ES2621568T3

ES2621568T3 - Polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana y polinucleótidos que codifican los mismos

Info

Publication number: ES2621568T3
Application number: ES06763497.2T
Authority: ES
Inventors: Jesper Vind; Dorotea Raventos Segura; Hans-Henrik Kristensen Hoegenhaug; Per Holse Mygind; Olivier Taboureau
Original assignee: Adenium Biotech ApS
Current assignee: Adenium Biotech ApS
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2026-06-02
Also published as: RU2415150C2; CN101189256A; EP1891097A1; MX2007015036A; EP1891097B1; JP2008545425A; AU2006256791A1; CA2607841C; NZ562801A; JP5118023B2; WO2006131504A1; KR20080023218A; IL186857A0; US20100120690A1; TW200740841A; AR053402A1; AP2007004213A0; AU2006256791B2; NO20080067L; BRPI0609801B1

Abstract

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: G-F-G-C-X5-G-X7-X8-X9-X10-X11-D-X13-X14-C-H-X17-X18-C-X20-S-X22-X23-X24-5 X25-X26-G-G-X29-C-X31- K-X33-X34-X35-X36-C-K-C-X40; en la que X5 >= N, R, Q, V, G, S, A, K o Y; X7 >= P, K o R; X8 >= W o R; X9 >= D, A, G, K, L, T, N, F, H, M, P, Q, S, V o Y; X10 >= E, G o S; X11 >= D, F, G, N, V, Y, H, K, L, P, S, T, W, I, M o R; X13 >= M, R, S, V, G, Y, L, F, T, W o K; X14 >= Q, R, L, F, G, H, S, K o Y; X17 >= N, R, I, Y, V, K, T, S, Q o H; X18 >= H o L; X20 >= K o R; X22 >= I, L o V; X23 >= K o R; X24 >= G, H, R, K o N; X25 >= Y o R; X26 >= K o R; X29 >= Y, F, R o W; X31 >= A, K, N, Q, T, S o Y; X33 >= G, K, Q, A o R; X34 >= G, K o R; X35 >= F o L; X36 >= V, L, M o T; X40 >= Y o YR; en la que el polipéptido tiene 1, 2, 3 o 4 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y tiene una actividad antimicrobiana más alta en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO:1.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente 5 unida en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped de elección puede usarse en la presente invención.

Terminadores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfaglucosidasa de Aspergillus niger y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Terminadores preferidos para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura se

15 describen por Romanos et al., 1992, arriba.

La secuencia de control también puede ser una secuencia conductora adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia conductora está operativamente unida al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia conductora que sea funcional en la célula huésped de elección puede usarse en la presente invención.

Conductores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

25 Conductores adecuados para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir restos de poliadenosina a ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped de elección puede usarse en la presente invención.

35 Secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

Secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura se describen por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido señal que codifica una secuencia de aminoácidos unida al extremo amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede contener inherentemente una

45 región codificante de péptido señal naturalmente unida en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de péptido señal que es externa a la secuencia codificante. La región codificante de péptido señal externa puede ser requerida donde la secuencia codificante no contenga naturalmente una región codificante de péptido señal. Alternativamente, la región codificante de péptido señal externa puede simplemente sustituir la región codificante de péptido señal natural con el fin de potenciar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier región codificante de péptido señal que dirija el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección puede usarse en la presente invención.

Regiones codificantes de péptido señal eficaces para células huésped bacterianas son las regiones codificantes de

55 péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis. Péptidos señal adicionales se describen por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Regiones codificantes de péptido señal eficaces para células huésped fúngicas filamentosas son las regiones codificantes de péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa.

65 Péptidos señal útiles para células huésped de levadura se obtienen de los genes para el factor alfa de

Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes de péptido señal útiles se describen por Romanos et al., 1992, arriba.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de propéptido que codifica una secuencia de

5 aminoácidos dispuesta en el extremo amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo maduro por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificante de propéptido puede obtenerse de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (documento WO 95/33836).

Donde estén presentes tanto las regiones de péptido señal como de propéptido en el extremo amino de un polipéptido, la región de propéptido está dispuesta a continuación del extremo amino de un polipéptido y la región de péptido señal está dispuesta a continuación del extremo amino de la región de propéptido.

15 También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido con respecto al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que se encienda o apague la expresión del gen en respuesta a un estímulo químico o físico, que incluye la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas del operador lac, tac y trp. En levadura, puede usarse el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de TAKA alfa-amilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucariotas, éstos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con

25 metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido estaría operativamente unida con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de terminación transcripcional y traduccional. Los diversos ácidos nucleicos y secuencias de control descritos anteriormente pueden unirse juntos para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, puede expresarse una

35 secuencia de nucleótidos de la presente invención insertando la secuencia de nucleótidos o una construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de manera que la secuencia codificante se una operativamente a las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector va a introducirse. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados.

45 El vector puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el (los) cromosoma(s) en el (los) que se ha integrado. Además, puede usarse un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que va a introducirse en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Los vectores de la presente invención contienen preferentemente uno o más marcadores de selección que permiten la fácil selección de células transformadas. Un marcador de selección es un gen cuyo producto proporciona

55 resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares.

Ejemplos de marcadores de selección bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos tales como resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Marcadores adecuados para células huésped de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores de selección para su uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), además de equivalentes de los mismos. Preferidos para su uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces

65 hygroscopicus.

