleotídeo na forma isolada". Os polinucleotídeos podem ser de origem genómico, ADNc, ARN, semi-sintético, sintético, ou qualquer combinação destes. ADNc: 0 termo "ADNc" é definido na presente invenção como uma molécula de ADN que pode ser preparado por transcrição invertida de uma molécula de ARNm madura, excisada, obtida de uma célula eucariótica. 0 ADNc carece de sequências de intrões que normalmente estão presentes no ADN genómico correspondente. A transcrição do ARN inicial, primária é um precursor do ARNm que é processado através de uma série de fases antes de aparecer como ARNm maduro excisado. Estas fases incluem a remoção das sequências de intrões por um processo chamado excisão. Portanto, o ADNc derivado de ARNm carece de qualquer sequência de intrão.

Constructo de ácidos nucleicos: A expressão "constructo de ácidos nucleicos" como é utilizado na presente invenção refere-se a uma molécula de ácidos nucleicos, de ligação única ou de ligação dupla, que é isolado de um gene de origem natural ou que é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de maneira que de contrário não existiria na natureza. A expressão constructo de ácidos nucleicos é sinónimo da expressão "cassete de expressão" quando o constructo de ácidos nucleicos contém as sequências de controlo requeridas para a expressão de uma sequência codificante da presente invenção.

Sequência de controlo: A expressão "sequências de controlo" são na presente invenção definidas para incluir todos os 9/63 componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controlo pode ser original ou estranha à sequência de nucleotideos que codifica o polipeptídeo. As sequências de controlo deste tipo incluem, mas não se limitam a, uma sequência líder, de poliadenilação, sequência de propeptídeo, promotora, sequência de peptídeo sinal, e de terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controlo incluem um promotor, e sinais de paragem transcripcionais e translacionais. As sequências de controlo podem ser providas com ligadores a fim de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controlo com a região da sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo.

Ligado funcionalmente: A expressão "ligado funcionalmente" estipula na presente invenção uma configuração na que uma sequência de controlo é colocada numa posição apropriada em relação com a sequência codificante da sequência polinucleotídea de tal maneira que a sequência de controlo dirige a expressão da sequência codificante de um polipeptídeo.

Sequência codificante: Quando na presente invenção é utilizada a expressão "sequência codificante" significa uma sequência de nucleotideos, que especifica directamente a sequência de aminoácidos do seu produto da proteína. Geralmente, os limites da sequência codificante são determinados por uma grelha de leitura aberta, que normalmente é iniciada com o codão de iniciação ATG ou codões de iniciação alternativos tais como GTG e TTG. A sequência codificante pode ser uma sequência de ADN, de ADNc, ou de nucleotideos recombinante.

Expressão: 0 termo "expressão" inclui qualquer fase envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas de forma não limitativa, transcrição, modificação pós-transcripcional, tradução, modificação pós-translacional, e secreção. 10/ 63 é na

Vector de expressão: A expressão "vector de expressão" presente invenção definida como uma molécula de ADN linear ou circular que compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptideo da invenção, e que está ligado funcionalmente aos nucleotideos adicionais que provêm a sua expressão. Célula hospedeira: A expressão "célula hospedeira", como é utilizada na presente invenção, inclui qualquer tipo de célula que é susceptivel de transformação, transfecção, transdução, e outros com um constructo de ácidos nucleicos que compreendem um polinucleotideo da presente invenção.

Modificação: 0 termo "modificação" na presente invenção significa qualquer modificação química do polipeptideo que consiste nos aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 2 assim como a manipulação genética do ADN que codifica este polipeptideo. A(s) modificação (modificações) pode(m) ser substituição (substituições), delecção (delecções) e/ou inserção (inserções) do(s) aminoácido(s) assim como substituição(substituições) de cadeia(s) laterais de aminoácidos; ou uso de aminoácidos não naturais com características idênticas na sequência de aminoácidos. Em particular a(s) modificação (modificações) pode(m) ser amidações, tais como amidação de C-terminal.

Variante artificial: Quando na presente invenção é utilizada a expressão "variante artificial" significa um polipeptideo com actividade antimicrobiana produzida por um organismo que expressa uma sequência de nucleotideos modificada da SEQ ID N0:1. A sequência de nucleotideos modificada é obtida através da intervenção humana por modificação da sequência de nucleotideos descrita na SEQ ID N0:1. 11/63

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Polipeptídeos que têm actividade antimicrobiana

Num primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptideos isolados com uma sequência de aminoácidos que tem um grau de identidade aos aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 2 (i.e., o polipeptídeo maduro) de pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda preferencialmente pelo menos 90%, da forma mais preferível pelo menos 95%, e ainda da forma mais preferível pelo menos 97%, que têm actividade antimicrobiana (de aqui para a frente "polipeptídeos homólogos"). Num aspecto preferido, os polipeptídeos homólogos têm uma sequência de aminoácidos que é diferente em dez aminoácidos, preferencialmente em cinco aminoácidos, mais preferencialmente em quatro aminoácidos, ainda preferencialmente em três aminoácidos, da forma mais preferível em dois aminoácidos, e ainda mais preferível num aminoácido dos aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. Noutro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2. Noutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. Noutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste nos aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2 .

Preferencialmente, as mudanças dos aminoácidos são de uma natureza menor do que as mudanças nas substituições ou nas inserções de aminoácidos conservadores que significativamente não afectam ao desdobramento e/ou à actividade da proteína; delecções pequenas, tipicamente de um a aproximadamente 10 aminoácidos; extensões pequenas amino ou carboxil terminais, tal como um resíduo de metionina amino terminal; um peptídeo pequeno 12/63 de ligação até aproximadamente 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação mudando a carga líquida ou outra função, tal como um tracto de poli-histidina, um epítopo antigénico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a actividade específica são conhecidos na técnica e são por exemplo descritos por H. Neurath & R.L. Hill, 1979, em, The Proteins, Academic Press, New York. As mudanças que mais frequentemente se dão são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos standards, aminoácidos não standards (tais como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina, e alfa-metil serina) podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo de tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos. "Aminoácidos não naturais" foram modificados depois da síntese da proteína, e/ou têm uma estrutura química na(s) sua(s) cadeia(s) lateral(laterais) diferente(s) da dos aminoácidos standards. Os aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados, e preferencialmente, estão comercialmente disponíveis, e incluem ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, dehidroprolina, 3- e 4-metilprolina, e 3,3-dimetilprolina. 13/63

Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH óptimo, e outras.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo pai podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutaqénese dirigida ao sitio ou mutagénese de varrimento de alanina (Cunningham & Wells, 1989, Science 244:1081-1085). Nesta última técnica, mutações únicas da alanina foram introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes foram testadas enquanto à sua actividade biológica (i.e., actividade antimicrobiana) para identificar os resíduos de aminoácidos que são críticos para a actividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. A interacção biológica pode também ser determinada por análise física da estrutura, como a determinada por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difracção electrónica, ou marcação por fotoafinidade, conjuntamente com mutação de aminoácidos do sítio de contacto suposto. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904;

Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais podem também ser inferidas da análise das identidades com polipeptídeos que estão relacionadas com um polipeptídeo de acordo com a invenção.

As substituições de aminoácidos únicas ou múltiplss podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagénese, recombinação, e/ou redistribução, seguidas de um método de rastreio relevante, tal como os descritos por Reidhaar-Olson &

Sauer, 1988 Science 241: 53-57; Bowie & Sauer, 1989, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625.

Outros métodos que podem ser utilizados incluem PCR propensa a erros, visualização do fago (e.g., Lowman et al., 1991, Biochem. 14/63 u.s.

No. 30:10832-10837; Pedido de Patente norte-americana 5,223,409; WO 92/06204), e mutagénese dirigida à região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127) .

Os métodos de mutagénese/redistribuição podem ser combinados com métodos de rastreio automatizados de alto rendimento para detectar a actividade dos polipeptídeos clonados e mutagenizados expressas pelas células hospedeiras. As moléculas de ADN mutagenizadas gue codificam os polipeptídeos activos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando na técnica os métodos standards na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância dos resíduos dos aminoácidos individuais num polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados aos polipeptídeos com estrutura desconhecida. O número total de substituições de aminoácidos, delecções e/ou inserções dos aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2 é 10, preferencialmente 9, mais preferencialmente 8, mais preferencialmente 7, mais preferencialmente no máximo 6, mais preferencialmente no máximo 5, mais preferencialmente 4, ainda mais preferencialmente 3, da forma mais preferível 2, ainda da forma mais preferível 1.

