BRPI0609801B1 - Polipeptídeo, polinucleotídeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante,microrganismo recombinante, método para produção do polipeptídeo, composição antimibrobiana, método in vitro para matar ou inibir o crescimento 5 de células microbianas, e, uso de um polipeptídeo antimicrobiano - Google Patents

Abstract

polipeptídeo, polinucleotídeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para produção do polipeptídeo, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, composição, método para matar ou inibir o crescimento de células microbianas, e, usos de um polipeptídeo e de pelo menos um polipeptídeo antimicrobiano. a presente invenção se refere a polipeptídeos isolados tendo atividade antimicrobiana e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. a invenção também se refere a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, bem como métodos para produção e uso dos polipeptídeos.

Description

(54) Título: POLIPEPTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE,MICRORGANISMO RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DO POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO ANTIMIBROBIANA, MÉTODO IN VITRO PARA MATAR OU INIBIR O CRESCIMENTO 5 DE CÉLULAS MICROBIANAS, E, USO DE UM POLIPEPTÍDEO ANTIMICROBIANO (51) Int.CI.: C07K 14/37; A23K 20/147; A23L 33/18 (52) CPC: C07K 14/37,A23K 20/147,A23L 33/18 (30) Prioridade Unionista: 06/06/2005 DK PA 2005 00823, 13/10/2005 DK PA 2005 01435 (73) Titular(es): NOVOZYMES ADENIUM BIOTECH A/S (72) Inventor(es): JESPER VIND; DOROTEA RAVENTOS SEGURA; HANS-HENRIK KRISTENSEN HOEGENHAUG; PER HOLSE MYGIND; OLIVIER TABOUREAU “POLIPEPTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, MICRORGANISMO RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DO POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO ANTIMIBROBIANA, MÉTODO IN VITRO PARA MATAR OU INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULAS MICROBIANAS, E, USO DE UM POLIPEPTÍDEO ANTIMICROBIANO” CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a polipeptídeos isolados tendo atividade antimicrobiana e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também se refere a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo o polinucleotídeo, bem como a métodos para produção e uso dos polipeptídeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

É um objetivo da presente invenção proporcionar polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana aperfeiçoada. Os polipeptídeos podem exibir atividade hemolítica reduzida e/ou citotoxicidade reduzida. Os polipeptídeos também podem exibir sensibilidade reduzida a cátions, tais como Ca²⁺, Mg²⁺, Na⁺. Os polipeptídeos também podem exibir um espectro antimicrobiano diferente comparado à SEQ ID NO: 1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana o qual compreende, de preferência consiste de, uma seqüência de aminoácido a qual tem pelo menos 80% de identidade com aminoácidos 1 a 40 da seqüência de aminoácido:

G-X1-G-C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-C-H-X12-X13-C-X14-X15-X

46X17-X18-X19-X20-G-G-X21-C-X22-X23-X24-X25-X26-X27-C-X28-C-X29;

em que de 31/08/2017, pág. 14/108

X, = F, L, W ou I; de preferência, Xj = F;

X₂ ~ N, R, Q, V, G, S, A, K, L, M, D, H ou Y; de preferência,

X₂ = K R, Q, V, G,S,A,KouY;

X₃ -G, R. A ou K; de preferência, X₃ = G;

X₄ = P, A, L, V, K ou R; de preferência, X₄ = P, K ou R;

X₅ - W ou R;

X₆ - D, A, G, K, L, T, N, F, Η, Μ, P, Q, S, C, I, R, V ou Y; de preferência, X₆ = D, A, G, K, L, ϊ, N, F, Η, Μ, P, Q, S, V ou Y;

X₇ = E, G, A, L, C, Q ou S; de preferência, X₇ H, G ou S;

X₈ = D, F, G, N, V, Y, Η, K, L, P, S, T, W, I, M, A, C ou R; de preferência, X₈ = D, F, G, N, V, Y, Η, K, L, P, S, T, W, I, M ou R;

X_g = D ou P; de preferência, X₉ = D; X₁₀ = M, R, S, V, A, F,

G, L, T, Y, W, E ou K; de preferência, X_w - M, R, S, V, G, Y, L, F, T, W ou K;

Xn - Q, R, L, F, G, H, S, A, C, I, K, Μ, P, T, V, W ou Y; de preferência, Xn = Q, R, L, F, G, H, S, K ou Y;

X12 = N, R, I, Y, V, K, T, Q, S, F, A, W, E ou H;

X₁₃ = Η, A, F, Q, T, V ou L; de preferência, X₁₃ = H ou L;

X14 = K, Q ou R; de preferência, X_]4 = K ou R;

X₁₅ = S, A, V, N ou F;

Xi6 = I, L, Μ, T, W ou V; de preferência, X₁₆ = I, L ou V;

X_]7 = K, Tou R;

Xis = G, Η, K, A, P, F, I, Q, R, S, T, Y ou N; de preferência,

X₁₈ = G, H, R, Kou N;

X19 = Y, Η, K, L, Μ, N, Q, S, V ou R; de preferência, X_i9 = Y ou R;

X20 “ K, F, Η, T, C ou R; de preferência, X₂o = K ou R;

X21 = Y, F, R, A, H, L, M, S ou W; de preferência, X₂j = Y, F,

Rou W;

*>

X₂₂ - A. K. N, Q, T, E, H, L R, S, V, G ou Y; de preferência. X₂₂ = A, K, N, Q, T, S ou Y;

X23 = K, R ou T; de preferência, X₂₃ K ou R:

X₂4 = G, K, Q, E, N, S, T, A ou R; de preferência, X₂₄ = G, K,

Q, A ou R;

X₂s = G, K, H, W ou R; de preferência, X₂₅ = G, K ou R;

X₂₆ = F, A, Η, I, Μ, V, W, R ou L; de preferência, X₂6 = F ou L;

X₂7 = V, L, M, 1, K, Q, R ou T; de preferência, Χ₂γ - V, E, M ou T;

X₂8 - K, Η, N ou R; de preferência, X₂§ = K ou R;

X₂9 = Y, I, YRCG ou YR; de preferência, X₂9 = Y ou YR; e a qual tem menos de 100% de identidade com aminoácidos 1 a 40 de SEQ IDNO: E

A presente invenção também se refere a construções de ácido nucléico, vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos.

A presente invenção também se refere a métodos para produção de tais polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana compreendendo (a) cultura de uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma construção de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições condutivas à formação do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.

A presente invenção também se refere a métodos de uso dos polipeptídeos da invenção.

DEFINIÇÕES

Atividade Antimicrobiana. O termo atividade antimicrobiana é definido aqui como uma atividade a qual é capaz de matar ou inibir o crescimento de células microbianas. No contexto da presente < j invenção, o termo antÍnucrobiano se destina a significar que há um efeito bactericida e/ou bacteriostático e/ou fungicida e/ou fungistático e/ou virucida. em que o termo bactericida” deve ser entendido como capaz de matar células bacterianas. O termo bacteriostático deve ser entendido como capaz de inibir o crescimento bacteriano, isto é, inibição do crescimento de células bacterianas. O termo fungicida deve ser entendido como capaz de matar células fúngicas. O termo fungistático deve ser entendido como capaz de inibir o crescimento fúngico, isto é, inibição de crescimento de células fúngicas. O termo virucida deve ser entendido como capaz de inativar vírus. O termo células microbianas denota células bacterianas ou fúngicas (incluindo levedos).

No contexto da presente invenção, o termo inibição de crescimento de células microbianas se destina a significar que as células estão no estado de não-crescimento, isto é, elas não são capazes de propagar.

Para fins da presente invenção, atividade antimicrobiana pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito por Lehrer e colaboradores, Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) páginas 167174 (1991). Altemativamente, atividade antimicrobiana pode ser determinada de acordo com as diretrizes NCCLS do CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute; formalmente conhecido como National Committee for Clinicai and Laboratory Standards).

Polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana podem ser capazes de redução do número de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) para 1/100 após 24 horas (de preferência após 12 horas, mais preferivelmente após 8 horas, mais preferivelmente após 4 horas, mais preferivelmente após 2 horas, ainda mais preferivelmente após 1 hora e, em particular, após 30 minutos) de incubação a 20 °C em uma solução aquosa de 25% (peso/peso); de preferência, em uma solução aquosa de 10% (peso/peso); mais preferivelmente, em uma solução aquosa de 5% (peso/peso); ainda mais .// preferivelmente, em uma solução aquosa de 1% (peso/peso); ainda mais preferivelmente, em uma solução aquosa de 0,5% (peso/peso); e, em particular, em uma solução aquosa de 0,1% (peso/peso) dos polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana.

Polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana também podem ser capazes de inibição do crescimento de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25 °C em um substrato de crescimento microbiano, quando adicionados em uma concentração de 1000 ppm; de preferência, quando adicionados em uma concentração de 500 ppm; mais preferivelmente, quando adicionados em uma concentração de 250 ppm; ainda mais preferivelmente, quando adicionados em uma concentração de 100 ppm; ainda mais preferivelmente, quando adicionados em uma concentração de 50 ppm; e, em particular, quando adicionados em uma concentração de 25 ppm.

Polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana podem ser capazes de redução do número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) para 1/100 após 24 horas (de preferência após 12 horas, mais preferivelmente após 8 horas, mais preferivelmente após 4 horas, mais preferivelmente após 2 horas, ainda mais preferivelmente após 1 hora e, em particular, após 30 minutos) de incubação a 20 °C em uma solução aquosa de

25% (peso/peso); de preferência, em uma solução aquosa de 10% (peso/peso);

mais preferivelmente, em uma solução aquosa de 5% (peso/peso); ainda mais preferivelmente, em uma solução aquosa de 1% (peso/peso); ainda mais preferivelmente, em uma solução aquosa de 0,5% (peso/peso); e, em particular, em uma solução aquosa de 0,1% (peso/peso) dos polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana.

Polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana também podem ser capazes de inibição do crescimento de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25 °C em um substrato de crescimento microbiano, quando adicionados em uma concentração de 1000 ppm; de preferência, quando

adicionados em uma concentração de 500 ppm; mais preferivelmente, quando adicionados em uma concentração de 250 ppm; ainda mais preferivelmente, quando adicionados em uma concentração de 100 ppm; ainda mais preferivelmente, quando adicionados em uma concentração de 50 ppm; e, em particular, quando adicionados em uma concentração de 25 ppm.

Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, de preferência pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%. mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 100% da atividade antimicrobiana do polipeptídeo consistindo da seqüência de aminoácido mostrada como aminoácidos 1 a 40 de qualquer uma de SEQ ÍD NO: 3 a SEQ ID NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274.

Defensina: O termo defensina, conforme usado aqui, se refere a polipeptídeos reconhecidos por uma pessoa habilitada na técnica como pertencendo à classe defensina de peptídeos antimicrobianos. Para determinar se um polipeptídeo é uma defensina de acordo com a invenção, a seqüência de aminoácido é, de preferência, comparada com os perfis do modelo de Markov ocultos (perfis HMM) do banco de dados PFAM através de uso do pacote de software HMMER gratuitamente disponível (veja Exemplo 7).

As famílias defensina no PFAM incluem Defensina_l ou Defensina de mamífero (no. de acesso PF00323), Defensina_2 ou Defensina de artrópode (no. de acesso PF01097), Defensina_beta ou Beta defensina (no. de acesso PF00711), Defensinapropep ou Pró-peptídeo de defensina (no. de acesso PF00879) e Gama-tionina ou Família das gamationinas (no. de acesso PF00304).

As defensinas podem pertencem à classe da alfa-defensina, à classe da beta-defensina, à classe da teta-defensina, às classes de defensina de inseto ou artrópode ou à classe de defensina de planta. Em uma modalidade, a seqüência de aminoácido de uma defensina de acordo com a invenção compreende 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de cisteína, de preferência 4, 5 ou 6 resíduos de cisteína, mais preferivelmente 4 ou 6 resíduos de cisteína e, ainda mais preferivelmente, 6 resíduos de cisteína.

As defensinas também podem ser defensinas sintéticas compartilhando os aspectos característicos de qualquer uma das classes de defensina.

Exemplos de tais defensinas incluem, mas não estão limitados a, α-Defensina HNP-1 (peptídeo de neutrófilo humano) HNP-2 e HNP-3; βDefensina-12, Drosomicina, Heliomicina, γΐ-purotionina, Defensina A de inseto e as defensinas divulgadas nos pedidos PCT WO 99/53053, WO 02/06324, WO 02/085934, PCT/DK2005/000725, PCT/DK2005/000735 e PCT/DK2006/000155.

Polipeptídeo Isolado. O termo polipeptídeo isolado, conforme usado aqui, se refere a um polipeptídeo o qual é pelo menos 20% puro, de preferência pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% puro e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95% puro, conforme determinado através de SDS-PAGE.

Polipeptídeo Substancialmente Puro: O termo polipeptídeo substancialmente puro denota aqui um preparado de polipeptídeo o qual contém no máximo 10%, de preferência no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1% e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,5% em peso de outro material polipeptídeos com o qual ele está

nativamente associado. Portanto, é preferido que o polipeptídeo substancialmente puro seja pelo menos 92% puro, de preferência pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99,5% puro e, ainda mais preferivelmente, 100% puro em peso do material polipeptídico total presente no preparado.

Os polipeptídeos da presente invenção estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que os polipeptídeos estejam em uma forma essencialmente pura, isto é, que o preparado de polipeptídeo seja essencialmente livre de outro material polipeptídico com o qual ele é nativamente associado. Isso pode ser obtido, por exemplo, através de preparo do polipeptídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos ou métodos clássicos de purificação.

Aqui, o termo polipeptídeo substancialmente puro é sinônimo dos termos polipeptídeo isolado e polipeptídeo na forma isolada.

Variante. O termo variante é definido aqui como um polipeptídeo antimicrobiano compreendendo uma ou mais alterações, tais como substituições, inserções, deleçoes e/ou truncamentos de um ou mais resíduos de aminoácído específicos em uma ou mais posições específicas no polipeptídeo.

Numeração de Variantes. Na presente invenção, uma numeração específica de posições de resíduo de aminoácído nas variantes de polipeptídeo antimicrobiano é empregada. Por exemplo, através de alinhamento das seqüências de aminoácído de polipeptídeos antimicrobianos conhecidos, é possível designar um número de posição de aminoácído a qualquer resíduo de aminoácído em qualquer polipeptídeo antimicrobiano.

Υ5

Usando ο sistema de numeração originário da seqüência de aminoácido do polipeptídeo antimicrobiano divulgado em STQ ID NO: 1. alinhada com a seqüência de uma série de outros polipeptídeos antimicrobianos, é possível indicar a posição de um resíduo de aminoácido em um polipeptídeo antimicrobiano em regiões de homologia estrutural.

Múltiplos alinhamentos de seqüências de proteína podem ser feitos, por exemplo, usando ClustalW (Thompson, J. D., Higgins, D.G. e Gibson, T.J., 1994, CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 46734680). Múltiplos alinhamentos de seqüências de DNA podem ser feitos usando o alinhamento de proteína como um modelo, substituindo os aminoácidos pelo códon correspondente da seqüência de DNA.

Algoritmos de comparação de seqüência em pares em uso comum são adequados para detectar similaridades entre seqüências de proteína que não divergiram além do ponto de aproximadamente 20-30% de identidade de seqüência (Doolittle, 1992, Protein Sei. 1: 191-200; Brenner e colaboradores, 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 6073-6078). Contudo, proteínas verdadeiramente homólogas com a mesma dobra e função biológica similar freqüentemente têm divergido até o ponto onde comparação seqüência-baseada tradicional falha em detectar sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615). Maior sensibilidade em busca seqüência-baseada pode ser obtida usando programas de busca que utilizam representações probabilísticas de famílias de proteínas (perfis) para buscar em bancos de dados. Por exemplo, o programa PS1-BLAST gera perfis através de um processo de busca em bancos de dados iterativo e é capaz de detecção de homólogos remotos (Atschul e colaboradores, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Sensibilidade ainda maior pode ser obtida se a família ou superfamília para a proteína de interesse tem um ou mais representantes nos

bancos de dados de estrutura de proteína. Programas tal como GenTHREADER (Jones 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffn e Jones. 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamento estrutural e potenciais de solvatação) como uma entrada em uma rede neural que prevê a dobra estrutural para uma seqüência de busca. Similarmente, o método de Gough e colaboradores, 2000,1 Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma seqüência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes no banco de dados SCOP. Esses alinhamentos, por sua vez, podem ser usados para gerar modelos de homologia para a proteína de interesse e tais modelos podem ser avaliados com relação à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para essa finalidade.

Para proteínas de estrutura conhecida, várias ferramentas e recursos estão disponíveis para recuperação e geração de alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias SCOP de proteínas foram estruturalmente alinhadas e esses alinhamentos são acessíveis e passíveis de download. Esses alinhamentos podem ser usados para prever os resíduos de aminoácido estrutural e funcionalmente correspondentes em proteínas dentro da mesma superfamília estrutural. Essa informação, junto com informação derivada de modelamento de homologia e buscas de perfil, pode ser usada para prever em quais resíduos realizar mutação quando movendo mutações de interesse de uma proteína para um homólogo íntimo ou remoto.

Na descrição de diversas variantes de polipeptídeo antimicrobiano da presente invenção, a nomenclatura descrita abaixo é adaptada para facilidade de referência. Em todos os casos, a abreviação aceita de aminoácido com uma única letra ou com três letras da IUPAC é empregada.

Para uma substituição de aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição, aminoácido(s) substituído(s).

//7

Consequentemente, a substituição de treonina por alanina na posição 226 é designada como T226A; e substituição de tirosina por tirosina e arginina na posição 40 (efetivamente adicionando arginina após tirosina) é designada como Y40YR. Múltiplas mutações são separadas através da adição de marcas (+), por exemplo, G205R + S411F, representando mutações em posições 205 e 411 substituindo glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

Polipeptídeo Antimicrobiano Precursor: O termo polipeptídeo antimicrobiano precursor”, conforme usado aqui, significa um polipeptídeo antimicrobiano no qual modificações, por exemplo, substituição(ões), inserção(ões), deleção(ões) e/ou truncamento(s), são feitas para produzir as variantes de polipeptídeo antimicrobiano da presente invenção. Esse termo também se refere ao polipeptídeo com o qual uma variante é comparada e alinhada. O precursor pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente (tipo selvagem) ou pode mesmo ser uma variante do mesmo, preparado através de qualquer meio adequado. Por exemplo, a proteína precursora pode ser uma variante de um polipeptídeo que ocorre naturalmente o qual tenha sido modificado ou alterado na seqüência de aminoácido. Um precursor também pode ser uma variante alélica a qual é um polipeptídeo codificado por qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossômico.