Los vectores de la presente invención contienen preferentemente un elemento(s) que permite la integración del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede basarse en la secuencia de polinucleótidos

5 que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una localización(s) precisa(s) en el (los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una localización precisa, los elementos de integración deben contener preferentemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 10.000 pares de bases, preferentemente 400 a 10.000 pares de bases, y lo más preferentemente 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia diana correspondiente para potenciar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga con la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector puede integrarse en el genoma

15 de la célula huésped por recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique autónomamente en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie en la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se define en el presente documento como una secuencia de nucleótidos que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Ejemplos de orígenes de replicación bacteriano son los orígenes de replicación de plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMβ1 que permiten

25 la replicación en Bacillus.

Ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; documento WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen puede llevarse a cabo según los métodos desvelados en el documento WO 00/24883.

35 Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención puede insertarse en la célula huésped para aumentar la producción del producto génico. Puede obtenerse un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador de selección amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador de selección, y así pueden seleccionarse copias adicionales del polinucleótido para cultivar las células en presencia del agente de selección apropiado.

Los procedimientos usados para unir los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son muy conocidos para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, arriba).

45

Células huésped

La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que se usa ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de manera que el vector se mantenga como integrante cromosómico o como vector extracromosómico auto-replicante como se describe anteriormente. El término "célula huésped" engloba cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

55 La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.

Microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias Gram-positivas que incluyen, pero no se limitan a, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o bacterias Gram-negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus 65 licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis. En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un

imagen12

imagen13

planta, sea cual sea el origen del tejido, se considera que es una parte de planta. Asimismo, partes de planta tales como tejidos y células específicos aislados para facilitar la utilización de la invención también se consideran partes de planta, por ejemplo, embriones, endospermos, aleurona y envueltas de semillas.

5 También están incluidos dentro del alcance de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de planta y células vegetales.

La planta transgénica o célula de planta que expresa un polipéptido de la presente invención puede construirse según métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula de planta se construye incorporando una o más construcciones de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta y propagando la planta modificada resultante o célula de planta en una planta transgénica o célula de planta.

La construcción de expresión es convenientemente una construcción de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente unido con secuencias

15 reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de nucleótidos en la planta o parte de planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador de selección útil para identificar células huésped en las que la construcción de expresión se ha integrado y secuencias de ADN necesarias para la introducción de la construcción en la planta en cuestión (lo último depende del método de introducción de ADN que va a usarse).

La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias señal o de tránsito, se determina, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde y cómo se desea expresar el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica del desarrollo, etapa o tejido, y el producto génico puede ser dirigido

25 a un tejido o parte de planta específico tal como semillas u hojas. Secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para la expresión constitutiva, pueden usarse 35S-CaMV, la ubiquitina 1 de maíz y el promotor de actina 1 de arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mo. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos de órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos de demanda de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata y frutos (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet.

24: 275-303), o de tejidos de demanda metabólica tales como meristemos (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863878), un promotor específico de semilla tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina o albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen de 35 proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo de aceite de la semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935941), el promotor napa de proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus Chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible por herida tal como el promotor pin2 de patata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducido por sustancias exógenamente aplicadas

45 que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas de planta tales como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico, y metales pesados.

También puede usarse un elemento potenciador promotor para lograr mayor expresión de un polipéptido de la presente invención en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador promotor puede ser un intrón que se pone entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, arriba, desvelan el uso del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para potenciar la expresión.

El gen marcador de selección y cualquier otra parte de la construcción de expresión pueden elegirse de aquellos disponibles en la materia.

55 La construcción de ácidos nucleicos se incorpora en el genoma de planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, que incluyen transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science

244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Actualmente, la transferencia génica mediada por Agrobacterium es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 1538) y también puede usarse para transformar monocotiledóneas, aunque frecuentemente se usan otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas 65 es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno recubiertas con el ADN transformante)

de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

5 Tras la transformación, los transformantes que tienen incorporada la construcción de expresión se seleccionan y regeneran en plantas completas según métodos muy conocidos en la técnica. Frecuentemente, el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección tanto durante la regeneración como en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, co-transformación con dos construcciones de T-ADN separadas o escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.

La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención que comprenden (a) cultivar una planta transgénica o una célula de planta que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana de la presente invención en condiciones propicias para la

15 producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Composiciones

La presente invención también se refiere a composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferentemente, las composiciones están enriquecidas en un polipéptido tal. El término "enriquecidas" indica que la actividad antimicrobiana de la composición ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de 1,1.

Las composiciones pueden comprender además otro agente farmacéuticamente activo, tal como un agente biocida o

25 biostático adicional, tal como otro polipéptido antimicrobiano que presenta actividad antimicrobiana como se ha definido anteriormente. El agente biocida puede ser un antibiótico, como se conoce en la técnica. Clases de antibióticos incluyen penicilinas, por ejemplo penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta-lactamasa, cefalosporinas, por ejemplo cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenémicos; monobactámicos; aminoglucósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprim; vancomicina; etc. El agente biocida también puede ser un agente antimicótico, que incluye polienos, por ejemplo anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azoles, por ejemplo miconazol, ketoconazol, itraconazol y fluconazol.

En una realización, el agente biocida es un agente químico no enzimático. En otra realización, el agente biocida es 35 un agente químico no de polipéptido.

Las composiciones pueden comprender un material de vehículo adecuado. Las composiciones también pueden comprender un vehículo de administración adecuado capaz de administrar los polipéptidos antimicrobianos de la invención al locus deseado cuando las composiciones se usan como un medicamento.

Las composiciones de polipéptido pueden prepararse según métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que va a incluirse en la composición puede estabilizarse según métodos conocidos en la técnica.

