BRPI0614968A2

BRPI0614968A2 - polipeptìdeo, polinucleotìdeo, construção de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, e um polinucleotìdeo, e para matar ou inibir o crescimento de células microbianas, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, composição, e, uso de um polipeptìdeo antimicrobiano

Info

Publication number: BRPI0614968A2
Application number: BRPI0614968-5A
Authority: BR
Inventors: Nikolaj Spodsberg
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2005-08-26
Filing date: 2006-08-22
Publication date: 2011-10-18
Also published as: CN101248085B; CN102643337A; ES2343586T3; WO2007023163A1; ZA200801426B; DE602006013330D1; KR20080048477A; CA2620125C; EP1922333B1; EP1922333A1; MX2008002485A; JP2013100301A; TWI386416B; PT1922333E; SI1922333T1; RU2008111504A; PL1922333T3; IL189135A0; RS51325B; CA2620125A1

Abstract

POLIPEPTìDEO, POLINUCLEOTìDEO, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLéICO, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, CéLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MéTODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTìDEO, E UM POLINUCLEOTìDEO, E PARA MATAR OU INIBIR O CRESCIMENTO DE CéLULAS MICROBIANAS, PLANTA TRANSGêNICA, PARTE DE PLANTA OU CéLULA DE PLANTA, COMPOSIçãO, E, USO DE UM POLIPEPTìDEO ANTIMICROBIANO. A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade antimicrobiana e polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos. A invenção também refere-se a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

"POLIPEPTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, E UM POLINUCLEOTÍDEO, E PARA MATAR OU INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULAS MICROBIANAS, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UM POLIPEPTÍDEO ANTIMICROBIANO" Listagem de seqüência

A presente invenção compreende uma listagem de seqüência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade antimicrobiana e polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos. a invenção também refere-se a construção de ácidos nucleicos, vetores, e célula hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos assim com métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

E um objeto da presente invenção prover polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade antimicrobiana selecionados dentre o grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 60% identidade com aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2;

(b) um polipeptídeo que é codificado por a seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência média com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:1, (ii) uma seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:1, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii);

(c) uma variante compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2; e

(d) um fragmento de (a) ou (b) que tem atividade antimicrobiana.

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados codificando polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana, selecionados dentre o grupo consistindo de:

(a) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 60% identidade com aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2;

(b) um polinucleotídeo tendo pelo menos 60% identidade com nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l; e (c) um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência média com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) uma seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii).

A presente invenção também refere-se a construção de ácido nucleicos, vetores de expressão recombinante, e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos.

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir estes polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana compreendendo (a) cultivar a célula hospedeira recombinante compreendendo a construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo sob condições condutivas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção também refere-se a métodos de usar os polipeptídeos e polinucleotídeos da invenção.

DEFINIÇÕES

Atividade antimicrobiana: O termo "atividade antimicrobiana " é definido aqui como uma atividade que é capaz de matar ou inibir crescimento de células microbianas. No contexto da presente invenção o termo "antimicrobiana " se destina a significar que ele tem um efeito bactericida e/ou um efeito bacteriostático e/ou fungicida e/ou fungistático e/ou um efeito virucida, em que o termo "bactericida" deve ser entendido como capaz de matar células bacterianas. O termo "bacteriostático" deve ser entendido como capaz de inibir crescimento bacteriano, isto é inibir o crescimento de células bacterianas. O termo "fungicida" deve ser entendido como capaz de matar células fungicas. O termo "fungistático" deve ser entendido como capaz de inibir crescimento fungico, isto é inibir o crescimento de células fungicas. O termo "virucida" deve ser entendido como capaz de inativar vírus. O termo "células microbianas" denota células bacterianas ou fungicas (incluindo leveduras).

No contexto da presente invenção o termo "inibir crescimento de células microbianas" se destina a significar que as células se encontram em um estado de não crescimento, isto é, que elas não são capazes de propagar.

Para fins da presente invenção, atividade antimicrobiana pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito por Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991 ). Alternativamente, atividade antimicrobiana pode ser determinada de acordo com as diretrizes de NCCLS de CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute; antes conhecido como National Committee for Clinicai and Laboratory Standards).

Polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana podem ser capazes de reduzir o número de células vidas de Escheríchia coli (DSM 1576) a 1/100 após 24 horas (preferivelmente após 12 horas, mais preferivelmente após 8 horas, mais preferivelmente após 4 horas, mais preferivelmente após 2 horas, o mais preferivelmente após 1 hora, e em particular após 30 minutos) incubação a 20°C em uma solução aquosa de 25% (p/p); preferivelmente em uma solução aquosa de 10% (p/p); mais preferivelmente em uma solução aquosa de 5% (p/p); ainda mais preferivelmente em uma solução aquosa de 1 % (p/p); o mais preferivelmente em uma solução aquosa de 0.5% (p/p); e em particular em uma solução aquosa de 0.1 % (p/p) dos polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana.

Polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana também podem ser capazes de inibir o crescimento excedente de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25°C em um substrato de crescimento microbiano, quando adicionados em uma concentração de 1000 ppm; preferivelmente quando adicionados em uma concentração de 500 ppm; mais preferivelmente quando adicionados em uma concentração de 250 ppm; ainda mais preferivelmente quando adicionados em uma concentração de 100 ppm; o mais preferivelmente quando adicionados em uma concentração de 50 ppm; e em particular quando adicionados em uma concentração de 25 ppm.

Polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana podem ser

capazes de reduzir o número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 após 24 horas (preferivelmente após 12 horas, mais preferivelmente após 8 horas, mais preferivelmente após 4 horas, mais preferivelmente após 2 horas, o mais preferivelmente após 1 hora, e em particular após 30 minutos) de incubação a 20°C em uma solução aquosa de 25% (p/p); preferivelmente em uma solução aquosa de 10% (p/p); mais preferivelmente em uma solução aquosa de 5% (p/p); ainda mais preferivelmente em uma solução aquosa de 1 % (p/p); o mais preferivelmente em uma solução aquosa de 0.5% (p/p); e em particular em uma solução aquosa de 0,1 % (p/p) dos polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana.

Polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana também podem ser capazes de inibir o crescimento excedente de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 250C em um substrato de crescimento microbiano, quando adicionados em uma concentração de 1000 ppm; preferivelmente quando adicionados em uma concentração de 500 ppm; mais preferivelmente quando adicionados em uma concentração de 250 ppm; ainda mais preferivelmente quando adicionados em uma concentração de 100 ppm; o mais preferivelmente quando adicionados em uma concentração de 50 ppm; e em particular quando adicionados em uma concentração de 25 ppm.

Os polipeptídeos da presente invenção tem pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95%, e mesmo o mais preferivelmente pelo menos 100% da atividade antimicrobiana do polipeptídeo consistindo de uma seqüência de aminoácido mostrada como aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2.

Polipeptídeo isolado: O termo " polipeptídeo isolado" como usado aqui refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro, preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, o mais preferivelmente pelo menos 90% puro, e mesmo o mais preferivelmente pelo menos 95% puro, como determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo " polipeptídeo substancialmente puro " denota aqui uma preparação de polipeptídeo que contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente no máximo 1 %, e mesmo o mais preferivelmente no máximo 0.5% em peso de outro material de polipeptídeo com o qual ele está nativamente associado. Assim, prefere-se que o, polipeptídeo substancialmente puro seja pelo menos 92% puro, preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99%, o mais preferivelmente pelo menos 99.5% puro, e ainda o mais preferivelmente 100% puro em peso do material de polipeptídeo de presente na preparação.

Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura. Em particular, prefere-se que os polipeptídeos estejam em uma "forma essencialmente pura", isto é, que o preparação de polipeptídeo é essencialmente isenta de outro material de polipeptídeo com que está nativamente associado. Isto pode ser obtido, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por meio de métodos recombinante bem conhecido ou por métodos de purificação clássicos.

Aqui, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" é sinônimo com os termos " polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo em foram isolada"

Identidade: O parentesco entre as duas seqüências de aminoácido ou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrito pelo parâmetro identidade".

Para fins da presente invenção, o grau de identidade entre duas seqüências de aminoácido é determinado por uso do programa FASTA incluído em versão 2.0x do pacote do programa FASTA (ver W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; e W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison com FASTP e FASTA", Methods em Enzymology 183:63-98). A matriz de classificação usada foi BLOSUM50, a penalidade de espaço foi -12, e a penalidade de extensão de espaço foi -2. O grau de identidade entre as duas seqüências de nucleotídeo é determinada usando o mesmo algoritmo e pacote de software como mencionado acima. A matriz de classificação usada foi a matriz de identidade, penalidade de espaço foi -16, e penalidade de extensão de espaço foi -4. Alternativamente, um alinhamento de duas seqüências de aminoácido é determinado usando o programa Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, penalidade de abertura de espaço é 10, e penalidade de extensão de espaço é 0.5. O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácido da presente invenção (como aminoácidos 1 a 43 de SEQ ID NO:2) e uma seqüência de aminoácido diferente é calculado como o número exato de correspondências das duas seqüências, dividido pelo comprimento (número de resíduos de aminoácido) de uma seqüência da presente invenção; ou alternativamente a saída de Needle rotulada " identidade mais longa" é usada como a identidade percentual e é calculada como a seguir: (Resíduos idênticos χ 100)/(extensão de alinhamento - número de espaços em alinhamento). O resultado é expressado em identidade percentual.

Fragmento de polipeptídeo: O termo " fragmento de polipeptídeo " é definido aqui como um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos selecionado dentre o término amino e/ou carboxila de SEQ ID NO:2 ou uma seqüência homóloga do mesmo, em que o fragmento tem atividade antimicrobiana. Em uma forma de realização o fragmento inclui, pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 16, mais preferivelmente pelo menos 17, ainda mais preferivelmente pelo menos 18, o mais preferivelmente pelo menos 19 e em particular pelo menos 20 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:2.

Subseqüência: O termo "subseqüência" é definido aqui como uma seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotídeos deletados da extremidade 5' e/ou 3' de SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga do mesmo, em que a subseqüência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana.

Variante alélica: O termo "variantes alélicas" denota aqui qualquer uma ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. As mutações de genes podem ser silentes (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácido alteradas. As variantes alélicas de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo " polinucleotídeo substancialmente puro " como usado aqui refere-se a uma preparação de polinucleotídeo isenta de outros nucleotídeos estranhos ou indesejadas e em uma forma apropriadas para uso dentro dos sistemas de produção de proteína geneticamente engenheirados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente no máximo 1 %, e mesmo o mais preferivelmente no máximo 0.5% em peso de outro material de polinucleotídeo com o qual ele é nativamente associado. O polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões não traduzidas 5' e 3' de ocorrência natural, como promotores e terminadores. Prefere-se que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, preferivelmente pelo menos 92% puro, mais preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% puro, o mais preferivelmente pelo menos 99%, e mesmo o mais preferivelmente pelo menos 99.5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção são preferivelmente em uma forma substancialmente pura. Em particular, prefere- se que os polinucleotídeos descrito aqui esteja em forma "essencialmente pura", isto é, que a preparação do polinucleotídeo é essencialmente isenta de outro material polinucleotídeo com que ele é nativamente associado. Aqui, o termo " polinucleotídeo substancialmente puro " é sinônimo com os termos " polinucleotídeo isolado " e "polinucleotídeo em forma isolada. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi- sintético, origem sintética, ou quaisquer combinações dos mesmos.

cDNA: O termo "cDNA" é definido aqui como uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA emendada, madura, obtida a partir de uma célula eucariótica. O cDNA falta seqüências de intron que estão geralmente presentes no DNA genômico correspondente. O Transcrito de RNA primário, inicial é um precursor para mRNA que é processado através de uma série de etapas antes de aparecer como mRNA emendado maduro. Estas etapas incluem a remoção de seqüências de intron por um processo chamado emenda. cDNA derivado de mRNA falta, assim, quaisquer seqüências de intron.

Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácido nucleico" como usado aqui refere-se a uma molécula de ácido nucleico molécula, de filamento único ou de filamento duplo, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos em um modo que não existiria de outra forma na natureza. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo com o termo " cassete de expressão " quando a construção de ácido nucleico contém as seqüências de controle requeridas para expressão de uma seqüência de codificação da presente invenção.

Seqüência de controle: O termo "seqüências de controle" é definido aqui para incluir todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode ser nativa ou estranha a uma seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Estas seqüências de controle incluem mas não são limitadas a uma seqüência líder, uma seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, promotor,, seqüência de peptídeo de sinal, e terminador de transcrição. Em um mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor e sinais de parada de transcrição e de tradução. As seqüências de controle podem ser providas com ligadores para o fim de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação de seqüências de controle com a região de codificação da seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo.

Operativamente ligado: O termo "operativãmente ligado" denota aqui a configuração em que uma seqüência de controla é colocada em uma posição apropriada relativa a uma seqüência de codificação da seqüência de polinucleotídeo de modo que a seqüência de controle dirige a expressão de uma seqüência de codificação de um polipeptídeo.

Seqüência de codificação: Quando usado aqui o termo "seqüência de codificação" significa uma seqüência de nucleotídeo, que diretamente especifica a seqüência de aminoácido de seu produto de proteína. Os limites de uma seqüência de codificação são geralmente determinados por uma matriz de leitura aberta que geralmente começa com um códon de partida ATG ou códons alternativos de partida como GTG e TTG. A seqüência de codificação pode ser uma seqüência de DNA, cDNA, ou seqüência de nucleotídeo recombinante.

Expressão: 0 termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pós- transcrição, tradução, modificação pós tradução, e secreção.

Vetor de expressão: O termo " vetor de expressão " é definido aqui como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção, e que é operativamente ligado a nucleotídeos adicionais que provêem sua expressão.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", como usado aqui, inclui qualquer tipo de célula que é susceptível a transformação, transfecção, transdução e outros e com construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo "modificação" significa aqui qualquer modificação química do polipeptídeo consistindo dos aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2 assim como a manipulação genética do DNA codificando este polipeptídeo. A (s) modificação(s) pode(m) ser substituição(s), deleção (s) e/ou inserção(s) dos aminoácido(s) assim como as substituição (s) de cadeias laterais de aminoácido, ou uso de aminoácidos não naturais com similares características nesta seqüência de aminoácido. Em particular, a(s) modificação(s) pode ser amidações, como amidação do término C-.

Variante artificial: Quando usado aqui, o termo " variante artificial " significa um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana produzido por um organismo expressando uma seqüência modificada de nucleotídeo de SEQ ID NO:l. A seqüência de nucleotídeo modificada é obtida através de intervenção humana por modificação de uma seqüência de nucleotídeo descrita em SEQ ID NO:l. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polipeptídeos Tendo Atividade antimicrobiana

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2 (isto é, o polipeptídeo maduro) de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95%, e mesmo o mais preferivelmente pelo menos 97%, que tem atividade antimicrobiana (a seguir " polipeptídeos homólogos"). Em um aspecto preferido, os polipeptídeos homólogos tem uma seqüência de aminoácido que difere por dez aminoácidos, preferivelmente por cinco aminoácidos, mais preferivelmente por quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente por três aminoácidos, o mais preferivelmente por dois aminoácidos, e mesmo o mais preferivelmente por um aminoácido dos aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2 ou uma variante alélica da mesma; ou um fragmento da mesma que tem atividade antimicrobiana. Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2, ou uma variante alélica da mesma; ou um fragmento da mesma que tem atividade antimicrobiana. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste of a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2 ou uma variante alélica da mesma; ou um fragmento da mesma que tem atividade antimicrobiana. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste de uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2 ou uma variante alélica da mesma; ou um fragmento da mesma que tem atividade antimicrobiana. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade antimicrobiana que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam sobre condições de estringência muito baixas, preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência média,, mais preferivelmente condições de estringência média - elevada, ainda mais preferivelmente condições de estringência elevada, e o mais preferivelmente condições de estringência muito elevada com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) uma seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii), ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii), ou (iii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor, New York). A subseqüência de SEQ ID NO:l contém pelo menos 100 nucleotídeos ou preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tem atividade antimicrobiana.

A seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:l ou uma subseqüência da mesma, assim como uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2 ou um fragmento da mesma, pode ser usada para projetar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Em particular, estas sondas podem ser usadas para hibridização com cDNA ou DNA genômico do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos Southern blotting padrões, a fim de identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Estas sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüência completa, mas devem ter pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35, e o mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Prefere-se, no entanto, que a sonda de ácido nucleico tenha pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ser pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 270 nucleotídeos. Ambas as sondas de DNA e RNA podem ser usadas As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 22Ρ, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Estas sondas são englobadas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir destes outros organismos pode, assim, ser triada para DNA que hibridiza com as sondas acima mencionadas e que codifica um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana. O DNA genômico ou outro destes outros organismos pode ser separado por eletroforese de gel poliacrilamida ou agarose ou outras técnicas de separação. DNA das bibliotecas ou DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material veículo apropriado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo com SEQ ID NO: ou uma subseqüência do mesmo, o material veículo é usado em Southern blot.

Para fins da presente invenção, a hibridização indica que a seqüência de nucleotídeo hibridiza para uma sonda de ácido nucleico rotulada correspondendo à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO:l, seu filamento complementar, ou uma subseqüência da mesma, sob condições de estringência muito baixas a muito elevadas. Moléculas que a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando filme de raios- X-. Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO:2, ou uma subseqüência do mesmo. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO:l. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é a região de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:l.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência muito baixas a muito elevadas são definidas como prehibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado e ou 25% formamida para estringências muito baixas e baixas, 35% formamida para estringências média e média elevada, ou 50% formamida para estringências altas e muito altas, de acordo com os procedimentos Southern blotting padrões para 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, o material veículo é finalmente lavado três vezes cada durante 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% SDS preferivelmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55°C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60°C (estringência média- elevada), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (estringência elevada), e o mais preferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito elevada).

Para sondas curtas, que tem cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência são definidas como prehibridização, hibridização, e pós- hibridização com lavagem a cerca de 5°C a cerca de IO0C abaixo do Tm calculado usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em 0.9 M NaCl, 0.09 M Tris-HCI pH 7.6, 6 mM EDTA, 0.5% NP-40, IX solução de Denhardfs, 1 mM pirofosfato de sódio, 1 mM fosfato monobásico de sódio, 0.1 mM ATP, e 0.2 mg of levedura RNA por ml seguindo procedimentos Southern blotting padrões.

Para sondas curtas, que tem cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, o material veículo é lavado uma vez em 6X SCC mais 0.1 % SDS durante 15 minutos e duas vezes cada durante 15 minutos usando 6X SSC a 5°C a 10°C abaixo do Tm calculado.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a variantes artificiais compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou o polipeptídeo maduro do mesmo. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza pequena, isto é substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significantemente a duplicação e/ou atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de cerca de 10 aminoácidos; extensões amino- ou carboxil-terminal pequenas, como um resíduo metionina amino-terminal; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, como um trato poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram geralmente a atividade específica são bem conhecidas na arte e descritas por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, In, The Proteínas, Academic Press, New York. As mudanças que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrões, aminoácidos não padrões (como 4- hidroxiprolina, 6-A/-metil lisina, ácido 2-aminoisobutirico, isovalina, e alfa-metil serina) podem ser substituídos por resíduos de aminoácido de um polipeptídeo de tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservativas, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos. "aminoácidos não naturais" foram modificados após a síntese de proteína, e/ou tem uma estrutura química em sua(s) cadeia(a) lateral(ais) diferentes dos aminoácidos padrões. Os aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados e preferivelmente são comercialmente disponíveis, e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, desidroprolina, 3- e 4 metil prolina e 3,3-dimetil prolina.

Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo,j alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ótimo e outros.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo parental podem ser identificados de acordo com procedimentos bem conhecidos na arte, com mutagênese sítio-dirigida, ou mutagene de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na ultima técnica, as mutações de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as resultantes moléculas mutantes são testadas para atividade biológica (isto é, atividade antimicrobiana ) para identificar os resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. A interação biológica também pode ser determinada por análise física de estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração eletrônica, ou rotulação por foto-afinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306- 312; Smith et al., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59- 64. As identidades de aminoácidos essenciais também pode ser deduzida de análises de identidades com polipeptídeos que são relacionados com um polipeptídeo de acordo com a invenção.

As substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de triagem relevante, como descrito por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR passível de erro, exibição de fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; patente US No. 5,223,409; WO 92/06204), e mutagênese dirigida à região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

Os métodos de mutagênese/ embaralhamento podem ser combinados com métodos de triagem automatizados de elevada produção para detectar a atividade de polipeptídeos mutageneizados clonados expressados por células hospedeiras. As moléculas de DNA mutageneizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente seqüenciadas usando métodos padrões na arte. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados a polipeptídeos de estrutura desconhecida.

O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos, 1 a 21 de SEQ ID NO:2 é 10, preferivelmente 9, mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente no máximo 6, mais preferivelmente no máximo 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, o mais preferivelmente 2, e mesmo o mais preferivelmente 1.

Em uma forma de realização, os polipeptídeos da invenção incluem pelo menos 4 resíduos de cisteína, preferivelmente os polipeptídeos incluem exatamente 4 resíduos de cisteína. Em outra forma de realização, os polipeptídeos são polipeptídeos cíclicos.

Extensão N-Terminal

Uma extensão N-terminal dos polipeptídeos da invenção pode consistir de modo apropriado de 1 a 50 aminoácidos, preferivelmente 2-20 aminoácidos, especialmente 3-15 aminoácidos. Em uma forma de realização, a extensão de peptídeo N-terminal não contém um Arg (R). Em outra forma de realização a extensão N-terminal compreende um sítio de clivagem de tipo kex2 ou kex2-, como será definido ainda abaixo.Em uma forma de realização preferida, a extensão N-terminal é um peptídeo, compreendendo pelo menos dois resíduos GIu (E) e/ou Asp (D) de aminoácidos, como uma extensão N- terminal compreendendo uma das seguintes seqüências: EAE, EE, DE e DD.

Sítios Kex2

Os sítios Kex2 (ver, por exemplo, Methods in Enzymology VoI 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") e sítios de tipo kex2- são sítios de reconhecimento di-básicos (isto é sítios de clivagem) encontrados entre a região de codificação pro-peptídeo e a região madura de algumas proteínas.