Identidade: A relação entre duas seqüências de aminoácido ou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro identidade.

Para fins da presente invenção, o grau de identidade entre duas seqüências de aminoácido é determinado através de uso do programa FASTA incluído na versão 2.0x do pacote de programa FASTA (veja W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Analysis, PNAS 85: 2444-2448; e W. R. Pearson (1990) Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183: 63-98).

 matriz de escore usada foi BLOSUM50, penalidade por gap foi de -12 e penalidade por extensão de gap foi de 2.

O grau de identidade entre duas seqüências de nucleotídeo é determinado usando o mesmo algoritmo e pacote de software conforme descrito acima. A matriz de escore usada foi a matriz de identidade, penalidade por gap foi de -16 e penalidade por extensão de gap foi de -4.

Altemativamente, um alinhamento de duas seqüências de aminoácido é determinada através de uso do programa de Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa de Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, penalidade por abertura de gap é 10 e penalidade por extensão de gap é 0,5. O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácido da presente invenção (tal como aminoácidos 1 a 40 de SEQ ID NO: 1) e uma seqüência de aminoácido diferente é calculado como o número de combinações exatas em um alinhamento das duas seqüências, dividido pelo comprimento (número de resíduos de aminoácido) da seqüência da presente invenção; ou, altemativamente, o produto de Needle designado identidade mais longa é usado como a identidade percentual e é calculado como segue: (resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento Número de Gaps no Alinhamento). O resultado é expresso em identidade percentual.

Fragmento de Polipeptídeo: O termo fragmento de polipeptídeo é definido aqui como um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos deletados do amino e/ou carbóxi término de SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência homóloga à mesma, em que o fragmento tem atividade antimicrobiano.

Sub-seqüência: O termo sub-seqüência é definido aqui como uma seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotídeos deletados

da extremidade 5’ e/ou 3' de SEQ ID NO: 1 ou uma seqüôricia homóloga à mesma, em que a sub-seqüência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade antimicrobiano.

Variante Alélica: O termo variante alélica denota aqui qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo Iocus cromossômico. Variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. Mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo Substancialmente Puro: O termo polinucleotídeo substancialmente puro, conforme usado aqui, se refere a um preparado de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para uso dentro de sistemas de produção de proteína geneticamente manipulados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, de preferência no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1% e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,5% em peso de outro material de polinucleotídeo com o qual ele está nativamente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, contudo, incluir regiões não traduzidas 5' e 3' que ocorrem naturalmente, tais como promotores e terminadores. É preferido que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, de preferência pelo menos 92% puro, mais preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que os polinucleotídeos divulgados aqui estejam em uma forma essencialmente pura, isto é, que o preparado de polinucleotídeo seja essencialmente livre de outro material de polinucleotídeo com o qual ele está nativamente associado. Aqui, o termo polinucleotídeo substancial mente puro é sinônimo dos termos polinucleotídeo isolado e polinucleotídeo na forma isolada. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintéticos, sintéticos ou quaisquer combinações dos mesmos.

cBNA: O termo cDNA é definido aqui como uma molécula de DNA a qual pode ser preparada através de transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA madura, unida, obtida de uma célula eucariota. CDNA carece de seqüências de íntron que estão usualmente presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial primário é um precursor ao mRNA, o qual é processado através de uma série de etapas antes de aparecer como mRNA unido maduro. Essas etapas incluem a remoção de seqüências de íntron através de um processo denominado união. CDNA derivado de mRNA carece, portanto, de quaisquer seqüências de íntron.

Construção de ácido nucleico: O termo construção de ácido nucleico, conforme usado aqui, se refere a uma molécula de ácido nucleico, quer fita simples ou dupla, a qual é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou a qual é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que, de outro modo, não existiría na natureza. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo do termo cassete de expressão quando a construção de ácido nucleico contém as seqüências de controle requeridas para expressão de uma seqüência de codificação da presente invenção.

Seqüência de Controle: O termo seqüências de controle é

definido aqui para incluir todos os componentes os quais são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que eodifíca um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha à seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Tais seqüências de controle incluem, mas não estão limitadas a, uma seqüência líder, de poliadenilação, seqüência de pró-peptídeo, promotor, seqüência de peptídeo sinalizador e terminador de transcrição. No mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor e sinais de término de transcrição e tradução. As seqüências de controle podem ser fornecidas com ligantes para fins de introdução de sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das seqüências de controle com a região de codificação da seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operavelmente ligado: O termo operavelmente ligado denota aqui uma configuração na qual uma seqüência de controle é colocada em uma posição apropriada com relação à seqüência de codificação da seqüência de polinucleotídeo, de modo que a seqüência de controle dirige a expressão da seqüência de codificação de um polipeptídeo.

Seqüência de codificação: Quando usado aqui, o termo seqüência de codificação significa uma seqüência de nucleotídeo a qual especifica diretamente a seqüência de aminoácido de seu produto de proteína. Os limites da seqüência de codificação são, em geral, determinados por uma rede de leitura aberta, a qual usualmente começa com o códon inicial ATG ou códons iniciais alternativos, tais como GTG e TTG. A seqüência de codificação pode ser uma seqüência de DNA, cDNA ou de nucleotídeo recombinante.

Expressão: O termo expressão inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação póstraducional e secreção.

Vetor de expressão: O termo vetor de expressão é definido aqui como uma molécula de DNA circular ou linear que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção e a qual está operavelmente ligada a nucleotídeos adicionais que proporcionam sua expressão.

Célula hospedeira: O termo célula hospedeira, conforme usado aqui, inclui qualquer tipo de célula o qual é suscetível à transformação, transfecção, transduçao e semelhantes com uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo modificação significa aqui qualquer modificação química do polipeptídeo consistindo de aminoácidos 1 a 40 de qualquer uma de SEQ ID NO: 2 a SEQ ÍD NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274, bem como manipulação genética do DNA que codifica esse polipeptídeo. A(s) modificação(Ões) pode(m) ser substituição(ões), deleção(Ões) e/ou inserção(ões) do(s) aminoácido(s), bem como substituição(ões) de cadeia(s) lateral(is) de aminoácido; ou uso de aminoácidos não naturais com características similares na seqüência de aminoácido. Em particular, a(s) modificação(ões) pode(m) ser amidações, tal como amidação do C-término.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Polipeptídeos Tendo Atividade Antimicrobiana

Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana o qual compreende, de preferência consiste de, uma seqüência de aminoácido a qual tem pelo menos 70% de identidade (de preferência pelo menos 80% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, ainda mais preferivelmente 97% de identidade e, em particular,

100% de identidade) com aminoácidos 1 a 40 da seqüência de aminoácido (1): G-X₁-G-C-X₂-X₃-X4-X5-X6-X7-X8-X9-XlG-XirC-H-X_i2-X₁3-C-Xl4-Xl5-Xl6X_í7-Xl8-Xl9-X20-G-G-X₂l-C-X₂₂-X₂3-X₂4-X25-X2O“X27-C-X28-C-X₂₉; em que

Χί = F, L, W ou I; de preferência, Xj = F;

X₂ = N, R, Q, V, G, S, A, K, L, M,D, Hou Y; de preferência,

X₂ - N, R, Q, V, G, S, A, K ou Y;

X₃ = G, R, A ou K; de preferência, X₃ = G;

X₄ - P, A, L, V, K ou R; de preferência, X₄ - P, K ou R;

X₅ = W ou R;

X₆ = D, A, G, K, L, Τ, N, F, Η, Μ, P, Q, S, C, I, R, V ou Y: de preferência, X₆ - D, A, G, K, L, Τ, N, F, Η, Μ, P, Q, S, V ou Y;

X₇ = E, G, A, L, C, Q ou S; de preferência, X₇ = E, G ou S;

X₈ - D, F, G, N, V, Y, Η, K, L, P, S, T, W, I, M, A, C ou R; de preferência, X₈ - D, F, G, N, V, Y, Η, K, L, P, S, T, W, I, M ou R;

X₉ = D ou P; de preferência, X₉ = D; X₁₀ = M, R, S, V, A, F,

G, F, Τ, Y, W, E ou K; de preferência, X₁₀ = M, R, S, V, G, Y, F, F, T, W ou K;

X, j - Q, R, F, F, G, H, S, A, C, I, Κ, Μ, P, Τ, V, W ou Y; de preferência, X) _t = Q, R, L, F, G, H, S, K ou Y;

X₁₂ = N, R, I, Y, V, Κ, T, Q, S, F, A, W, E ou H;

X_]3 = Η, A, F, Q, Τ, V ou L; de preferência, X₁₃ “I I ou I,;

Xi4 = K, Q ou R; de preferência, X₎₄ = K ou R;

X₁₅ = S, A, V, N ou F;

Xi₆ = I, F, Μ, T, W ou V; de preferência, X₁₆ = I, F ou V;

X₁₇ ⁼ Kl, T ou R;

Xi₈ = G, Η, Κ, A, P, F, I, Q, R, S, Τ, Y ou N; de preferência,

X₁₈ = G, H, R, Kou N;

X,₉ = Y, Η, K, L, Μ, N, Q, S, V ou R; de preferência, X_]9 - Y

ou R;

X₂o = K, F, I í, T, C ou R; de preferência, X₂₍₎ ⁼ K ou R;

X₂! = Y, F, R, A, H, E, M, S ou W; de preferência, X₂, - Y. F,

Rou W;

X₂₂ = A, K, N, Q, T, E, Η, I, R, S, V, Gou Y; de preferência, X₂₂ - A, K, N, Q, T, S ou Y;

X₂₃ = K, R ou T; de preferência, X₂₃ = K ou R;

X₂₄ = G, K, Q, E, N, S, T, A ou R; de preferência, X₂₄ ~ G, K,

Q, A ou R;

X₂₅ = G, K, H, W ou R; de preferência, X₂₅ - G, K ou R;

X₂6 ⁼ F, A, Η, ί, Μ, V, W, R ou L; de preferência, X₂₆ ~ F ou L;

X₂₇ = V, L, Μ, I, K, Q, R ou T; de preferência, X₂₇ = V, L, M ou T;

X₂₈ = K, Η, N ou R; de preferência, X₂₈ = K ou R;

X₂₉ = Y, I, YRCG ou YR; de preferência, X₂₉ = Y ou YR; e a qual tem menos de 100% de identidade com aminoácidos 1 a 40 de SEQ ID NO: 1.

Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção é um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana o qual compreende, de preferência consiste de, uma seqüência de aminoácido a qual tem pelo menos pelo menos 70% de identidade (de preferência pelo menos 80% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, ainda mais preferivelmente 97% de identidade e, em particular, 100% de identidade) com aminoácidos 1 a 40 da seqüência de aminoácido (II):

G-F-G-C-X₁-G-X₂-X₃-X4-X₅-X6-D-X₇-X₈-C-H-X₉-X₁o-C-X₁₁-S-X₁₂-X-₁₃-Xu-X-^-Xuô-G-G-Xn-C-X-^-K-X^-X^rX^-C-K-C-X^;

..9 em que

Xj - N, R, Ο, V, G, S. A, Kou Y; de preferência, X, = N, R. S ou G;

X₂ - P, K ou R;

X₃ = W ou R;

X₄ = D, A, G, K, L, T, N, F, Η, Μ, P, Q, S, V ou Y; de preferência, X₄ = D, S, A, G ou N;

X₅ = E, G ou S; X₆ - D, F, G, N, V, Y, Η, K, L, P, S, T, W,

M ou R; de preferência,

X₆ = D, G ou N;

X₇ - M, R, S, V, G, Y, L, F, T, AV ou K; de preferência, X₇ =

M, L, G ou V;

X₈ = Q, R, L, F, G, H, S, K ou Y; de preferência, X₈ - Q, K, R ou F;

X₉ - N, R, I] Y, V, K, T, S, Q ou H; de preferência, X₉ = N, R,

V ou Q;

X_]0 = H ou L;

Xi i — K ou R;

Xi2 ~ 1, L ou V;

X₁₃ = K ou R;

X]₄ = G, H, R, K ou N; de preferência, X_!4 = G ou R;

X₁₅ = You R;

X₁₆ = K ou R;

X_l7 - Y, F, R ou W; X₁₈ = A, K, N, Q, T, S ou Y, de preferência,

X]₈ = A, S ou T;

X_i9 = G, K, Q, A ou R; de preferência, X₁₉ = G ou A;

X20 ~ K ou R;

X21 = F ou L;

X₂₂ - V, L, Μ ou Τ; dc preferência, X₂₂ - V ou L;

X₂₃ = Y ou YR;

e a qual tem menos de 100% de identidade com aminoácidos 1 a 40 de SEQ ID NO: 1.

Em outra modalidade, a seqüência de aminoácído (I) e/ou (II) tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 diferenças de aminoácído comparado com a seqüência de aminoácído de SEQ ID NO: 1. De preferência, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; mais preferivelmente 1, 2, 3, 4 ou 5; ainda mais preferivelmente 1, 2, 3 ou 4; ainda mais preferivelmente 1, 2 ou 3; e, ainda mais preferivelmente, 1 ou 2 aminoácidos são diferentes comparado com a seqüência de aminoácido de SEQID NO: 1.

Em outra modalidade, a seqüência de aminoácido (I) e/ou (II) tem pelo menos 60% de identidade com aminoácidos 1 a 40 de SEQ ID NO: 1, de preferência pelo menos 65% de identidade, pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade ou pelo menos 95% de identidade com aminoácidos 1 a 40 de SEQ ID NO: 1.

Em outra modalidade, a seqüência de aminoácido (I) e/ou (II) tem 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, de preferência 0, 1, 2 ou 3 inserções, mais preferivelmente, 0, 1 ou 2 inserções; e 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 deleções, de preferência 0, 1, 2 ou 3 deleções, mais preferivelmente 0, 1 ou 2 deleções, quando comparado à SEQ ID NO: 1 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274.

Em outra modalidade, o polipeptídeo da invenção compreende, de preferência consiste de, uma seqüência de aminoácido a qual tem pelo menos 60% de identidade (de preferência 70% de identidade, mais preferivelmente 80% de identidade, ainda mais preferivelmente 85% de identidade, ainda mais preferivelmente 90% de identidade, ainda mais preferivelmente 95% de identidade e, ainda mais preferivelmente, 100% de identidade) com aminoácidos 1 a 40 de qualquer uma de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274, de preferência qualquer uma de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 117 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274.

O termo qualquer uma de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 117 se destina a significar SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: II, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ TD NO: 15, SEQ IDNO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO:

96, SEQ ÍD NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100.

SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104.

SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108,

SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112,

SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116 ou SEQ ID NO: 117.

O termo qualquer uma de SEQ ID NO: 118 a SEQ ID NO: 225 se destina a significar qualquer uma de SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO:

119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127, SEQ ÍD NO: 128, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ÍD NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO:

121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ÍD NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO:

203, SEQ ID NO. 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO*

207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO:

211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO:

215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO:

219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO:

223, SEQ ID NO: 224 ou SEQ ID NO: 225.

O termo qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 se destina a significar qualquer uma de SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO:

231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO:

235, SEQ ID NO; 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ TD NO:

239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO:

243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO; 246, SEQ ID NO:

247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250 ou SEQ ID NO: 251.

O termo qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274 se destina a significar qualquer uma de SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO:

257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO:

261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO:

265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO:

269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273 ou SEQ ID NO: 274.

O termo qualquer uma de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 225 se destina a significar qualquer uma de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 117 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 118 a SEQ ID NO: 225.

O termo qualquer uma de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 225 se destina a significar SEQ ID NO: 2 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 225.

Os aminoácidos que compõem os polipeptídeos da invenção podem ser independentemente selecionados de formas D ou L. De preferência, o polipeptídeo da invenção é um polipeptídeo de defensina; mais preferivelmente, uma alfa defensina, uma beta defensina ou uma defensina de inseto (artrópode).

Os polipeptídeos da invenção podem exibir atividade antimicrobiana superior ou pelo menos igual, de preferência superior, comparado com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, determinada como a Concentração Inibitória Mínima (MIC), contra Staphylococcus carnosus

ATCC51365, Staphylococcus aureus ATCC29213 ou Staphylococcus aureus

ATCC25923 de acordo com as diretrizes NCCLS / CLSl, protocolo M7-A6, vol. 20, No. 2: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bactéria That Grow Aerobically.

Em uma modalidade, a presente invenção se refere à variantes artificiais compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274. De preferência, alterações de aminoácido são de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetam significativamente a duplicação e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 10 aminoácidos; pequenas extensões amino- ou carbóxi-terminais, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita purificação através de alteração da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácido básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e

asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácido as quais geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As trocas que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Vaí/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrões, aminoácidos não-padrões (tais como 4-hidróxiprolina, 6-7V-metil li sina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina e alfa-metil serina) podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não-conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético e aminoácidos não naturais pode ser substituído por resíduos de aminoácido. Aminoácidos não naturais foram modificados após síntese de proteína e/ou têm uma estrutura química, em sua(s) cadeia(s) lateral(is), diferente daquela dos aminoácidos padrões. Aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados e, de preferência, estão comercialmente disponíveis e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, dehidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.

Altemativamente, as alterações de aminoácido são de uma natureza tal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, alterações de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, alterar o pH ótimo e semelhantes.

Aminoácidos essenciais no polipeptídeo precursor podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada por sítio ou mutagênese por exploração de alanina

(Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações únicas de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação à atividade biológica (isto é, atividade antimicrobiana) para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Veja também Hilton e colaboradores, 1996, J. BioL Chem. 271: 4699-4708. A interação biológica também pode ser determinada através de análise física de construção, conforme determinado através de técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou rotulação por fotoafínidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Veja, por exemplo, de Vos e colaboradores, 1992, Science 255: 306- 312; Smitb e colaboradores, 1992, J. Mol. BioL 224: 899-904; Wlodaver e colaboradores, 1992, FEBS Lett. 309: 59- 64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir de análise de identidades com polipeptídeos os quais estão relacionados a um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Uma única ou múltiplas substituições de aminoácido podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguindo por um procedimento de seleção relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erro, exibição fágica (por exemplo, Lowman e colaboradores, 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente U.S. No.

5.223.409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada por região (Derbyshire e colaboradores, 1986, Gene 46:145; Ner e colaboradores, 1988, DNA 7: 127).

Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção automáticos de elevado rendimento para detectar atividade de polipeptídeos clonados com mutação expressos por

células hospedeiras. Moléculas dc DNA com mutação que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente seqüeneiadas usando métodos padrões na técnica. Esses métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse e podem ser aplicados a polipeptídeos de estrutura desconhecida.

O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido dos aminoácidos 1 a 40 de qualquer uma de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274 é 10, de preferência 9, mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente no máximo 6, mais preferivelmente no máximo 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, ainda mais preferivelmente 2 e, ainda mais preferivelmente, 1.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma variante de um polipeptídeo antimicrobiano precursor, polipeptídeo antimicrobiano precursor o qual tem pelo menos 60% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade antimicrobiana e compreende uma substituição em uma ou mais posições e em que as substituições são selecionadas de:

F2L, E2W ou F2I;

N5R, N5Q, N5V, N5G, N5S, N5A, N5K, N5L, N5M, N5D,

N5H ou N5Y;

G6R, G6A ou G6K;

P7A, P7L, P7V, P7K ou P7R;

W8R;

D9A, D9G, D9K, D9L, D9T, D9N, D9F, D9H, D9M, D9P, D9Q, D9S, D9C, D9I, D9R, D9V ou D9Y;

E10G, E10A, E10L, E10C, E10Q ou E10S;

D11F, D11G, Dll N, Dl IV, D11Y, Dl 1 H, Dl 1 K, Dl 1 Ϊ , D11P, D11S, D11T, D11W, Dl 11, D11M, Dl IA, DllCouDll R;

D12P;

M13R, M13S, M13V, M13A, M13F, M13G, M13L, M13T, M13Y, M13W, M13E ouM13K;

Q14R, Q14L, Q14F, Q14G, Q14H, Q14S, Q14A, Q14C, Q14I, Q14K, Q14M, Q14P, Q14T, Q14V, Q14W ou Q14Y;

N17R, N17I, N17Y, N17V, N17K, N17T, N17S, N17Q, NI7F, Ν17A, Ν17W, Ν17E ou Ν17H;

H18A, H18F, H18Q, H18T, H18V ou H18L;

K20Q ou K20R;

S21A, S21V, S21 Nou S21F;

122L, I22M, I22T, I22W ou I22V;

K23Rou K23T;

G24H, G24K, G24A, G24P, G24F, G24I, G24Q, G24R, G24S, G24T, G24Y ou G24N;

Y25H, Y25K, Y25L, Y25M, Y25N, Y25Q, Y25S, Y25V ou

Y25R;

K26F, K26H, K26T, K26C ou K26R;

Y29F, Y29R, Y29A, Y29H, Y29L, Y29M, Y29S ou Y29W; A31K, A31 N, A31Q, A31T, A31E, A31H, A31 I, A31 R,

A31S, A31V, A31Gou A31Y;

K32Rou K32T;

G33K, G33Q, G33E, G33N, G33S, G33T, G33A ou G33R; G34K, G34H, G34W ou G34R;

F35A, F35H, F35I, F35M, F35V, F35W, F35R ou F35L;

V36L, V36M, V36I, V36K, V36Q, V36R ou V36T;

K38H, K38N ou K38R; e

Y40I, Y40YRCG ou Y40YR.

De preferência, o polipeptídeo antimicrobiano precursor tem pelo menos 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 80% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade e, ainda mais preferivelmente, 95% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em particular, o polipeptídeo antimicrobiano precursor pode ser idêntico à seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

Em uma modalidade, o polipeptídeo antimicrobiano precursor é um polipeptídeo de defensina; mais preferivelmente, uma alfa defensina, uma beta defensina ou uma defensina de inseto (artrópode). De preferência, a seqüência de aminoácido precursora exibe atividade antimicrobiano.

Ern outra modalidade, o polipeptídeo antimicrobiano precursor tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 diferenças de aminoácido comparado com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. De preferência 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; mais preferivelmente 1, 2, 3, 4 ou 5; ainda mais preferivelmente 1, 2, 3 ou 4; ainda mais preferivelmente 1, 2 ou 3; e, ainda mais preferivelmente, 1 ou 2 aminoácidos são diferentes comparado com a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 1.

Extensão N-terminal

Uma extensão N-terminal dos polipeptídeos da invenção pode, adequadamente, consistir de 1 a 50 aminoácidos, de preferência 2-20 aminoácidos, especialmente 3-15 aminoácidos. Em uma modalidade, extensão de peptídeo N-terminal não contém uma Arg (R). Em outra modalidade, a extensão N-terminal compreende um sítio de divagem kex2 ou semelhante a kex2, conforme será definido ainda abaixo. Em uma modalidade preferida, a extensão N-terminal é um peptídeo compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido Glu (E) e/ou Asp (D), tal como uma extensão N-terminal compreendendo uma das seguintes seqüências: EAE, EE, DE e DD.

Sítios Kex2

Sítios Kex2 (veja, por exemplo, Methods in Enzymology Vol

185, ed. D. Goeddel, Aeademic Press ínc. (1990), San Diego, CA, Gene Expression Technology) e sítios semelhantes a kex2 são sítios de reconhecimento di-básicos (isto é, sítios de divagem) encontrados entre a região de codificação de pró-peptídeo e a região madura de algumas proteínas.

Foi mostrado que, em determinados casos, inserção de um sítio kex2 ou um sítio semelhante a kex2 melhora processamento correto de endopeptidase no sítio de divagem de pró-peptídeo, resultando em níveis aumentados de secreção de proteína.

No contexto da invenção, inserção de um sítio kex2 ou semelhante a kex2 resulta na possibilidade de obter divagem em uma determinada posição na extensão N-terminal, resultando em um polipeptídeo antimicrobiano sendo estendido em comparação com aminoácidos 1 a 40 de qualquer uma de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ

ID NO: 274.

Polipeptídeos Fundidos

Os polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis nos quais outro polipeptídeo é fundido no N-término ou no C-término do polipeptídeo da invenção ou um fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fundido é produzido através de fusão de uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção da mesma) que codifica outro polipeptídeo a uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção da mesma) da presente invenção. Métodos para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidos na técnica e incluem ligação das seqüências de codificação que codificam os polipeptídeos, de modo que elas estejam em rede e que expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador(es).

Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade Antimicrobiano

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para fins da presente invenção, o termo obtido de, conforme usado aqui com relação a uma determinada fonte, significará que o polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual a seqüência de nucleotídeo da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido de uma determinada fonte é secretado extracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo, tal como um polipeptídeo de Bacillus, por exemplo, um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis', ou um polipeptídeo de Streptomyces, por exemplo, um polipeptídeo de Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus', ou um polipeptídeo bacteriano negativo, por exemplo, um polipeptídeo de E. coli ou Pseudomonas sp.

Um polipeptídeo da presente invenção pode também ser um polipeptídeo fúngico e, mais preferivelmente, um polipeptídeo de levedo, tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia', ou, mais preferivelmente, um polipeptídeo fúngico filamentoso, tal como um polipeptídeo de Acremonium, Aspergillus, A ureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Eusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium ou Trichoderma.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces

diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis tendo atividade antimicrobiana.

Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium hactridioidcs. Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

Será compreendido que, para as espécies antes mencionadas, a invenção abrange os estados perfeito e imperfeito e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, a despeito do nome da espécie pelo qual eles são conhecidos. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

Cepas dessas espécies estão prontamente acessíveis ao público em uma série de coleções de cultura, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis nos quais outro polipeptídeo é fundido ao N-ténnino ou ao C-término do polipeptídeo ou fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fundido é produzido através de fusão de uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção da mesma) que codifica outro polipeptídeo a uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção da mesma) da presente invenção. Métodos para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidos na técnica e incluem ligação das seqüências de codificação que codificam os polipeptídeos de modo que elas estejam em rede e que expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador(es).

Polinucleotídeos

A presente invenção se refere a polinucleotídeos tendo uma seqüência de nucleotídeo a qual codifica um polipeptídeo da invenção. Em particular, a presente invenção se refere a polinucleotídeos consistindo de uma seqüência de nucleotídeo a qual codifica um polipeptídeo da invenção. Em virtude da degenerância do código genético, a pessoa habilitada pode reconhecer facilmente que várias seqüências de nucleotídeo que codificam cada um dos polipeptídeos da invenção podem ser preparadas. E bem sabido na técnica quais nucleotídeos compõem códons que codificam os aminoácidos dos polipeptídeos da invenção.

A presente invenção também se refere a polinucleotídeos os quais codificam fragmentos da seqüência de aminoácido mostrada como qualquer uma de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ÍD NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274 que tem atividade antimicrobiana. Uma sub-seqüência dos polinucleotídeos é uma seqüência de nucleotídeo em que um ou mais nucleotídeos das extremidades 5' e/ou 3' tenham sido deletados.

A seqüência de nucleotídeo pode ser obtida através de procedimentos padrões de clonagem usados em engenharia genética para deslocar a seqüência de nucleotídeo de um local para um local diferente onde

ela será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver excisão e isolamento de um fragmento desejado compreendendo a seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula de vetor e incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira onde múltiplas cópias ou clones da seqüência de nucleotídeo serão replicados. A seqüência de nucleotídeo pode ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética ou quaisquer combinações dos mesmos.

Modificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de um polipeptídeo, o qual compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos uma substituição, deíeção e/ou inserção quando comparado aos aminoácidos 1 a 40 de qualquer uma de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 225 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 226 a SEQ ID NO: 251 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 252 a SEQ ID NO: 274. Essas variantes artificiais podem diferir, em alguma forma manipulada, do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem quando à atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo ou semelhante.

Será evidente para aqueles habilitados na técnica que tais substituições podem ser feitas fora das regiões críticas para a função da molécula e ainda resultar em um polipeptídeo ativo. Resíduos de aminoácido essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção e, portanto, de preferência, não submetido à substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada por sítio ou mutagênese por exploração da alanina (veja, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081 1085). Na última técnica, mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação à atividade antimicrobiana para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Sítios de interação

também podem ser determinados através de análise da construção tridimensional, conforme determinado através de técnicas tais como análise por ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulação por fotoafinidade (veja, por exemplo, de Vos e colaboradores, 1992, Science 255:

306-312; Smith e colaboradores, 1992, Journal of Molecular Biology 224:

899-904; Wlodaver e colaboradores, 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

Além disso, uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser modificada através de introdução de substituições de nucleotídeo as quais não dão origem a outra seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo, mas a qual corresponde ao uso de códon do organismo hospedeiro destinado à produção do polipeptídeo antimicrobiano.

Construções de Acido Nucléico

A presente invenção também se refere a construções de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo isolado da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais seqüências de controle as quais direcionam a expressão da seqüência de codificação em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo da invenção pode ser manipulado em uma variedade de formas para proporcionar expressão do polipeptídeo. Manipulação da seqüência de polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária, dependendo do vetor de expressão. Os métodos para modificação de seqüências de polinucleotídeo utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.

A seqüência de controle pode ser uma seqüência promotora apropriada, uma seqüência de nucleotídeo a qual é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo que codifica um

polipeptídeo da presente invenção. A seqüência promotora contém seqüências de controle transcricíonal as quais mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo a qual mostra atividade transcricíonal na célula hospedeira de escolha, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares, quer homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do operon lac de £. coli, gene de agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene de levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis e gene de beta-lactamase procariota (Villa-Kamaroff e colaboradores, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer e colaboradores, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Outros promotores são descritos em Useful proteins from recombinant bactéria em Scientific American, 1980, 242: 7494; e em Sambrook e colaboradores, 1989, supra.

Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fungica filamentosa são promotores obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Phizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácido-estável de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), üpase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae,

isomerase de fosfato de triose de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus niduians, amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de

Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores para os genes para alfaamilase neutra de Aspergillus niger e isomerase de fosfato de triose de Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos.

Em um hospedeiro de levedo, promotores úteis são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquínase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), desidrogenase de álcool/desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), isomerase de fosfato de triose de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotionina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) e quinase de 3fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedo são descritos por Romanos e colaboradores, 1992, YeastZ: 423-488.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência terminadora de transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência terminadora é operavelmente ligada ao 3’ término da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador o qual é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção. Terminadores preferidos para

células hospedeiras de fungo fdamentoso são obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, sintase de antranilato de Aspergillus nidulans, alfa-giicosidase de Aspergillus niger e protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum.

Terminadores preferidos para células hospedeiras de levedo são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocroma C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e desidrogenase de gliceraldeído-3fosfato de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedo são descritos por Romanos e colaboradores, 1992, supra.

A seqüência de controle pode também ser uma seqüência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA a qual é importante para tradução pela célula hospedeira. A seqüência líder é operavelmente ligada ao 5' término da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção. Líderes preferidos para células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidos os genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae e isomerase de fosfato de triose de Aspergillus nidulans.

Líderes adequados para células hospedeiras de levedo podem ser obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), quínase de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae, alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae e desidrogenase de álcool/desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência operavelmente ligada ao 3' término da seqüência de nucleotídeo e a qual, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação a qual é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Seqüências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, sintase de antranilato de Aspergillus nidulans, protease semelhante à tripsina de

Fusarium oxysporum e alfa-glicosidase de Aspergillus niger.

Seqüências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedo são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

A seqüência de controle também pode ser uma região de 10 codificação de peptídeo sinalizador que codifica uma seqüência de aminoácido ligada ao amino término de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo codificado para a via secretória da célula. A extremidade 5' da seqüência de codificação da seqüência de nucleotídeo pode conter, inerentemente, uma região de codificação de peptídeo sinalizador naturalmente ligada, em uma rede de leitura de tradução, ao segmento da região de codificação a qual codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a extremidade 5' da seqüência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo sinalizador a qual é estranha à seqüência de codificação. A região de codificação de peptídeo sinalizador estranha pode ser requerida onde a seqüência de codificação não contém naturalmente uma região de codificação de peptídeo sinalizador. Altemativamente, a região de codificação do peptídeo sinalizador estranha pode simplesmente substituir a região de codificação de peptídeo sinalizador natural de forma a intensificar a secreção do polipeptídeo. Contudo, qualquer região de codificação de peptídeo sinalizador a qual dirige o polipeptídeo expressão na via secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Regiões de codificação de peptídeo sinalizador eficazes para células hospedeiras bacterianas são as regiões de codificação de peptídeo

sinalizador obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis subtilisin, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras dc Bacillus stearothermophilus {nprT. nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtil is.

Outros peptídeos sinalizadores sâo descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Regiões de codificação de peptídeo sinal izador eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as regiões de codificação de peptídeo sinalizador obtidas dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspáríica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens e lipase de Humicola lanuginosa.

Peptídeos sinalizadores úteis para células hospedeiras de levedo são obtidos dos genes para alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras regiões de codificação de peptídeo sinalizador úteis são descritas por Romanos e colaboradores, 1992, supra.

A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de pró-peptídeo que codifica uma seqüência de aminoácido posicionada no amino término de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimógeno em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo maduro através de divagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A região de codificação de pró-peptídeo pode ser obtida dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis {aprE), protease neutra de Bacillus subtilis {nprT), alfafator de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Onde ambas as regiões de peptídeo sinalizador e pró-peptídeo

estão presentes no amino término de um polipeptídeo. a região de própeptídeo está posicionada próximo ao amino término de um polipeptídeo e a região de peptídeo sinalizador está posicionada próxima ao amino término da região de pró-peptídeo.

Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias as quais permitem a regulação da expressão do polipeptídeo com relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são aqueles os quais fazem com que a expressão do gene seja ativada ou desativada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Sistemas regulatórios em sistemas procariotas incluem os sistemas do operador lac, tac e trp. Em levedo, o sistema ADH2 ou o sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos fílamentosos, o promotor de alfa-amilase TAKA, promotor de glicoamilase de Aspergillus niger e o promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados como seqüências regulatórias. Outros exemplos de seqüências regulatórias são aquelas as quais permitem amplificação de gene. Em sistemas eucariotas, essas incluem o gene de reductase de dihidrofolato o qual é amplificado na presença de metotrexato e os genes de metalotioneína os quais são amplificados com metais pesados. Nesses casos, a seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo seria operavelmente ligada à seqüência regulatória.

Vetores de Expressão

A presente invenção também se refere a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucíeotídeo da invenção, um promotor e sinais de término de transcrição e tradução. Os vários ácidos nucleicos e seqüências de controle descritas acima podem ser unidos juntos para produzir um vetor de expressão recombinante o qual pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir inserção ou substituição da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Altemativamente, uma

seqüência de nucleotídeo da presente invenção pode ser expressa através de inserção da seqüência de nucleotídeo ou uma construção de ácido nucléico compreendendo a seqüência em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a seqüência de codificação está localizada no vetor, de modo que a seqüência de codificação esteja operavelmente ligada às seqüências de controle apropriadas para expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) o qual pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e pode levar à expressão da seqüência de nucleotídeo. A escolha do vetor dependerá, tipicamente, da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor tem de ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.

O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor o qual existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossoma ou um cromossoma artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um o qual, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) ele foi integrado. Além disso, um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos os quais, juntos, contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon pode ser usado.

Os vetores da presente invenção contêm, de preferência, um ou mais marcadores selecionáveis os quais permitem seleção fácil de células transformadas. Um marcador selecionável é um gene, o produto do qual proporciona resistência a biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos e semelhantes.

Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos sao os

genes dal de Bacillus subtil is ou Bacillus licheniformis ou marcadores os quais conferem resistência a antibiótico, tal como resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedo são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e IRA3. Marcadores adequados para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (carbamoiltransferase de omitina), bar (acetiltransferase de fosfinotricina), hph (fosfotransferase de higromicina), niaD (reductase de nitrato), pyrG (decarboxilase de orotidina-5'-fosfato), sC (adeniltransferase de sulfato) e trpC (sintase de antranilato), bem como equivalentes dos mesmos. Preferidos para uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção contêm, de preferência, (um) elemento(s) que permite(m) integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a seqüência de polinucleotideo que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma através de recombinação homóloga ou não-homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter seqüências de nucleotídeo adicionais para direcionar a integração através de recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em (um) íocal(is) preciso(s) no(s) cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais conterão, de preferência, um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de base, de preferência 400 a 10.000 pares de base e, ainda mais preferivelmente, 800 a 10.000 pares de base, os quais têm um alto grau de identidade com a seqüência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer seqüência que é homóloga à seqüência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser seqüências de nucleotídeo de codificação ou não-codificação. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira através de recombinação não-homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode ainda compreender uma origem de replicação que permite que o vetor se reproduza de modo autônomo na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer reprodutor de plasmídeo que media replicação autônoma o qual funciona em urna célula. O termo origem de replicação ou reprodutor de plasmídeo é definido aqui como uma seqüência de nucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se reproduza in vivo.

Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184, que permitem replicação em E. coli e pUBllO, pE194, pTA1060 e ρΑΜβΙ, que permitem replicação em Bacillus.

Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedo são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMAI e ANSI (Gems e colaboradores, 1991, Gene 98: 61-67; Cullen e colaboradores, 1987, Nucleic Acids Research 15: 91639175; WO 00/24883). Isolamento do gene AMAI e construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser realizados de acordo com os métodos divulgados no WO 00/24883.

Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto do gene. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode

ser obtido através de integração de pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou através de inclusão de um gene marcador selecíonável amplificável com o polinucleotídeo, onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecíonável e, desse modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas através de cultura das células na presença do agente selecíonável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica (veja, por exemplo, Sambrook e colaboradores, 1989, supra).

Céiuias Hospedeiras

A presente invenção também se refere à células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção as quais são, vantajosamente, usadas na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo um polinucleotídeo da invenção é introduzido em uma célula hospedeira, de modo que o vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico de autoreplicação, conforme descrito anteriormente. O termo célula hospedeira abrange qualquer prole de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursora em virtude de mutações que ocorrem durante replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá, até grande ponto, do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, por exemplo, um procariota, ou um microorganismo não-unicelular, por exemplo, um eucariota.

Microorganismos unicelulares úteis são células bacterianas, tais como bactérias gram positivas incluindo, mas não limitado a, uma célula de Bacillus, por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans. Bacillus clausii, Bacillus coagulans,

Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium. Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtil is e Bacillus ihuringicnsis: ou uma célula de Streptomyces, por exemplo, Streptomyces lividans e Streptomyces murinus ou bactérias gram negativas, tais como E. coli e Pseudomonas sp. Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtllis. Em outro aspecto preferido, a célula de Bacillus é um Bacillus alcalofílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser realizada através de transformação de protoplasta (veja, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (veja, por exemplo, Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (veja, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (veja, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

A célula hospedeira também pode ser um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungica.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula fungica. Fungos, conforme usado aqui, inclui os gêneros Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (conforme definido por Hawksworth e colaboradores, em Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8^a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido), bem como Oomycota (conforme citado em Elawksworth e colaboradores, 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth e colaboradores, 1995, supra).

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula de levedo. Levedo, conforme usado aqui, inclui levedo ascosporogêneo (Endomicetales), levedo basidiosporogêneo e levedo pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomicetes). Uma vez que a classificação de levedo pode mudar no futuro, para fins da presente invenção, levedo será definido conforme descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S. M. e Davenport, R.R., eds, Soc. App. BacterioL Symposium Series No. 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira de levedo é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyees, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedo é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis. Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedo é uma célula de Kluyveromyees lactis. Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedo é uma célula de Yarrowia lipolytics.

Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula fungica filamentosa. Fungos filamentosos incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (conforme definido por Hawksworth e colaboradores, 1995, supra). Os fungos filamentosos são, em geral, caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glicana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. Crescimento vegetativo é através de alongamento hifal e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, crescimento vegetativo por levedos, tal como, é através de germinação de um talo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus, A ureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus,

Cryptocuccus, Filibasidium, Fusa/pim, Humicola, Magnaporthe. Mucor. Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora. Paecilomyces. Penicillium. Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces. Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma. Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ou Fusarium venenatum. Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula da cepa Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa ou Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes ver si color, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

Células fúngicas podem ser transformadas através de um processo envolvendo formação de protoplasta, transformação dos protoplastas e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de

Aspergillus e Trichoderma são descritos no EP 238 023 e Yelton e colaboradores, 1984, Proceedings of the National Aeademy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adequados para transformação de espécies Fusarium são descritos por Malardier e colaboradores, 1989, Gene 78: 147-156 e WO

96/00787. Levedo pode ser transformado usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, páginas 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito e colaboradores, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hínnen e colaboradores, 1978,

Proceedings of the National Aeademy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Produção

A presente invenção também se refere a métodos para produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultura de uma célula a qual, em sua forma do tipo selvagem, é capaz de produção do polipeptídeo, sob condições condutivas à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.

A presente invenção também se refere a métodos para produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultura de uma célula hospedeira sob condições condutivas à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada através de cultura em frasco de agitação e fermentação em pequena escala ou larga escala (incluindo fermentações contínua, em batelada, alimentada-em batelada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em um meio adequado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. A cultura ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais

SC inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo nào é secretado, ele pode ser recuperado de lisados de célula.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Esses métodos de detecção podem incluir uso de anticorpos específicos. Por exemplo, um ensaio de atividade antimicrobiana pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo, conforme descrito aqui.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente através de procedimentos convencionais incluindo, mas não limitado a, centrifugação, filtração, extração, liofilização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados através de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (veja, por exemplo, Protein Purificador^ J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989).

Plantas

A presente invenção também se refere a uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta a qual tenha sido transformada com uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana da presente invenção, de modo a expressar e

produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Altemativamente. a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou destruir um fator antinutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como capim do prado (capim-do-campo, Poa), capim de forragem, tal como Festuca, Lolium, capim temperado, tal como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (milho).

Exemplos de plantas dicots são tabaco, legumes, tais como lúpulos, batata, beterraba sacarínica, ervilha, feijão e soja e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza e o organismo modelo intimamente relacionado Arahidopsis thalicma.

Exemplos de partes de planta são tronco, caule, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo essas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos celulares de planta específicos, tais como cloroplastas, apoplastas, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomas e citoplasma, também são considerados como sendo uma parte da planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem tecidual, é considerada como sendo uma parte de planta. Da mesma forma, partes de planta, tais como tecidos e células específicas isoladas para facilitar a utilização da invenção, também são considerados partes de planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e envoltórios de sementes.

Também incluída dentro do escopo da presente invenção está a prole de tais plantas, partes de planta e células de planta.

A planta ou célula de planta transgênica expressando um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída através de incorporação de uma ou mais construções de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeiro da planta e propagação da planta modificada ou célula de planta resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.

A construção de expressão é, convenientemente, uma construção de ácido nucleico a qual compreende um polinucíeotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção operavelmente ligado com seqüências regulatórias apropriadas requendas para expressão da seqüência de nucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificação de células hospedeiras nas quais a construção de expressão tenha sido integrada e seqüências de DNA necessárias para introdução da construção na planta em questão (o último depende do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha de seqüências regulatórias, tais como seqüências terminadoras e promotoras e, opcionalmente, seqüências de sinal ou trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como se deseja que o polipeptídeo seja expresso. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou induzível ou pode ser específica ao desenvolvimento, estágio ou tecido e o produto do gene pode ser objetivado a um tecido ou parte de planta específica, tais como sementes ou folhas. Seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague e colaboradores, 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para expressão constitutiva, os promotores de 35-CaMV, ubiquitina 1 de milho e actina 1 de arroz podem ser usados (Franck e colaboradores, 1980, Cell 21: 285-294, Christensen e colaboradores, 1992,

Planí Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang e colaboradores, 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores órgão-específicos podem ser. por exemplo, um promotor de tecidos de retenção de armazenamento, tais como sementes, batata, tubérculos e frutos (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:

275-303) ou de tecidos de retenção metabólica, tais como meristemas (Ito e colaboradores, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor sementeespecífico, tal como os promotores de glutelina, prolamina, globulina ou albumina de arroz (Wu e colaboradores, 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecida de Vicia faba (Conrad e colaboradores, 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708- 711), um promotor de uma proteína de corpo óleo de semente (Chen e colaboradores, 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor napA de proteína de armazenamento de Brassica napus ou qualquer outro promotor semente-específíco conhecido na técnica, por exemplo, conforme descrito no WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor folha-específico, tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka e colaboradores, 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), o promotor do gene de metil trans ferase de adenina do vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93) ou o protomor do gene aldP de arroz (Kagaya e colaboradores, 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674) ou um promotor ferida-induzível, tal como o promotor pin2 de batata (Xu e colaboradores, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzível por tratamentos abióticos, tais como temperatura, estiagem ou alterações na salinidade ou induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios, hormônios vegetais, tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico e metais pesados.

Um elemento intensificador promotor também pode ser usado para obter maior expressão de um polipeptídeo da presente invenção na

planta. Poi exemplo, o elemento intensificador promotor pode ser um intron o qual é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, Xu e colaboradores, 1993, supra, divulgam o uso do primeiro intron do gene de actina 1 de arroz para intensificar expressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma da planta de acordo com métodos convencionais conhecidos na técnica, incluindo transformação Agrobacterium<oe&zàz, transformação vírusmediada, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística e eletroporação (Gasser e colaboradores, 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto e colaboradores, 1989,

Wwre338:274).

Presentemente, transferência gene de Agrobacterium tumefaciens-me<T\&á& é o método de escolha para geração de dicots transgênicas (para uma revisão, veja Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) e pode também ser usado para transformação de monocots, embora outros métodos de transformação sejam freqüentemente usados para essas plantas. Presentemente, o método de escolha para geração de monocots transgênicas é bombardeamento de partícula (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA de transformação) de caules embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil e colaboradores, 1992,

Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocots é baseado em transformação de protoplasta, conforme descrito por Omirulleh e colaboradores, 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Após transformação, os transform antes tendo incorporada a construção de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Freqüentemente, o procedimento de transformação é projetado 5 para a eliminação seletiva de genes de seleção, durante regeneração ou nas gerações seguintes através de uso, por exemplo, de co-transformação com duas construções de T-DNA distintas ou excisão sítio-específíca do gene de seleção por uma recombinase específica. A presente invenção também se refere a métodos para produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultura de uma planta ou uma célula de planta transgênica compreendendo um polinucíeotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana da presente invenção sob condições condutivas à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.

Composições

A presente invenção também se refere à composições, tais como composições farmacêuticas, compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. De preferência, as composições são enriquecidas em tal polipeptídeo. O termo enriquecida indica que a atividade antimicrobiana da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de

1,1.

As composições podem ainda compreender outro agente farmaceuticamente ativo, tal como um agente biocida ou biostático adicional, tal como outro polipeptídeo antimicrobiano exibindo atividade antimicrobiana conforme definido acima. O agente biocida pode ser um antibiótico, conforme conhecido na técnica. Classes de antibióticos incluem penicilinas, por exemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas em combinação com inibidores de betalactamase, cefalosporinas, por exemplo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenems; monobactames; aminoglicosídeos;

letraciclinas; macrolídcos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazola; espectinomicina; trimetoprim: vancomicina; etc. O agente biocida pode também ser um agente anti-micótieo. incluindo polienos, por exemplo, anfotericina B, nistatina; 5-fIucosina; e azolas, por exemplo, miconazol, cetoconazol, itraconazol e fluconazol.

Em uma modalidade, o agente biocida é um agente químico não-enzimático. Em outra modalidade, o agente biocida é um agente químico não-polipeptídico.

As composições podem compreender um material veículo adequado. As composições também podem compreender um veículo de distribuição adequado capaz de distribuição dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção ao locus desejado quando as composições são usadas como um medicamento.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de um líquido ou uma composição seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Exemplos são fornecidos abaixo de usos preferidos das composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

Métodos e Usos

A presente invenção também é dirigida a métodos para uso dos polipeptídeos tendo atividade antimicrobiana. Os polipeptídeos antimicrobianos são, tipicamente, úteis em qualquer locus sujeito à contaminação por bactérias, fungos, levedo ou algas. Tipicamente, loci estão em sistemas aquosos, tais como sistemas de água de refrigeração, água de

enxágüe de lavanderia, sistemas dc óleo, tais como óleos de corte, lubrificantes, campos petrolíferos e semelhantes, onde microorganismos precisam ser mortos ou onde seu crescimento precisa ser controlado. Contudo, a presente invenção também pode ser usada em todas as aplicações para as quais composições antimicrobianas conhecidas são úteis, tais como proteção de madeira, látex, adesivo, cola, papel, papelão, têxtil, couro, plásticos, calafetagem e ração.

Outros usos incluem preservação de alimentos, bebidas, cosméticos, tais como loções, cremes, géis, pomadas, sabonetes, xampus, condicionadores, anti-transpirantes, desodorantes, anti-séptico bucal, produtos para lentes de contato, formulações enzimáticas ou ingredientes alimentícios.

Assim, os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser úteis como um desinfetante, por exemplo, no tratamento de infecções nos olhos ou na boca, infecções da pele; em anti-transpirantes ou desodorantes; para limpeza e desinfecção de lentes de contato e dentes (cuidados orais).

Em geral, considera-se que os polipeptídeos antimicrobianos da presente invenção são úteis para limpeza, desinfecção ou inibição de crescimento microbiano sobre qualquer superfície. Exemplos de superfícies as quais podem, vantajosamente, ser contatadas com os polipeptídeos antimicrobianos da invenção são superfícies de equipamento de processo usado, por exemplo, fábricas de processo de produtos lácteos, químicos ou farmacêuticos, sistemas de sanitarização de água, fábricas de processamento de óleo, fábricas de processamento de polpa de papel, fábricas de tratamento de água e torres de refrigeração. Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção deverão ser usados em uma quantidade a qual é eficaz para limpeza, desinfecção ou inibição de crescimento microbiano sobre a superfície em questão.

Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem, adicionalmente, ser usados para limpeza de superfícies e utensílios de cozinha

em fábricas de processamento de alimento e em qualquer área na qual alimento é preparado ou servido, tais como hospitais, casas de repouso e restaurantes.

Eles também podem ser usados como um agente conservante 5 ou um agente de desinfecção em tintas baseadas em água.

A invenção se refere ao uso de um polipeptídeo antimicrobiano ou composição da invenção como um medicamento. Ainda, um polipeptídeo antimicrobiano ou composição da invenção também pode ser usada para a fabricação de um medicamento para controle ou combate de microorganismos, tais como organismos fungicos ou bactérias, de preferência bactérias gram positivas.

A composição e polipeptídeo antimicrobiano da invenção podem ser usados como um agente terapêutico ou profilático antimicrobiano humano ou veterinário. Assim, a composição e polipeptídeo antimicrobiano da invenção podem ser usados no preparo de agentes terapêuticos ou agentes profiláticos humanos ou veterinários para o tratamento de infecções microbianas, tais como infecções bacterianas ou fúngicas, de preferência infecções bacterianas gram positivas. Em particular, as infecções microbianas podem estar associadas à doenças do pulmão incluindo, mas não limitado a, tuberculose, pneumonia e fibrose cística; e doenças sexualmente transmissíveis incluindo, mas não limitado a, gonorréia e clamídia.

A composição da invenção compreende uma quantidade eficaz do polipeptídeo antimicrobiano da invenção.

O termo quantidade eficaz, quando usado aqui, se destina a significar uma quantidade dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção a qual é suficiente para inibir o crescimento dos microorganismos em questão.

A invenção também se refere à composições para cicatrização de ferimentos ou produtos tais como bandagens, dispositivos médicos tais como, por exemplo, cateteres e ainda a produtos anti-caspa para os cabelos,

tais como xampus. Formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção são administradas a um hospedeiro sofrendo de ou pré-disposto a uma infecção microbiana. Administração pode ser tópica, localizada ou sistêmica, dependendo do microorganismo específico, de preferência, ela será localizada. Geralmente, a dose dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção será suficiente para diminuir a população microbiana em pelo menos cerca de 50%, usualmente em pelo menos 1 log e pode ser em 2 ou mais logs de morte. Os compostos da presente invenção são administradas em uma dosagem que reduz a população microbiana, ao mesmo tempo em que minimiza quaisquer efeitos colaterais. Considera-se que a composição será obtida e usada sob a orientação de um médico para uso in vivo. Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção são particularmente úteis para matar bactérias gram negativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa e Chlamydia trachomatis\ e bactérias gram positivas, incluindo estreptococos, tais como Streptococcus pneumonia,

S. uberis, S. hyointestinalis, S. pyogenes e S. agalactiaej e estafilococos, tais como Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus e 5. carnosus.

Formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser administradas a um hospedeiro sofrendo de ou pré-disposto a uma infecção microbiana do pulmão, tal como pneumonia; ou a uma infecção microbiana em um ferimento, tal como uma infecção bacteriana em um ferimento.

Formulações dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção também podem ser administradas a um hospedeiro sofrendo de ou pré25 disposto a uma infecção da pele, tal como acne, dermatite atópica ou dermatite seborréica; de preferência, a infecção da pele é uma infecção bacteriana da pele, por exemplo, causada por Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes, Pityrosporum ovale ou Malassezia furfur.

Os polipeptídeos antimierobianos da invenção também são úteis para formulações in vivo para matar micróbios, particularmente onde não se deseja introduzir quantidades de antibióticos convencionais. Por exemplo, os polipeptídeos antimierobianos da invenção podem ser adicionados a preparados alimentícios para animais e/ou seres humanos; ou eles podem ser incluídos como um aditivo para culturas de células in vitro, para prevenir o crescimento de micróbios em cultura tecidual,

A suscetibilidade de um micróbio particular à morte com os polipeptídeos antimierobianos da invenção pode ser determinada através de testagem in vitro, conforme detalhado na seção experimental. Tipicamente, uma cultura do micróbio é combinada com o peptídeo antimicrobiano em concentrações variadas durante um período de tempo suficiente para permitir que a proteína atue, usualmente entre cerca de uma hora e um dia. Os micróbios viáveis são, então, contados e o nível de morte determinado.