45 Se dan más adelante ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones en las que se usa la composición pueden determinarse basándose en métodos conocidos en la técnica.

Métodos y usos

La presente invención también se refiere a métodos de uso de los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana. Los polipéptidos antimicrobianos normalmente son útiles en cualquier sitio sometido a contaminación por bacterias, hongos, levadura o algas. Normalmente, los sitios están en sistemas acuosos tales como sistemas de agua de

55 refrigeración, agua de aclarado de la colada, sistemas de aceite tales como aceites de corte, lubricantes, campos del aceite y similares, donde los microorganismos necesitan ser aniquilados o donde su crecimiento necesita controlarse. Sin embargo, la presente invención también puede usarse en todas las aplicaciones para las que son útiles las composiciones antimicrobianas conocidas, tales como protección de madera, látex, adhesivo, pegamento, papel, cartón, textil, cuero, plásticos, sellado y pienso.

Otros usos incluyen conservación de alimentos, bebidas, cosméticos tales como lociones, cremas, geles, pomadas, jabones, champús, acondicionadores, antitranspirantes, desodorantes, enjuague bucal, productos de lentes de contacto, formulaciones de enzima, o componentes alimenticios.

65 Así, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser útiles como desinfectante, por ejemplo, en el

imagen14

imagen15

imagen16

contacto, tales como aislamiento, agentes de unión, y similares. En un aspecto de la invención, los liposomas se diseñan para ser aerosolizados para administración pulmonar. Los liposomas pueden prepararse con proteínas purificadas o péptidos que median en la fusión de membranas, tales como virus de Sendai o virus de la gripe, etc. Los lípidos pueden ser cualquier combinación útil de lípidos formadores de proteasoma conocidos, que incluyen

5 lípidos catiónicos o de ión bipolar, tales como fosfatidilcolina. El lípido restante será normalmente lípidos neutros o ácidos, tales como colesterol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, y similares.

Para preparar los liposomas, puede usarse el procedimiento descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Brevemente, los lípidos y los péptidos que contienen la composición de luz se combinan en un medio acuoso

10 apropiado, convenientemente un medio de solución salina donde los sólidos totales estarán en el intervalo de aproximadamente el 1-10 por ciento en peso. Después de agitación intensa durante cortos periodos de tiempo, de aproximadamente 5-60 s, el tubo se coloca en un baño de agua templada de aproximadamente 25-40 ºC y este ciclo se repitió aproximadamente 5-10 veces. La composición se sónica entonces durante un periodo de tiempo conveniente, generalmente de aproximadamente 1-10 s, y puede agitarse además por vórtex. El volumen se

15 expande entonces añadiendo medio acuoso, generalmente aumentando el volumen aproximadamente 1-2 veces, seguido de agitación y enfriamiento. Este método permite la incorporación en la luz de moléculas de alto peso molecular.

Formulaciones con otros agentes activos

20 Para su uso en los métodos objeto, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden formularse con otros agentes farmacéuticamente activos, particularmente otros agentes antimicrobianos. Otros agentes de interés incluyen una amplia variedad de antibióticos, como se conoce en la técnica. Clases de antibióticos incluyen penicilinas, por ejemplo penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.;

25 penicilinas en combinación con inhibidores de beta-lactamasa, cefalosporinas, por ejemplo cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenémicos; monobactámicos; aminoglucósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprim; vancomicina; etc.

30 También son útiles agentes antimicóticos, que incluyen polienos, por ejemplo anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azoles, por ejemplo miconazol, ketoconazol, itraconazol y fluconazol. Fármacos antituberculóticos incluyen isoniazida, etambutol, estreptomicina y rifampina. También pueden incluirse citocinas en una formulación de los polipéptidos antimicrobianos de la invención, por ejemplo interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa, interleucina 12, etc.

35

Síntesis in vitro

Los péptidos antimicrobianos de la invención pueden prepararse por síntesis in vitro, usando métodos convencionales como se conoce en la técnica. Están disponibles diversos aparatos sintéticos comerciales, por

40 ejemplo, sintetizadores automatizados por Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Usando sintetizadores, los aminoácidos que existen de forma natural pueden sustituirse con aminoácidos no naturales, particularmente Disómeros (o formas D), por ejemplo, D-alanina y D-isoleucina, diaestereoisómeros, cadenas laterales que tienen diferentes longitudes o funcionalidades, y similares. La secuencia particular y el modo de preparación se determinarán por conveniencia, economía, pureza requerida, y similares.

45 Puede proporcionarse enlace químico a diversos péptidos o proteínas que comprenden funcionalidades convenientes para la unión, tales como grupos amino para la formación de amida o amina sustituida, por ejemplo aminación reductora, grupos tiol para la formación de tioéter o disulfuro, grupos carboxilo para la formación de amida, y similares.

50 Si se desea, pueden introducirse diversos grupos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, que permiten el enlace con otras moléculas o con una superficie. Así, pueden usarse cisteínas para preparar tioéteres, histidinas para unir con un complejo de ión metálico, grupos carboxilo para formar amidas o ésteres, grupos amino para formar amidas, y similares.

55 Los polipéptidos también pueden aislarse y purificarse según métodos convencionales de síntesis recombinante. Un lisado puede prepararse a partir de la expresión huésped y el lisado purificarse usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de purificación. En general, las composiciones que se usan comprenderán al menos el 20 % en peso del producto deseado, más normalmente al

60 menos aproximadamente el 75 % en peso, preferentemente al menos aproximadamente el 95 % en peso, y para fines terapéuticos, normalmente al menos aproximadamente el 99,5 % en peso, en relación con los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Normalmente, el porcentajes se basará en la proteína total

65

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

Finalmente se realizó un ensayo de difusión radial (RDA) siguiendo el protocolo descrito en Methods in Molecular Biology para analizar y cuantificar la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes de levadura contra S. carnosus.