A inserção de um sítio Kex2 ou de tipo kex2 foi mostrada, em alguns casos, como melhorando o processamento de endopeptidase correto no sítio de clivagem pro-peptídeo resultando em níveis de secreção de proteína aumentados.

No contexto da invenção inserção de um kex2 ou sítio de tipo kex2- resulta na possibilidade de obter uma clivagem em uma determinada posição na extensão N-terminal resultando em um polipeptídeo antimicrobiano sendo estendido em comparação com o polipeptídeo maduro mostrado como aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2.

Polipeptídeos fundidos

Os polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que outro polipeptídeo é fundido no N-término ou C-término do polipeptídeo da invenção ou um fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fundido é produzido usando uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção da mesma) codificando outro polipeptídeo em uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção da mesma) da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são bem conhecidas na arte, incluem ligação de uma seqüência de codificação codificando os polipeptídeos de modo que eles estão na matriz em que a expressão do polipeptídeo fundido está sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminator.

Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade antimicrobiana Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para fins da presente invenção, o termo "obtido a partir de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo é produzido pela fonte ou pela cepa em que a seqüência de nucleotídeo a partir da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo como um polipeptídeo de Bacillus, por exemplo, um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis; ou um polipeptídeo de Streptomyces, por exemplo, um polipeptídeo de Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus\ ou um polipeptídeo bacteriano gram negativo, por exemplo, um polipeptídeo de E. coli ou Pseudomonas sp..

Um polipeptídeo da presente invenção também pode ser um polipeptídeo fungico e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura como polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowium; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso como um polipeptídeo de Acremonium, Aspergillus, Aureobas idium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavía, Tolypocladium, ou Trichodermum.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Saccharomyces earlsbergensis, Saccharomyees eerevisiae, Saccharomyees diastatieous, Saccharomyees douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyees norbensis, ou Saccharomyees oviformis tendo atividade antimicrobiana.

Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Aspergillus aeuleatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium baetridioides, Fusarium eerealis, Fusarium erookwellense, Fusarium eulmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium retieulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambueinum, Fusarium sareoehroum, Fusarium sporotriehioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium triehotheeioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma Iongibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Arenicola marinum, por exemplo, o polipeptídeo de SEQ ID NO:2.

Deve ser entendido que para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem levar em conta o nome da espécie à qual eles são conhecidos. O versado na arte irá prontamente reconhecer a identidade dos equivalentes apropriados.

As cepa destas espécies são prontamente acessíveis ao público em várias coleções de culturas, como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Além disso, estes polipeptídeos podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microorganismos isolados na natureza (por exemplo, solos, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. As técnicas para isolar os microorganismos de habitais naturais são bem conhecidas na arte. O polinucleotídeo pode então ser obtido por similar triagem de uma bibliotecas de DNA genômico ou cDNA de outro microorganismo. Uma vez que uma seqüência de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo foi detectada com a (s) sonda (s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado usando técnicas que são bem conhecidas dos versados na arte (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou de polipeptídeos fusão clivável em que outro polipeptídeo é fundido no N-término ou no C-término do polipeptídeo ou fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fundido é produzido usando uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção da mesma) codificando outro polipeptídeo em uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção da mesma) da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são bem conhecidas na arte e incluem a ligação de uma seqüência de codificação codificando os polipeptídeos de modo que eles estão na matriz e que a expressão do polipeptídeo fundido está sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminator.

Polinucleotídeos

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados tendo a seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo é especificada em SEQ ID NO:l. Em outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo é a região de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:l. A presente invenção também engloba seqüências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2 ou o polipeptídeo maduro da mesma, que diferem de SEQ ID NO: 1 devido à degenerescência do código genético. A presente invenção também refere-se a subseqüências de SEQ ID NO:l que codificam fragmentos de SEQ ID NO:2 que tem atividade antimicrobiana.

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos mutantes compreendendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:l, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que consiste de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo são bem conhecidas na arte e incluem isolamento de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma combinação das mesmas. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir deste DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, por uso da reação de cadeia polimerase bem conhecida (PCR) ou triagem de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar os fragmento de DNA clonado com aspectos estruturais compartilhados. Ver, por exemplo, lnnis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and application, Academic Press, New York. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico como reação de cadeia ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação com base em seqüência de nucleotídeo (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Arenicola, ou outra ou organismo relacionado e assim, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou espécie da região codificando o polipeptídeo da seqüência de nucleotídeo. A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos tendo seqüências de nucleotídeo que tem um grau de identidade para uma seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:l (isto é, nucleotídeos 496 a 558) de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, e o mais preferivelmente pelo menos 97% identidade, que codificam um polipeptídeo ativo.

Modificação de uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similar ao polipeptídeo. O termo "substancialmente similar" para o polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir em algum modo engenheirado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes artificiais que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo e outros. A seqüência variante pode ser construída com base na seqüência de nucleotídeo apresentada como a região de codificação de polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, por exemplo uma subseqüência do mesmo, e/ou introdução de substituições de nucleotídeo que não dão lugar a outra seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo, mas que correspondem ao uso de códons do organismo hospedeiro destinado para a produção da enzima, ou por introdução das substituições de nucleotídeos que podem dar lugar a uma seqüência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Proteína Expresssion and Purification 2: 95-107.

Como será evidente para os versados na arte que estas substituições podem ser feitas fora das regiões criticas para a função da molécula e ainda resultar em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácido essenciais para atividade do polipeptídeo codificado por polinucleotídeo isolado da invenção, e assim, preferivelmente, não submetido à substituição, pode ser identificado de acordo com procedimentos bem conhecidos na arte, como mutagênese sítio-dirigida, ou mutagênese de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081- 1085). Na última técnica, as mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula, e as resultantes moléculas mutantes são testadas para atividade antimicrobiana para identificar os resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Os sítios de interação substrato-enzima também podem ser determinados por análise da estrutura tri-dimensional como determinado por tais técnicas, como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia, ou rotulação por foto-afinidade, (ver, por exemplo, de Vos et aL, 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et ai, 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo da presente invenção, que hibridizam sob condições de estringência baixa, preferivelmente condições de estringência média, mais preferivelmente condições de estringência média - elevada, ainda mais preferivelmente condições de estringência elevada, e o mais preferivelmente condições de estringência muito elevada com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) uma seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); ou variantes alélicas e subseqüências da mesma (Sambrook et ai., 1989, supra), como definido aqui.

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados obtidos por (a) hibridização de uma população de DNA sob condições de estringência baixa, média, média-elevada, elevada e muito elevada com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) uma seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e (b) isolamento do polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana.

Construções de ácido nucleico

A presente invenção também refere-se a construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo isolado da presente invenção operativamente ligado a uma ou mais seqüências de controle que dirigem a expressão de uma seqüência de codificação em uma célula hospedeira apropriada sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

Um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado em vários modos para prover a expressão do polipeptídeo. Manipulação da seqüência de polinucleotídeo antes da inserção em um vetor pode ser desejável ou necessário dependendo do vetor de expressão. As técnicas para a modificação das seqüências de polinucleotídeo utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na arte.

A seqüência de controle pode ser uma seqüência de promotor apropriada, uma seqüência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. A seqüência de promotor contém seqüências de controle transcripcional que mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo que mostra atividade transcripcional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares ou homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Os exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos de operon Iac de E. coli, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene alfa amilase de Bacillus lieheniformis (amyL), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene alfa- amilase de Bacillus amyloliquefaeiens (amyQ), gene penicilinase de Bacillus lieheniformis (penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene beta-lactamase procariótico (Villa-Kamaroff et ai, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727- 3731 ), assim como o promotor tac (DeBoer et ai, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21- 25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinant bactéria" em Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

Exemplos de promotores apropriado para dirigir a transcrição da construção de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira de fungo filamentoso são promotores obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei, alfa-amilase neutral de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), lipase de Rhizomueor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), protease de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta- glucosidase de Triehoderma reesei, celobiohidrolase de Triehoderma reesei I, endoglucanase de Triehoderma reesei I, endoglucanase de Triehoderma reesei II, endoglucanase de Triehoderma reesei III, endoglucanase de Triehoderma reesei IV, endoglucanase de Triehoderma reesei V, xilanase de Triehoderma reesei I, xilanase de Triehoderma reesei II, beta-xilosidase de Triehoderma reesei, assim como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para neutral alfa-amilase Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos. Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces eerevisiae (ENO-1 ), galactoquinase de Saccharomyees eerevisiae (GAL1 ), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de Saccharomyees eerevisiae (ADH1,ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyees eerevisiae (TPI), metalotionina de Saccharomyees eerevisiae (CU Pl ), e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyees eerevisiae. Outros promotores apropriados para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de terminador de transcrição, uma seqüência reconhecida pela célula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência de terminador é operativamente ligada ao 3' término de uma seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para TAKA amilase Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, e protease de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Os terminadores preferidos para célula hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces eerevisiae, citocromo de Saccharomyces eerevisiae C (CYC1 ), e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces eerevisiae. Outros terminadores utilizáveis para células hospedeiras de leveduras são descritos por Romanos et al., 1992, supra. A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líder apropriada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. A seqüência líder é ligada operativamente ao 5''término da seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os líderes preferidos para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans. Os líderes apropriados para células hospedeiras de leveduras são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces eerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyees eerevisiae, alfa-fator de Saccharomyees eerevisiae, e álcool desidrogenase/gloceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyees eerevisiae (ADH2/GAP).

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência ligada operativamente ao término 3' da seqüência de nucleotídeo e que, quando transcrito, é reconhecido pela célula hospedeira como um sinal a adicionar aos resíduos de poliadenosina para mRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidas de genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.

As seqüências de poliadenilação utilizáveis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular CelularBiology 15: 5983-5990.

A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de peptídeo sinal que codifica para uma seqüência de aminoácido ligada ao amino término de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo codificado na via secretória da célula. A extremidade 5' da seqüência de codificação da seqüência de nucleotídeo pode conter inerentemente uma região de codificação de peptídeo sinal naturalmente ligado em matriz de leitura de tradução com o segmento da região de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade 5' da seqüência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo sinal que é estranha para a seqüência de codificação. A região de codificação de peptídeo sinal estranho pode ser requerida onde a seqüência de codificação não contém naturalmente uma região de codificação de peptídeo sinal. Alternativamente, a região de codificação de peptídeo sinal estranho pode simplesmente substituir a região de codificação de peptídeo sinal natural a fim de melhorar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer região de codificação de peptídeo sinal que dirige o polipeptídeo expressado na via secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

As regiões de codificação de peptídeo sinal eficazs para células hospedeiras bacterianas são as regiões de codificação de peptídeo sinal obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 1 1837, alfa- amilase de Bacillus stearothermophilus, Baeillus Iieheniformis subtilisin, beta- lactamase de Bacillus lieheniformis, proteases neutrais de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As regiões de codificando de peptídeo de sinal eficazs para célula hospedeira de fungo filamentoso são as regiões de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutral de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei, celolulase Humieola insolens, e lípase de Humicola lanuginosa. Em um aspecto preferido, a região de codificação de peptídeo sinal é de nucleotídeos 1 a 72 de SEQ ID No 1, que codificam aminoácidos -165 a -142 de SEQ ID NO:2.