Numa forma de realização, os polipeptídeos da invenção incluem pelo menos 4 resíduos de cisteína, preferencialmente os polipeptídeos incluem exactamente 4 resíduos de cisteína. Noutra forma de realizar a invenção, os polipeptídeos são polipeptídeos cíclicos.

Extensão N-terminal

Uma extensão N-terminal dos polipeptídeos da invenção pode adequadamente ser constituída por 1 a 50 aminoácidos, preferencialmente 2-20 aminoácidos, especialmente 3-15 aminoácidos. Numa forma de realizar a invenção a extensão do 15/ 63 peptídeo N-terminal não contém Arg (R). Noutra forma de realizar a invenção a extensão N-terminal compreende um sitio de clivagem kex2 ou do tipo kex2 como será definida também abaixo. Numa forma preferida de realizar a invenção a extensão N-terminal é um peptídeo, que compreende pelo menos dois resíduos de aminoácidos Glu (E) e/ou Asp (D), tal como uma extensão N-terminal que compreende uma das seguintes sequências: EAE, EE, DE e DD. Sítios Kex2 Sítios Kex2 (ver, por exemplo, Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") e sítios do tipo kex2 são sitios de reconhecimento di-básicos (isto é, sítios de clivagem) encontrados entre a região codificante do pro-peptídeo e a região madura de algumas proteínas. A inserção de um sítio kex2 ou de um sítio do tipo kex2 nalguns casos demonstrou que melhorava o processamento da endopeptidase correcta no sítio de clivagem do pro-peptídeo dando como resultado níveis aumentados da secreção de proteínas.

No contexto da invenção, a inserção de um sítio kex2 ou do tipo kex2 resulta na possibilidade de obter a clivagem a uma posição determinada na extensão N-terminal resultando num polipeptídeo antimicrobiano que estendido em comparação com o polipeptídeo maduro mostrado como os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.

Polipeptídeos fundidos

Os polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão clivados onde outro polipeptídeo é fundido no N-terminal ou no C-terminal do polipeptídeo da invenção ou um fragmento dele. Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo uma sequência de nucleotídeos (ou 16/63 uma parte da mesma) que codifica outro polipeptídeo a uma sequência de nucleotideos (ou uma parte da mesma) da presente invenção. As Técnicas para produzir polipeptideos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligar as sequências codificantes que codificam os polipeptídeos de forma a que estas estejam na grelha e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sobre controlo do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador.

Fontes de polipeptídeos que têm actividade antimicrobiana

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer género. Para os objectivos da presente invenção, a expressão "obtido de" como é utilizado na presente invenção em relação com uma fonte dada entender-se-á que o polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotideos é produzido pela fonte ou por uma estirpe na que a sequência de nucleotideos da fonte foi inserida. Num aspecto preferido, o polipeptídeo obtido de uma fonte dada é segregado extracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus, e.g., um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou um de Bacillus thuringiensis; ou um polipeptídeo de Streptomyces, e.g., um polipeptídeo de

Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus; ou um polipeptídeo bacteriano gram negativo, e.g., um polipeptídeo de E. coli ou um polipeptídeo de Pseudomonas sp.

Um polipeptídeo da presente invenção pode também ser um polipeptídeo fúngico, e mais preferencialmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, 17/ 63

Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou polipeptídeo de Yarrowia; ou mais preferencialmente um polipeptídeo filamentoso fúngico tal como um polipeptídeo de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum,

Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma.

Num aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii,

Sachharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou

Saccharomyces oviformis que têm actividade antimicrobiana.

Noutro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

Noutro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Arenicola marina, e.g., o polipeptídeo da SEQ ID N0:2.

Será entendido que para as espécies mencionadas anteriormente, a invenção inclui tanto os estados perfeitos como os estados 18/63 imperfeitos, e outros equivalentes taxonómicos, e.g., anamorfos, apesar do nome pelos quais elas são conhecidas. Os técnicos especializados reconhecerão facilmente a identidade dos equivalentes apropriados.

As estirpes destas espécies são de fácil acesso para o público num número de colecções de culturas, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Além disso, estes polipeptideos podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (e.g., terra, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. As técnicas para isolar microrganismos de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. 0 polinucleotideo pode seguidamente ser obtido de maneira idêntica pelo rastreio genómico ou de uma biblioteca de ADNc de outro microrganismo. Logo que uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a(s) sonda(s) é detectada, o polinucleotideo pode ser isolado ou clonado utilizando as técnicas que são bem conhecidas daqueles com conhecimentos comuns na técnica (ver, e.g., Sambrook et al., 1989, supra).

Os polipeptideos da presente invenção também incluem polipeptideos fundidos ou polipeptideos de fusão clivados em que outro polipeptídeo é fundido no N-terminal ou no C-terminal do polipeptídeo ou num seu fragmento. Um polipeptídeo fundido é produzido mediante a fusão de uma sequência de nucleotídeos (ou uma parte desta) que codifica outro polipeptídeo para uma sequência de nucleotídeos (ou uma parte desta) da presente invenção. As técnicas para produzir os polipeptideos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligar as sequências codificantes que codificam os polipeptideos de forma a que 19/ 63 estejam na grelha e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controlo do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador.

Polinucleotídeos A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados com uma sequência de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo da presente invenção. Num aspecto preferido, a sequência de nucleotídeos é estabelecida na SEQ ID N0:1. Noutro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeos é a região codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID N0:1. A presente invenção também abrange sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou o seu polipeptídeo maduro, que é diferente da SEQ ID N0:1 devido à degeneração do código genético. A presente invenção refere-se também a subsequências da SEQ ID N0:1 que codificam fragmentos da SEQ ID NO:2 que têm actividade antimicrobiana. A presente invenção refere-se também a polunucleótidos mutantes que compreendem pelo menos uma mutação na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID N0:1, onde a sequência de nucleotídeos mutante codifica um polipeptídeo que consiste nos aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo são conhecidas na técnica e incluem o isolamento do ADN genómico, a preparação do ADNc, ou uma combinação dos mesmos. A clonação dos polinucleotídeos da presente invenção deste ADN genómico pode ser efectuada, e.g., usando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) bem conhecida ou por rastreio dos anticorpos das bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de ADN clonados com características estruturais compartidas. Ver, e.g., Innis et al., 1990, PCR: A

Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tal como reacção em cadeia da ligase (LCR), transcrição activada 20/ 63 ligada (LAT) e amplificação baseada nas sequências de nucleotídeos (NASBA) podem ser utilizados. Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma estirpe de Arenicola, ou outro ou um organismo relacionado e portanto, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou uma variante de espécies da região que codifica o polipeptideo da sequência de nucleotídeos. A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos com sequências de nucleotídeos que têm um grau de identidade à sequência que codifica o polipeptideo maduro da SEQ ID N0:1 (i.e., nucleotídeos 496 a 558) de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 65%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, e da forma mais preferível pelo menos 97% de identidade, que codificam um polipeptideo activo. A modificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo da presente invenção pode ser necessária para a síntese dos polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptideo. A expressão "substancialmente similar" ao polipeptideo refere-se a formas do polipeptideo que não ocorrem naturalmente. Estes polipeptídeos podem ser de alguma forma diferentes da engenharia do polipeptideo isolado da sua fonte nativa, por exemplo, variantes artificiais que são diferentes