Brevemente, se vertieron 30 ml de medio de sustrato mínimo que contenía 1 % de agarosa y 5x105 ufc/ml de S.

5 carnosus en una placa OmniTray (Nunc, 242811). Se insertó una placa TSP de Nunc (N.º 445497) inmediatamente sobre la placa para permitir una formación de patrón de 96 pocillos. Una vez los medios habían solidificado, se retiró la placa TSP y se aplicaron 10 µl de muestras de sobrenadante de levadura sobre los orificios. Las placas se incubaron 3 horas a 37 grados Celsius y se extendieron con 15 ml de medio de crecimiento de agar de LB. Finalmente, las placas se incubaron durante la noche a 37 grados Celsius y se colorearon con MTT 1,5 mM para

10 visualizar las zonas despejadas.

Se realizó la inspección y las mediciones de las zonas despejadas sobre las placas. Se recogieron los clones de levadura correspondientes que produjeron zonas despejadas de tamaño similar o mayor que los clones que codificaban plectasina no mutante de las placas madre y se transfirieron a placas de agar que contenían medio de

15 crecimiento SC con 2 % de glucosa y ampicilina (100 mg/l). Tales placas se incubaron durante 2 días más a 30 grados Celsius para permitir el crecimiento de levadura. Posteriormente, se realizó PCR de la colonia, seguido de análisis de secuencias para identificar cambios de aminoácidos en la secuencia de plectasina.

Las mutaciones y actividades antimicrobianas correspondientes, con respecto a la actividad de plectasina, se

20 muestran en la Tabla 2. Una actividad de 2 se corresponde con la actividad de plectasina. Una actividad de 3 es mejor que la plectasina, y 1 es peor que la plectasina.

Tabla 2. Datos de actividad antimicrobiana del ensayo de cribado de levadura.

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Tipo salvaje 1 2

GFGCRGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5R 3 3

GFGCQGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5Q 4 3

GFGCVGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5V 5 3

GFGCGGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5G 6 3

GFGCSGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5S 7 3

GFGCAGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5A 8 3

GFGCNGKWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: P7K 9 3

GFGCNGRWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: P7R 10 3

GFGCNGPRDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: W8R 11 3

GFGCNGPWAEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9A 12 3

GFGCNGPWGEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9G 13 3

GFGCNGPWKEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9K 14 3

GFGCNGPWLEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9L 15 3

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

GFGCNGPWTEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9T 16 3

GFGCNGPWYEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9Y 17 3

GFGCNGPWFEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9F 18 3

GFGCNGPWHEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9H 19 3

GFGCNGPWMEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9M 20 3

GFGCNGPWNEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9N 21 3

GFGCNGPWPEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9P 22 3

GFGCNGPWQEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9Q 23 3

GFGCNGPWSEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9S 24 3

GFGCNGPWVEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9V 25 3

GFGCNGPWDGDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: E10G 26 3

GFGCNGPWDSDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: E10S 27 3

GFGCNGPWDEFDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11F 28 3

GFGCNGPWDEGDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11G 29 3

GFGCNGPWDEHDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11H 30 3

GFGCNGPWDEKDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11K 31 3

GFGCNGPWDELDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11L 32 3

GFGCNGPWDEPDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11P 33 3

GFGCNGPWDESDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11S 34 3

GFGCNGPWDETDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11T 35 3

GFGCNGPWDEVDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11V 36 3

GFGCNGPWDEWDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11W 37 3

GFGCNGPWDEIDMQCHNHCKSIKGYKGGY: D11I 38 3

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

CAKGGFVCKCY: imagen21 imagen22 imagen23

GFGCNGPWDEMDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11M 39 3

GFGCNGPWDENDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11N 40 3

GFGCNGPWDERDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11R 41 3

GFGCNGPWDEYDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11Y 42 3

GFGCNGPWDEDDRQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13R 43 3

GFGCNGPWDEDDSQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13S 44 3

GFGCNGPWDEDDVQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13V 45 3

GFGCNGPWDEDDMFCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14F 46 3

GFGCNGPWDEDDMGCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14G 47 3

GFGCNGPWDEDDMHCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14H 48 3

GFGCNGPWDEDDMSCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14S 49 3

GFGCNGPWDEDDMYCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14Y 50 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNLCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: H18L 51 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSLKGYKG GYCAKGGFVCKCY: I22L 52 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSVKGYKG GYCAKGGFVCKCY: 122V 53 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKHYKGG YCAKGGFVCKCY: G24H 54 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKKYKGG YCAKGGFVCKCY: G24K 55 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKNYKGG YCAKGGFVCKCY: G24N 56 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG FCAKGGFVCKCY: Y29F 57 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG RCAKGGFVCKCY: Y29R 58 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG WCAKGGFVCKCY: Y29W 59 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCKKGGFVCKCY: A31K 60 3

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCNKGGFVCKCY: A31N 61 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCQKGGFVCKCY: A31Q 62 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCTKGGFVCKCY: A31T 63 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCYKGGFVCKCY: A31Y 64 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKKGFVCKCY: G33K 65 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKQGFVCKCY: G33Q 66 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKRGFVCKCY: G33R 67 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGKFVCKCY: G34K 68 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGRFVCKCY: G34R 69 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGLVCKCY: F35L 70 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFLCKCY: V36L 71 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFMCKCY: V36M 72 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFTCKCY: V36T 73 3

GFGCKGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCY: N5K+K26R 74 3

GFGCKGPWDEGDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5K+D11G 75 3

GFGCSGPWDEDDMRCHNHCKAIRGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5S+Q14R+S21A+ K23R 76 3

GFGCSGPWDEDDMRCHSHCKSIRGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5S+Q14R+N17S+ K23R 77 3

GFGCNGPRDEDDRQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: W8R+M13R 78 3

GFGCNGPWGEDDMRCHNHCKSIRGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9G+Q14R+K23R 79 3

GFGCNGPWDGDDMRCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: E10G+Q14R 80 3

GFGCNGPWDEGDMQCHNHCKSIKGYKGG YCARGGFVCKCY: D11G+K32R 81 3

GFGCNGPWDEGDMQCHSHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11G+N17S 82 3

GFGCNGPWDEGDMQCHNHCKSVKGYKG: D11G+I22V 83 3

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

GYCAKGGFVCKCY: imagen24 imagen25 imagen26

GFGCNGPWDENDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFICKCY: D11N+V36I 84 3

GFGCNGPWDERDIQCHNHCKSIKGYKGGY CAKGGFVCKCY: D11R+M13I 85 3

GFGCNGPWDEDDMVCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCY: Q14V+K26R 86 3

GFGCNGPWDEDDMRCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCRCY: Q14R+K26R+K38R 87 3

GLGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: F2L 118 2

GWGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKG GYCAKGGFVCKCY: F2W 119 2

GIGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: F2I 120 2

GFGCLGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5L 121 2

GFGCMGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5M 122 2

GFGCNRPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: G6R 123 2

GFGCNAPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: G6A 124 2

GFGCNKPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: G6K 125 2

GFGCNGAWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: P7A 126 2

GFGCNGLWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: P7L 127 2

GFGCNGVWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: P7V 128 2

GFGCNGPWCEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9C 129 2

GFGCNGPWIEDDMQCHNHCKSIKGYKGGY CAKGGFVCKCY: D9I 130 2

GFGCNGPWREDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9R 131 2

GFGCNGPWWEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D9W 132 2

GFGCNGPWDADDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: E10A 133 2

GFGCNGPWDLDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: E10L 134 2

GFGCNGPWDCDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: E10C 135 2

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

GFGCNGPWDQDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: E10Q 136 2

GFGCNGPWDEADMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11A 137 2

GFGCNGPWDECDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11C 138 2

GFGCNGPWDEDPMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D12P 139 2

GFGCNGPWDEDDAQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13A 140 2

GFGCNGPWDEDDFQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13F 141 2

GFGCNGPWDEDDGQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13G 142 2

GFGCNGPWDEDDLQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13L 143 2

GFGCNGPWDEDDTQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13T 144 2

GFGCNGPWDEDDYQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13Y 145 2

GFGCNGPWDEDDMACHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14A 146 2

GFGCNGPWDEDDMCCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14C 147 2

GFGCNGPWDEDDMICHNHCKSIKGYKGGY CAKGGFVCKCY: Q14I 148 2

GFGCNGPWDEDDMKCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14K 149 2

GFGCNGPWDEDDMMCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14M 150 2

GFGCNGPWDEDDMPCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14P 151 2

GFGCNGPWDEDDMTCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14T 152 2

GFGCNGPWDEDDMVCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14V 153 2

GFGCNGPWDEDDMWCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14W 154 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNACKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: H18A 155 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNFCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: H18F 156 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNQCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: H18Q 157 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNTCKSIKGYKGG: H18T 158 2

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

YCAKGGFVCKCY: imagen27 imagen28 imagen29

GFGCNGPWDEDDMQCHNVCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: H18V 159 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCQSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: K20Q 160 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSMKGYKG GYCAKGGFVCKCY: I22M 161 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSTKGYKG GYCAKGGFVCKCY: I22T 162 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSWKGYKG GYCAKGGFVCKCY: I22W 163 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKAYKGG YCAKGGFVCKCY: G24A 164 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKPYKGG YCAKGGFVCKCY: G24P 165 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKFYKGG YCAKGGFVCKCY: G24F 166 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKIYKGGY CAKGGFVCKCY: G24I 167 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKQYKGG YCAKGGFVCKCY: G24Q 168 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKRYKGG YCAKGGFVCKCY: G24R 169 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKSYKGG YCAKGGFVCKCY: G24S 170 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKTYKGG YCAKGGFVCKCY: G24T 171 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKYYKGG YCAKGGFVCKCY: G24Y 172 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGHKGG YCAKGGFVCKCY: Y25H 173 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGKKGG YCAKGGFVCKCY: Y25K 174 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGLKGG YCAKGGFVCKCY: Y25L 175 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGMKGG YCAKGGFVCKCY: Y25M 176 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGNKGG YCAKGGFVCKCY: Y25N 177 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGQKGG YCAKGGFVCKCY: Y25Q 178 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGSKGG YCAKGGFVCKCY: Y25S 179 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGVKGG YCAKGGFVCKCY: Y25V 180 2