Os peptídeos de sinal utilizáveis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para alfa-fator de Saccharomyces eerevisiae e invertase de Saccharomyees eerevisiae. Outras regiões de codificação de peptídeo sinal utilizáveis são descritas por Romanos et al., 1992, supra. A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de propeptídeo que codifica para uma seqüência de aminoácido posicionada no amino término de um polipeptídeo. O resultante polipeptídeo é conhecido como uma pro-enzima ou propolipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um propolipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo maduro por clivagem catalítica ou auto-catalítica do propeptídeo a partir do propolipeptídeo. A região de codificação do propeptídeo pode ser obtida dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutral de Bacillus subtilis (nprf), alfa-fator de Saccharomyees eerevisiae, proteínaase aspártica de Rhizomueor miehei, e lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Em um aspecto preferido, a região de codificação de propeptídeo é de nucleotídeos 73 to 495 de SEQ ID NO :1 que codificam aminoácidos -141 a -1 de SEQ ID NO:2.

Quando ambas as regiões de peptídeo sinal e propeptídeo estão presentes no término amino de um polipeptídeo, a região de propeptídeo é posicionada próxima do término amino de um polipeptídeo e a região de peptídeo de sinal é posicionada próxima do término amino da região de propeptídeo.

Também pode ser desejável adicionar seqüências regulatórias que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo com relação ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas regulatórios são os que causam a expressão do gene a ser ligado ou desligado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procarióticos incluem os sistemas de operador lac, tac, e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GALl pode ser usado. Em fungos filamentosos, o promotor de TAKA alfa- amilase, o promotor glucoamilase de Aspergillus niger e promotor glucoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados como seqüências regulatórias. Outros exemplos de seqüências regulatórias são os que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estes e incluem o gene dihidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneina que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo deve ser operativamente ligada com a seqüência regulatória.

Vetores de Expressão

A presente invenção também refere-se a vetores de expressão recombinante compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada transcriptionais e translacionais. As várias seqüências de ácidos nucleicos e de controle descritas acima podem ser unidas juntas para produzir o vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição da seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, uma seqüência de nucleotídeo da presente invenção pode ser expressada por inserção da seqüência de nucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a seqüência de codificação está localizada no vetor de modo que a seqüência de codificação é ligada operativamente com as seqüências de controle apropriadas para expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinantes e pode ocasionar a expressão da seqüência de nucleotídeo. A escolha do vetor irá tipicamente depender da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que o vetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos circulares fechados ou lineares.

O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo um plasmídeo, um elemento extra-cromossômico, um mini-cromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio de assegurar a auto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s cromossomo(s) em que ele foi integrado. Além disso, um vetor único ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contém o DNA a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon podem ser usados.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contém um ou mais marcadores selecionáveis, que permitem a fácil seleção de células transformadas. Um marcador selecionável é um gene, cujo produto provê para resistência viral ou biocida, resistência a metais pesados, prototrofia a auxótrofos e outros.

Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus lieheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos como ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os marcadores apropriados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas não são limitados a amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfmotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pirG (orotidina-5'- fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), assim como equivalentes dos mesmos. São preferidos para uso em uma célula Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contém elemento (s) que permitem a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na seqüência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter seqüências de nucleotídeo adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local preciso ou locais no(s) cromossomo(s). Para aumentar a possibilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais devem preferivelmente conter um número suficiente de ácidos nucleicos, como 100 a 10,000 pares de base, preferivelmente 400 a 10,000 pares de base, e o mais preferivelmente 800 a 10,000 pares de base, que tem um alto grau de identidade com a seqüência de marcação correspondente para a seqüência para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer seqüência que é homóloga com a seqüência de marcação no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser seqüências de nucleotídeos de não codificação ou de codificação. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por uma recombinação não homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode ainda compreender uma origem de replicação permitindo ao vetor replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo "origem de replicação" ou "replicador de plasmídeo" é definido aqui como uma seqüência de nucleotídeo que permite ao plasmídeo ou vetor replicar in vivo.

Os exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC 184 permitindo a replicação em E. coli, e pUBl 10, pE194, pTA1060, e ρΑΜβί permitindo a replicação em Bacillus.

Exemplos of origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2, ARS1, ARS4, a combinação de ARSl e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

Exemplos de origens de replicação utilizáveis em uma célula de fungo filamentoso são AMAI e ANSI (Gems et ai., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Acid Nucleic Research 15: 9163- 9175; WO 00/24883). Isolamento do gene AMAI e construções de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser obtidos de acordo com os métodos descritos em WO 00/24883.

Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e assim cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas para cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos do versado na arte (ver, por exemplo, Sambrook et ai., 1989, supra).

Células hospedeiras

A presente invenção também refere-se a células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, que são usados com vantagem em produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra - cromossômico como descrito acima. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira irá depender, em uma grande extensão, do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, por exemplo um procarioto, ou um microorganismo não unicelular, como um eucarioto.

Os microorganismos unicelulares utilizáveis são células bacterianas como bactérias gram-positivas, incluindo, mas não limitada a célula de Bacillus, por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis; ou uma célula de Streptomyces, por exemplo, Streptomyces lividans e Streptomyces murinus, ou bactérias gram negativas como E. coli e Pseudomonas sp. Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, ou Bacillus subtilis. Em outro aspecto preferido, a célula de Bacillus é um Bacillus alcanofílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo ser efetuada por transformação de protoplastos, (ver por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 1 11-1 15), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 ), electroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751 ), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula de fungos. "Fungos" como usado aqui inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definido em Hawksworth et al, In, Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a. ed. 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assim como os Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, pág. 171 ) e todos os fungos mitosporicos (Hawksworth et al., 1995, supra). Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungos é uma célula de levedura. "Levedura" como usado aqui inclui levedura ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa, e levedura pertencendo ao Fungi lmperfecti (Blastomycetes). Porque a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os fins desta invenção, levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S. M., e Davenport, R. R., eds, Soe. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyees earlsbergensis,Saccharomyees eerevisiae, Saccharomyces diastatieous, Saccharomyees douglasii, Saccharomyees kluyveri, Saccharomyees norbensis ou Saccharomyces oviformis. Em um outro aspecto o mais preferidos, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces laetis. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolitica.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungos é uma célula de fungo filamentoso. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da sub-divisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por parede miceliana composta de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento hifal e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras, como Saccharomyces cerevisiae é por formação de brotos de um talo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Aeremonium, Aspergillus, Aureohasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptoeoecus, Filibasidium, Fusarium, Humieola, Magnaporthe, Mueor, Myeeliophthora, Neoeallimastix, Neurospora, Paeeilomyees, Penieillium, Phaneroehaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Sehizophyllum, Talaromyces, Thermoaseus, Thielavia, Tolypoeladium, Trametes, ou Triehoderma. Em um aspecto mais preferido, a célula de fungo filamentoso hospedeira é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Fusarium baetridioides, Fusarium eerealis, Fusarium erookwellense, Fusarium eulmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. Em outra aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo fílamentoso é uma célula da cepa de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, ou Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phaneroehaete ehrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versieolor, Triehoderma harzianum, Triehoderma koningii, Trichoderma longibraehiatum, Trichoderma reesei, ou Triehoderma viride.

As células de fungos podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos, transformação de protoplastos, e regeneração da parede da célula em um modo conhecido por si.

Os procedimentos apropriados para a transformação de célula hospedeiras Aspergillus e Triehoderma são descritos em EP 238 023 e Yelton et ai., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 147Ο- 1474. Os métodos apropriados para transformação de espécies Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. Levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, Μ. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182- 187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Métodos de Produção

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula, que em sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, sob condições condutivas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Preferivelmente, a célula é do gênero Arenicola, e mais preferivelmente Arenicola marina.

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições condutivas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições condutivas para produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende a seqüência de nucleotídeo mutante tendo pelo menos uma mutação em a região de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:l, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que consiste de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2, e (b) recuperar o polipeptídeo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente apropriado para a produção do polipeptídeo usando os métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, e fermentação em escala pequena ou escala grande (incluindo fermentação contínua, batelada, batelada alimentada ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais, realizada em um meio apropriado e sob condições permitindo ao polipeptídeo ser expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos bem conhecidos na arte. Os meios apropriados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado dos lisados de células.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos bem conhecidos na arte que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos. Por exemplo, um teste de atividade antimicrobiana pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo como aqui descrito.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não são limitados a centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos podem ser purificados por vários procedimentos bem conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a cromatografia (por exemplo troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromoto- focalização, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Proteína Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

Plantas

A presente invenção também refere-se a uma planta transgênica, parte de planta, ou célula de planta que foi transformada com a seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usado como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicótile) ou monocotiledônea (uma monocótile). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, como grama dos campos (grama azul, Poá), gramas de forragem como Festuca, Lolium, gramas temperadas, como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho (milho).

Os exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, como tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), como couve-flor, semente de colza e o organismo de modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Exemplos de partes de plantas são haste, calos, folhas, raiz, frutas, sementes e tubérculos, assim como os tecidos individuais compreendendo estas partes, por exemplo epiderme, mesófilos, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos de células de plantas específicos como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxisomas, e citoplasma são também considerados como sendo uma parte de plantas. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem de tecido, é considerada como sendo uma parte de planta. Do mesmo modo as partes de plantas como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes de plantas por exemplo embriões, endospermas, aleurona e coberturas de sementes.

Também está incluído no escopo da presente invenção a progênie destas plantas, parte de plantas, e células de plantas.

A planta transgênica ou célula de planta expressando um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com os métodos bem conhecidos na arte. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de uma ou mais construções de expressão codificando um polipeptídeo da presente invenção no genoma da planta hospedeira e propagando a planta modificada resultante ou célula de planta em uma planta transgênica ou célula de planta.

A construção de expressão é convenientemente uma construção de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção operativamente ligado com seqüências regulatórias apropriadas requeridas para expressão de uma seqüência de nucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável para a identificação de células hospedeiras na construção de expressão tem integrado e seqüências de DNA necessárias para introdução da construção na planta em questão (o último depende do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha de seqüências regulatórias, como seqüências de promotor e terminado e opcionalmente seqüências de sinal ou trânsito é determinada por exemplo com base de quando, onde, e como o polipeptídeo é desejado a ser expressado. Por exemplo, a expressão do geneticamente codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser específica de desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto de gene pode ser marcado em um tecido ou planta específico como sementes ou folhas. As seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86:506.

Para expressão constitutiva, o 35S-CaMV, a ubiquitina de milho 1, e o promotor de actina 1 de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Ce// 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mo. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Cell Plant 3: 1155-1165).Os promotores específicos de órgãos, podem ser por exemplo um promotor de tecidos de imersão de armazenamento, como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de imersão metabólicos como os meristemas (Ito et al., 1994, Plant MoI. Biol. 24: 863- 878), um promotor específico de semente como promotor glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de Vicia faba de legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708- 711), um promotor de uma proteína de corpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor de proteína de armazenamento napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente bem conhecido na arte, por exemplo, como descrito em WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico de folha, como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, o promotor de gene adenina metiltransferase do vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor de gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida como o promotor de batata pin2 (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Do mesmo modo, o promotor pode ser indutível por tratamentos abióticos, como temperatura, seca, ou alterações em salinidade ou induzidos por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo etanol, estrogênios, hormônios de plantas como etileno, ácido abscísico, e ácido giberélico, e metais pesados.