Micróbios de interesse incluem, mas não estão limitados a, bactérias Gram-negativas, por exemplo: Citrobacter sp.; Enterobacter sp.; Escherichia sp., por exemplo, E. coli; Klebsiella sp.; Morganella sp.; Proteus sp.; Providencia sp.; Salmonella sp., por exemplo, S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp., por exemplo, P. aeruginosa; Yersinia sp., por exemplo, Y. pestis, Y pseudotuberculosis, Y enterocolitica; Franciscella sp.; Pasturella sp.; Vibrio sp., por exemplo, V. cholerae, V. parahemolyticus; Campylobacter sp., por exemplo, C. jejuni; Haemophilus sp., por exemplo, H. influenzae, H. ducreyi; Bordetella sp., por exemplo, B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis; Brucella sp., Neisseria sp., por exemplo, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, etc. Outras bactérias de interesse incluem Legionella sp., por exemplo, L. pneumophila; Listeria sp., por exemplo, L, monocytogenes; Mycoplasma sp., por exemplo, M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., por exemplo, M. tubérculos is, M. leprae; Treponema sp., por exemplo, T. pallidum; Borrelia sp., por exemplo, B.

burgdorfeií; Leptospirae sp.; Rickcttsia sp., por exemplo, R. riekettsii. R. typhi; Chlamydia sp., por exemplo, C. trachomatis, C pneumoniae. C. psittaci; Helicobacter sp., por exemplo, H. pylori, etc.

Patógenos não-bacterianos de interesse incluem patógenos íungicos e protozoários, por exemplo, Plasmodia sp., por exemplo, P. falciparum, Trypanosoma sp., por exemplo, T. brucev, cistossomas; Entaemoeba sp., Cryptococcus sp., Candida sp., por exemplo, C. albicans; etc.

Vários métodos para administração podem ser empregados. A formulação de polipeptídeo pode ser fornecida oralmente ou pode ser injetada intravascuíarmente, subcutaneamente, peritonealmente, através de aerossol, oftalmicamente, intra-bexiga, topicamente, etc. Por exemplo, métodos de administração através de inalação são bem conhecidos na técnica. A dosagem da formulação terapêutica variará amplamente, dependendo do polipeptídeo antimicrobiano específico a ser administrado, da natureza da doença, da freqüência de administração, da maneira de administração, da eliminação do agente do hospedeiro e semelhantes. A dose inicial pode ser maior, seguido por doses de manutenção menores. A dose pode ser administrada tão infreqüentemente quanto semanalmente ou bi-semanalmente ou fracionada em doses menores e administrada uma ou várias vezes ao dia, semisemanalmente, etc. para manter um nível de dosagem eficaz. As ligações de amida, bem como os amino e carbóxi términos, podem ser modificados para maior estabilidade quando de administração oral. Por exemplo, o carbóxi término pode ser amidado.

Formulações

Os compostos da presente invenção podem ser incorporados em uma variedade de formulações para administração terapêutica. Mais particularmente, os compostos da presente invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas através de combinação com veículos ou

diluentes farmaceuticamente aceitáveis apropriados e podem ser formulados em preparados nas formas sólida, semi-sólida, líquida ou gasosa, tais como tabletes, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, cremes, espumas, soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, microesferas, loções e aerossóis. Como tal, administração dos compostos pode ser obtida de várias formas, incluindo administração oral, bucal, retal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intraqueal, etc. Os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser sistêmicos após administração ou podem ser localizados através do uso de um implante ou outra formulação que atua para reter a dose ativa no local de implante.

Em uma modalidade, uma formulação para uso tópico compreende um agente de quelação que diminui a concentração eficaz de cátions divalentes, particularmente cálcio e magnésio. Por exemplo, agentes tais como citrato, EGTA ou EDTA podem ser incluídos, onde citrato é preferido. A concentração de citrato usualmente será de cerca de 1 a 10 mM.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados sozinhos, em combinação uns com os outros ou eles podem ser usados em combinação com outros compostos conhecidos (por exemplo, perforina, agentes anti-inflamatórios, antibióticos, etc.). Em formas de dosagem farmacêuticas, os compostos podem ser administrados na forma de seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os métodos e excipientes a seguir são meramente exemplificativos e não são, de qualquer forma, limitativos.

Para preparados orais, os compostos podem ser usados sozinhos ou em combinação com aditivos apropriados para fazer tabletes, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, tais como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com aglutinantes, tais como celulose cristalina, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegrantes, tais como amido de milho, amido de batata ou carbóximetil celulose de sódio; com lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio; e, sc desejado, com diluentes, agentes de tamponamento, agentes umidificantes, conservantes e agentes de flavorização.

Os compostos podem ser formulados em preparados para injeções através de dissolução, suspensão ou emulsificação dos mesmos em um solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleos vegetais ou outros similares, glicerídeos de ácido alifático sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno glicol; e, se desejado, com aditivos convencionais, tais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes de emulsificação, estabilizantes e conservantes.

Os compostos podem ser utilizados na formulação em aerossol a ser administrada via inalação. Os compostos da presente invenção podem ser formulados em propelentes pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e semelhantes.

Os compostos podem ser usados como loções, por exemplo, para prevenir infecção de queimaduras, através de formulação com aditivos convencionais, tais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes de emulsificação, estabilizantes e conservantes.

Além disso, os compostos podem ser transformados em supositórios através de mistura com uma variedade de bases, tais como bases de emulsificação ou bases solúveis em água. Os compostos da presente invenção podem ser administrados retalmente via um supositório. O supositório pode incluir veículos, tais como manteiga de cacau, carboceras e polietileno glicóis, os quais derretem em temperatura corporal, enquanto que são solidificados em temperatura ambiente.

Formas de dosagem unitária para administração oral ou retal, tais como xaropes, elixires e suspensões podem ser proporcionadas, em que cada unidade de dosagem, por exemplo, colher de chá, colher de sopa, tablete ou supositório, contém uma quantidade predeterminada da composição contendo um ou mais compostos da presente invenção, similarmente, formas

de dosagem unitária para injeção ou administração intravenosa podem compreender o composto da presente invenção em uma composição como uma solução em água estéril, solução salina normal ou outro veículo farmaceuticamente aceitável.

Implantes para formulações com liberação sustentada são bem conhecidos na técnica. Implantes são formulados como microesferas, placas, etc. com polímeros biodegradáveis ou não biodegradáveis. Por exemplo, polímeros de ácido láctico e/ou ácido glicólico formam um polímero passível de erosão que é bem tolerado pelo hospedeiro. O implante contendo os polipeptídeos antimicrobianos da invenção é colocado em proximidade ao local de infecção, dc modo que a concentração local de agente ativo seja aumentada com relação ao resto do corpo.

O termo forma de dosagem unitária, conforme usado aqui, se refere à unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de compostos da presente invenção calculada em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente, carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável. As especificações para as formas de dosagem unitária da presente invenção dependem do composto empregado em particular e do efeito a ser obtido e da farmacodinâmica associada ao composto no hospedeiro.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, carreadores ou diluentes, estão prontamente disponíveis ao público. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes para ajuste de pH e tamponamento, agentes para ajuste de tonicidade, estabilizantes, agentes de umedecimento e semelhantes, estão prontamente disponíveis ao público.

Dosagens típicas para administração sistêmica oscilam de 0,1 pg a 100 miligramas por kg de peso do indivíduo por administração. Uma

dosagem típica pode ser um tablete tomado de duas a seis vezes ao dia ou uma cápsula ou tablete de liberação com o tempo tomado uma vez ao dia contendo um teor proporcionalmente maior de ingrediente ativo. O efeito de liberação com o tempo pode ser obtido por materiais da cápsula que dissolvem em diferentes valores de pH, por cápsulas que liberam lentamente através de pressão osmótica ou através de quaisquer outros meios conhecidos de liberação controlada.

Aqueles habilitados apreciarão prontamente que níveis de dose podem variar como uma função do composto específico, a gravidade dos sintomas e a suscetibilidade do indivíduo ao efeitos colaterais. Alguns dos compostos são mais potentes do que outros. Dosagens preferidas para um determinado composto são prontamente determináveis por aqueles habilitados na técnica através de uma variedade de meios. Um meio preferido é medir a potência fisiológica de um determinado composto.

O uso de lipossomas como um veículo de distribuição é um método de interesse. Os lipossomas se fundem com as células do sítio alvo e distribuem os conteúdos do lúmen intracelularmente. Os lipossomas são mantidos em contato com as células durante um tempo suficiente para fusão, usando vários meios para manter contato, tais como isolamento, agentes de ligação e semelhantes. Em um aspecto da invenção, lipossomas são projetados para serem aerossolizados para administração pulmonar. Lipossomas podem ser preparados com proteínas purificadas ou peptídeos que mediam fusão de membranas, tal como vírus Sendai ou vírus da influenza, etc. Os lipídios podem ser qualquer combinação útil de lipídios conhecidos que formam lipossomas, incluindo lipídios catiônicos ou zwiteriônicos, tal como fosfatidileolina. O lipídio restante será, normalmente, lipídios neutros ou ácidos, tais como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol e semelhantes.

Para preparo de lipossomas, o procedimento descrito por Kato e colaboradores (1991) J. Biol. Chem. 266: 3361 pode ser usado.

Resumidamente, os lipídios c composição de lúmen contendo peptídeos são combinados em um meio aquoso apropriado, convenientemente um meio salino, onde os sólidos totais estarão na faixa de cerca de 1-10 por cento em peso. Após agitação intensa durante curtos períodos de tempo, de cerca de 55 60 seg, o tubo é colocado em um banho de água morna, de cerca de 25-40 °C e esse ciclo é repetido de cerca de 5-10 vezes. A composição é, então, submetida a ultra-som durante um período de tempo conveniente, geral mente de cerca de 1-10 seg. e pode ser ainda agitada através de vórtice. O volume é, então, expandido através de adição de meio aquoso, geralmente aumentando o volume em cerca de 1-2 vezes, seguido por agitação e resfriamento. Esse método permite a incorporação, no lúmen, de moléculas de elevado peso molecular.

Formulações com Outros Agentes Ativos

Para uso nos métodos em questão, os polipeptídeos antimicrobianos da invenção podem ser formulados com outros agentes farmaceuticamente ativos, particularmente outros agentes antimicrobianos. Outros agentes de interesse incluem uma ampla variedade de antibióticos, conforme conhecido na técnica. Classes de antibióticos incluem penicilinas, por exemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas em combinação com inibidores de betalactamase, cefalosporinas, por exemplo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenems; monobactames; aminoglicosídeos;

tetraciclinas; macroiídeos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas;

quinolonas; cloranfenical; metronidazola; espectinomicina; trimetoprim;

vancomicina; etc.

Agentes anti-micóticos também são úteis, incluindo polienos, por exemplo, anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; e azolas, por exemplo, miconazol, cetoconazol, itraconazol e fluconazol. Fármacos antitubercuíóticos incluem isoniazid, etambutol, estreptomicina e rifampina.

Citoeinas também podem ser incluídas em uma formulação dos polipeptídeos antimicrobianos da invenção, por exemplo, interferon gama, fator alfa de necrose de tumor, interleucina 2, etc.

Síntese in vitro

Os peptídeos antimicrobianos da invenção podem ser preparados através de síntese in vitro, usando métodos convencionais conforme conhecido na técnica. Vários aparelhos sintéticos comerciais estão disponíveis, por exemplo, sintetizadores automáticos pela Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Através de uso de sintetizadores, aminoácidos que ocorrem naturalmente podem ser substituídos por aminoácidos não naturais, particularmente D-isômeros (ou D-formas), por exemplo, D-alanina e D-isoleucina, diastereoisômeros, cadeias laterais tendo diferentes comprimentos ou funcionalidades e semelhantes. A seqüência particular e a maneira de preparo serão determinados pela conveniência, aspectos econômicos, pureza requerida e semelhantes.

Ligação química pode ser proporcionada a vários peptídeos ou proteínas compreendendo funcionalidades convenientes para ligação, tais como grupos amino para formação de amida ou amida substituída, por exemplo, aminação redutiva, grupos tiol para formação de tioéter ou dissulfeto, grupos carboxila para formação de amida e semelhantes.

Se desejado, vários grupos podem ser introduzidos no peptídeo durante síntese ou durante expressão, os quais permitem ligação à outras moléculas ou a uma superfície. Assim, cisteínas podem ser usadas para fazer tioéteres, histidinas para ligação a um complexo de íons de metal, grupos carboxila para formação de amidas ou ésteres, grupos amino para formação de amidas e semelhantes.

Os polipeptídeo também podem ser isolados e purificados de acordo com métodos convencionais de síntese recombinante. Um lisado pode ser preparado do hospedeiro de expressão e o lisado purificado usando HPLC, cromatografia de exclusão, elctroforese em gel, cromatografia por afinidade ou outra técnica de purificação. Em sua maioria, as composições as quais são usadas compreenderão pelo menos 20% em peso do produto desejado, mais usualmente pelo menos cerca de 75% em peso, de preferência pelo menos cerca de 95% em peso e, para fins terapêuticos, usualmente pelo menos cerca de 99,5% em peso, com relação aos contaminantes relacionados ao método de preparo do produto e sua purificação. Usualmente, os percentuais serão baseados na proteína total.

Ração para Animal

A presente invenção é também dirigida a métodos para uso dos polipeptídeos tendo atividade antimicrobiano em ração para animal, bem como à composições de ração e aditivos para ração compreendendo os polipeptídeos antimicrobianos da invenção.

O termo animal inclui todos os animais, incluindo seres humanos. Exemplos de animais são não-ruminantes e ruminantes, tais como vacas, ovelhas e cavalos. Em uma modalidade particular, o animal é um animal não-ruminante. Animais não-ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas não limitado a, leitões, porcos em crescimento e porcas); aves, tais como perus e galinhas (incluindo, mas não limitado a, aves para abate, poedeiras); bezerros jovens; e peixe (incluindo, mas não limitado a, salmão).

O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparado, mistura ou composição adequada para ou destinada à ingestão por um animal.

No uso de acordo com a invenção, o polipeptídeo antimicrobiano pode ser alimentado ao animal antes, após ou simultaneamente com a dieta. O último é preferido.

Em uma modalidade particular, o polipeptídeo antimicrobiano, na forma na qual ele é adicionado à ração ou quando estando incluído em um

aditivo para ração, é bem definido. Bem definido significa que o preparado de polipeptídeo antimicrobiano é pelo menos 50% puro, conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho (veja Exemplo 12 do WO 01/58275). Em outras modalidades particulares, o preparado de polipeptídeo antimicrobiano é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 ou pelo menos 95% puro, conforme determinado através desse método.

Um preparado de polipeptídeo antimicrobiano bem definido é vantajoso. Por exemplo, é muito mais fácil dosar corretamente à ração um polipeptídeo antimicrobiano que é essencialmente livre de polipeptídeos antimicrobianos de interferência ou outros contaminantes. O termo dosar corretamente se refere, em particular, ao objetivo de obtenção de resultados consistentes e constantes e à capacidade de otimizar a dosagem baseado no efeito desejado.

Para o uso em ração para animal, contudo, o polipeptídeo antimicrobiano não precisa ser aquele puro; ele pode, por exemplo, incluir outras enzimas, caso no qual ele poderia ser denominado um preparado de polipeptídeo antimicrobiano.

O preparado de polipeptídeo antimicrobiano pode ser (a) adicionado diretamente à ração (ou usado diretamente em um processo de tratamento de proteínas vegetais) ou (b) pode ser usado na produção de uma ou mais composições intermediárias, tais como aditivos para ração ou prémisturas, que são subseqüentemente adicionados à ração (ou usados em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima se refere à pureza do preparado de polipeptídeo antimicrobiano original, quer usado de acordo com (a) ou (b) acima.

Preparados de polipeptídeo antimicrobiano com purezas dessa ordem de magnitude são, em particular, obteníveis usando métodos de produção recombinante, enquanto que eles não são tão facilmente obtidos e, assim, estão sujeitos a uma variação lote-a-lote maior quando o polipeptídeo

antimicrobiano é produzido através de métodos de fermentação tradicionais.

Tal preparado de polipeptídeo antimicrobiano pode, naturalmente, ser misturado com outras enzimas.

O termo proteínas vegetais, conforme usado aqui, se refere a qualquer composto, composição, preparado ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou originária de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em modalidades particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, ou 60% (peso/peso).

Proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, tais como legumes e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae e Poaceae, tais como farinha de soja, farinha de lúpulo e farinha de colza.

Em uma modalidade particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, lúpulo, ervilha ou feijão.

Em outra modalidade particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba sacarínica, espinafre ou quinoa.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são colza e couve.

Soja é uma fonte de proteína vegetal preferida.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais, tais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho (milho), arroz e sorgo.

O polipeptídeo antimicrobiano pode ser adicionado à ração em qualquer forma, seja como um polipeptídeo antimicrobiano relativamente puro ou em mistura com outros componentes destinados à adição à ração para animal, isto é, na forma de aditivos de ração para animal, tais como as assim denominadas pré-misturas para ração para animal.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere à composições para uso em ração para animal, tal como ração para animal e aditivos de ração para animal, por exemplo, pré-misturas.

Além do polipeptídeo antimicrobiano da invenção, os aditivos de ração para animal da invenção contêm pelo menos um a vitamina solúvel em gordura e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água e/ou pelo menos um mineral residual e/ou pelo menos um macro mineral.

Ainda, ingredientes aditivos para ração opcionais são agentes de coloração, compostos aromáticos, estabilizantes e/ou pelo menos uma outra enzima selecionada dentre as fitases EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26; xilanases EC 3.2.1.8; galactanascs EC 3.2.1.89; e/ou beta-glucanases EC 3.2.1.4.

Em uma modalidade particular, essas outras enzimas são bem definidas (conforme definido acima para preparados de polipeptídeo antimicrobiano).

Exemplos de outros peptídeos antimicrobianos (AMPs) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Ovispirina, tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000) e variantes ou fragmentos dos mesmos os quais retêm atividade antimicrobiana.

Exemplos de outros polipeptídeos antifúngicos (AFPs) são os peptídeos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, bem como variantes e fragmentos dos mesmos os quais retêm atividade antifúngica, conforme divulgado no WO 94/01459 e WO 02/090384.

Usualmente, vitaminas solúveis em gordura e água, bem como minerais residuais, formam parte de uma assim denominada pré-mistura destinada à adição à ração, enquanto que macro minerais são usualmente adicionados separadamente à ração. Qualquer um desses tipos de composição, quando enriquecida com um polipeptídeo antimicrobiano da invenção, é um aditivo de ração para animal da invenção.

Em uma modalidade particular, o aditivo de ração para animal

da invenção se destina a scr incluído (ou prescrito como tendo sido incluído) em dietas ou ração para animal em níveis de 0,01 a 10.0%; mais particularmente 0,05 a 5,0%, ou 0,2 a 1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de ração). Isso é, assim, em particular para pré-misturas.

O seguinte são listas nào exclusivas de exemplos desses componentes:

Exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina a, vitamina D3, vitamina E e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.

Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina BI2, 10 biotina e colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, D-pantotenato.