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYFGG YCAKGGFVCKCY: K26F 181 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYHGG YCAKGGFVCKCY: K26H 182 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYTGG YCAKGGFVCKCY: K26T 183 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG ACAKGGFVCKCY: Y29A 184 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG HCAKGGFVCKCY: Y29H 185 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG LCAKGGFVCKCY: Y2 9L 186 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG MCAKGGFVCKCY: Y2 9M 187 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG SCAKGGFVCKCY: Y2 9S 188 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCEKGGFVCKCY: A31E 189 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCHKGGFVCKCY: A31H 190 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCIKGGFVCKCY: A31I 191 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCRKGGFVCKCY: A31R 192 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCSKGGFVCKCY: A31S 193 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCVKGGFVCKCY: A31V 194 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCARGGFVCKCY: K32R 195 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCATGGFVCKCY: K32T 196 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKEGFVCKCY: G33E 197 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKNGFVCKCY: G33N 198 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKSGFVCKCY: G33S 199 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKTGFVCKCY: G33T 200 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGHFVCKCY: G34H 201 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGWFVCKCY: G34W 202 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG: F35A 203 2

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

YCAKGGAVCKCY: imagen30 imagen31 imagen32

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGHVCKCY: F35H 204 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGIVCKCY: F35I 205 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGMVCKCY: F35M 206 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGVVCKCY: F35V 207 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGWVCKCY: F35W 208 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFICKCY: V36I 209 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFKCKCY: V36K 210 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFQCKCY: V36Q 211 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFRCKCY: V36R 212 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCHCY: K38H 213 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCNCY: K38N 214 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCRCY: K38R 215 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCI: Y40I 216 2

GFGCNGPWLEDDMQCHNHCKSIKGYNGG YCAKGGFVCKCY: D9L+K26N 217 2

GFGCNGPWDELDIQCHNHCKSIKGYKGGY CAKGGFVCKCY: D11L+M13I 218 2

GFGCNGPWDEDDRQCHNHCKSIKGYKGG FCAKGGFVCKCY: M13R+Y29F 219 2

GFGCNGPWDEDDMRCHNHCKSIRGYRGG YCAKGGFVCKCY: Q14R+K23R+K26R 220 2

GFGCNGPWDEDDMRCHNHCRSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14R+K20R 221 2

GFGCNGPWDEDDMSCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCRCY: Q14S+K38R 222 2

GFGCNGPWDEDDMQCHSHCKSIRGYKGG YCAKGGFVCKCY: N17S+K23R 223 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG FCARGGFVCKCY: Y29F+K32R 224 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCARGKFVCKCY: K32R+G34K 225 2

imagen33

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

GFGCNGPWDEDDKQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13K 90 3

GFGCNGPWDEDDMLCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14L 91 4

GFGCNGPWDEDDMRCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: Q14R 92 4

GFGCNGPWDEDDMQCHHHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N17H 93 4

GFGCNGPWDEDDMQCHIHCKSIKGYKGGY CAKGGFVCKCY: N17I 94 2

GFGCNGPWDEDDMQCHRHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N17R 95 2

GFGCNGPWDEDDMQCHYHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N17Y 96 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCRSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: K20R 97 2

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCY: K2 6R 98 3

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCYR: Y40YR 99 2

GFGCYGPWDEDDMLCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: N5Y+Q14L 100 2

GFGCNGPWDEGDMQCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCY: D11G+K26R 101 2

GFGCNGPWDEGDKQCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCY: D11G+M13K+K26 R 102 3

GFGCNGPWDEDDKQCHRHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCYR: M13K+N17R+Y40 YR 103 3

GFGCNGPWDEDDMQCHRHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCYR: N17R+Y40YR 104 3

GFGCNGPWDENDMQCHNHCKFIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: D11N+S21F 105 4

GFGCNGPWDEDDKQCHRHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCY: M13K+N17R 106 3

GFGCNGPWDEDDKQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCKCYR: M13K+Y40YR 107 4

GFGCNGPWDEDDKQCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCY: M13K+K26R 108 4

GFGCNGPWDEDDKQCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFVCRCY: M13K+K38R 109 4

GFGCNGPWDEGDMQCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCYR: D11G+K26R+Y40 YR 110 4

GFGCNGPWDEGDKQCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCYR: D11G+M13K+K26 R+ Y40YR 111 4

GFGCNGPWDEDDMRCHNHCKSIKGYKGG: Q14R+Y40YR 112 3

Secuencia: Mutación(es) SEQ ID NO: Actividad

YCAKGGFVCKCYR: imagen34 imagen35 imagen36

GFGCNGPWDEDDMRCHNHCKSIKGYKGG YCAKGGFICKCY: Q14R+V36I 113 4

GFGCNGPWDEDDMRCHNHCKSIKGYRGG YCAKGGFVCKCY: Q14R+K26R 114 4

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKFIKGYKGG YCTKGGFVCKCY: S21F+A31T 115 2

Ejemplo 4

5 Evaluación de la actividad antimicrobiana

Se expresaron y purificaron plectasina no mutante (SEQ ID NO:1) y cinco variantes de plectasina, que mostraron actividad mejorada en el método TAPS y/o en el sistema de levadura. Se determinó la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM, µg/ml) para probar su actividad antimicrobiana siguiendo las directrices de NCCLS (Clinical and

10 Laboratory Standards Institute; antiguamente conocido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards).

Los resultados mostraron que todas las variantes de plectasina tuvieron actividad mejorada, en comparación con la plectasina no mutante, contra Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Bacillus subtilis. 15 Tabla 4. Valores de CIM; todos los valores son µg/ml.

Mutación(es): SEQ ID NO: CIM contra S. aureus CIM contra M. luteus CIM contra B. subtilis

tipo salvaje: 1 8 32 1

M13K+Y40YR: 107 2 2 0.25

D11G+K26R: 101 2 8 0.50

Q14K+K26R: 116 2 1 0.13

D11G+K26R+Y40YR: 110 0.50 0.25 0.06

D11G+M13K+K26R+ Y40YR: 111 0.50 0.50 <0.03

20 Ejemplo 5

Evaluación de la actividad antimicrobiana

Se expresaron y purificaron plectasina no mutante (SEQ ID NO:1) y varias variantes de plectasina. Se determinó la

25 Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) para probar su actividad antimicrobiana siguiendo las pautas de NCCLS de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute; antiguamente conocido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards).