Um elemento melhorador de promotor também pode ser usado para obter uma maior expressão de um polipeptídeo da presente invenção na planta. Por exemplo, o elemento melhorador de promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, descrevem o uso do primeiro intron do gene actina de arroz 1 para melhorar a expressão.

O gene de marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção de expressão pode ser selecionado dentre os disponíveis na arte.

A construção de ácido nucleico incorporada no genoma da planta de acordo com técnica convencionais bem conhecidas na arte, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, micro-injeção, bombardeio de partículas, transformação biolística, e electroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Atualmente, a transferência de genes mediada por Agrobaeterium tumefaeiens é o método de escolha para gerar dicotiledôneas transgênicas (para um estudo ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) e também pode ser usado para transformar monocotiledôneas, apesar de outros métodos de transformação serem com freqüência usados para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeio de partículas ( partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA de transformação) de calos embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um alternativo método para transformação de monocotiledôneas é baseado em transformação de protoplastos, como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Após a transformação, os transformantes tendo incorporado a construção de expressão são selecionados e regenerados em plantas completas de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Com freqüência, o procedimento de transformação é designado para a eliminação seletiva de genes de seleção ou durante a regeneração ou em gerações seguintes por uso, por exemplo, de co- transformação com duas construções de T-DNA separadas ou na excisão específica do sítio pelo gene de seleção por uma recombinase específica.

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana da presente invenção sob condições condutivas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Composições

A presente invenção também refere-se a composições, como composições farmacêuticas, compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em tal polipeptídeo. O termo "enriquecida" indica que a atividade antimicrobiana da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de 1.1.

As composições podem ainda compreender outro gene farmaceuticamente ativo, como um biocida adicional ou agente bioestático, como outro polipeptídeo antimicrobiano demonstrando atividade antimicrobiana como definido acima. O agente biocida pode ser um antibiótico, como bem conhecido na arte. Classes de antibióticos incluem penicilinas, por exemplo penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas em combinação com inibidores de beta-lactamase, cefalosporinas, por exemplo cefaclor, cefazolin, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenemos; monobactamas; aminoglicosideos; tetraciclinas; macrolídeos; lincomicinas; polimixins; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; espectinomicina; trimetoprim; vancomicina; etc. O agente biocida também pode ser um agente anti-micotico, incluindo polienos, por exemplo anfotericina B, nistatina; 5- flucosin; e azóis, por exemplo miconazol, cetoconazol, itraconazol e fluconazol.

Em uma forma de realização, o agente biocida é um agente químico não enzimático. Em outra forma de realização, o agente biocida é um agente químico não polipeptídeo.

As composições podem compreender um material veículo apropriado. As composições também podem compreender um veículo de liberação apropriado capaz de distribuir os polipeptídeos antimicrobianos da invenção no local desejado quando as composições são usadas como um medicamento.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com os métodos bem conhecidos na arte e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou micro-granulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com os métodos bem conhecidos na arte.

Os exemplos são dados abaixo de usos preferidos das composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinados com base em métodos bem conhecidos na arte.

Métodos e Usos

A presente invenção é também dirigida a métodos para usar os polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana. Os polipeptídeos antimicrobianos são tipicamente utilizáveis em qualquer local sujeito a contaminação por bactérias, fungos, leveduras ou algas. Tipicamente, os Ioci são sistemas aquosos como sistemas de água de resfriamento, água de enxágüe de roupas, sistemas de óleo, como óleo de corte, lubrificantes, campos de petróleo e outros, onde os microorganismos necessários a serem mortos ou onde seu crescimento precisa ser controlado. No entanto, a presente invenção pode também ser usada em todas as aplicações para as quais as composições antimicrobianas conhecidas são utilizáveis, como proteção de madeira, látex, adesivo, cola, papel, cartolina, têxtil, couro, plásticos, revestimentos e rações.

Outros usos incluem a conservação de alimentos, bebidas, cosméticos como loções, cremes, géis, ungüentos, sabões, xampus, condicionadores, antiperspirantes, desodorantes, colutórios, produtos para lentes de contato, formulações de enzimas, ou ingredientes de alimentos.

Assim, os pôlipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser usados como um desinfetante, por exemplo no tratamento de infecções no olho ou na boca, infecções da pele, em antiperspirantes ou desodorantes, para limpeza e desinfecção de lentes de contato e dentes (cuidado oral).

Em geral, contempla-se que os polipeptídeos antimicrobiana da presente invenção são utilizáveis par limpeza, desinfecção ou inibição do crescimento microbiano em qualquer superfície. Os exemplos de superfícies que podem ser contatadas com vantagem com os polipeptídeos antimicrobianos da invenção são superfícies de equipamento de processo usados por exemplo em laticínios, plantas de processo farmacêutico ou químico, sistemas de sanitização de água, plantas de processamento de petróleo, plantas de processamento de pasta de papel, plantas de tratamento de água, e torres de resfriamento. Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção devem ser usados em uma quantidade, que é eficaz para limpeza, desinfecção, ou inibição de crescimento microbiano sobre a superfície em questão.

Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem adicionalmente ser usados para a limpeza de superfícies e utensílios de cozinha nas plantas de processamento de alimentos e em qualquer área em que o alimento é preparado ou servido, como em hospitais, enfermarias, e restaurantes.

Ele também pode ser usado como um agente de conservação ou um agente de desinfecção em tintas à base d'água. A invenção também refere-se ao uso de um polipeptídeo antimicrobiano ou composição da invenção como um medicamento. Além disso, um polipeptídeo antimicrobiano ou composição da invenção também pode ser usado para a fabricação de um medicamento para controlar ou combater microorganismos, como organismos fungicos ou bactérias, preferivelmente bactérias gram positivas.

A composição e polipeptídeo antimicrobiano da invenção também podem ser usados como um agente terapêutico ou profilático antimicrobiano para uso veterinário ou humano. Assim, a composição e polipeptídeo antimicrobiano da invenção podem ser usados na preparação de agentes terapêuticos ou agentes profiláticos para uso veterinário ou humano para o tratamento de infecções microbianas, como infecções bacterianas ou fungicas, preferivelmente infecções bacterianas gram positivas. Particularmente, as infecções microbianas podem ser associadas com doenças do pulmão incluindo, mas não são limitadas a tuberculose, pneumonia, e fibrose cística, e doenças transmitidas sexualmente incluindo mas não limitadas a gonorréia e clâmdia.

A composição da invenção compreende uma quantidade eficaz de polipeptídeo antimicrobinao da invenção.

O termo "quantidade eficaz" quando usado aqui se destina a significar uma quantidade dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção, que é suficiente para inibir o crescimento dos microorganismos em questão.

A invenção também refere-se a composições para a cicatrização de feridas ou produtos como bandagens, dispositivos médicos, como, por exemplo, cateteres e outros produtos para cabelo anti-caspa, como xampus

Formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção são administradas a um hospedeiro sofrendo de ou predisposto a uma infecção microbiana. Administração pode ser tópica, localizada ou sistêmica, dependendo do microorganismo específico, preferivelmente será localizada. Geralmente, a dose dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção será suficiente para diminuir a população microbiana em, pelo menos cerca de 50%, geralmente por pelo menos 1 log, e pode ser por 2 ou mais Iogs de morte. Os compostos da presente invenção são administrados em uma dosagem que reduz a população microbiana enquanto minimizando quaisquer efeitos laterais. E contemplado que a composição será obtida e usada sob a diretriz de um médico para o uso in vivo. Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção são particularmente utilizáveis for matar bactérias gram negativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, e Chlamydia trachomatis; e bactérias gram-positivas, incluindo estreptococos como Streptococcus pneumonia, S. uberis, S. hyointestinalis, S. pyogenes e S. agalaetiae; e staphyloeoeci como Staphyloeoeeus aureus, S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus e S. earnosus. Formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser administradas a um hospedeiro sofrendo de ou predisposto a uma infecção microbiana do pulmão, como pneumonia; ou a uma infecção microbiana de feridas, como uma infecção bacteriana de feridas.

Formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção também podem ser administradas a um hospedeiro sofrendo de predisposto a uma infecção da pele, como acne, dermatite atópica ou dermatite seborrêica; preferivelmente a infecção da pele é uma infecção bacteriana da pele, por exemplo causada por Staphyloeoeeus epidermidis, Staphyloeoeeus aureus, Propionibaeterium aenes, Pityrosporum ovale ou Malassezia furfur.

Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção são também utilizáveis formulações in vitro para matar micróbios, particularmente onde não se deseja introduzir quantidades de antibióticos convencionais. Por exemplo, os polipeptídeos antimicrobianos da invenção pode ser adicionados a preparações de ração de animal e/ou humano; ou eles podem ser incluídos como um aditivo para culturas in vitro de células, para evitar o super crescimento de micróbios em cultura de tecidos.

A susceptibilidade de um micróbio particular para matar com os polipeptídeos antimicrobianos da invenção pode ser determinada no teste em vitro, como detalhado na seção experimental. Tipicamente uma cultura do micróbio é combinada com o polipeptídeo antimicrobiano em concentrações variadas durante um período de tempo suficiente para permitir à proteína atuar, geralmente entre cerca de uma hora e um dia. Os micróbios viáveis são então contados o nível de mortes determinado.

Os micróbios de interesse incluem, mas não são limitados a, bactérias Gram-negativas, por exemplo: Citrobacter sp.; Enterobacter sp.; Escherichia sp., por exemplo E. eoli; Klebsiella sp.; Morganella sp.; Proteus sp.; Providencia sp.; Salmonella sp., por exemplo S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp., por exemplo P. aeruginosa; Yersinia sp., por exemplo Y. pestis, Y. pseudotubereulosis, Y. enterocolitica; Franciseella sp.; Pasturella sp.; Vibrio sp., por exemplo V. eholerae, V. parahemolyticus; Campylobaeter sp., por exemplo C. jejuni; Haemophilus sp., por exemplo H. influenzae, H. duereyi; Bordetella sp., por exemplo B. pertussis, B. bronehiseptiea, B. parapertussis,Brueella sp., Neisseria sp., por exemplo N. gonorrhoeae, N. meningitidis, etc. Outras bactérias de interesse incluem Legionella sp., por exemplo L. pneumophila; histeria sp., por exemplo L. monocytogenes; Mycoplasma sp., por exemplo M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., por exemplo M. tuberculosis, M. Ieprae;Treponema sp., por exemplo T. pallidum; Borrelia sp., por exemplo B. burgdorferi; Leptospirae sp,; Riekettsia sp., por exemplo R. rickettsii, R. typhi; Chlamydia sp., por exemplo C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci;Helicobacter sp., por exemplo H. pylori, etc.

Os patógenos não bacterianos de interesse incluem patógeno fungais e protozoários, por exemplo Plasmodia sp., por exemplo P. falciparum, Trypanosoma sp., por exemplo T. brucei; shistosomes; Entaemoeba sp., Cryptococcus sp., Candida sp., por exemplo C. albieans; etc.