enquanto à sua actividade específica, termostabilidade, pH óptimo, ou outros. A sequência da variante pode ser construída tendo como base a sequência de nucleotídeos apresentada como a região que codifica o polipeptideo da SEQ ID NO:l, e.g., uma subsequência da mesma, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não dão lugar a outra sequência de aminoácidos do polipeptideo codificado pela sequência de nucleotídeos, mas que correspondem ao uso do codão do organismo hospedeiro destinado à produção da enzima, ou por introdução de 21/63 substituições de nucleotideos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral da substituição de nucleotideos, ver, e.g., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Será evidente para os técnicos especializados que estas substituições podem ser feitas fora das regiões criticas para a função da molécula e ainda resultam num polipeptideo activo. Os resíduos de aminoácidos essenciais para a actividade do polipeptideo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção, e portanto preferencialmente não sujeitos a substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagénese dirigida ou mutagénese de varrimento de alanina (ver, e.g., Cunningham & Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Nesta última técnica, as mutações são introduzidas em cada resíduo carregado positivamente na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas enquanto à sua actividade antimicrobiana para identificar os resíduos de aminoácidos que são críticos para a actividade da molécula. Os sítios de interacção substrato-enzima também podem ser determinados por análise da estrutura tridimensional como o determinado por essas técnicas tais como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou marcação de f otoaf inidade (ver, e.g., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64) . A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptideo da presente invenção, que se hibridam em condições de baixa adstringência, preferencialmente em condições de adstringência média, mais preferencialmente em condições de adstringência média a alta, ainda mais preferencialmente em condições de alta adstringência, e da forma mais preferível em condições de adstringência muito alta com 22/ 63 (i) nucleotídeos 496 a 558 da SEQ ID NO:l, (ii) a sequência de ADNc contida nos nucleotídeos 1 a 558 da SEQ ID NO:l, ou (iii) uma cadeia complementar de (i) ou (ii) ; ou variantes alélicas e subsequências das mesmas (Sambrook et al., 1989, supra), como o definido na presente invenção. A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados obtidos por (a) hibridação de uma população de ADN em condições de adstringência baixa, média, média alta, alta, ou muito alta com (i) nucleotídeos 496 a 558 da SEQ ID N0:1, (ii) a sequência de ADNc contida nos nucleotídeos 1 a 558 da SEQ ID NO:1, ou (iii) uma cadeia complementar de (i) ou (ii) ; e (b) o isolamento do polinucleotídeo de hibridação, que codifica um polipeptídeo que tem actividade antimicrobiana.

Constructos de ácidos nucleicos A presente invenção refere-se também a constructos de ácidos nucleicos que compreendem um polinucleotídeo isolado da presente invenção ligado funcionalmente a uma ou mais sequências de controlo que dirigem a expressão da sequência codificante numa célula hospedeira adequada em condições compatíveis com as sequências de controlo.

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado numa variedade de maneiras para prover a expressão do polipeptídeo. A manipulação da 23/63 sequência do polinucleotídeo antes da sua inserção num vector pode ser desejável ou necessária dependendo do vector de expressão. As técnicas para modificar sequências polinucleotidicas utilizando métodos de ADN recombinante são bem conhecidos na técnica. A sequência de controlo pode ser uma sequência promotora apropriada, uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. A sequência prometora contém sequências de controlo transcripcionais que mediam a expressão do polipeptídeo. 0 promotor pode ser qualquer sequência de nucleotídeos que mostre actividade transcripcional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares tanto homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos constructos de ácidos nucleicos da presente invenção, especialmente numa célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do operão lac de E. coli, o gene de agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, o gene de levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, o gene de alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, o gene de amilase maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, o gene de alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, o gene de penicilinase (penP) de Bacillus lichenif ormis, os genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e o gene procariótico de beta-lactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), assim como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinant bactéria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. 24/ 63

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos constructos de ácidos nucleicos da presente invenção numa célula hospedeira filamentosa fúngica são promotores obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, assim como o promotor NA2-tpi (um hibrido dos promotores dos genes para a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

Num hospedeiro de levedura, os promotores úteis são obtidos dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldehído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/abertura) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotionina (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. 25/ 63 A sequência de controlo pode também ser uma sequência de terminação da transcrição adequada, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora está ligada funcionalmente ao terminal 3' da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras filamentosas fúngicas são obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra. A sequência de controlo pode também ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um ARNm que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está ligada funcionalmente ao terminal 5' da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Os lideres preferidos para células hospedeiras filamentosas fúngicas são obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans. 26/ 63

Os líderes adequados para as células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae. A sequência de controlo pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência ligada funcionalmente ao terminal 3' da sequência de nucleotideos e que, quando é transctita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar os resíduos de poliadenosina ao ARNm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As sequências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras filamentosas fúngicas são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum, e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.

As sequências de poliadenilação úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas por Guo & Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. A sequência de controlo pode também ser uma região codificante do peptídeo sinal que codifica uma sequência de aminoácidos ligada ao terminal amino de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo codificado na via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante da sequência de nucleotideos pode intrinsecamente conter uma região codificante do peptídeo sinal naturalmente ligado na grelha de leitura de tradução com o segmento da região codificante que codifica o polipeptídeo segregado. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma região codificante do 27/63 peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. A região codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida quando a sequência codificante não contém naturalmente uma região codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, a região codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a região codificante do peptídeo sinal natural para aumentar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer região codificante do peptídeo sinal que dirige o polipeptídeo expresso na via secretora de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As regiões codificantes do peptídeo sinal eficazes para as células hospedeiras bacterianas são as regiões codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes de amilase maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos sinais são descritos por Simonen & Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As regiões codificantes do peptídeo sinal eficazes para as células hospedeiras filamentosas fúngicas são as regiões codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens, e lipase de Humicola lanuginosa.

Num aspecto preferido, a região codificante do peptídeo sinal são os nucleotídeos 1 a 72 da SEQ ID NO:l que codificam os aminoácidos -165 a -142 da SEQ ID NO:2.

Os peptídeos sinais úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para alfa factor de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras 28/ 63 regiões codificantes úteis que codificam o peptídeo sinal são descritos por Romanos et al., 1992, supra. A sequência de controlo pode também ser uma região codificante do propeptídeo que codifica uma sequência de aminoácidos situada no terminal amino de um polipeptideo. 0 polipeptideo resultante é conhecido como uma proenzima ou propolipeptideo (ou nalguns casos um zimogénio). Um propolipeptideo é geralmente inactivo e pode ser convertido num polipeptideo maduro activo por clivagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo desde o propolipeptideo. A região codificante do propeptídeo pode ser obtido dos genes para protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Num aspecto preferido, a região codificante do propeptideo são os nucleotídeos 73 a 495 da SEQ ID N0:1 que codificam os aminoácidos -141 a -1 da SEQ ID N0:2.

Quando ambas as regiões do peptídeo sinal e as regiões do propeptídeo estão presentes no terminal amino de um polipeptideo, a região do propeptídeo está situado perto do terminal amino de um polipeptideo e a região do peptídeo sinal está situado perto do terminal amino da região do propeptídeo.

Pode também ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitam a regulação da expressão do polipeptideo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja activado ou desactivado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador.

Sistemas reguladores nos sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac, e trp. Na levedura, o sistema ADH2 ou o sistema GAL1 pode ser utilizado. Nos fungos filamentosos, o 29/63 promotor TAKA de alfa-amilase, promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados como sequências reguladoras. Outros exemplos de sequências reguladoras são as que permitem a amplificação do gene. Nos sistemas eucarióticos, estas incluem o gene da dihidrofolato reductase que é amplificada na presença de metotrexato, e os genes da metalotioneina que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a sequência de nucleotideos que codifica o polipeptídeo estará ligada funcionalmente à sequência reguladora.

Vectores de expressão A presente invenção refere-se também a vectores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotideo da presente invenção, um promotor, e sinais de paragem transcripcionais e translacionais. Os vários ácidos nucleicos e as sequências de controlo acima descritos podem ser unidos para produzir um vector de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou a substituição da sequência de nucleotideos que codifica o polipeptídeo nesses sítios. Alternativamente, uma sequência de nucleotideos da presente invenção pode ser expressa com a inserção da sequência de nucleotideos ou com um constructo de ácidos nucleicos que compreende a sequência num vector apropriado para a sua expressão. Ao criar o vector de expressão, a sequência codificante está localizada no vector de forma a que a sequência codificante esteja ligada funcionalmente às sequências de controlo apropriadas para a expressão. 0 vector de expressão recombinante pode ser qualquer vector (por exemplo, um plasmideo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de ADN recombinantes e pode provocar a expressão da sequência de nucleotideos. Habitualmente, a escolha do vector dependerá da compatibilidade do vector com a célula 30/63 hospedeira na qual o vector vai ser introduzido. Os vectores podem ser plasmideos lineares ou plasmídeos circulares fechados. 0 vector pode ser um vector de replicação autónoma, i.e., um vector que existe como uma entidade extracromossómica, cuja replicação é independente da replicação cromossómica, por exemplo um plasmídeo, um elemento extracromossómico, um minicromossoma, ou um cromossoma artificial. 0 vector pode conter qualquer meio para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vector pode ser um que, quando seja introduzido na célula hospedeira, fique integrado no genoma e seja replicado juntamente com o/os cromossoma(s) onde foi integrado. Além disso, pode ser usado um único vector ou plasmídeo ou dois ou mais vectores ou plasmídeos que juntos contêm o ADN total para ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposão.