Los péptidos se probaron contra las siguientes cepas: 30

A: Staphylococcus aureus, ATCC 29213;

B: Staphylococcus aureus, ATCC 25923;

C: Staphylococcus aureus, ATCC 29737;

D: Staphylococcus aureus, MRSA ST5 (2001), cepa clínica humana multirresistente de Statens Serum Institut, 35 Dinamarca;

E: Staphylococcus aureus, MRSA ST80 (2003), cepa clínica humana multirresistente de Statens Serum Institut,

Dinamarca. 39

Todos los valores de CIM representan un promedio de dos experimentos independientes; y todos los resultados en la Tabla 5 se expresan con respecto a plectasina no mutante:

5 0: > 100 % de CIM de plectasina no mutante;

1: 80-100 % de CIM de plectasina no mutante;

2: 50-80 % de CIM de plectasina no mutante;

3: < 50 % de CIM de plectasina no mutante.

10 Tabla 5. Valores de CIM relativa; nd = no determinado.

Mutación(es): SEQ ID NO: A B C D E

tipo salvaje: 1 1 (8 µg/mL) 1 (22 µg/mL) 1 (4 µg/mL) 1 (15 µg/mL) 1 (22 µg/mL)

N5R+M13Y+N17R: 226 3 3 3 3 3

D9S+Q14K+V36L: 227 3 3 3 3 3

N5S+M13W+N17R: 228 3 nd 3 3 3

Q14R+K26R+K38R: 87 3 3 3 3 3

D9G+Q14R+K23R: 79 3 3 3 3 3

M13G+N17R+G33A: 229 3 3 3 3 3

N5S+D9S+M13L+Q14R+ N17V+A31S: 230 3 3 3 3 3

D9S+Q14L+K26R: 231 3 3 3 3 3

N5S+D9A+K26R: 232 3 3 3 3 3

Q14R+K20R: 221 3 3 3 3 3

N5G+M13L: 233 2 3 3 3 3

D9A+K38R: 234 3 3 3 3 3

D11G+K32R: 81 1 3 3 2 3

Q14F: 46 1 nd 3 2 3

N5R+M13V: 235 3 nd 3 2 3

N5G+M13Y+N17K: 236 3 3 3 3 2

Q14K+K26R: 116 3 2 3 3 3

M13F+Q14K+K26R: 237 3 nd 3 3 3

M13K+K38R: 109 1 3 3 2 3

N5A+D9S+M13L+N17T: 238 0 3 3 2 3

N17Y: 96 1 3 3 2 2

M13T+Q14K+K26R: 239 1 3 3 2 0

D9S: 24 2 3 3 2 nd

N17R: 95 nd 3 3 3 2

Q14R: 92 2 3 3 3 0

N5S+Q14R+N17S+K23R: 77 1 3 3 3 nd

N5R: 3 1 2 2 2 2

D11G+K26R+Y40YR: 110 3 3 3 3 nd

Mutación(es): SEQ ID NO: A B C D E

N5S+Q14R+S21A+K23R: 76 1 3 2 2 0

M13L+Q14K+K26R: 240 3 nd 3 3 nd

D9N+M13L+Q14R: 241 3 3 3 3 3

D9A+Q14H+K26R+V36L: 242 3 3 3 3 3

Q14R+K23R+K26R: 220 3 3 3 3 3

N5S+D9S+M13V+N17R: 243 3 3 3 3 3

N5G+D9S+M13L+ N17Q+A31T: 244 3 3 3 3 3

M13V+N17T: 245 nd 3 3 3 3

D9S+M13L+Q14H: 246 3 3 3 3 3

D9S+Q14L: 247 3 nd 3 3 3

D9N+Q14H+K38R: 248 3 3 3 3 2

M13Y+Q14K+K26R: 249 2 3 3 3 3

D11N: 40 2 3 2 2 3

N5S+D9S: 250 0 3 3 2 3

G24R: 169 1 2 nd 2 2

N5G+Q14K: 251 2 2 3 0 2

N5K+K26R: 74 1 2 3 2 2

Ejemplo 6

5 Evaluación de la actividad antimicrobiana

Se probaron un gran número de péptidos antimicrobianos de la invención contra un panel de 6 cepas diferentes de Staphylococcus aureus enumeradas a continuación:

Staphylococcus aureus,: ATCC29213, MSSA, Cepa de referencia de NCCLS;

Staphylococcus aureus,: ATCC25923, MSSA, Cepa de referencia de NCCLS;

Staphylococcus aureus,: ATCC29737, MSSA;

Staphylococcus aureus,: E33235, MSSA;

Staphylococcus aureus,: 698-01, MRSA ST5, Str, Kan, Oxa;

Staphylococcus aureus,: 566-03, MRSA ST80, Oxa, Tet, Fus, Kan.

10

S. aureus E33235, S. aureus 698-01 y S. aureus 566-03 están disponibles de Statens Serum Institut, Dinamarca.

Los estafilococos se expusieron a las siguientes concentraciones de péptido: 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,13; 0,6; y

0,03 µg/ml. Todos los péptidos se purificaron, se cuantificaron por HPLC y los péptidos concentrados (>160 µg/ml) 15 se diluyeron a 160 µg/ml en tampón de dilución de péptido (0,1 % de BSA, 0,01 % de ácido acético).