Vários métodos de administração podem ser empregados. A formulação de polipeptídeo pode ser dada oralmente, ou pode ser injetada intravascularmente, subcutaneamente, peritonealmente, por aerossol, oftalmicamente, intra-bexiga, topicamente, etc. Por exemplo, os métodos de administração por inalação são bem conhecidos na arte. A dosagem da formulação terapêutica irá variar amplamente, dependendo do polipeptídeo antimicrobiano específico a ser administrado, a natureza da doença, a freqüência de administração, o modo de administração, a depuração do agente do hospedeiro, e outros. A dose inicial pode ser maior, seguida por doses de manutenção menores. A dose pode ser administrada de modo infrequente como semanalmente ou bi semanalmente, ou fracionada em doses menores e administrada uma vez ou várias vezes diariamente, semi-semanalmente, etc, para manter um nível de dosagem efetivo. Em muitos casos, a administração oral irá requerer uma dose maior do que se administrada intravenosamente. As ligações amida, assim como os términos amino e carbóxi pode ser modificados para maior estabilidade em administração oral. Por exemplo, o término carbóxi pode ser amidado.

Formulações

Os compostos desta invenção podem ser incorporados em várias formulações, para administração terapêutica. Mais particularmente, os compostos da presente invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas por combinação com veículos farmaceuticamente aceitáveis, apropriados, ou diluentes, e3 podem ser formulados em preparações em formas sólida, semi-sólida, líquida ou gasosa, como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, ungüentos, cremes, espumas, soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, microesferas, loções e aerossóis. Como tal, a administração dos compostos pode ser obtida em vários modos, incluindo administração oral, bucal, retal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, etc. Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser sistêmicos após administração ou podem estar localizados pelo uso de um implante ou outra formulação que atua para reter a dose ativa no sítio de implante.

Em uma forma de realização, a formulação para uso tópico compreende um agente quelante que diminui a concentração eficaz de cátions divalentes, particularmente cálcio e magnésio. Por exemplo, agentes como citrato, EGTA ou EDTA podem ser incluídos onde se prefere citrato. A concentração de citrato será geralmente de cerca de 1 a 10 mM.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados sozinhos, em combinação um com o outro, ou eles podem ser usados em combinação com outros compostos conhecidos (por exemplo perforina, agentes anti-inflamatórios, antibióticos, etc). Na forma de dosagem farmacêutica, os compostos podem ser administrados na forma de seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os seguintes métodos e excipientes são apenas exemplares e não devem ser limitativos.

Para preparações orais, os compostos podem ser usados sozinhos ou em combinação com aditivos apropriados para fazer comprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo com aditivos convencionais, como lactose, manitol, amido de milho, ou amido de batata, com aglutinante s, como celulose cristalina, derivados de celulose, acácia, ou amido ou gelatinas, com desintegradores, como amido de milho, amido de batata ou carboximetil celulose de sódio, com lubrificantes como talco ou estearato de magnésio e, se desejado, com diluente, agentes tampão, agentes umectantes, conservantes e agentes aromatizantes.

Os compostos podem ser formulados em preparações para injeção por dissolução, colocação em suspensão ou emulsificação dos mesmos em um solvente aquoso ou não aquoso, como óleos vegetais ou outros similares, glicerídeos de ácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno glicol e se desejado com aditivos convencionais como solubilizadores, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsificadores, estabilizadores e conservantes.

Os compostos podem ser usados em formulação aerossol a ser administrada via inalação. Os compostos da presente invenção podem ser formulados em propelentes aceitáveis pressurizados como diclorodifluoro metano, propano, nitrogênio e outros.

Os compostos podem ser usados como loções, por exemplo para evitar infecção por queimaduras, por formulação com aditivos convencionais, como solubilizadores, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, estabilizadores e conservantes.

Além disso, os compostos podem ser feitos em supositórios por misturação com várias bases como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. Os compostos da presente invenção podem ser administrados retalmente via um supositório. O supositório pode incluir veículos como manteiga de cacau, carboceras, e polietileno glicóis, que fundem na temperatura do corpo, ainda são solidificados em temperatura ambiente.

As formas de dosagem para administração oral ou retal como xaropes, elixires e suspensões podem ser providas aqui em cada unidade de dosagem, por exemplo uma colher de chá, colher de sopa, comprimido ou supositório, contém uma quantidade pré-determinada de composição contendo um ou mais compostos da presente invenção. Similarmente, as formas de dosagem unitária para injeção ou administração intravenosa pode compreender o composto da presente invenção em uma composição como uma solução em água estéril, solução salina normal ou outro veículo farmaceuticamente aceitável.

Os implantes para formulações de liberação prolongada são bem conhecidos na arte. Os implantes são formulados como microesferas, lâminas, etc, com polímeros biodegradáveis ou não biodegradáveis. Por exemplo, os polímeros de ácido láctico e/ou ácido glicólico formam um polímero erodível que é bem tolerado pelo hospedeiro. O implante contendo os polipeptídeos antimicrobianos da invenção é colocado em proximidade ao sítio de infecção, de modo que a concentração local de agente ativo é aumentada com relação ao resto do corpo.

O termo "forma de dosagem unitária" como usado aqui, refere- se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade pre- determinada de compostos da presente invenção calculada em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente farmaceuticamente aceitável,carreador ou veículo. As especificações para as formas de dosagem unitária da presente invenção dependem do composto particular empregado e o efeito a ser obtido, e a farmacodinâmica associada com o composto no hospedeiro.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, como veículos, adjuvantes, carreadores ou diluentes, são prontamente disponíveis ao público. Além disso, as substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como agentes de tampão e ajuste de pH, agentes de ajuste de tonicidade, estabilizadores, agentes umectantes e outros, são prontamente disponíveis ao público.

As dosagens típicas para administração sistêmica estão na faixa de 0,1 pg a 100 miligramas por kg de peso do indivíduo por administração.Uma dosagem típica pode ser um comprimido tomado de duas a seis vezes diariamente, ou uma cápsula de liberação no tempo ou comprimido tomado uma vez por dia e contendo um teor proporcionalmente maior do ingrediente ativo. O efeito de liberação no tempo pode ser obtido por materiais de cápsula que dissolve em valores de pH diferentes, por cápsulas que liberam lentamente por pressão osmótica, ou por qualquer outro meio conhecido de liberação controlada.

Os versados na arte irá prontamente notar que os níveis de dose podem variar como uma função do composto específico, a severidade dos sintomas e a susceptibilidade do indivíduo aos efeitos laterais. Alguns dos compostos específicos são mais potentes do que outros. As dosagens preferidas para um dado composto são prontamente determináveis pelo versado na arte por vários meios. Um meio preferido é medir a potência fisiológica de um dado composto.

O uso de lipossomas como um veículo de liberação é um método de interesse. Os lipossomas fundem com as células do sítio de marcação e liberam os conteúdos do lúmen intracelularmente. Os lipossomas são mantidos em contato com as células durante um tempo suficiente para fusão, usando vários meios para manter contato, como isolamento, gentes de ligação e outros. Em um aspecto da invenção, os lipossomas são projetados para serem aerossolizados para administração pulmonar. Os lipossomas podem ser preparados com proteínas ou peptídeos purificados que mediam a fusão de membranas, como vírus Sendai ou vírus de influenza, etc. Os lipídeos podem ser qualquer combinação útil de lipídeos formadores de lipossomas conhecidos, incluindo lipídeos catiônicos ou zwiteriônicos, como fosfatidil colina. O lipídeo restante irá normalmente ser lipídeo neutro ou ácido, como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol e outros.

Para preparar os lipossomas, o procedimento descrito por Kato et al. (1991 ) J. Biol.Chem. 266:3361 pode ser usado. Em resumo, os lipídeos e composição de lúmen contendo peptídeos são combinados em um meio aquoso apropriado, convenientemente um meio de solução salina onde os sólidos totais estarão na faixa de cerca de 1-10 % em peso. Após agitação intensa durante períodos curtos de tempo, de cerca de 5-60 s, o tubo é colocado em um banho de água quente, de cerca de 25- 40 0C, e este ciclo repetido durante cerca de 5-10 vezes. A composição é então sonicada por um período conveniente de tempo, geralmente de 1-10 s, e pode ser ainda agitada por vórtice. O volume é então expandido por adição de meio aquoso, geralmente aumentando o volume em cerca de 1-2 vezes, seguido por agitação e resfriamento. Este método permite a incorporação no lúmen de moléculas de peso molecular elevado.

Formulações com outros agentes ativos

Para uso nos presentes métodos, os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser formulados com outros agentes farmaceuticamente ativos, particularmente outros agentes antimicrobianos. Outros agentes de interesse incluem vários antibióticos, como conhecido na arte. Classes de antibióticos incluem penicilinas, por exemplo penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas em combinação com inibidores de beta-lactamase, cefalosporinas, por exemplo cefaclor, cefazolin, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenemos; monobactamas; aminoglicosídeos, tetraciclinas; macrolídeos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; espectinomicina; trimetoprim; vancomicina; etc.

Os agentes anti-micóticos são também utilizáveis, incluindo polienos, por exemplo amfotericina B, nistatina; 5- flucosina; e azóis por exemplo miconazol, cetoconazol, itraconazol e fluconazol. Fármacos antituberculóticos incluem isoniazid, etambutol, estreptomicina e rifampin. Citocinas também podem ser incluídas em uma formulação dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção, por exemplo interferon gama, fator de necrose de tumor alfa, interleucina 12, etc.

Síntese in vitro

Os peptídeos antimicrobianos da invenção podem ser preparados por síntese in vitro, usando métodos convencionais como conhecido na arte. Vários aparelhos sintéticos comerciais são disponíveis, por exemplo sintetizados automatizados por Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Por uso de sintetizados, os aminoácidos de ocorrência natural podem ser substituídos com aminoácidos não naturais, particularmente D-isômeros (ou D-formas) por exemplo D-alanina e D-isoleucina, diastereoisômeros, cadeias laterais tendo comprimentos ou funcionalidades diferentes e outros. A seqüência particular e o modo de preparação serão determinados por conveniência, economia, pureza requerida e outros.

A ligação química pode ser provida a vários peptídeos ou proteínas compreendendo funcionalidades convenientes para ligação, com grupos amino para formação de amida ou amina substituída, por exemplo aminaçao redutiva, grupos tiol para formação de dissulfeto ou tioéter, grupos carboxila para formação de amida e outros.

Se desejado, vários grupos podem ser introduzidos no peptídeo durante a síntese ou durante a expressão, que permitem a ligação a outras moléculas ou a uma superfície. Assim, cisteínas podem ser usadas para fazer tioétres, histidinas, para ligação a um complexo de íon metal, grupos carboxila para formação de amidas ou ésteres, grupos amino para formação de amidas e outros.

Os polipeptídeos podem ser isolados e purificados estrutura métodos convencionais de síntese recombinante. Um lisado pode ser preparado do hospedeiro de expressão e o lisado purificado usando HPLC, cromatografia de exclusão, eletroforese de gel, cromatografia de afinidade ou outra técnica de purificação. Para a maior parte, as composições que são usadas irão compreender pelo menos 20% em peso do produto desejado, mais geralmente pelo menos cerca de 75% em peso, preferivelmente pelo menos cerca de 95% em peso, e para fins terapêuticos, geralmente pelo menos cerca de 99.5% em peso, em relação a contaminantes relacionados a método de preparação do produto e sua purificação. Geralmente, as percentagens serão baseadas em 1 proteína total.