Exemplos de minerais residuais são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

Exemplos de macro minerais são cálcio, fósforo e sódio.

Os requisitos nutricionais desses componentes (exemplificado em aves e leitões/porcos) são listados na Tabela A do WO 01/58275. Requisito nutricional significa que esses componentes deverão ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

Altemativamente, o aditivo de ração para animal da invenção 20 compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A do WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um de, um ou mais de, um ou dois ou três ou quatro e assim por diante até todos os treze ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, esse pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em uma quantidade tal de modo a proporcionar uma concentração na-ração dentro da faixa indicada na coluna quatro ou coluna cinco ou coluna seis da Tabela A.

A presente invenção também se refere à composições de ração para animal. Composições de ração para animal ou dietas têm um teor relativamente alto de proteína. Dietas para ave e porco podem ser

caracterizadas conforme indicado na Tabela B do WO 01 /58275. colunas 2-3. Dietas para peixe podem ser caracterizadas conforme indicado na coluna 4 dessa Tabela B. Além disso, tais dietas para peixe usualmente têm um teor de gordura bruta de 200-310 g/kg.

Uma composição de ração para animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruta de 50-800 g/kg e, além disso, compreende pelo menos um polipeptídeo antimicrobiano conforme reivindicado aqui.

Além disso ou altemativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração para animal da invenção tem um teor de energia metabolizávcl de 10 30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.

Em modalidades particulares, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína e/ou lisina está dentro de qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B do WO 01/58275 (R. 2-5).

Proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator de 6,25, isto é, Proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado através do método de Kjeldahl (A.O.A.C, 1984, Official Methods of Analysis 14^a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

Energia metabolizável pode ser calculada com base na Publicação NRC Nutrient Requirements in Swine, nona edição revista 1988, Subcommittee on Swine Nutrition, Committee on Animal Nutrition, Board of Agriculture, National Research Council. National Academy Press, Washington, D. C, páginas 2-6 e na Tabela Européia de Valores de Energia para Matérias Alimentícias para Aves, Spelderholt Centre for Poultry

Research and Extension, 7361 DA Beekbergen, Países Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

O teor dietético de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas completas para animal é calculado com base em tabelas de ração, tais como Veevoedertabel 1997, Gegevens Over Chemische Samenstelling, Verteerbaarheid en Voederwaarde Van Voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

Em uma modalidade particular, a composição de ração para animal da invenção contém pelo menos uma proteína ou fonte de proteína vegetal, conforme definido acima.

Em ainda outras modalidades particulares, a composição de ração para animal da invenção contém 0-80% de milho; e/ou 0-80% de sorgo; e/ou 0-70% de trigo; e/ou 0-70% de cevada; e/ou 0-30% de aveias; e/ou 040% de farinha de soja; e/ou 0-10% de farinha de peixe; e/ou 0-20% de soro.

Dietas para animal podem, por exemplo, ser fabricadas como ração amassada (não pelotizada) ou ração pelotizada. Tipicamente, as matérias alimentícias moídas são misturadas e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. Enzimas podem ser adicionadas como formulações enzimáticas sólidas ou líquidas. Por exemplo, uma formulação enzimática sólida é, tipicamente, adicionada antes ou durante a etapa de mistura; e um preparado enzimático líquido é, tipicamente, adicionado após a etapa de pelotização. A enzima pode também ser incorporada em um aditivo para ração ou prémistura.

A concentração final de enzima na dieta está dentro da faixa de

0,01-200 mg de proteína de enzima por kg de dieta, por exemplo, na faixa de 5-30 mg de proteína de enzima por kg de dieta para animal.

O peptídeo antimicrobiano pode ser administrado em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagem): 0,01-200; ou 0,01-100;

υιι 0,05-100; ou 0,05-50; ou 0,10-10 - todas essas faixas sendo em mg de proteína de polipeptídeo antimicrobiano por kg de ração (ppm).

Para determinação do mg de proteína de polipeptídeo antimicrobiano por kg de ração, o polipeptídeo antimicrobiano é purificado da composição de ração e a atividade específica do polipeptídeo antimicrobiano purificado é determinada usando um ensaio relevante (veja sob atividade antimicrobiano, substratos e ensaios). A atividade antimicrobiano da composição de ração como tal é também determinada usando o mesmo ensaio e, com base nessas duas determinações, a dosagem em mg de proteína de polipeptídeo antimicrobiano por kg de ração é calculada.

Os mesmos princípios se aplicam para determinação de mg de proteína de polipeptídeo antimicrobiano em aditivos para ração. Naturalmente, se uma amostra está disponível do polipeptídeo antimicrobiano usado para preparo do aditivo para ração ou da ração, a atividade específica é determinada a partir dessa amostra (não precisa purificar o polipeptídeo antimicrobiano da composição de ração ou do aditivo).

A presente invenção é ainda descrito através dos exemplos a seguir os quais não deverão ser construídos como limitando o escopo da invenção.

EXEMPLOS

Produtos químicos usados como tampões e substratos eram produtos comerciais pelo menos de grau reagente.

EXEMPLO 1

Avaliação de Concentração Mínima Eficaz 25 Três polipeptídeos antimicrobianos, os quais são variantes de

SEQ ID NO: 1, foram testados com relação à atividade antimicrobiano. Um ensaio de Concentração Mínima Eficaz (MEC, expresso como pg/mL) contra diferentes microorganismos foi realizado usando os três mutantes de plectasina, Y40YR, N17R e Y25R, seguindo o protocolo descrito no livro

Methods in Molecular Biology, vol 78, Antibacterial peptide protocol William M. Shafer, Tluman Press.

O mutante de píectasina 'Ύ40ΥΚ^Ν foi construído através de adição de um resíduo de arginina à extremidade da seqüência de aminoácido de píectasina.

Os resultados mostraram atividade aperfeiçoada de todos os três peptídeos antimicrobianos comparado com píectasina do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) contra as bactérias Bacillus subtilis. Micrococcus luteus e Staphylococcus epidennidis.

Mutação	SEQ ID NO:	MEC contra B. subtilis	MEC contra M. luteus	MEC contra 5. epidermis
tipo selvagem	1	0.09	1,89	0,98
Y40R	99	0,05	0,18	0,31
N17R	95	0,07	0,32	0,59
Y25R	117	0,04	1,40	ND

EXEMPLO 2

Avaliação de atividade antimicrobiana

Uma faixa de polipeptídeos antimicrobianos, os quais são variantes de SEQ ID NO: 1 (Píectasina), foi testada com relação à atividade antimicrobiana através de expressão dos mesmos em S. cerevisiae e seleção do sobrenadante dos transformantes de levedo com relação à atividade antimicrobiana contra Staphylococcus carnosus ATCC5Í365.

Meios e soluções de crescimento foram preparados conforme descrito em Sambrook, Fritsch e Maniatis (1989), Molecular cloning, Cold Spring Harbour, Laboratory Press, Nova Iorque.

O Ensaio de Difusão Radial foi realizado conforme descrito em Methods in Molecular Biology, vol 78, Antibacterial peptide protocol, William M. Shafer, Human Press.

200-300 colônias de transformantes de levedo foram colocadas sobre lâminas redondas de 14 cm contendo 25 ml de meio de crescimento SC suplementado com galactose a 1,5%, glicose a 0,5% e agarose a 1,5%. As lâminas foram incubadas durante três horas em temperatura ambiente,

sobrepostas com 25 ml do mesmo meio de crescimento e deixadas crescer durante três dias a 30 graus Celsius.

Então, as lâminas foram sobrepostas com 25 ml de meio de crescimento LB contendo agarose a 1,5% e 10⁵ células da cepa indicadora Staphylococcus carnosus e incubadas a 30 graus Celsius durante a noite para permitir crescimento das células bacterianas. No dia seguinte, as lâminas foram coradas com MTT a 1,5 mM para facilitar visualização das zonas de clarificação.

Colônias de levedo que criaram zonas de clarificação foram transferidas para lâminas de microtitulação contendo 200 pL de meio de crescimento SC suplementado com glicose a 2% e ampicilina (100 mg/L). Tais lâminas, designadas lâminas mestre, foram incubadas durante 2 dias a 30 graus Celsius com agitação a 450 rpm para permitir crescimento de levedo.

pL de meio de crescimento de cada cavidade das lâminas mestre foram transferidos para novas lâminas de microtitulação contendo 200 pL de meio de crescimento SC com galactose a 1,5% e glicose a 0,5%. Essas lâminas foram denominadas lâminas filha e foram incubadas durante 3 dias a 30 graus Celsius sob agitação a 450 rpm para permitir crescimento de levedo e síntese de peptídeo.

Finalmente, um Ensaio de Difusão Radial (RDA) foi realizado seguindo o protocolo descrito em Methods in Molecular Biology para analisar e quantificar a atividade antimicrobiana dos sobrenadantes de levedo contra 5. carnosus.

Resumidamente, 30 mL de meio de sustentação mínimo contendo agarose a 1% e 5 x 10⁵ cfu/mL de S. carnosus foram entornados em uma lâmina Omnitray (Nunc, 242811). Uma lâmina Nunc TSP (#445497) foi inserida imediatamente sobre a lâmina para permitir uma formação padrão com 96 cavidades. Uma vez que o meio tinha solidificado, a lâmina TSP foi removida e 10 pL de amostras de sobrenadante de levedo foram aplicados

sobre os orifícios. As lâminas foram incubadas 3 horas a 37 graus Celsius e sobrepostas com 15 mL dc meio de crescimento de agar I.B. Finalmente, as lâminas foram incubadas durante a noite a 37 graus Celsius e coradas com MTT a 1,5 mM para visualizar as zonas de clariftcação.

Inspeção e medições das zonas de clarificação foram realizadas sobre as lâminas. Os clones de levedo correspondentes que resultaram em zonas de clarificaçâo de tamanho similar ou aumentado com relação aos clones que codificam plectasina do tipo selvagem foram retirados das lâminas mestre e transferidos para lâminas de agar contendo meio de crescimento SC com glicose a 2% e ampicilina (100 mg/L). Tais lâminas forarn incubadas durante mais 2 dias a 30 graus Celsius para permitir crescimento de levedo. Subseqüentemente, PCR de colônia foi realizada, seguido por análise de seqüência, para identificar alterações de aminoácido na seqüência da plectasina.

As mutações e atividades antimicrobianas correspondentes, com relação à atividade de plectasina, são mostradas na Tabela 2. Uma atividade de 2 corresponde à atividade de Plectasina. Uma atividade de 3 é melhor do que a Plectasina e 1 é pior do que a Plectasina.

Tabela 2. Dados de atividade antimicrobiana do ensaio de seleção de levedo

Seqüência	Mutação(ões)	SEQ ID NO:	Ativi- dade
GFGCNG?-Wr)Eí;-DMQCHNt}CfíSTftGY?:G5'íCAKGGr<CKCY	tipo selvagem	1	/
gfgcrg?wdel?dmíx:hnhc:<sixgykggycakgüfvckcy	NEtf	/	3 !
gfgçqgpwdeddmçchnhcksikgykggycakggfvckcy	N5Q	4	3
GFGCVGPKnEDDMCCHNHCKSTKGYKGGYCAKGGFVCKCY	K5V	5	3
SFGCGGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	K5G	6	3
GF GG S G?W DE DOMQC HN HCX S T KGYXGGY CAK GGFV CKÇ Y	N5S	7	3
gfgcagrwdeddhcchíjhcksikgykggycakggfvckcy	N5A	&	3
gfgckgkwdeddmqchnhcksixgyxggycakggfvckcy	P7K	9	3
GFGCKGRWDEDÜMQCíiNnCKSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	F7R	10	3
GFGCKGFRDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	MÊR	11	3
GFGCNGPWASDDMQC ÜNHCKSIKGYKGGY C AKGGFVCKC Y	D9A	12	3
gfgckgpwgedümcchuhcksikgykggycakggfvckcy	D9G	13	3
GFGÇKGPKXEDPWQCHHHÇXSTKGYXGGYCAKGGFVCKCY	D9K	14	3
GFGCKGPWLEDDMQCHKHCKSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	D9L	15	3
GFGCKGPWTEDDMQCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	D9T	16	3
GFGCNGPWYEDDMQCHNHCXSTKGYXGGYCAKGGFVCKCY	D9Y	17	3
GFGCKGFWFEDDMQCHNHCXSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	D9F	ia	3
GFGCKGPWHEDDMÇJC3NHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	D9H	19	3
GFGCNGPWMEDDMQCHNHCXSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	D9M	20	3
GFGCKGFWKEDDMQCHNHCKSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	D9N	21	3
GFGCKG?KPE DDMQC HNFICKS T KG Y7GGYC AKGGFVCKC Y	Π9Ρ	22	3
GFGCKGPWQEDDMQCHNHCXSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	D9Q	23	3
GFGCKG2WSED0MQCHNHÇXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	D9S	24	3
GFGCKGPWVEDDMQCiíNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	D9V	25	3
GFGCKGFWDÇDDMQCHNHCXSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	ElOG	26	3
GFGCNGPWDSDDMQCfWHCKSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	El OS	27	3
GFGCKGRWüEFDMQC-ÍÍJHCKSXKGYKGGYCAKGGFVCKCY	1?11F	28	3

GFGCKGPWDEGDMCCHNHCXSIXGYXGGYDAKGGFVCKCY	D] 1G	29	3
gfgckg?wdehdmcc.hnhcxsikgyxggycakggfvckcy	ιη i h	30	3
£FGOíG?WnFXDMGCHNílCXSTXGYXGGYCAKGGFVCKCY	Dl IX	31	3
GFGCKGFWDELDMOCHNHCXS1XGYXGGYCAKGGFVCKCY	Dl 1L	32
GFGCNG?WBE?DMQC3NHCXSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	BllP	33	3
GFGCNGPWBESnMQCHNHCXSTXGYXGGYCARGGFVCKCY	mis	34	3
gfgckgpkdetdmqchnhcxsixgyxggycakggfvckcy	DllT	35	3
GFGCKGPWDEVDMQGHNHCKSJXGYXGGYCAKGGFVCKCY	Dl IV	36	3
GFGCKGPWDEWDMQCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	DllW	37	3
GFGCKGPWDEIDMQCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFYCKCY	Eli?	38	3
GFGCNGFWDEMDMQCMNHCXSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	DllM	33	3
GFGCKGPWDENDMQCXNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	EllK	40	3
GFGCKGPWDFRDMQÇHNHCXSTXGYXGGYCAKGGFVCKCY	Dl IR	41	3
gfgckgfwdeydmcxhnhcksikgyxggycakggfvcrcy	DllY	42	3
GFGCNGPKDEDDRQCHNHCXSIKGYXGGYCAKGGFVCKÇY	Ml 3R	43	3
GFGCKGPWDEDDSQCHNHCXSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	Ml 35	44	3
GFGCKGPKDEDDVGCHNHCXSIXGYXGGYCAKGÊFVCKCY	M13V	45	3
GFGCKGPWDEDDMFCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	Q14F	46	3
GFGCKG FVÍDE DDMGCHN HCXSI KGYXGG Y CAKGG FVCKC Y	Q14G	47	3
GFGCNGPWDEDÜMHÇHNHÇXSIKGYRGGYCAKGGFVCKCY	Q14H	43	3
GFGCKGPWDEDDMSCHNHCXSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	Q14S	49	3
GFGCKGPWDEDDMYCMNHCXSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	Q14Y	50	3
GFGCKGPWBEDDMQCHHECXSTXGYXGGYCAKGGFVCKCY	H181,	51	3
GfOCKGRWDEDDMQCHNHCXSLKGYKGGYCAKGGFVCKCY	I22L	52	3
GFGCNGPWDEDÜHQCHNHCXSVXGYXGGYCAKGGFVCKCY	I22V	53	3
GFGCKGFHDEDDWQCfWHCXSIXHYXGGYCAKGGFVCKCY	G24H	54	3
GFGCKGPKDEDDMQCHNHCKSIXKYXGGYCAKGGFVCKCY	G24X	55	3
GFGCKGPWDEDDMQCaNHCKSTXNYXGGYCAKGGFVCKCY	G24K	56	3
GFGCNGPWDEDDMQCaNHCKSIKGYKGGFCAKGGFVCKCY	Y29F	57	3
GFGCNGPWDEDBMQCHNHCXSIXGYXGGRCAKGGFVCKCY	¥2 9R	58	3
GiOCNGPWDEDDHQCHNHCKSlKGYKGGWCAKGGFVCKCY	Y29W	59	3
GFGCNGPIfDEDOMCCHNHCXSIKGYXGGYCKKGGFVCKCY	A31K	60	3
GFGCNGPTOEDDMQCHNHCKSTKGYXGGYCNKGGFVCKCY	A31X	61	3
GFGCNGPWDEüDMQCHNHCXSIKGYXGGYCQKGGFVCKCY	A31Q	62	3