Os vectores da presente invenção preferencialmente contêm um ou mais marcadores seleccionáveis que permitem a selecção fácil das células transformadas. Um marcador seleccionável é um gene cujo produto provê resistência biocida ou vírica, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofia, e outros.

Exemplos de marcadores seleccionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou de Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência antibiótica tal como resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol, ou tetraciclina. Marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores seleccionáveis para serem usados numa célula hospedeira filamentosa fúngica incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina-carbamoiltransferase) , bar (fosfinitricina acetiltransferase) , hph (higromicina

fosfotransferase) , niaD (nitrato-reductase) , pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) , e trpC (antranilato sintase), assim como os seus equivalentes. Os 31/63 preferidos para serem usados numa célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces higroscopicus.

Os vectores da presente invenção preferencialmente contêm um elemento(s) que permite(m) a integração do vector no genoma da célula hospedeira ou replicação autónoma do vector na célula independente do genoma.

Para integração no genoma da célula hospedeira, o vector pode depender da sequência do polinucleotideos que codifica o polipeptideo ou qualquer outro elemento do vector para a integração no genoma por recombinação homóloga ou recombinação não homóloga. Alternativamente, o vector pode conter sequências de nucleotideos adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira num lugar(es) preciso(s) no(s) cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade de integração num lugar preciso, os elementos integradores preferencialmente deverão conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10,000 pares de bases, preferencialmente 400 a 10,000 pares de bases, e da forma mais preferível 800 a 10,000 pares de bases, que têm um alto grau de identidade com a sequência alvo correspondente para aumentar a probabilidade da recombinação homóloga. Os elementos integradores podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integradores podem ser sequências de nucleotideos não codificantes ou sequências de nucleotideos codificantes. Além disso, o vector pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Para a replicação autónoma, o vector pode ainda compreender uma origem de replicação permitindo ao vector replicar-se de maneira autónoma na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador plasmídeo que medeie a replicação autónoma que funciona numa célula. A expressão "origem de 32/63 replicação" ou "replicador plasmídeo" é definido na presente invenção como uma sequência de nucleotideos que permite a um plasmídeo ou vector replicar-se in vivo.

Exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322; pUC19; pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUBUO; pE194; pTA1060, e ρΑΜβΙ que permitem a replicação em Bacillus.

Exemplos de origens de replicação para serem usadas numa célula hospedeira de levedura são as origens de replicação de 2 mícrones, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

Exemplos de origens de replicação úteis numa célula dos fungos filamentosos são AMAI e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67;

Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). 0 isolamento do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou de vectores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos descritos em WO 00/24883.

Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto génico. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou incluindo um gene marcador seleccionável amplificável com os polinucleotídeos onde as células que contêm cópias amplificadas do gene marcador seleccionável, e assim cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser seleccionadas cultivando as células na presença do agente seleccionável apropriado.

Os procedimentos utilizados para ligar os elementos acima descritos para construir os vectores de expressão recombinantes 33/63 da presente invenção sao bem conhecidos dos técnicos especializados (ver, e.g., Sambrook et al., 1989, supra). Células hospedeiras A presente invenção refere-se também às células hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, que são vantajosamente usadas na produção recombinante dos polipeptideos. Um vector que compreende um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido numa célula hospedeira de forma a que o vector seja mantido como um integral cromossómico ou como um vector extracromossómico auto-replicante como o anteriormente descrito. A expressão "célula hospedeira" abrange qualquer geração de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira depende em grande parte do gene que codifica o polipeptídeo e da sua fonte. A célula hospedeira pode ser um microrganismo unicelular, e.g., um microrganismo procariota, ou um microrganismo não unicelular, e.g., uma eucariota.

Os microrganismos unicelulares úteis são as células bacterianas tais como bactérias gram positivas incluindo, mas de forma não limitativa, uma célula de Bacillus, por exemplo Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis; ou uma célula de Streptomyces, e.g., Streptomyces lividans e Streptomyces murinus, ou bactérias gram negativas tais como E. coli e Pseudomonas sp. Num aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, ou Bacillus 34/63 subtilis. Noutro aspecto preferido, a célula de Bacillus é um Bacillus alcalofilico. A introdução de um vector numa célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efectuada por transformação do protoplasto (ver e.g., Chang & Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, e.g.,

Young & Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou

Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporação (ver, e.g., Shigekawa & Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, e.g.,

Koehler & Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278). A célula hospedeira pode também ser uma eucariota, tal como uma célula de mamífero, de insecto, de planta, ou fúngica.

Num aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula fúngica. "Fungos" como são utilizados na presente invenção inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como é definido por Hawksworth et al., in, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB

International, University Press, Cambridge, UK) assim como o Oomycota (como o citado por Hawksworth et al., 1995, supra, page 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Num aspecto mais preferido, a célula hospedeira dos fungos é uma célula de levedura. "Levedura" como é utilizada na presente invenção inclui levedura ascosporógena (Endomycetales) , levedura basidiosporogénea, e levedura que pertence aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Como a classificação das leveduras pode ser mudada no futuro, para os objectivos desta invenção, a levedura deverá ser definida como a descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., & Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium series No. 9, 1980). 35/63

Ainda num aspecto mais preferido, a célula hospedeira da levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia.

Num aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis. Noutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Noutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytica.

Noutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira dos fungos é uma célula dos fungos filamentosos. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como a definida por Hawksworth et al., 1995, supra) . Os fungos filamentosos geralmente são caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucano, quitosano, manano, e outros polissacarídeos complexos. 0 crescimento vegetativo é por alongamento hifal e o catabolismo de carbono é estritamente aeróbico. Por outro lado, o crescimento vegetativo por leveduras tal como Saccharomyces cerevisiae é por enxerto de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Num aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira dos fungos filamentosos é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bierkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma. 36/ 63

Num aspecto mais preferido, a célula hospedeira dos fungos filamentosos é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Noutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira dos fungos filamentosos é uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venatum. Noutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fúngica filamentosa é uma célula de uma célula da estirpe de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneiria, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, ou Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação dos protoplastos, transformação dos protoplastos, e a regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Os procedimentos adequados para a transformação das células hospedeiras de Aspergillus e de Trichoderma são descritos no Pedido de Patente europeia EP 238 023 e em Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Os métodos adequados para transformar espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e em WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker & 37/63

Guarente, in Abelson, J.N. & Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnem et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920 . Métodos de produção A presente invenção refere-se também a métodos para produzir um polipeptideo da presente invenção, gue compreende (a) cultivar uma célula, gue na sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptideo, em condições propícias para a produção do polipeptideo; e (b) recuperar o polipeptideo.

Preferencialmente, a célula é do género Arenicola, e mais preferencialmente Arenicola marina. A presente invenção refere-se também a métodos para produzir um polipeptideo da presente invenção, que compreende (a) cultivar uma célula hospedeira em condições propícias para a produção do polipeptideo; e (b) recuperar o polipeptideo. A presente invenção refere-se também a métodos para produzir um polipeptideo da presente invenção, que compreende

(a) cultivar uma célula hospedeira em condições propícias para a produção do polipeptideo, em que a célula hospedeira compreende uma sequência de nucleotídeos mutante que tem pelo menos uma mutação na região codificante do polipeptideo maduro da SEQ ID 38/63 N0:1, em que a sequência de nucleotídeos mutante codifica um polipeptideo que consiste nos aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2, e (b) recuperar o polipeptideo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas num meio nutritivo adequado para a produção do polipeptideo usando os métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por uma cultura num frasco de agitação, e fermentação a pequena escala ou a grande escala (incluindo, fermentação contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou de estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado num meio adequado e em condições que permitem que o polipeptideo seja expresso e/ou isolado. A cultura é feita num meio nutritivo adequado compreendendo fontes de nitrogénio e carbono e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis pelos fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (e.g., em catálogos da American Type Culture Collection) . Se o polipeptideo é segregado no meio nutritivo, o polipeptideo pode ser recuperado directamente do meio. Se o polipeptideo não é segregado, pode ser recuperado dos lisados celulares.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos. Por exemplo, um ensaio da actividade antimicrobiana pode ser usado para determinar a actividade do polipeptideo como a descrita na presente invenção. 0 polipeptideo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptideo pode ser recuperado do meio nutritivo por procedimentos convencionais de forma nao incluindo, mas de forma não limitativa a centrifugação, 39/ 63 filtração, extracção, secagem por pulverização, evaporaçao, ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (e.g., de troca iónica, de afinidade, hidrofóbica, de focagem isoeléctrica, e de exclusão por tamanho), procedimentos electroforéticos (e.g., focagem isoeléctrica preparatória), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amónio), SDS-PAGE, ou extracção (ver, e.g., Protein Purification, J.-C. Janson & Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Composições A presente invenção refere-se também a composições, tais como composições farmacêuticas, que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas com esse polipeptídeo. 0 termo "enriquecido" indica que a actividade antimicrobiana da composição foi aumentada, e.g., com um factor de enriquecimento de 1.1.

