JP2008545425A - 抗菌作用を有するポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
G-X1-C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-C-H-X12-X13-C-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-G-G-X21-C- X22-X23-X24-X25-X26-X27-C-X28-C-X29;
[ X1 = F,L,W又はI;好ましくはX1= F ;
X2 = N,R,Q,V,G,S,A,K,L,M,D,H又はY ;好ましくはX2 = N,R,Q,V,G,S,A,K 又はY ;,
X3 = G,R,A又はK ; 好ましくは X3 = G ;
X4 = P,A,L,V,K又はR ; 好ましくは X4 = P,K又はR ;
X5 = W又はR ;
X6 = D,A,G,K,L,T,N,F,H,M,P,Q,S,C,I,R,V又はY ;好ましくは X6 = D,A,G,K,L,T,N,F, H,M,P,Q,S,V又はR ;
X7 = E,G,A,L,C,Q又はS ;好ましくは X7 = E,G又はS ;
X8 = D,F,G,N,V,Y,H,K,L,P,S,T,W,I,M,A,C又はR ;好ましくはX8 = D,F,G,N,V,Y,H,K,L, P,S,T,W,I,M又はR ;
X9 = D又はP ; 好ましくは X9 = D ;
X10 = M,R,S,V,A,F,G,L,T,Y,W,E,又はK ;好ましくは X10 = M,R,S,V,G,Y,L,F,T,W又はK ;
X12 = N,R,I,Y,V,K,T,Q,S,F,A,W,E又はH ;
X13 = H,A,F,Q,T,V又はL ;好ましくはX13 = H又はL ;
X14 = K,Q又はR ;好ましくはX14 = K又はR ;
X15 = S,A,V,N又はF ;
X16 = I,L,M,T,W又はV ;好ましくはX16 = I,L又はV ;
X17 = K,T又はR ;
X18 = G,H,K,A,P,F,I,Q,R,S,T,Y又はN ;好ましくはX18 = G,H,R,K又はN ;
X19 = Y,H,K,L,M,N,Q,S,V又はR ;好ましくはX19 = Y又はR ;
X20 = K,F,H,T,C又はR ;好ましくはX20 = K又はR ;
X22 = A,K,N,Q,T,E,H,I,R,S,V,G又はY ;好ましくはX22 = A,K,N,Q,T,S又はY ;
X23 = K,R又はT ;好ましくはX23 = K又はR ;
X24 = G,K,Q.E,N,S,T,A又はR ;好ましくはX24 = G,K,Q,A,又はR ;
X25 = G,K,H,W又はR ;好ましくはX25 = G,K又はR ;F又はL ;
X26 = F,A,H,I,M,V,W,R又はL ;好ましくはX26 = F又はL ;
X27 = V,L,M,I,K,Q,R又はT ;好ましくはX27 = V,L,M又はT ;
X28 = K,H,N又はR ;好ましくはV28 = K又はR ;
X29 = Y,I,YRCG又はYR ;好ましくはX29 = Y又はYR ]、
であるアミノ酸と少なくとも80%の同一性を有し、そして配列番号1の1から40のアミノ酸と100%以下の同一性を有するアミノ酸を含み、好ましくはそのアミノ酸から成る、抗菌作用を有するポリペプチドを提供する。
抗菌作用:
用語「抗菌作用」は、菌細胞を殺生又は増殖を阻害できる作用として、本明細書に定義されている。本発明の説明事項において、用語「抗菌」は、細菌の殺生、および/又は細菌の増殖阻害、および/又は真菌類の殺生、および/又は真菌類の増殖阻害効果、そして/又はウイルスの殺生効果の意味を意図し、ここで用語「細菌の殺生(bactericidal)」は、細菌の細胞を殺すことができるとして、理解する必要がある。
用語「細菌の増殖阻止(bacteriostatic)」は、細菌の増殖を阻害できるものとして、すなわち細菌細胞の増殖を阻害できるものとして理解する必要がある。
本明細書に使用されている用語「デフェンシン(defensin)」は、抗菌性ペプチドのデフェンシン(defensin)網に属するものとして当業者により認められたポリペプチドを指している。ポリペプチドが、本発明によるデフェンシン(defensin)であるかどうかを決定するために、アミノ酸配列を、自由に入手できるHMMERソフトウエア・パッケイジを使用し、PFAMデータベースのhidon markov model profiles(HMM profile)と比較することが好ましい。
本明細書にて使用されている用語「単離されたポリペプチド」は、SDS-PAGEにより決定される場合に、少なくとも20%の純度、好ましくは少なくとも40%の純度、好ましくは少なくとも40%の純度、より好ましくは少なくとも60%の純度、さらにより好ましくは少なくとも80%の純度、最も好ましくは少なくとも90%の純度、そしてさらに最も好ましくは少なくとも95%の純度であるポリペプチドを指している。