La determinación de CIM se hizo esencialmente como se describe por las directrices de NCCLS / CLSI usando caMHB. Las CIM se leyeron después de 18-24 horas de incubaciones a 37 ºC y se registraron junto con las UFC en la siguiente tabla.

Se evaluaron un número total de 95 péptidos antimicrobianos por duplicado contra las 6 cepas bacterianas descritas anteriormente.

En la mayoría de las determinaciones dobles (93 %), la CIM varió < 2 veces. Se tabulo una CIM promedio a 25 continuación. Si la CIM fue superior a 32 µg/ml, se usó un valor de 64 para calcular el promedio.

Tabla 6. Valores de CIM promedio.

Mutación(es): SEQ ID NO: CIM promedio (µg/mL)

N5R+M13Y+N17R: 226 1

D9N+M13L+Q14R: 241 1

D9S+Q14K+V36L: 227 1

D9A+Q14H+K26R+V36L: 242 1

D9G+Q14R+K23R: 79 2

Q14R+K23R+K26R: 220 2

M13G+N17R+G33A: 229 2

N5S+D9S+M13V+N17R: 243 2

N5S+M13W+N17R: 228 2

Q14R+K26R+K38R: 87 2

N5S+D9S+M13L+Q14R+N17V+ A31S: 230 2

D9S+Q14L+K26R: 231 3

N5S+D9A+K26R: 232 3

N5G+D9S+M13L+N17Q+A31T: 244 3

M13V+N17T: 245 3

D9S+M13L+Q14H: 246 3

D9S+Q14L: 247 3

Q14R+K20R: 221 3

N5G+M13L: 233 4

D9A+K38R: 234 4

D9N+Q14H+K38R: 248 4

N17R: 95 4

M13R+Q14K+K26R: 252 5

M13Y+Q14K+K26R: 249 5

D11G+K32R: 81 5

Q14F: 46 5

N5R+M13V: 235 5

Q14R: 92 5

N5G+M13Y+N17K: 236 5

Q14R+K26R: 114 5

M13F+Q14K+K26R: 237 6

M13K+K38R: 109 6

D11N: 40 6

N5S+D9S: 250 6

Q14K+K26R: 116 6

Mutación(es): SEQ ID NO: CIM promedio (µg/mL)

N5A+D9S+M13L+N17T: 238 6

N17Y: 96 6

N17K+K32R: 253 7

M13T+Q14K+K26R: 239 7

D9K: 14 7

D9S: 24 7

M13K+N17R+Y40YR: 103 8

N5S+Q14R+N17S+K23R: 77 8

N5R: 3 8

G24R: 169 8

D11G+K26R+Y40YR: 110 9

N5S+Q14R+S21A+K23R: 76 9

N5G+M13W: 254 9

N5G+Q14K: 251 9

M13A+Q14K+K26R: 255 9

M13L+Q14K+K26R: 240 9

N5K+K26R: 74 9

A31N: 61 9

M13R: 43 9

N5K+M13L: 256 9

M13K+K26R: 108 10

N5G+M13W+N17S: 257 10

N17K: 258 11

S21N: 259 11

D11G+K26R: 101 11

K26C+Y40YRCG: 260 11

Q14V+K26R: 86 12

M13K+Y40YR: 107 12

M13K: 90 12

N5H+M13E+N17E: 261 12

N5K: 88 12

N17F: 262 12

D11G+M13K+K26R+Y40YR: 111 12

Q14L: 91 13

Wildtype: 1 14

N17I: 94 14

N17S: 263 14

Mutación(es): SEQ ID NO: CIM promedio (µg/mL)

N17S+K23R: 223 14

N5G+D9A+Q14S+K23T+A31T: 264 14

N17A: 265 15

K2 6R: 98 15

M13S+Q14K+K26R: 266 15

D11G+N17I: 267 16

N5S+M13V+N17T: 268 16

N5D+D9S+Q14R: 269 16

D11G+I22V: 83 17

S21A: 270 17

N17R+Y25R: 271 18

N5S+M13V+N17A: 272 18

Q14G: 47 18

D9G: 13 21

N17T: 273 21

Q14S: 49 21

N5G: 6 24

N5S: 7 24

M13S: 44 24

S21V: 274 26

M13T: 144 26

V36L: 71 26

N5A: 8 29

D9V: 25 30

Ejemplo 7

5 Uso de archivos de HMM de la base de datos PFAM para identificar una defensina

Puede llevarse a cabo análisis de secuencias usando perfiles de modelo oculto de Markov (perfiles HMM) tanto en línea en internet como localmente en un ordenador usando el paquete de software libremente disponible muy conocido HMMER. La versión actual es HMMER 2.3.2 de octubre de 2003.

10 Los perfiles de HMM pueden obtenerse de la base de datos PFAM muy conocida. La versión actual es PFAM 16.0 de noviembre de 2004. Tanto HMMER como PFAM están disponibles para todas las plataformas informáticas de, por ejemplo, la Universidad de Washington en San Luis (EE.UU.), Escuela de Medicina (http://pfam.wustl.edu y http://hmmer.wustl.edu).

15 Si una secuencia de aminoácidos de búsqueda, o un fragmento de la misma, pertenece a una de las cinco siguientes familias de PFAM, la secuencia de aminoácidos es una defensina según la presente invención:

 Defensina_beta o "Defensina beta", número de acceso: PF00711;

20  Defensina_propep o "Propéptido de defensina", número de acceso: PF00879;  Defensina_1 o "Defensina de mamífero ", número de acceso: PF00323;  Defensina_2 o "Defensina de artrópodo ", número de acceso: PF01097;

Claims

imagen1

imagen2