Ração animal A presente invenção é também dirigida a métodos para usar os polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana em ração animal, assim como a composições de ração e aditivos de ração compreendendo os polipeptídeos antimicrobianos da invenção.

O termo animal inclui todos os animais, incluindo seres humanos. Exemplos de animais são os não ruminantes, e ruminantes, como vacas, ovelhas e cavalos. Em uma particular forma de realização, o animal é um animal não ruminante. Os animais não ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo porcos ou suínos (incluindo mas não limitados a leitões, porcos em crescimento, e porcas), aves como perus e galinhas (incluindo mas não limitados frangos de assar, poedeiras), bezerros jovens, e peixes (incluindo mas não limitados a salmão).

O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura ou composição apropriada para ou destinada a ingestão por um animal.

No uso de acordo com a invenção o polipeptídeo antimicrobiano pode ser dado ao animal antes, após ou simultaneamente com a dieta. A última é preferida.

Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo antimicrobiano, na forma em que ele é adicionado à ração, ou quando sendo incluído em um aditivo de ração, é bem definido. Bem definido significa que a preparação de polipeptídeo antimicrobiano é pelo menos 50% pura, como determinado por cromatografia de exclusão de tamanho (ver exemplo 12 de wOOl/ 58275). Em outras formas de realização particulares, a preparação de polipeptídeo antimicrobiano é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 ou pelo menos 95% pura como determinado pelo método.

Uma preparação de polipeptídeo antimicrobiano bem definida é vantajosa. Por exemplo, é bem mais fácil dosar corretamente na ração um polipeptídeo antimicrobiano que é essencialmente isento de outros polipeptídeos antimicrobianos interferentes ou contaminantes. O termo dosar corretamente refere-se, particularmente, ao objetivo de obter resultados consistentes e constantes, e a capacidade de otimizar a dosagem com base no efeito desejado.

Para uso em ração animal, no entanto, o polipeptídeo antimicrobiano não precisa ser tão puro, ele pode, por exemplo, incluir outras enzimas, neste caso ele pode ser chamado uma preparação de polipeptídeo antimicrobiano.

A preparação de polipeptídeo antimicrobiano pode ser (a) adicionada diretamente na ração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas vegetais, ou (b) pode ser usado na produção de uma ou mais composições intermediárias como aditivos ou pré-misturas de ração que é subseqüentemente adicionado à ração (ou usado no processo de tratamento). O grau de pureza acima refere-se à pureza da preparação de polipeptídeo antimicrobiano original, seja usada de acordo com (a) ou (b) acima.

As preparações de polipeptídeo antimicrobiano com purezas desta ordem de magnitude são em particular obteníveis usando métodos recombinantes de produção, enquanto elas não são tão facilmente obtidas e também submetidas a uma variação batelada-a-batelada bem maior quando o polipeptídeo antimicrobiano é produzido por métodos de fermentação tradicionais.

Esta preparação de polipeptídeo antimicrobiano pode, como evidente, ser misturada com outras enzimas.

O termo proteínas vegetais, como usado aqui refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou se originando de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivadas de proteína. Em formas de realização particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, ou 60% (ρ/ρ).

As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteínas vegetais, como legumes e cereais, por exemplo materiais de plantas de famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, como farinha de feijão de soja, farinha de tremoço e farinha de semente de colza.

Em uma forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais das plantas da família de Fabaceae, por exemplo soja, tremoços, ervilha ou feijão.

Em outra forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo beterraba, beterraba de açúcar ou quinoa.

Outros exemplos fontes de proteína vegetal são semente de colza e repolho. A soja é a fonte de proteína vegetal preferida.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz e sorgo.

O polipeptídeo antimicrobiano pode ser adicionado à ração em qualquer forma, seja ele um polipeptídeo antimicrobiano relativamente puro, ou em mistura com outros componentes destinados à adição à ração animal, isto é na forma de aditivo de ração animal, como as assim chamadas pré- misturas para ração animal.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a composições para uso em ração animal, como ração animal, e aditivo de ração animal, por exemplo pré-misturas.

Além do polipeptídeo antimicrobiano da invenção, o aditivo de ração animal da invenção contém pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral de traço, e/ou pelo menos um macro mineral.

Além disso, os ingredientes de aditivos de ração opcionais são agentes colorantes, compostos aromatizantes, estabilizadores, e/ou pelo menos uma outra enzima selecionada dentre as fitases EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26; xilanases EC 3.2.1.8; galactanases EC 3.2.1.89; e/ou beta-glucanases EC 3.2.1.4.

Em uma forma de realização particular, estas outras enzimas são bem definidas (como definido acima para preparações de polipeptídeo antimicrobiano)

Os exemplos de outros peptídeos antimicrobianos (AMPs) são CAP18, Leucocin A, Tritrpticin, Protegrin-1, Tanatin, Defensin, Ovispirin como Novispirin (Robert Lehrer, 2000), e variantes, ou fragmentos dos mesmos que retém atividade antimicrobiana. Exemplos de outros polipeptídeos antifungicos (AFPs) são peptídeos de Aspergillus giganteus, e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmentos dos mesmos que retém a atividade antifüngica, como descrito em WO 94/01459 e WO 02/090384.

Geralmente, as vitaminas solúveis em gordura e água, assim como minerais de traço formam parte de uma assim chamada pré-mistura destinada para adição à ração, enquanto os macro-minerais são geralmente adicionados em separado à ração. Ambos os tipos de composição, quando enriquecidos com polipeptídeo antimicrobiano da invenção, são um aditivo de ração animal da invenção.

Em uma forma de realização particular, o aditivo de ração animal da invenção é destinado a ser incluído (ou prescrito como destinado a ser incluído) em dietas animais ou ração a níveis de 0.01 a 10.0%; mais particularmente 0.05 a 5.0%; ou 0.2 a 1.0% (% significando g aditivo por 100 g ração). Isto ocorre em particular para pré-misturas.

As seguintes são listas não exclusivas de exemplos destes componentes:

Exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo vitamina K3. Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo Ca-D-pantotenato.

Exemplos de minerais de traço são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

Exemplos of macro minerais são cálcio, fósforo e sódio.

As exigências nutricionais destes componentes (exemplificados com aves e leitões/ suínos) são dadas na Tabela A de WO 01/58275. Exigência nutricional significa que estes componentes devem ser providos na dieta nas concentrações indicadas.

Na alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais específicos na tabela A de WO 01/ 58275. Pelo menos um, significa ou de, um ou mais de, um ou dois, ou três ou quadro, e assim em diante para todos os trezes, ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em tal quantidade de modo a prover uma concentração na ração dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A.

A presente invenção também refere-se a compreendendo de ração animal. As composições de ração animal ou dietas tem um teor relativamente elevado de proteína. As dietas de aves e suínos podem ser caracterizadas como indicado na tabela B de WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas para peixes podem ser caracterizadas como indicado na coluna 4 desta tabela B. Além disso, estas dietas de peixe geralmente tem um teor de gordura bruto de 200-310 g/kg.

Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruta de 50- 800 g/kg, e além disso compreende pelo menos um polipeptídeo antimicrobiano como aqui reivindicado.

Além disso, ou na alternativa (para o teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção tem um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0.1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0.1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0.1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0.1- 150 g/kg; e/ou um teor de lisina of 0.5-50 g/kg.

Em formas de realização particulares, teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina está dentro de uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 em Tabela B de WO 01/58275 (R. 2-5).

A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator de 6.25, isto é proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) χ 6.25. O teor de nitrogênio é determinado pelo método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methds of Analysis 14a. ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC da nona ed. revista 1988, "Nutrient requirements in swine", subcommittee on swine nutrition, Committee on Animal Nutrition, Board of Agriculture, National Research Council. National Academy Press, Washington, D. C, pp. 2-6, e na European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research e extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

O teor na dieta de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas completas para animais é calculada com base em tabelas de ração como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

Em uma forma de realização particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína ou fonte de proteína vegetal, como definido acima.

Em ainda outras formas de realização particulares, a composição de ração animal da invenção contém 0-80% milho; e/ou 0-80% sorgo; e/ou 0-70% trigo; e/ou 0-70% cevada; e/ou 0-30% aveia; e/ou 0-40% farinha de soja e/ou 0-10% farinha de peixe; e/ou 0-20% soro de leite. As dietas para animais podem, por exemplo, ser fabricadas como uma alimentação de massa (não pelotizada) ou ração pelotizada. Tipicamente, os componentes da ração moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionados de acordo com as especificações para as espécies em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzima sólida ou líquida. Por exemplo, uma formulação de enzima sólida é tipicamente adicionada antes ou derivado a etapa de misturação, e uma preparação de enzima líquida é tipicamente adicionada após a etapa de pelotização. A enzima também pode ser incorporada em um aditivo de ração ou pré-mistura.

A concentração de enzima final na dieta está na faixa de 0,01- 200 mg de proteína de enzima por kg de dieta, por exemplo na faixa de 5-30 mg de proteína de enzima por kg de dieta animal.

O polipeptídeo antimicrobiano pode ser administrado em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagem): 0.01-200; ou 0.01- 100; ou 0.05-100; ou 0.05-50; ou 0.10-10 - todas estas faixas sendo em mg polipeptídeo antimicrobiano proteína por kg de ração (ppm).

Para a determinação de mg de proteína de polipeptídeo antimicrobiano por kg de ração, o polipeptídeo antimicrobiano é purificado a partir da composição de ração, e a atividade específica do polipeptídeo antimicrobiano purificado é determinada usando um teste relevante (ver sob atividade antimicrobiana, substratos e testes). A atividade antimicrobiana da composição de ração como tal é também determinada usando o mesmo teste, e com base nestas duas determinações, a dosagem em mg de proteína de polipeptídeo antimicrobiano por kg de ração é calculada.

Os mesmos princípios se aplicam para a determinação de mg de proteína de polipeptídeo antimicrobiano nos aditivos de ração. Como evidente, se uma amostra for disponível do polipeptídeo antimicrobiano usado para preparar o aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada a partir desta amostra (não é necessário purificar o polipeptídeo antimicrobiano da composição de ração ou o aditivo).

Peptídeo e Propeptídeo de sinal

A presente invenção também refere-se a construção de ácido nucleicos compreendendo um gene codificando uma proteína operativamente ligada a uma ou ambas dentre a primeira seqüência de nucleotídeos consistindo de nucleotídeos 1 a 72 de SEQ ID NO:l codificando um peptídeo de sinal consistindo de aminoácidos -165 a -142 de SEQ ID NO:2 e uma segunda seqüência de nucleotídeo consistindo de nucleotídeos 73 a 495 de SEQ ID NO:l codificando um propeptídeo consistindo de aminoácidos -141a -1 de SEQ ID NO:2, em que o gene é estranho para a primeira e segunda seqüências de nucleotídeo.

A presente invenção também refere-se a vetores de expressão recombinante e células hospedeiras recombinantes compreendendo tal construção de ácido nucleicos.