C-FGCKG?WDEDDMCCHNí)CKSI KG YXGGYCTKGG FVCKCY	1- A 3X7	6 3	3
GFGCKG?WBEÜDMÇ<HNH£X5.í.XGYXG£YC YKGGFVCKCY	A31Y	64	j
GFGCNGPWnEODMCCHNHCXST KG YXGGYCAKXGFVCKCY	G33K	65	3
GFGCN73FWDEDDMQCXNHCXS1XGYXGGYCAKQGFVCKCY	G33Q	66	3
GFGCKGRWDEDDMÇCHNHCX5IXGYXGGYCAKRGFVCKCY	G33R	67	3
GFGCKG?wnEDDMQC5tNííC?(ST?-íGYKGGYCAKGKPJCKCY	G34K	6?	3
GFGCKGFWDEDDMQCXNHCXSIXGYXGGYCAKGRFVCKCY	G34K	€5	3
GFGCKGFffDEDDMQCXNHCXSTXGYXGGYCAKGGKVCKCY	F35L	70	3
gfgckgfwdeddhqcxnhcxgxxgyxggycakggflckcy	V36L	i I	3
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYSGGYCAKGGFMCKCY	V36M	72	3
G FGCKG ?WD E DDMQCHNÍ1CXS1XG YXGG YC AKGG F7'CKCY	V36T	73	3
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCKSIXGYRGGYCAKGGFVCKÚY	K5K+X2ÊR	74	3
GFGCKGFWDEGDMQCXNHCX5IXGYXGGYCAKGGFVCKCY	K5K+D3XG	75	3
GFGCSGPWDEDDMRCHNHCXAIKGYKGGYCAKGGFVÇKÇY	N5SW14R4S2XA4 K2 3R	76	3
GFGCSGPWDEDDMRCaSHCXSIHGYXGGYCAKGGFVCKCY	K5S+Q14R+N17S+ K23R	77	3
GFGCfêG?RDEDD?QCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKC¥	W8R+M13R	78	3
GFGCKG?WGEDDlMRCHNHCXSIRGYKGGYCAKGGFVCKÇY	D9G+Q14R+-K23R	79	3
GFGCNGPWPGDDMPC3NHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	E10G+Q1IR	SO	3
GFGCNGPWDEGDMQCHNHCXSIXGYKGGYCARGGFVCKCY	DX1G+K32R	81	3
GFGCKGPWDEGBMQCHSHCXSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	D11G+K17S	82	3
GFGCKGPWDEGDMQCHNHCXSVKGYXGG YCAKGG FVCKCY	D11G+I22V	83	3
GFGCKGPWDENDMQÇ3NHCXSIXGYXGGYCAKGGFICKCY	D11K+V36I	84	3
GFGCKGPWDERDICJCHNHCXSIKGYXGGYCAKGG FVCKCY	M1R4M13I	85	3
GFGCKGPWDEDDMVCíttJHCKSlKGYRGGYCAKGGFVCKCY	Q14V+K26R	86	3
GFGCKGPWDEDDMRCHNHCKSIKGYRGGYCAKGGFVCRCY	Q14R+K26R1-K3SR	87	3
GLGCKGFtt&EDDMCCiíNHeXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	F2L	118	2
GWGCKGFKDEDDMQCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	F2K	119	2
GIGCKG?WDEDDMQCXNHCXSIKGYXGGYCAKGG FVCKC Y	F2I	120	2.
GFGCLGFWDEDDMQCHNHCXSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	N5E	121	2
gfgcmgrwderdmqçhnhçkstkgyxggycakggfvckcy	fJSM	122	2
GFGCKRRWDEDDMQCíÍNHCXSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	G6R	123	2
GFGCKAFKDEDDMQC3NHCXSIXGYXGGY CAKGGFVCKCY	GõA	124	2
GFGCKX?WDEDDMQCXNHCXSIKGYXGGY CAKGG FVCKCY	G6K	125	2

-,--------- GFGCNGAWDEDDMÇCHNíiCXSlKGYKGGYCAKGG FVCKCY	P7A	126	2
^ΚΟΓΝΟί^ΠΕΟΟΜφΟΉΝΗΟΧΕΙΚΟΥΚϋΰΥΟΑΚύΟΚνΟΚύΥ	P7L	127	2
GFGCKGVWDEDDMÇCHNHCKSTXGYXGGYCAKGGFVCKCY	P7V	178	2
G1’GCKG?WCEDD.,j!CC:-ÍNHCK5 I KGYKGGYCAKGGFVCKCY	! l'9C	lz9	ί 2
GFGCKGPWIEDDHÇJCHNHCKEIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	D9I	130	2
GFGCKGPWREDDMQCHNHCXSTKGYKGGYCAKGGFVCKCY	D9R	1 31	2
GFGCKGPWWEDDHQC3MHCKSIXGYKGGYC AKGG FVCKCY	D9K	132	2
GFGCKGPWDADDMQCHNHCKSTKGYKGGYCAKGGFVCKCY	El 0A	1 33
ΰΐΌΟΚβ?^ΟΕϋΟΜ^ΗΝ11ΟΧ5ΐ KG YXGGYCAK.GG FVCKCY	ElOL	134	2
GFGCKGPWDCDDMQC-ÍNHCK5IXGYKGGY C AKGG FVCKCY	E10C	135	2
GFGCKGPWDCDDHQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	E1OQ	136	2
GFGCKG PWDEADMÇJCHNHCXSIXGYXGGYCAKGG FVCKCY	D11A	137	2
GFGCKG?WDECDMQÇHNHÇKSTKGYKGGYCAKGGFVCKCY	D11C	138	2
GiOCKGPWDEDPMQCHNUCKSlKGYKGGYCAKGGfcVCKCY	D12P	139	2
GFGÇNGPSfDEDDAÇCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	Ml 3A	140	2
GFGCNGPWDEDDFQCHNHCKSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	M13F	141	2
GFGCKGPWDE DDGQCHNHCX5IKGYXGG YCAKGGFVCKCY	M13G	142	2
GFGCKGPWDEDDLCCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	M13L	143	2
GFGCKGPWDEDDTQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	M13T	144	2
GFGCNGPKDEDDYQCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	M13Y	145	2
GFGCNGPWDEDDMACHNHCXSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	Q14A	146	2
GFGCKGFWDEDDMCCHNHCKSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	C14C	147	2
C-FGCNGPWDEDDMICHNHCXSTXGYXGGYCAKGGFVCKCY	Q14I	148	2
GFGCKGPWDEDOHKCHNHCKSlKGYKGGYCAKGGi<VCKCY	Q14K	149	2
GFGCKGPKDEDDMMCHNHÇXSIXGYXGGYCAKGG FVCKCY	Q14M	150	2
GFGCKGPWDE DDMPCHK HCX5 TKGYKGG YC AKGG FVCKCY	Q14P	151	2
GFGCNGPWDEDDMTCHNHÇXSIXGYXGGYCAKGGFVCKCY	Ç14T	152	2
GFGCNGPWDEDDMVCHKHCKS TKGYKGGYCAKGG FVCKCY	Q14V	153	2
GiOCKGPWDEDDMWCíWHCKSlKGYKGGYCAKGGFVCKCY	C14W	154	2
GFGCKGFWDEDEJMQCHNACKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	H13A	155	2
GFGCKGPWDEDDMXHNFCKS1KGYKGGYCAKGG FVCKCY	U13F	156	2
c-fgckgfwdeddmqchnocksikgykggycakggfvckcy	H13Q	157	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNTÇXSTXGYXGGYCAKGGFVCKCY	H1 ST	158	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNVCKSiKGYKGGYCAKGGFVCKCY	H13V	159	2

GFGCNGPWDEDDMQCHNÍJCQSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	K20Q	16Ü	2
StOCKGPWDEmMCCHNHCKSMKGYSGGTCAKGGFVCKCY	122M	161	2
GFGCKGPWDFPDMQGHNHCXSTXGYXGGYCAKGGFVCKCY	12 27	1 62	2
GFGCKGYWDEDnMGCHNHCXSWKGYXGGYCAKGGFVGKCY	1Z2W	1 63
GFGCKG PKDEDDMQCHNHCXSIKAYXGGYCAKGGFVCKCY	G24A	164	2
GEGCKG?wnFDDHC<HNHCXSTX?YXGGYCAKGGFVCKCY	G24P	165
GFGCKGPWDE DDMQC HNHCXSIKFYXGG YCAKGGFVCKCY	G24F	166	o
GFGCNGPWDEDBMÇCHNHCKSTXTYXGGYCAKGGFVCKCY	G24T	167	?
GFGCKG?WÜELO4QCaNHCXSÍXCYXGG¥CAKGXSF7CKCY	G24Q	168	2
gfgckgpwdeddmçchnhcxeixryxggycakggfvckcy	G24R	169	O
GFGCKGFWDEDDMQCHNUCXSIXSYXGGYCAKGGFVCKCY	G24S	170	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCXSIXTYXGGYCAKGGFVCKCY	G24T	171	2
GFGCKGPKDEDDMQCHNHCXSTXYYXGGYCAKGGFVCKCY	G24Y	172	2
GíOCKÔFWDEüDMQCHNHCXSIXGHXGGYCAKGGFVCXCY	Y25H	173	2
Gr GGKGP η DE DDMQCHNÍIÇKST XGXXGGY C AKGGFVCKC Y	Y25K	174	2
GFGCKG9WDEDDHQCHNHCXSIKGLXGGYCAKGGFVCKCY	Y2.5L	175	2
GFGCKGFWDEDDMQCHNHCXSIXGMXGGYCAKGGFVCKCY	Y25M	176	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNHÇXSIXGNXGGYCAKGGFVCKCY	Y25H	177	2
gfgckgfwdeddmqchnhcxsixgoxggycakggfvckcy	Y25G	178	2
GFGCKGPKDEDDMQCHNHCXSIXGSXGGYCAKGGFVCKCY	Y25S	179	2
GFGCKGPWDEDDMQCHMHCXSIXGVXGGYCAKGGFVCKCY	Y25V	180	2
GFGCKGRÍDEDDMQCHNHCXSIKGYFGGYCAKGGFVCKCY	K26F	181	2
GFGCKG PWDEDDMQCHNFTCXSIKGYXGGYCAKGGFVCKCY	K26H	182	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCXSIKGYTGGYCAKGGFVCKCY	K26T	183	2
ÇFGCKGFWDEDDMQCHNHCXSIXGYXGGACAKGGFVCKCY	Y2 9A	184	2
GFGCNGPWDEDDMQCHNHCXSTKGYXGGHCAKGGFVCKCY	Y29H	185	2
GFGCKGPWDEDDMCC3NHCXSIKGYXGGLCAXGGFVCKCY	Y29L	186	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCXSTXGYXGGMCAKGG FVCXC Y	Y29M	1 87	2
GFGCKGPWDEDDMCKaNHCXSIKGYKGGSCAKGGFVCKCY	Y29S	168	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCXSIXGYXGGYCEKGGFVCKCY	A31E	189	2
GFGCKGPWDEDDMQCíttJHCXSiXGYXGGYCHKGGFVCKCY	A31H	190	2
GFGCKGDEDDMQCHNHCXSIXGYXGGYC1XGGFVCKCY	A31I	191	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCKSTXGYXGGYCRKGGFVCKCY	A31R	192	T*. z
GFGCKGPWDEDDHQCílNilCKSIKGYKGGYCSKGGFVCKCY	A31S	193	2

GFGCKGFWPEDDMQCHNHCKSIjíGYXGGYCVKGGFVCKCY	| A31V	134	z
gfgckgfkdeddmcchnhcksikgyxggycarggfvckcy	K32R	195	2
GFGCKG?Wr)EDDMQe?ÍNHCX5TXGYXGGYCATGGFVCKCY	K32T	i 96	z.
GFGCKGFWDEDDHQCHNaCXSlXGYXGGYCAKEGFVCKCY	G5JE	197	2
GFGCKG?KDEDDMQÇHNHCKSIKGYKGGYCAKKGFVCKCY	G33N	198	2
gfgckgpwdkddmqchnhcxstfgyxggycaksgfvckcy	G33S	1 99	2
GFGCNGPWDEDDMQÇHNHCXSIKGYXGGYCAKTGFVCKCY	G33T	200
gfgcngfhpkddmqchnhckstkgykggycakghfvckcy	G34H	201	2
GEGCKG?WDEijDMGCHNHCKSlXGYX.GGYCAKGWFVCKCY	G34W	202	-Ί é
GFGCKGFKDEDDMQCRNHCXSTXGYKGGYCAKGGAVCK.CY	F35A	203	Z
GFGCKG ?WDE DDMQCHNHCKS1XG YKGG YCAKGGlj VCKC Ϊ	F35H	204	2
GFGCKGFWDEDDMQÇHNHCKSIKGYXGGYCAKGGIVCKCY	F35l	205	2
GFGCKGPKOEDDMQÇHNHCXSIKGYKGCYCAKGGMVCKÇY	F35M	206	2
GFGCKGPWDEDDMCKHNHCKSIKGYKGGYCAKGGVVCKCY	P35V	207	2
GFGCNGPWBEDDMQÇHNHÇXSIKGYXGGYCAKGGWVCKCY	F35W	208	2
GFGCNGPWDEDDMQCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFICKCY	V36I	209	2
GEGCNGPWDEDDMQCHNHCXSIKGYXGGYCAKGGFKCKCY	V36K	210	2
GFGCKG?WDEDDMQÇHNHÇKSIKGYXGGYCAKGGFQCKCY	V36Q	211	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYXGGYCAKGCFRCKCY	V36R	212	2
GFGCKGPWDEDDMQÇHNHCKSIKGYKGGYCAKGG FVCHCY	K3SH	213	2
GFGCKGFWDEDDMQCHNHCXSIXGYXGGYCAKGGFVCNCY	K3SK	214	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCRCY	K38E	215	2
GFGCKGPWDEDDMQCHNRCXSIXGYRGGYCAKGGFVCKCT	Y4QT	216	2
GFGCKG?WLEDDMQÇHNHCXSIKG YKGG YCAKGGPVCKCY	D9L+X26N	217	2
GFGCKGPKDELDIQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	D11L+M13I	218	2
GFGÇKGPWDEDDRQCHNHCXSTKGYXGGFCAKGGFVCKCY	M13RIY29F	239	2
GFGCKGPWDEDDMRC3KHCKSIHGYRGGYCAKGGFVCKCY	Ç14R+K23R+K26R	220	2
GFGCKGPWDEDDMRCHNHCRSTXGYXGGYCAKGGFVCKCY	Q14R+K20R	271	2
GFGCNGPWDEDDMSCHNHCXS1KGYKGGYCAKGGFVCRCY	C14S+K36R	222	2
gfgcngpkdeddmqçhshcksirgykggycakggfvckcy	ÍJ17S+K2 3R	223	2
GFGCKGRWDEDÜMQCHNHCKSIKGYXGGFCARGGFVCKCY	Y23F4K32R	224	2
GEGCKGPWDEDDMQÇHNHCKSIKGYKGG YCARGK PVCKCY	S32R+G34K	225	2

EXEMPLO 3

Identificação de peptídeos antimicrobianos com atividade antimicrobiana aperfeiçoada

Uma faixa polipeptídeos antimicrobianos, os quais são variantes de SEQ ID NO: 1, foi testada no ensaio TAPS. TAPS pode ser usado para identificar genes novos ou aperfeiçoados que codificam peptídeos

que podem matar ou inibir o crescimento de células alvo (veja pedido PCT WO 2004/033715). O ensaio TAPS, um acrônimo para Sistema de Peptídeo de Trans Atuação, é baseado em ter um hospedeiro sensível que produz um polipeptídeo, seguido por seleção com relação à sua atividade em trans contra uma cepa indicadora. A vantagem desse sistema está baseada no fato de que o peptídeo antimicrobiano é expresso na bactéria Gram-negativa E. coli e sua atividade antimicrobiana pode ser monitorada sobre diferentes micróbios, incluindo Gram-negativos, positivos ou fungos. Adicionalmente, o TAPS oferece a possibilidade de produzir AMPs corretamente duplicados contendo ligações de dissulfeto nas células hospedeiras, desse modo, retendo suas atividades antimicrobianas.

A abordagem TAPS requer primeiro que expressão do peptídeo esteja sob o controle de um promotor induzível com regulação rigorosa, por que as células hospedeiras são sensíveis ao peptídeo quando de produção do mesmo. Segundo, o peptídeo produzido tem de ser liberado dos meios de modo que ele possa interagir com o organismo alvo.

A seleção pelo TAPS pode ser realizada em meios sólidos ou líquidos. Sobre meios sólidos, uma biblioteca de plasmídeo é inicialmente introduzida em células hospedeiras de E. coli. É importante que os transformantes sejam cultivados sobre a superfície de um filtro de acetato de celulose colocado sobre meio de crescimento LB sem indutor (arabinose) para evitar expressão do peptídeo antimicrobiano e, conseqüentemente, inibição de crescimento. Na próxima etapa, o filtro contendo as colônias é transferido para meio de crescimento LB contendo indutor (arabinose a 0,1%) para permitir síntese de peptídeo. Subseqüentemente, a cepa alvo, por exemplo, 5. carnosus, é sobreposta sobre a lâmina e deixada crescer durante 12-16 horas a 37 graus Celsius. Finalmente, inspeção visual das células hospedeiras capazes de redução da proliferação das células alvo é realizada e a seqüência de nucleotídeo que codifica o peptídeo antimicrobiano é recuperada das células

hospedeiras. Análise de seqüência de DNA das variantes é obtida para elucidar a natureza do peptídeo.

Conforme mencionado acima, a seleção pelo TAPS pode scr realizada usando meio líquido. Esse procedimento requer o uso de robótica para analisar um grande número de clones. Nesse sistema, as células hospedeiras de £. coli são transformadas com a biblioteca de plasmídeo e colocadas sobre meio LB + glicose a 0,2% + ampicilina (200 mg/L). Colônias independentes são, então, inoculadas em lâminas com 96 ou 384 cavidades contendo 200 pL de meio TB + ampicilina (200 mg/L) e cultivadas durante a noite a 37 graus Celsius. Essas culturas são, então, reproduzidas roboticamente e crescidas até a fase exponencial até que indutor (arabinose a 0,1%) seja adicionado para disparar a síntese de peptídeo. A próxima etapa consiste em hidrolise das células, de modo que o peptídeo seja liberado nos meios através de hidrolise com ácido quente. Esse tratamento consiste de adição de tampão de Fosfato de sódio a 1 M, pH de 2,3, para obter um pH final de aproximadamente 2,3 e incubação das culturas durante a noite a 80 graus Celsius. No dia seguinte, uma alíquota de 25 μΐ das culturas hidrolisadas é usada para realizar um teste de atividade contra os organismos alvo desejados. O teste de atividade realizado era um Ensaio de Difusão

Radial (RDA), onde uma alíquota das culturas hidrolisadas foi adicionada aos meios de agarose inoculados com a cepa alvo, S. carnosus. RDAs obtidos das lâminas de seleção contendo zonas de clarificação correspondendo a clones exibindo atividade antimicrobiana foram facilmente identificados. Medições do diâmetro das zonas de clarificação foram realizadas para quantificar a potência da atividade antimicrobiana dos peptídeos.

A atividade antimicrobiana (contra Staphylococcus carnosus) das variantes de plectasina testadas, a qual foi medida usando o ensaio TAPS, é mostrada na tabela 3. A atividade antimicrobiana corresponde ao tamanho da zona de clarificação e foi classificada como 4 > 3 > 2 > 1; enquanto que 4

é melhor do que 1 e atividade do tipo selvagem corresponde a 1.

Tabela 3. Dados de atividade antimicrobiana do ensaio TAPS.