As composições podem também compreender outro agente farmaceuticamente activo, tal como um agente biocida adicional ou bioestático, tal como outro polipeptídeo antimicrobiano que exiba actividade antimicrobiana tal como o acima definido. 0 agente biocida pode ser um antibiótico, como o conhecido na técnica. Classes de antibióticos incluem penicilinas, por exemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas em combinação com inibidores de beta lactamase, cefalosporinas, por exemplo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactamo, etc.; carbapenemos; monobactamos; aminoglicosídeos; tetraciclina; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc. 0 agente biocida pode também ser um agente 40/ 63 anti-micótico, incluindo polienos, por exemplo, anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; e azóis, por exemplo, miconazol, cetoconazol, itraconazol e fluconazol.

Numa forma de realizar a invenção o agente biocida é um agente químico não enzimático. Noutra forma de realizar a invenção o agente biocida é um agente químico não polipeptídico.

As composições podem compreender um material portador adequado. As composições podem também compreender um veículo de entrega adequado capaz de administrar os polipeptídeos antimicrobianos da invenção no locus desejado quando as composições são usadas como um medicamento.

As composições do polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de um líquido ou de uma composição seca. Por exemplo, a composição do polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou de um microgranulado. 0 polipeptídeo para ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com os métodos conhecidos na técnica.

Seguidamente são dados exemplos de usos preferidos das composições do polipeptídeo da invenção. A dosificação da composição de polipeptídeos da invenção e outras condições nas que a composição é usada podem ser determinadas tendo como base os métodos conhecidos na técnica. Métodos e Usos A presente invenção também é dirigida a métodos para usar os polipeptídeos que têm actividade antimicrobiana. Os polipeptídeos antimicrobianos são habitualmente úteis em qualquer locus submetido à contaminação por bactérias, fungos, levedura ou algas. Habitualmente, os loci estão nos sistemas aquosos tal como sistemas de água de refrigeração, água de 41/63 enxaguamento de lavandaria, sistemas a óleo tal como óleos de corte, lubrificantes, campos de óleo e outros, onde os microrganismos têm que ser mortos ou onde o seu crescimento tem que ser controlado. No entanto, a presente invenção pode também ser usada em todas as aplicações para as quais as composições antimicrobianas conhecidas são úteis, tal como a protecção de madeira, látex, adesivo, cola, papel, cartão, têxtil, couro, plástico, vedantes, e alimentos.

Outros usos incluem a conservação de alimentos, bebidas, cosméticos tal como loções, cremes, géis, pomadas, sabões, champôs, suavizantes, antitranspirantes, desodorizantes, anti-sépticos bucais, produtos para lentes de contacto, formulações enzimáticas, ou ingredientes alimentares.

Portanto, os polipeptideos antimicrobianos da invenção podem ser úteis como um desinfectante, por exemplo, no tratamento de infecções oculares ou bucais, infecções cutâneas; como antitranspirantes ou desodorizantes; para a limpeza e a desinfecção das lentes de contacto e dos dentes (higiene oral).

Em geral é contemplado que os polipeptídeos antimicrobianos da presente invenção são úteis para limpar, desinfectar ou inibir o crescimento microbiano em qualquer superfície. Exemplos de superfícies, que podem vantajosamente ser contactadas com os polipeptídeos antimicrobianos da invenção são superfícies do equipamento de processo usado por exemplo nas indústrias lácteas, fábricas de processo químico ou farmacêutico, sistemas de saneamento de água, fábricas de processamento de óleos, fábricas de processamento de pasta de papel, fábricas de tratamento de água, e torres de arrefecimento. Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção deverão ser utilizados numa quantidade, que seja eficaz para limpar, desinfectar ou inibir o crescimento microbiano na superfície em questão. 42/63

Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem adicionalmente ser utilizados para limpar superfícies e utensílios de cozinha nas fábricas de processamento de alimentos e em qualquer área em que os alimentos são preparados e servidos tais como hospitais, clínicas e restaurantes.

Pode também ser usado como um agente de conservação ou um agente de desinfecção nas pinturas à base de água. A invenção refere-se também ao uso de um polipeptídeo antimicrobiano ou de uma composição da invenção como um medicamento. Além disso, um polipeptídeo antimicrobiano ou composição da invenção pode também ser usado para a produção de um medicamento para controlar ou combater os microrganismos, tais como organismos fúngicos ou bactérias, preferencialmente bactérias gram positivas. A composição e o polipeptídeo antimicrobiano da invenção podem ser utilizados como um agente antimicrobiano veterinário ou humano terapêutico ou profiláctico. Portanto, a composição e o polipeptídeo antimicrobiano da invenção podem ser utilizados na preparação de agentes veterinários ou humanos terapêuticos ou agentes profilácticos para o tratamento de infecções microbianas, tais como infecções bacterianas ou fúngicas, preferencialmente infecções bacterianas gram positivas. Em particular as infecções microbianas podem estar associadas a doenças pulmonares incluindo, mas de forma não limitativa, tuberculoses, pneumonia e fibrose cística; e doenças de transmissão sexual incluindo, mas de forma não limitativa, gonorreia e clamidia. A composição da invenção compreende uma quantidade eficaz do polipeptídeo antimicrobiano da invenção. A expressão "quantidade eficaz" quando é usada neste caso é entendida para significar como uma quantidade dos polipeptídeos 43/ 63 antimicrobianos da invenção, que é suficiente para inibir o crescimento dos microrganismos em questão. A invenção refere-se também a composições ou produtos para a curar feridas, tais como ligaduras, dispositivos médicos tais como por exemplo, cateteres e também produtos anticaspa para o cabelo, tais como champôs.

As formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção são administradas a um hóspede que sofre ou está predisposto a uma infecção microbiana. A administração pode ser tópica, localizada ou sistémica, dependendo do microrganismo específico, preferencialmente ele será localizado. Geralmente a dose dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção será suficiente para reduzir a população microbiana pelo menos aproximadamente 50%, normalmente pelo menos em 1 log, e pelo menos em 2 ou mais logs de morte. Os compostos da presente invenção são administrados numa dose que reduz a população microbiana enquanto é minimizado qualquer efeito secundário. É contemplado que a composição seja obtida e usada sob a orientação de um médico para o seu uso in vivo. Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção são particularmente úteis para matar bactérias gram negativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, e Chlamydia trachomatis; e bactérias gram-positivas, incluindo estreptococos tal como Streptococcus pneumonia, S. uberis, S. hyointestinalis, S. pyogenes e S. agalactiae; e estafilococos tal como Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus e S. camosus.

As formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser administradas a um hospedeiro que sofre ou é predisposto a sofrer uma infecção microbiana de pulmão, tal como pneumonia; ou uma infecção microbiana da ferida, tal como uma infecção bacteriana da ferida. 44/ 63

As formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem também ser administradas a um hospedeiro que sofre ou é predisposto a sofrer uma infecção da pele, tal como acne, dermatite atópica ou dermatite seborreica; preferencialmente a infecção da pele é uma infecção bacteriana da pele, por exemplo provocada por Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes, Pityrosporum ovale ou Malassezia furfur.

Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção também são úteis para formulações in vitro para matar micróbios, particularmente onde não é desejável introduzir quantidades de antibióticos convencionais. Por exemplo, os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser adicionados a preparações alimentares para animais e/ou humanos; ou podem ser incluídos como um aditivo para culturas celulares in vitro, para prevenir o crescimento excessivo de micróbios na cultura do tecido. A susceptibilidade de um micróbio particular para ser morto com os polipeptídeos antimicrobianos da invenção pode ser determinada mediante provas in vitro, como é detalhada na secção experimental. Habitualmente uma cultura do micróbio é combinada com o polipeptídeo antimicrobiano em concentrações variáveis durante um período de tempo suficiente para permitir que a proteína actue, normalmente entre aproximadamente uma hora e um dia. Os micróbios viáveis são seguidamente contados, e o nível de morte é determinado.

Os micróbios de interesse incluem, mas de forma não limitativa, bactérias gram-negativas, por exemplo: Citrobacter sp.;

Enterobacter sp. ; Escherichia sp. , e.g. E. coli; Klebsiella sp.; Morganella sp. ; Proteus sp. ; Providência sp. ; Salmonella sp., e.g. S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp., e.g. P. aeruginosa; Yersinia sp., e.g. Y. pestis, Y. Pseudotuberculosis, Y. enterocolitica; Franciscella sp. ; Pasturella sp. ; Vibrio sp., e.g. V. cholerae, V. 45/ 63 parahemolyticus; Campylobacter sp., e.g. C. jejuni; Haemophilus sp., e.g. H. influenzae, H. ducreyi; Bordetella sp., e.g. B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis; Brucella sp., Neisseria sppor e.g. N. gonorrhoeae, N. meningite, etc. Outras bactérias de interesse incluem Legionella sp., e.g. L. pneumophila; Listeria sp., e.g. L. monocytogenes; Mycoplasma sp., e.g. M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., e.g. M. tuberculoses, M. leprae; Treponema sp., e.g. T. pallidum; Borrelia sp., e.g. B. burgdorferi; Leptospirae sp.; Ricketsia sp., e.g. R. rickettsii, R. typhi; Chlamydia sp., e.g. C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci; Helicobacter sp., e.g. H. pylori, etc.

Os patogénicos não bacterianos de interesse incluem patogénicos fúngicos e patogénicos de protozoários, e.g. Plasmodia sp., e.g. P. falciparum, Trypanosoma sp., e.g. T. brucei; Schistomas; Entaemoeba, Cryptococcus sp., Candida sp., e.g. C. albicans; etc. Vários métodos de administração podem ser empregues. A formulação do polipeptídeo pode ser dada oralmente, ou pode ser injectada por via intravascular, subcutaneamnete, peritonealmente, por aerossol, oftalmicamente, intra-bexiga, topicamente, etc. Por exemplo, os métodos de administração por inalação são bem conhecidos na técnica. A dose da formulação terapêutica variará muito, dependendo do polipeptídeo antimicrobiano específico a ser administrado, da natureza da doença, da frequência de administração, da forma de administração, da depuração do agente hospedeiro, e outros. A dose inicial pode ser maior, seguida de doses de manutenção mais pequenas. A dose pode ser administrada de forma pouco frequente como semanal ou bissemanal, ou fraccionada em doses mais pequenas e administradas uma vez ou várias vezes, diariamente, dia sim dia não, etc. para manter um nível de dosificação eficaz. Em muitos casos, a administração oral requererá uma dose mais alta do que se esta fosse administrada por via intravenosa. 46/63

As ligações amido, assim como os terminais de amino e carboxi, podem ser modificadas para uma maior estabilidade na administração oral. Por exemplo, o terminal carboxi pode ser amidado.

Formulações

Os compostos desta invenção podem ser incorporados numa variedade de formulações para a administração terapêutica. De forma mais particular, os compostos da presente invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas por combinação com portadores apropriados aceitáveis na Indústria Farmnacêutica ou diluentes, e podem ser formulados em preparações em formas sólidas, semi-sólidas, liquidas ou gasosoas, tais como comprimidos, cápsulas, pó, grânulos, pomadas, cremes, espumas, soluções, supositórios, injecções, inaladores, géis, microesferas, loções, e aerossóis. Como tal, a administração dos compostos pode ser obtida de várias maneiras, incluindo administração oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, etc.. Os polipeptideos antimicrobianos da invenção podem ser sistémicos depois da administração ou podem ser localizados pelo uso de um implante ou outra formulação que actue para reter a dose activa no sítio de implantação.

Numa forma de realizar a invenção, uma formulação para uso tópico compreende um agente quelante que reduz a concentração eficaz de catiões bivalentes, particularmente cálcio e magnésio. Por exemplo, agentes tais como citrato, EGTA ou EDTA podem ser incluídos, onde o citrato é preferido. A concentração de citrato usualmente será de aproximadamente 1 a 10 mM.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados sozinhos, combinados entre si, ou podem ser utilizados em combinação com outros compostos conhecidos (por exemplo perforina, agentes anti-inflamatórios, antibióticos, etc.). Nas 47/63 formas de dosagens farmacêuticas, os compostos podem ser administrados na forma dos seus sais aceites na Indústria Farmacêutica. Os seguintes métodos e excipientes são meramente ilustrativos e de maneira nenhuma são limitativos.

Para as preparações orais, os compostos podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com aditivos apropriados para fazer comprimidos, pó, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, tais como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com aglutinantes, tais como celulose cristalina, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegradores, tais como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose de sódio; com lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio; e se desejável, com diluentes, agentes tampão, agentes humidificantes, agentes conservantes e aromatizantes.

Os compostos podem ser formulados em preparações para injecções dissolvendo, suspendendo ou emulsionando num solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleos vegetais ou outros óleos idênticos, glicéridos de ácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou polipropilenoglicol; e se desejável, com aditivos convencionais tais como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizadores e conservantes.

Os compostos podem ser utilizados na formulação de aerossóis para serem administrados por inalação. Os compostos da presente invenção podem ser formulados em propelentes pressurizados aceitáveis tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogénio e outros.

Os compostos podem ser utilizados como loções, por exemplo para prevenir a infecção de queimaduras, por formulação com aditivos convencionais tais como solubilizantes, agentes isotónicos, 48/63 agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizadores e conservantes.

Além disso, os compostos podem ser feitos em supositórios mediante a mistura com uma variedade de bases tal como bases emulsionantes ou bases hidrossolúveis. Os compostos da presente invenção podem ser administrados por via rectal via um supositório. 0 supositório pode incluir veículos tal como manteiga de cacau, polietilenoglicol e glicóis de politileno, que derretem à temperatura corporal, são ainda solidificados à temperatura ambiente.

Formas de doses unitárias para a administração oral ou rectal tal como xaropes, elixires, e suspensões podem ser providas em que cada unidade de dose, por exemplo, colher de chá, colher da sopa, pastilha ou supositório, contém uma quantidade predeterminada da composição contendo um ou mais compostos da presente invenção. De maneira similar, formas de dose unitária para injecção ou administração intravenosa podem compreender o composto da presente invenção numa composição como uma solução em água estéril, solução salina normal ou outro portador aceite na Indústria Farmacêutica.

Os implantes para formulações de libertação sustentada são bem conhecidos na técnica. Os implantes são formulados como microesferas, tiras, etc. com polímeros biodegradáveis ou não biodegradáveis. Por exemplo, polímeros de ácido láctico e/ou ácido glicólico formam um polímero que é passível de erosão que é bem tolerado pelo hospedeiro. 0 implante que contém os polipeptídeos antimicrobianos da invenção é colocado perto do sítio de infecção, de forma a que a concentração local do agente activo seja aumentada em relação ao resto do corpo. A expressão "forma de dose unitária", como é utilizada na presente invenção, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como doses unitárias para sujeitos humanos e sujeitos 49/63 animais, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de compostos da presente invenção calculada numa quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente aceite na Indústria Farmacêutica, portador ou veiculo. As especificações para as formas de dose unitária da presente invenção dependem do composto particular empregue e o efeito a ser obtido, e a farmacodinâmica associada ao composto no hospedeiro.

Os excipientes aceites na Indústria Farmacêutica, tal como veículos, adjuvantes, suportes ou diluentes, estão facilmente disponíveis ao público. Além disso, as substâncias auxiliares aceites na Indústria Farmacêutica, tais como agentes reguladores e de tampão do pH, agentes reguladores da tonicidade, estabilizadores, agentes humidificantes e outros, estão facilmente disponíveis ao público.