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir a proteína compreendendo (a) cultivar esta célula hospedeira recombinante sob condições apropriadas para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

A primeira e a segunda seqüências de nucleotídeo podem ser operativamente ligadas a genes estranhos individualmente com outras seqüências de controle ou em combinação com outras seqüências de controle. Estas outras seqüências de controle são descritas supra. Como descrito acima, onde ambas as regiões de peptídeo sinal e propeptídeo estão presentes no amino término de uma proteína, a região de propeptídeo é posicionada próxima do amino término de uma proteína e a região de peptídeo sinal região é posicionada próximo do amino término da região de propeptídeo.

A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo "proteína" não deve significar aqui fazer referência a um comprimento específico do produto codificado e, assim, engloba peptídeos, oligopeptídeos, e proteínas. O termo "proteína" também engloba dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinação de seqüências de polipeptídeos parciais ou completas obtidas de pelo menos duas proteínas diferentes em que uma ou mais pode ser heteróloga ou nativa para a célula hospedeira. Proteínas ainda incluem variações alélicas e engenheiradas de ocorrência natural das proteínas acima mencionadas e proteínas híbridas.

Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante do mesmo, enzima, receptor ou porção do mesmo, anticorpo ou porção do mesmo, ou repórter. Em um aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidoreductase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase. Em uma aspecto preferido ainda mais preferido, a proteína é uma aminopeptidase, amilase, carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quiitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterase, alfa- galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta- glucosidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolitica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolitica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

O gene pode ser obtido de qualquer fonte procariótica, eucariótica ou outra.

A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitando o escopo da invenção. EXEMPLOS

Os produtos químicos usados como tampões e substratos são produtos comerciais de pelo menos tipo reagente. Nos seguintes exemplos, o polipeptídeo antimicrobiano mostrada como aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2 é referido como "Arenicina".

EXEMPLO 1

Atividade antimicrobiana de Arenicina

O peptídeo antimicrobiano mostrada como aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2 foi preparado sinteticamente. A concentração inibitória mínima (MIC) foi determinada para testar a atividade antimicrobiana de Arenicina de acordo com as diretrizes de NCCLS de CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute; anteriormente conhecido como National Committee for Clinicai and Laboratory Standards) - protocolo M7-A6, vol. 20, No. 2: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bactéria That Grow Aerobically.

O peptídeo antimicrobiano da invenção foi testado contra 12 cepas bacterianas obtidas do American Type Culture Collection (ATCC). Os resultados na Tabela 1 são valores médios de duas avaliações independentes.

Tabela 1. Atividade antimicrobiana de Arenicina

<table>table see original document page 69</column></row><table>

EXEMPLO 2 Concentração inibitória mínima contra fungos clínicos As concentrações inibitórias mínimas de Arenicina contra leveduras e fungos foram determinadas essencialmente como descrito por NCCLS/CLSI (Clinicai E Laboratory Standards Institute).

Em resumo, a suspensão de fungos ou leveduras de aproximadamente 1 unidade McFarland foi diluída 1:1OO em caldo PD (8 g/L de dextrose de batata) e o crescimento foi testado contra diluições de 2 vezes em série de Arenicina (0,03- 32 μg/mL). As placas de teste foram incubadas a 25-27°C para Candida albicans, Candida tropicalis, Cryptococcus 10 neoformans, Triehophyton mentagrophytes e Epidermophyton floeeosum, e a 30°C para Candida glabrata, Piehia pastoris, Saccharomyces eerevisiae e Aspergillus niger. Crescimento foi registrado visualmente (olho nu, iluminação oblíqua) após aproximadamente 40 horas de incubação. Os resultados são apresentados na tabela 2 abaixo.

Tabela 2. Atividade antimicrobiana de Arenicina.

<table>table see original document page 70</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Novozymes A/S

<120> Polipeptideo tendo atividade antimicrobiana

<130> 10865.204-WQ

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 558

<212> DNA

<213> Arenicola marina

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(558)

<220>

<221> sig_ peptideo

<222> (1)..(72)

<220>

<221> sig_ peptideo

<222> (496)..(558)

<400> 1

atg gga tat tca atg aac ate gcc ctg gtt tac gcc acg gta ctt 45 Met Gly Tyr Ser Met Asn Ile Ala Leu Val Tyr Ala Thr Val Leu -165 -160 -155

att ggt gta ctg cat gtc ggc ggc ata cac tgt aac aac cag ata 90 Ile Gly Val Leu His Val Gly Gly Ile His Cys Asn Asn Gln Ile -150 -145 -140

cag gag ttt gat ttg gcg ggc gat aag ttt gtg ata gac gcc gag 135 Gln Glu Phe Asp Leu Ala Gly Asp Lys Phe Val Ile Asp Ala Glu -135 -130 -125

aac aac agg gaa gtc ate caa ctc tcg gac gga gat ctc gaa gga 180 Asn Asn Arg Glu Val Ile Gln Leu Ser Asp Gly Asp Leu Glu Gly -120 -115 -110

tet ate atg gtc ate gac cac gcc aag agt ctg att ggc tgg ttc att 228 Ser Ile Met Val Ile Asp His Ala Lys Ser Leu Ile Gly Trp Phe Ile -105 -100 -95 -90

ccg aac act gat gag tgt tac ctg att ggc ggg gtg gac agg aag ttg 27 6 Pro Asn Thr Asp Glu Cys Tyr Leu Ile Gly Gly Val Asp Arg Lys Leu -85 -80 -75

ctg gac tcc agg gag ctt ttg gea caa ttt caa gcc gga cag ttt aag 324 Leu Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Gln Phe Gln Ala Gly Gln Phe Lys -70 -65 -60

gaa act gcg gac gag gac gtg gag gac tcg ctg acc tac gtc aag gtc 372 Glu Thr Ala Asp Glu Asp Val Glu Asp Ser Leu Thr Tyr Val Lys Val -55 -50 -45

gac gac cgt gag gtc agt gac ctg agt ctg ttg cca aac gag ctt ctg 420

Asp Asp Arg Glu Val Ser Asp Leu Ser Leu Leu Pro Asn Glu Leu Leu -40 -35 -30

gag ccc tgc tcg gga aag gac gtc ttc tgg ctg gag agg aac aac ate 468

Glu Pro Cys Ser Gly Lys Asp Val Phe Trp Leu Glu Arg Asn Asn Ile -25 -20 -15 -10

cag aga acg ggc aat cgg cag aag aga ggt ttc tgc tgg tac gtc tgc 516

Gln Arg Thr Gly Asn Arg Gln Lys Arg Gly Phe Cys Trp Tyr Val Cys -5 -11 5

gtc tac agg aac gga gtc cgc gtc tgc tac cga cgg tgc aac 558

Val Tyr Arg Asn Gly Val Arg Val Cys Tyr Arg Arg Cys Asn 10 15 20

<210> 2

<211> 186

<212> PRT

<213> Arenicola marina

<400> 2

Met Gly Tyr Ser Met Asn Ile Ala Leu Val Tyr Ala Thr Val Leu -165 -160 -155

Ile Gly Val Leu His Val Gly Gly Ile His Cys Asn Asn Gln Ile -150 -145 -140

Gln Glu Phe Asp Leu Ala Gly Asp Lys Phe Val Ile Asp Ala Glu -135 -130 -125

Asn Asn Arg Glu Val Ile Gln Leu Ser Asp Gly Asp Leu Glu Gly -120 -115 -110

Ser Ile Met Val Ile Asp His Ala Lys Ser Leu Ile Gly Trp Phe Ile -105 -100 -95 -90

Pro Asn Thr Asp Glu Cys Tyr Leu Ile Gly Gly Val Asp Arg Lys Leu -85 -80 -75

Leu Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Gln Phe Gln Ala Gly Gln Phe Lys -70 -65 -60

Glu Thr Ala Asp Glu Asp Val Glu Asp Ser Leu Thr Tyr Val Lys Val -55 -50 -45

Asp Asp Arg Glu Val Ser Asp Leu Ser Leu Leu Pro Asn Glu Leu Leu -40 -35 -30 Glu Pro Cys Ser Gly Lys Asp Val Phe Trp Leu Glu Arg Asn Asn Ile -25 -20 -15 -10

Gln Arg Thr Gly Asn Arg Gln Lys Arg Gly Phe Cys Trp Tyr Val Cys -5 -1 1 5

Val Tyr Arg Asn Gly Val Arg Val Cys Tyr Arg Arg Cys Asn 10 15 20

Claims

1. Polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre o grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 60% identidade com aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2; (b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência média com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) a seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); (c) uma variante compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2; e (d) um fragmento de (a) ou (b) que tem atividade antimicrobiana.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácido tem pelo menos 65% identidade com aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2, preferivelmente pelo menos 70% identidade, mais preferivelmente pelo menos 75% identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 85% identidade, o mais preferivelmente pelo menos 90% identidade, ou pelo menos 95% identidade com aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de consistir de SEQ ID NO:2 ou um fragmento da mesma tendo atividade antimicrobiana.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que consiste de SEQ ID NO:2.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que consiste de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência média - elevada com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) uma seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii).

8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência elevada com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) uma seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii).

9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2.

10. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-9.

11. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ter pelo menos uma mutação na seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:l, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo consistindo de aminoácidos 1 a -21 de SEQ IDNO:2.

12. Construção de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 10 operativamente ligado a uma ou mais seqüências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

13. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a construção de ácido nucleico como definida na

14. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de compreender a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação -12.

15. Método para produzir o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultivar uma célula que em sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, ou cultivar uma célula hospedeira compreendendo construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo, sob condições condutivas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

16. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de ser obtido por (a) hibridizar uma população de DNA sob condições de estringência média - elevada com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) uma seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo hibridizando, que codifica um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana.

17. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser obtido por (a) hibridização de uma população de DNA sob condições de estringência elevada com (i) nucleotídeos 496 a 558 de SEQ ID NO:l, (ii) a seqüência de cDNA contida em nucleotídeos 1 a 558 de SEQ ID NO:l, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo hibridizando, que codifica um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana.

18. Método para produzir um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mutante, caracterizado pelo fato de compreender (a) introduzir pelo menos uma mutação na seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:l, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo consistindo de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2; e (b) recuperar o polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mutante.

19. Polinucleotídeo mutante, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo método como definido na reivindicação 18.

20. Método para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultivar uma célula compreendendo o polinucleotídeo mutante como definido na reivindicação 19 codificando o polipeptídeo sob condições condutivas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

21. Método para produzir o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana da presente invenção sob condições condutivas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

22. Planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, caracterizada pelo fato de que foi transformada com um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-10.

23. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um polipeptídeo antimicrobiano como definido em qualquer uma das reivindicações I-IOe um veículo farmaceuticamente aceitável.

24. Método para matar ou inibir o crescimento de células microbianas, caracterizado pelo fato de compreender contatar as células microbianas com um polipeptídeo antimicrobiano como definido em qualquer uma das reivindicações 1-10.

25. Polipeptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento, ou um agente profilático ou terapêutico veterinário ou humano antimicrobiano.

26. Uso de um polipeptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um agente terapêutico veterinário ou humano para o tratamento de uma infecção microbiana ou para uso profilático.

27. Uso de pelo menos um polipeptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de ser em uma ração animal.