Sequence	I Mutaüon{s)	SEQ ID NO:	Actívity
	centro3		0
GFGCNGFWOLLOHQCHNUCKSIXGYXGGYCAKGGE-VCXCY	wildtype	1	1
GFGCKGPWDEDDMQCHKHCXSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	N5K	89	2
gfgcygphdfddmqçhnhcxstxgykggycakggfvckcy	N5Y		2
GFGCNG?WDFDDXCCHNRCKSIXGYKGGYCAXGGFYrCKCY	M13K	90	2
GFGCNG?WDFY;DMLCHKHCKSIXGYXG£YCAKGGFVCKCY	Q14i.	91	3
GFGCNGPWDEDDMRCíINHCXSIXGYKGGYCAXGGFVCKCY	Q14R	92	4
gfgcngpwdeddmqchhhcxsixgykggycakggfvckcy	N17R	93	4
GFGCNGPWDEDDMQCHIHCXSIXGYKGGYCAKGGFVCXCY	N17I	94	2
GFGCNGFWDEDDMQCHRHCKSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	N17R	95	2
GFGCNGPWDEDQMQÇHYHCXSIXGYKGGYCAKGGFVCXCY	N1?Y	96	3
GFGCKGPWDEDDHQCRNHCRSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY	K2QR	97	2
GFGCNGPWDEDDMQCHHaCXSIXGYRGGYCAKGGFVCKCY	K26R	99	3
GFGCNGRWDEDDMQCHNHCXSIXGYKGGYCAKGGFVCKCYR	Y4 0YR	99	2
GFGCYG?WOEDCMLCa«aCXSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	N5Y+Q14L	100	2
GFGCNGPKDEGDHQCHNHCKSIXGYRGGYCAKGGFVCKCY	D11G+K26R	101	2
GFGCNGPttOEGDXQCyNHCKSIXGYRGGYCÀKGGFVCKCY	D11G+-M13K+K26R	102	3
GFGCNGPWDEDDSCQCHRHCKSIXGYKGGYCAKGGFVCKCYR	M13X+N17R+Y40YR	103	3
GFGCNGPWnEDDMQCHRHCXSTXGYKGGYCAKGGFVCKCYR	N17P+Y40YR	104	3
GFGCNGFtiÜENDMGCHNttCXFIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	D11N+S21F	105	4
GFGCNGPKDEDDKQCHRHCXSIXGYKGGYCAKGGFVCKCY	H13K+N17R	106	3
GFGCNGPWDEDDKQCHNHCKSXXGYKGGYCAKGGFVCKCYR	Ml3K»Y4QYR	107	4
GFGCNGPIfDEDDXQCHNHCKSIXGYRGGYCAKGGFVCKCY	M13X+K26R	108	4
GFGCNGPWDEDDKQCHNHCXSIXGYKGGYCAKGGFVCRCY	M13K+K38R	109	4
GFGCNG PWDEG DMGCRN HCKSIXGYRGGYCAKGGFVCKCYR	D11G+K26R4-Y40YR	110	4
GFGCNGFWDEGDKGCHNHCKSíKGYRGGYCAXGGFVCKCYR	Dl IGiMl3K*K2$R« Y40YR	111	4
GFGCNGFWDEDDMRCHNHCKSIXGYKGGYCAKGGFVCKCYR	C14R+Y40YR	112	3
GFGCNGPWDEDDMRCHNHCKSIXGYKGGYCAKGGFTCKCY	Q14R+Y36T	133	4
GFGCNGPWDEDDMFCHNHCKSIXGYRGGYCAKGGFVCKCY	Q14R*K26R	114	4
GFGCNGFWDEDDMGCHNHC.XF1XGYKGGYCTKGGFVCKCY	S21F+A31T	115	2

EXEMPLO 4

Avaliação de atividade antimicrobiana

Plectasina do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e cinco variantes de Plectasina, as quais mostravam atividade aperfeiçoada no método TAPS e/ou no sistema de levedo, foram expressas e purificadas. A Concentração Inibitória Mínima (MIC, iig/mL) foi determinada para testar sua atividade antimicrobiana seguindo as diretrizes do NCCLS (Clinical and Laboratory

Standards Institute; formalmente conhecido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards).

Os resultados mostraram que todas as variantes de plectasina tinha atividade aperfeiçoada, comparado com a plectasina do tipo selvagem, contra Stapylococcus aureus, Micrococcus luteus e Bacillus subtilis.

Tabela 4. Valores de MEC; todos os valores estão em gg/mL.

Mutação	SEQ ID NO:	MEC contra S.aureus	MEC contra M. luteus	MEC contra B. subtilis
tipo selvagem	1	8	32	1
M13K+Y40YR	107	2	2	0,25
D11G+K26R	101	2	8	0,50
Q14K+K26R	116	2	1	0,13
D11G+K26R+Y40YR	110	0,50	0,25	0,06
D11G+M13K+K26R+Y40YR	111	0,50	0,05	<0,03

EXEMPLO 5

Avaliação de atividade antimicrobiana

Plectasina do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e cinco variantes de Plectasina foram expressas e purificadas. A Concentração Inibitória

Mínima (MIC) foi determinada para testar sua atividade antimicrobiana seguindo as diretrizes do NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute; formalmente conhecido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards).

Os peptídeos foram testados contra as seguintes cepas:

A: Staphylococcus aureus, ATCC 29213;

B: Staphylococcus aureus, ATCC 25923;

C: Staphylococcus aureus, ATCC 29737;

D: Staphylococcus aureus, MRSA ST5 (2001), isolado humano clínico multi-resistente do Statens Serum Institut, Dinamarca;

E: Staphylococcus aureus, MRSA ST80 (2003), isolado

Petição 870170064377, de 31/08/2017, pág. 15/108

humano clínico multi-resistente do Statens Serum Instituí, Dinamarca.

Todos os valores de MIC representam uma média de dois experimentos independentes; e todos os resultados na Tabela 5 sào expressos com relação à Plectasina do tipo selvagem:

0: > 100% da MIC de Plectasina do tipo selvagem;

1: 80-100% da MIC de Plectasina do tipo selvagem;

2: 50-80% da MIC de Plectasina do tipo selvagem;

3: < 50% da MIC de Plectasina do tipo selvagem.

Tabela 5. Valores relativos de MIC; nd = não determinado.

Mutação (ôes)	SEQ ID NO:	A	B	C	D	E
Tipo selvagem	1	1 (8 pg/mL)	1 <22 pg/mi>	1 (4 pg/mL)	1 (15 pg/mL)	Ί (22 pg/mL)
N5R+M13Y+K17R	226	3	3	3	3	3
D9S+Q14K+V36L	227	3	3	3	3	3
N5S4M13W4K17R	228	3	nd	3	3	3
Q14R+K26R+K38R	87	3	3	3	3	3
D9G+Q14R+K23R	79	3	3	3	3	3
M13G+N17R+G33A	229	3	3	3	3	3
N55+D9S+M1.3L+Q14R+ N17V+A31S	230	3	3	3	3	3
Ü9S+Q14L+K26R	231	3	3	3	3	3
N5S1D9A+K26R	232	3	3	3	3	3
Q14R+K20R	221	3	3	3	3	3

1 Ν5Γ-+Μ13Ί, 1 '	233	2	3	j 3	3	J
! D9A<K36R	234	3	3	í 3 1	3	3 i 1
: DllC-i Κ3?Ρ I	81	1	3	ί 3	2	1 3 i
Q1 4F	46	1	nd	i 3	2	í 3
N5R4M13V	235	3	nd	1 3	2
N5G+M13Y+N17K	236	3	3	1 3	3	! 2
Q14K+K26R	116	3	2	3	3	3
K13FtQl4K*K?^F	237	3	nd	3	3	! 3
' M13K+K38F	109	1	3		2	í ó 1
N5A+D9S+M13L+N17T	238	0	3	3	2	3
N17Y	96	1	3	3	2	2
M13T+Q14K+K26R	239	1	3	3	2	0
D9S	24	2	3	3	2	nd
M17R	95	nd	3	3	3	2
Q14R	92	2	3	3	3	0
N5S+Q14R+N17S+K23R	77	1	3	3	3	nd
N5R	3	1	2	2	2	2
Dl 3C-+K26R+Y40YR	110	3	3	3	3	nd
NT5S+Q14R+S21A+K2 3R	76	1	3	2	2	0
Ml3LiQl4KíK26R	240	3	nd	3	3	nd
D9N+M13L+Q14R	241	3	3	3	3	3
D9A+Q14H+K26R+V36L	242	3	3	3	3	3
Q14RIK23R+K26R	220	3	3	3	3	3
N5S+D9S+M13V+N1 7R	243	3	3	3	3	3
N5G+D9S+M13L+ M7Q+A31T	244	3	3	3	3	3
M13V4R17T	245	nd	3	3	3	3
D9S+M13L+Q14H	246	3	3	3	3	3
D9S+Q14L	247	3	nd	3	3	3
D9N+Q14H+K38R	248	3	3	3	3	2
Ml3Y+Q14K+K26R	249	2	3	3	3	3
D11K	40	2	3	2	2	3

	K5S + rj9S	í 250	0	3	3	2	3
	G24R	. _ __ j 169	1	2 I	! nd ! .	2	2
	XSG-SQI 4K	! 251	2	2	i	3	0	2
	N5K+K2ÇR	j 74	1	......2 —..L.	3	2	I 2	i J

EXEMPLO 6

Avaliação de atividade antimicrobiana

Tm grande número de peptídeos antimicrobianos da invenção foi testado contra um quadro de 6 diferentes cepas de Staphylococcus aureus listadas abaixo:

Staphylococcus	AICC25923,	MSSA;	cepa de referência no NCCLS;
aureus, Staphylococcus	ATCC29737,	MSSA;	cepa de referência no NCCLS;
aureus, Staphylococcus	E33235,	MSSA;
aureus, Staphylococcus	698-01,	MRSA ST5,	Str, Kan, Oxa;
aureus, Staphylococcus	566-03,	MRSA	Oxa, Tet, Fus, Kan.
aureus,		ST80,

S. aureus E33235, S. aureus 698-01 e N. aureus 566-03 estão disponíveis do Statens Serum Institut, Dinamarca.

Os estafilococos foram expostos às seguintes concentrações de peptídeo: 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,13; 0,6; e 0,03 pg/mL. Todos os peptídeos foram purificados, quantificados por HPLC e os peptídeos concentrados (>160 pg/mL) foram diluídos para 160 pg/mL em tampão de diluição de peptídeo (BSA a 0,1%, ácido acético a 0,01%).

A determinação de MIC foi feita essencialmente conforme descrito pelas diretrizes do NCCLS / CLSI usando caMHB. As MICs foram lidas apos 18-24 horas de incubações a 37 °C e registradas junto com a CFL^T na tabela abaixo.

Um número total de 95 peptídeos antimicrobianos da invenção foi avaliado em duplicata contra as 6 cepas bacterianas descritas acima.

Na maioria das determinações duplas (93%), a MIC variava <

2 vezes. Uma MIC média é mostrada na Tabela abaixo. Se a MIC estava

acima de 32 pg/mL, um valor de 64 foi usado para calcular a média. Tabela 6. Valores de MIC média.

Mutação(oes)	SEQ 10 NO:	MIC medio ' (pg/mL) |
N5R1M13YIK17R	226	1 I
D9hUMl3LtQl4R	241	1 ! I
D9S+-Q1 4K+V361.	227	í 1 j
D9AíQlWK26RfV3€L	242	1 S
D9C-+Q14P+K2 3R	79	2 l
014R+K23R-FK26R	220	2
M13G+K17R+G33A	229	2
N5S+D9S+M13V+K17R	243	2
N5S+M13W+K17R	228	2
Q14R1K26R4K3SR	87	2
N5S+D95+M13L+Q14R+N17V+-A31S	230	2
s D9S+Q14L+K26R	231	3
N5S+D9A4K26R	232	3
N5G+D9S+M13L+N17Q+A31T	244	3
M13V+K17T	245	3
D9S+M13UQ14H	246	3
D9S+Q14L	247	3
Q14R+K2ÜR	221	3
K5G+M13L	233	4
D9A+K38R	234	4
D9N+Q14H+K38R	248	4
N17R	95	4
M13R+Q14K-f-K26P	252	5
M13Y+Q14K+K26R	249	5
D11G+K32R	81	5
Q14F	46	5
K5R+M13V	235	5
Q14R	92	5
N5G+M13Y+N17K	236	5
Q14R+K26R	114	5
M13PÍQ14K1K26R	237	6

M13KfK3âR	109	6 l
D11N	40	6 i
K5S»D9S	250	- 6 s
Q14K1K26R	116	6
N5AU5951-M13LHÍ17T	238	6
N17Y	96	6
N17IOK32R	253	7
Ml3T + Q14KFKP6R	239	7
D9K	14	7
D9S	24	7
M13K1N17RIY4QYR	103	8
N5S+Q14R+N17S+K23R	77	8
K5R	3	8
G24R	169	8
Dl 1G+K26R+Y40YR	110	9
N5S1Q14R1521AIK23R	76	9
K5G+M13W	254	9
K5G+Q14K	251	9
M13A4-Q14K+-K26R	255	9
M13L+Q14K+K26R	240	9
K5K+K26R	74	9
A31N	61	9
Ml 3R	43	9
K5K+M13L	256	9
M13K4K2ÓR	108	10
N5G+M13W+N17S	257	10
K17K	258	11
521N	259	11
Dl1G+K26R	101	11
K26C+Y4DYRCG	260	11
Q14VtK26R	86	12

rfCO

Ml Y40YR	107	12
M13K	90	12
N5níM13E + T,'l 7F.	261	12
K5K	86	12
K17F	262	12
Dl1G+M13K+K26R+Υ4ΠYR	111	12
Q14L	91	13
Tipo selvagem	1	14
Kl 7T	94	14
Kl 7 3	263	14
N17S+K23R	223	14
N5G+D9A+Q14S+K23T+A31T	264	14
K17A	26S	15
K26R	98	15
Ml3S+Q14K+K26R	266	15
D11G1K17I	267	16
N5S+M13V+N17T	268	16
N5D+D9S+Q14R	269	16
D11GM22V	63	17
S2 IA	270	17
K17R+Y25R	271	18
N5S+M13V1K17A	272	18
Q1 4G	47	18
D9G	13	21
K17T	273	21
Q14S	49	21
K5G	6	24
K5S	7	24
M13S	44	24
S21V	274	26
M13T	144	26

	71	26	! i
K5A	8	29
D9V	25	30

EXEMPLO 7

Usando os arquivos HMM do banco de dados PFAM para identificar uma defensina

Análise de seqüência usando perfis do modelo de Markov 5 oculto (perfis HMM) pode ser realizada online na Internet ou localmente em um computador usando o pacote de software gratuitamente disponível HMMER bem conhecido. A versão atual é HMMER 2.3.2 de Outubro de

2003.

Os perfis HMM podem ser obtidos do banco de dados PFAM 10 bem conhecido. A versão atual é PFAM 16.0 de Novembro de 2004. HMMER e PFAM estão disponíveis para todas as plataformas de computador, por exemplo, da Washington University in St. Louis (EUS),

School of Medicine (http://pfam.wustl.edu e http://hmmer.wustl.edu).

Se uma seqüência de aminoácido de busca ou um fragmento 15 da mesma pertence a uma das cinco famílias PFAM a seguir, a seqüência de aminoácido é uma defensina de acordo com a presente invenção:

• Defensina_beta ou Beta Defensina, número de acesso:

PF00711;

• Defensina_propep ou Pró-peptídeo de defensina, número 20 de acesso: PF00879;

• Defensina_l	ou	Defensina	de mamífero, número	de
acesso: PF00323;
• Defensina2	ou	Defensina	de artrópode, número	de
acesso: PF01097;
25 · Gama-tionina	ou	Família de	gama-tioninas, número	de

acesso: PF00304.

Uma seqüência de aminoácido pertence a uma família PFAM,

de acordo com a presente invenção, se ela gera um E-valor o qual é maior do que 0,1 e um escore o qual é maior do que ou igual a zero, quando o banco de dados PFAM é usado online ou quando o programa hmmpfam (do pacote de software HMMER) é usado localmente.

Quando a análise de seqüência é realizada localmente usando o programa hmmpfam, é necessário obter (download) os perfis HMM do banco de dados PFAM. Dois perfis existem para cada família; xxxls.hmm para buscas globais e xxxfs.hmm para buscas locais (xxx é o nome da família). Isso faz um total de dez perfis para as cinco famílias mencionadas acima.

Esses dez perfis podem ser usados individualmente ou unidos (anexos) em um único perfil (usando um editor de texto - os perfis são arquivos ASCII) que poderia ser denominado, por exemplo, defensina.hmm. Uma seqüência de aminoácido de busca pode, então, ser avaliada através de uso da seguinte linha de comando:

hmmpfam -E 0.1 defensin. hmm sequencefile

- em que sequence file é um arquivo com a seqüência de aminoácido de busca em qualquer um dos formatos reconhecidos pelo pacote de software HMMER.

Se o escore é maior do que ou igual a zero (0,0) e o E-valor é maior do que 0,1, a seqüência de aminoácido de busca é uma defensina de acordo com a presente invenção.

O banco de dados PFAM é ainda descrito em Bateman e colaboradores (2004) The Pfam Protein Families Database, Nucleic Acids Research, Vol. 32 (Edição de Banco de Dados) páginas D138-D141.

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polipeptídeo tendo atividade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 3-274:
2. 2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:117 ou qualquer uma de SEQ ID NO:226 a SEQ ID NO:251 ou qualquer uma de SEQ ID NO:252 a SEQ ID NO:262.
3. 3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de consistir da sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:117 ou qualquer uma de SEQ ID NO:226 a SEQ ID NO:251 ou qualquer uma de SEQ ID NO:252 a SEQ ID NO:262.
4. 4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de consistir da sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:117 ou qualquer uma de SEQ ID NO:226 a SEQ ID NO:251.
5. 5. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos a qual codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. 6. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 5 operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão, em que a sequência de controle é exógena ao polinucleotídeo.
7. 7. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 6.
8. 8. Microrganismo recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 6.
9. 9. Método para produção do polipeptídeo como definido em

   Petição 870180016746, de 01/03/2018, pág. 9/10 qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultura do microrganismo recombinante como definido na reivindicação 8 sob condições condutivas à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.
10. 10. Composição antimicrobiana, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Método in vitro para matar ou inibir o crescimento de células microbianas, caracterizado pelo fato de compreender contato das células microbianas com um polipeptídeo antimicrobiano como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
12. 12. Polipeptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento ou um agente terapêutico ou profilático antimicrobiano veterinário ou humano.
13. 13. Uso de um polipeptídeo antimicrobiano como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para o preparo de um agente terapêutico veterinário ou humano para o tratamento de uma infecção microbiana ou para uso profilático.

    Petição 870180016746, de 01/03/2018, pág. 10/10