As dose habituais para a administração sistémica variarão por administração desde 0.1 pg a 100 miligramas por kg de peso do sujeito. Uma dose habitual pode ser uma pastilha tomada entre duas a seis vezes ao dia, ou uma cápsula ou pastilha de libertação gradual tomada uma vez ao dia e contendo um teor proporcionalmente mais alto do ingrediente activo. O efeito da libertação gradual pode ser obtido por materiais de cápsula que são dissolvidos a valores de pH diferentes, por cápsulas que se vão libertando lentamente por pressão osmótica, ou por qualquer outro meio conhecido de libertação controlada.

Os especilaistas apreciarão facilmente que os níveis de doses podem variar em função do composto específico, da gravidade dos sintomas e da susceptibilidade do sujeito aos efeitos secundários. Alguns dos compostos específicos são mais potentes que outros. As doses preferidas para um composto dado são facilmente determináveis pelos técnicos especializados por uma variedade de meios. Um meio preferido é o de medir a potência fisiológica de um composto dado. 50/ 63 0 uso de lipossomas como um veículo de entrega é um método de interesse. Os lipossomas são fundidos com as células do sítio alvo e entregam o teor do lúmen intracelularmente. Os lipossomas são mantidos em contacto com as células durante um tempo suficiente para a fusão, usando diferentes meios para manter o contacto, tal como isolamento, agentes aglutinantes, e outros. Num aspecto da invenção, os lipossomas estão desenhados em aerossol para a administração pulmonar. Os lipossomas podem ser preparados com proteínas purificadas ou peptídeos gue medeiam a fusão das membranas, tal como vírus de Sendai ou vírus da gripe, etc. Os lípidos podem ser qualquer combinação útil de lípidos conhecidos que formam lipossomas, incluindo lípidos catiónicos ou não iónicos, tal como a fosfatidilcolina. 0 lípido restante normalmente será um lípido neutro ou lípido ácido, tal como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol, e outros.

Para preparar os lipossomas, pode ser usado o método descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Resumidamente, os lípidos e a composição de lúmen que contêm os peptídeos são combinados num meio aquoso apropriado, convenientemente um meio salino onde os sólidos totais estarão na gama de aproximadamente entre 1 e 10 por cento em peso. Depois de agitação intensa durante períodos curtos de tempo, de aproximadamente entre 5 e 60 seg., o tubo é colocado num banho de água quente, entre aproximadamente 25 e 40 °C e este ciclo é repetido entre aproximadamente 5 e 10 vezes. Seguidamente a composição é submetida a ultra-sons durante um período de tempo conveniente, geralmente entre aproximadamente 1 e 10 seg. e além disso pode ser agitado com vórtex. O volume é seguidamente expandido adicionando um meio aquoso, geralmente aumentando o volume entre aproximadamente 1 e 2 vezes, seguido de agitação e arrefecimento. Este método permite a incorporação no lúmen de moléculas com alto peso molecular.

Formulações com outros agentes activos 51/63

Para o uso nos métodos em questão, os polipept ídeos antimicrobianos da invenção podem ser formulados com outros agentes farmaceuticamente activos, particularmente outros agentes antimicrobianos. Outros agentes de interesse incluem uma grande variedade de antibióticos, como os conhecidos na técnica. As classes de antibióticos incluem penicilinas, por exemplo penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas em combinação com inibidores de beta-lactamase, cefalosporinas, por exemplo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactamo, etc.; carbapenemos; monobactamos; aminoglicosideos; tetraciclina; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc.

Agentes antimicóticos também são úteis, incluindo polienos, por exemplo anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; e azóis, por exemplo miconazol, cetoconazol, itraconazol e fluconazol. Os medicamentos tuberculinicos incluem isoniazida, etambutol, estreptomicina e rifampicina. As citoquinas podem também ser incluídas numa formulação dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção, por exemplo interferão gama, factor alfa de necrose tumoral, interleucina 12, etc. Síntese in vitro

Os peptídeos antimicrobianos da invenção podem ser preparados por síntese in vitro, usando métodos convencionais como os conhecidos na técnica. Vários aparelhos comerciais sintéticos estão disponíveis, por exemplo sintetizadores automatizados de Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Usando os sintetizadores, os aminoácidos de origem natural podem ser substituídos por aminoácidos não naturais, particularmente D-isómeros (ou D-formas) por exemplo D-alanina e D-isoleucina, diastereoisómeros, cadeias laterais que têm comprimentos ou funções diferentes, e 52/ 63 outras. A sequência particular e a forma de preparação serão determinadas por conveniência, economia, pureza requerida, e outras. A ligação química pode ser provida a vários peptídeos ou proteínas compreendendo funcionalidades convenientes para a ligação, tal como grupos amino para a formação de amido ou amina substituído, por exemplo aminação reductiva, grupos tiol para a formação de tioéter ou de dissulfureto, grupos carboxil para formação de amido, e outros.

Se desejável, vários grupos podem ser introduzidos no peptídeo durante a síntese ou durante a expressão, que permitem a ligação a outras moléculas ou a uma superfície. Assim as cisteínas podem ser utilizadas para fazer tioéteres, histidinas para ligação a um complexo do ião metálico, grupos carboxil para formar amidas ou ésteres, grupos amino para formar amidas, e outros.

Os polipeptídeos podem também ser isolados e purificados de acordo com métodos convencionais de síntese recombinante. Um lisado pode ser preparado do hospedeiro da expressão e o lisado purificado usando HPLC, cromatografia de exclusão, electroforese de gel, cromatografia de afinidade, ou outra técnica da purificação. A maior parte das composições que são usadas compreenderão pelo menos 20% em peso do produto desejado, mais habitualmente pelo menos aproximadamente 75% em peso, preferencialmente pelo menos aproximadamente 95% em peso, e para fins terapêuticos, habitualmente pelo menos aproximadamente 99.5% em peso, em relação com contaminantes relacionados com o método de preparação do produto e a sua purificação. Habitualmente, as percentagens estarão baseadas na proteína total A presente invenção é mais detalhadamente descrita pelos seguintes exemplos que não deverão ser interpretados como limitativos do âmbito da invenção. 53/ 63

EXEMPLOS

Os produtos químicos utilizados como tampões e substratos foram produtos comerciais com pelo menos grau reactivo. Nos exemplos seguintes, o polipeptídeo antimicrobiano mostrado como aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2 é referido como "Arenicina". EXEMPLO 1

Actividade antimicrobiana da Arenicina 0 peptídeo antimicrobiano mostrado como aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 2 foi preparado sinteticamente. A Concentração Mínima Inibidora (CMI) foi determinada para testar a actividade antimicrobiana da Arenicina seguindo as directrizes do NCCLS de CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute; anteriormente conhecido como National Committee for Clinicai and Laboratory Standards) - protocolo M7-A6, vol. 20, No. 2: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bactéria That Grow Aerobically. O peptídeo antimicrobiano da invenção foi testado em relação a 12 estirpes bacterianas obtidas do American Type Culture Collection (ATCC). No quadro 1 os resultados são valores médios de duas avaliações independentes.

Quadro 1. Actividade antimicrobiana da Arenicina.

Estirpe Número de acesso CMI Escherichia coli ATCC 25922 0.25 pg/mL Escherichia coli ATCC 25404 0.5 pg/mL 54/63

Enterobacter aerogenes ATCC 13048 1 pg/mL Enterobacter cloacae ATCC 13047 1 pg/mL Shigella sonnei ATCC 11060 0.5 pg/mL Citrobacter freundii ATCC 8090 1 pg/mL Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 0.5 pg/mL Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 1 pg/mL Stenotrophomonas maltophlila ATCC 13637 1 pg/mL Aeromonas salmonicida ATCC 14174 2 pg/mL Acinetobacter iwoffii ATCC 15309 0.25 pg/mL Moraxella catarrhalis ATCC 25238 <0.06 pg/mL EXEMPLO 2

Concentração mínima inibidora contra fungos clínicos

As concentrações mínimas inhibidoras de Arenicina em relação às leveduras e fungos foram determinadas essencialmente como o descrito por NCCLS/CLSI (Clinicai and Laboratory Standards

Institute).

Em resumo, a suspensão fúngica ou de leveduras de aproximadamente 1 unidade McFarland foi diluída 1:100 num caldo PD (8 g/L de dextrose de batata) e o crescimento foi avaliado em relação às diluições de 2 vezes em série de Arenicina (0.03-32 pg/mL). As placas de ensaio foram incubadas a 25-27 °C para Candida albicans, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes e Epidermophyton floccosum, e a 30 °C para Candida glabrata, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e Aspergillus niger. O crescimento foi registado visualmente (a olho nu, iluminação oblíqua) depois de 55/ 63

Os resultados sao aproximadamente 40 horas de incubaçao. apresentados abaixo no quadro 2.

Quadro 2. Actividade antimicrobiana da Arenicina.

Estirpe Número de acesso CMI Candida albicans ATCC 10231 4 yg/mL Candida albicans ATCC 28517 8 yg/mL Candida albicans ATCC 18804 8 yg/mL Candida tropicalis DSM 11953 2 yg/mL Candida glabrata DSM 11226 16 yg/mL Cryptococcus neoformans DSM 11959 1 yg/mL Pichia pastoris ATCC 201178 4 yg/mL Pichia pastoris ATCC 20864 2 yg/mL Saccharomyces cerevisiae DSM 1333 8 yg/mL Aspergillus niger ATCC9642 8 yg/mL Trichophyton mentagrophytes DSM 4870 8 yg/mL 56/ 63

LISTA DE SEQUÊNCIAS 57/ 63 <110> Novozymes A/S <120> Polipeptídeos que têm actividade antimicrobiana <13 0> 10865.204-WO <160> 2 <17 0> Patentin versão 3.3 <210> 1 <211> 558 <212> ADN <213> <220> Arenicola marina <221> CCS <222> <220> (1)..(558) <221> sig_peptídeo <222> <220> (D · · (72) <221> mat_peptideo <222> (496)..(558) <400> 1 &tg gça tat tCB atg asc atç gee ctg gtt tac gee aeg gta ctt 45 Ket gyi $*L MeL Abll He Ala Leu Vai Tyr Ala Tnr Vai Leu -us -160 -155 att qgt gta ctg cst gtc ggc ggc ata cac tgt aac aac cag ata 30 lis Siy vai Leu His Vai Gly Gly lie His Cys Asn Asn Gin He -ISO -145 -140 cag gag ttt gat ttg gcg ggc gat ssg ttt gtg ata gac gee gag 135 Gin Glu Phe Asp Leu Ala Gly Asp Lye Phs Vai Ile Asp Ala Glu -13b -130 -125 aac 53C agg ges gtc ate caa ctc tcg gac gga gat ctc gaa gga ISO Agn As π Arg Glu Vai ile Gin Leu Ser Asp Gly Asp Leu Glu Gly -120 -115 -110 tct etc atg gtc ate gac cac gee aag agt ctg att ggc tgg ttc att 226 Ser He Met Vai Ue Aap His Ala Lys Ser Leu Ile Gly Trp Phe Ile -105 -100 -S>$ -00 ccg aac . ãCt 1 gat gag tgt tac ctg att ggc ggg gtg gac sgg aag ttg 276 Pro Asn 1 Thr Asp Glu Cys Tyr Leu Ile Gly Gly Vai Asp Arg Lys Leu -85 -80 -75 ctg. gac tcc í sgg gag ctt ttg gca caa ttt caa gcc gga cag ttt aag 324 Leu Asp , 5«e Arg Glu Leu Leu Ala Gin Phe Gin Ala Gly Gin Phe Lys -70 -55 -60 gaa act i gcg gac gag gac gtg gag gac tcg ctg acc tac gtc aag gtc 372 Glu Thr Ala Asp Glu Aap Vai filu Asp s©r Leu Thr Tyr Vai Lys Vai -55 -50 -45 g&c gsc cgt gag gtc agt gac ctg agt ctg ttg cca aat gag ctt ctg 420 asp Aso Arg Glu Vai Ser Asp Leu Ser Leu Leu Pro Asn Glu Leu Leu -40 -35 -30 gag ccc tgc tcg gga aag gac gtc ttc tgg ctg gag agg aac aac ate 469 ^lu Pro Cvs Ser Gly Lys Asp Vai Phe Trp Leu Glu Arg Asn Asn He -25 -20 -15 -10 caq aga acg ggc aat cgg cag aag sga ggt ttc tgc tgg tac gtc tgc 516 Sln Arg Thr Gly Asn Arg Gin Lys Arg Gly Phe Cys Trp Tyr vai cys -5 -1 1 5 gtc tac agg asc gga gtc ege gtc tgc tac cga cgg tgc aac 558 Vai ?yr Ara Asn Gly vai Arg Vsl Cya Tyr Arg Arg Cys Açn 10* 15 20

<210> 2 <211> 186 <212> PRT <213> Arenicola marina <400> 2 58/63

Met Gly .yt Ser Met Asn Ile Ala Lsu Vai Tyr Ala Thr Vai Leu -165 -160 -155 lie Gly Val Leu His Vai 01y Gly Ile His Cys Asn Aen Gin lie -150 -145 -140

Gin Glu Phe Asp Leu Ala 01y Asp lys Phe vai Ile Asp Ala Olu -135 -130 ' -125

Asn Asn Arg Glu Val lie Oln L&u Sss Asp Gly Asp Leu Glu Gly -120 -115 -110

Ser Ile Met Vsl lie Asp His Ala Lys Ser Leu Ile Gly Trp Phé lie -105 -100 -Ϊ5 -90

Pro Açu Thr Asp Glu Cys Tyr Leu Ile Gly Gly Val Asp Axg Lys Leu -35 -G0 -75

Leu Asp &er Arg Glu Lqu Leu Ais Gin Phe Gin Ala Gly Gin Phe Lys -T0 -65 -60

Glu chi Ala Asp Glu Asp val Glu Asp Ser Leu Thr Tyr Val Lys Val -55 -50 -45 .

Asp Asp Arg Glu Val Ser Asp Leu Ser Leu Leu Pro Asn Glu Leu Leu -40 -35 -30

Glu Pro Cys Ser Gly Lys Asp Val Phe Trp Leu GlU Arg Asn Asn ile -25 -20 -15 -10 Gin Arg Thr Gly Asn Arg Gin Lys Arg Gly Phe. Cys Trp Tyr Val Cys -5 “1 1 5 Val Tyr Arg Agn Gly Val Arg Val Cys Tyr Arg Arg Cys Asn 10 15 20

Lisboa, 30 de Junho de 2010 59/63

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de Pedidos de Patente citadas na descrição

• WO 9517413 A • WO 9522625 A • US 5223409 A • WO 9206204 A • WO 0056900 A

• WO 9600787 A • WO 9533836 A • WO 0024883 A • EP 238023 A

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Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um polipeptídeo que têm actividade antimicrobiana, que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade com os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.
2. 2. O Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de aminoácidos ter pelo menos 75% de identidade com os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.
3. 3. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizado por a sequência de aminoácidos ter pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.
4. 4. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por a sequência de aminoácidos ter pelo menos 85% de identidade com os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 2 .
5. 5. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por a sequência de aminoácidos ter pelo menos 90% de identidade com os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 2 .
6. 6. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por a sequência de aminoácidos ter pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 2 .
7. 7. O polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por este compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2.
8. 8. O polipeptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por este consistir na SEQ ID NO:2. 1/3 9. 0 polipeptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por este consistir nos aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:2.
9. 10. Um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotideos que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 9.
10. 11. Um constructo de ácidos nucleicos que compreende o polinucleotídeo da reivindicação 10 liqado funcionalmente a uma ou mais sequências de controlo que diriqem a produção do polipeptídeo num hospedeiro de expressão.
11. 12. Um vector de expressão recombinante que compreende o constructo de ácidos nucleicos da reivindicação 11.
12. 13. Uma célula hospedeira recombinante que compreende o constructo de ácidos nucleicos da reivindicação 11.
13. 14. Um método para produzir o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 caracterizado por este compreender (a) cultivar uma célula que na sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, ou cultivar uma célula hospedeira que compreende um constructo de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de nucleotideos que codifica o polipeptídeo, em condições propícias para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
14. 15. Uma composição que compreende um polipeptídeo antimicrobiano como o definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 e um veículo aceite na Indústria Farmacêutica. 2/3
15. 16. Um método in vitro para matar ou inibir o crescimento das células microbianas, que compreende contactar as células microbianas com um polipeptídeo antimicrobiano como o definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9.
16. 17. Um polipeptídeo antimicrobiano como o definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 para ser usado como um medicamento.
17. 18. Uso de um polipeptídeo antimicrobiano como o definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 na preparação de um agente veterinário ou agente terapêutico humano para o tratamento de uma infecção microbiana. Lisboa, 30 de Junho de 2010 3/3