用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、本明細書においては天然で関連する別のポリペプチド物質を重量当り、多くても10重量%、好ましくは多くても8重量%、より好ましくは多くても6重量%、より好ましくは多くても5重量%、より好ましくは多くても4重量%、より好ましくは多くて3も重量%、さらにより好ましくは多くても2重量%、最も好ましくは多くても1重量%、そしてさらに最も好ましくは多くても0.5重量%含む、ポリペプチドの調製物である。
用語「変異物」は、ポリペプチドの1又は複数の特定位置で、1又は複数の特定アミノ酸残基の挿入、欠失、および/又は切り取りなどの1又は複数の変形を含む抗菌性ポリペプチドとして定義される。
本発明において、抗菌性ポリペプチド変異物のアミノ酸残基の位置に付けられた特定番号が、用いられる。たとえば、周知の抗菌性ポリペプチドのアミノ酸配列をアラインメントすることにより、抗菌性ポリペプチドのいずれかのアミノ酸残基に、アミノ酸の位置番号を指定できる。
アミノ酸の置換に対し、以下の用語:アミノ酸源、位置、置換されたアミノ酸を使用する。従って位置226でトレオニンをアラニンで置換することを、「T226A」として指定し、そして位置40でチロシンをチロシンおよびアルギニンで置換すること(チロシンの後アルギニンを効果的に加える)「Y40YR」として指定する。複数の変異を、符号(「+」)を加えることで分離し、たとえば「G205R + S411F」により、グリシン(G)をアルギン(R)にて、そしてセリン(S)を、フェニルアラニン(F)にて、205と411のそれぞれの位置で置換する変異物を表す。
本明細書に用いられる用語「親(parent)」は、これに対してたとえば置換、挿入、欠失、および/又は切断などの修飾が行われ、本発明の抗菌性ペプチドの変異物を生成する抗菌性ペプチドの意味である。さらにこの用語は、変異物が、比較および整合されるポリペプチドを指している。親(parent)は、天然に存在する(野生型)ペプチドであってもよく、又はそれがその変異物であるとしてもよく、何か適切な方法により調製することができる。たとえば、親タンパク質が、アミノ酸配列内で修飾又は変更された天然に存在するポリペプチドの変異物であっても良い。さらに親(parent)ペプチドは、同じ染色体の遺伝子座を占める遺伝子の2以上のいずれかによりコードされるポリペプチドである対立遺伝子変異物で良い。
2のアミノ酸配列の間又は2のヌクレオチド配列の間の関連性は、「同一性(identity)」パラメータにより記載されている。本発明の目的のために、2のアミノ酸配列の間の同一性の程度は、バージョン2.0xのFASTAプログラム・パッケージに含まれるプログラム・FASTA(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)、「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」、PNAS 85:2444-2448;and W.R.Pearson(1990)「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA」Methods in Enzymology 183:63-98を参照)を使用することにより決定される。
用語「ポリペプチドの断片」は、配列番号2又はその相同配列からアミノ末端および/又はカルボキシ末端から1又は複数のアミノ酸が欠失されたポリペプチドで、ここでその断片が抗菌作用を有するものとして本明細書で定義される。
用語「部分配列(subsequence)」は、配列番号1又はその相同配列から5’および/又は3’末端から1又は複数のヌクレオチドが欠失されたヌクレオチド配列として、ここで部分配列(subsequence)が抗菌作用を有するポリペプチド断片をコードするものとして本明細書で定義される。
本明細書において、用語「対立遺伝子変異物」は、同じ染色体の遺伝子座を占める遺伝子の2以上の別の形状のいずれかを示す。対立遺伝子変異物は、変異を介し天然に形成され、そして集団内で多型を形成することになる。遺伝子の変異は、沈黙状態(コードされたポリペプチドの変化がない)のこともあり、又は変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもある。ポリペプチドの対立遺伝子変異物は、遺伝子の対立遺伝子変異物によりコード化されたポリペプチドである。
本発明に使用される用語「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の外来からの又は要望されないヌクレオチドを伴わない、又は遺伝子操作によるタンパク質生成で使用するに適切な形状のポリヌクレオチドの調製を指している。従って実質的に純粋なポリヌクレオチドは、それが天然に関連する他のポリヌクレオチド物質をせいぜい10重量%、好ましくはせいぜい8重量%、より好ましくはせいぜい6重量%、より好ましくはせいぜい5重量%、より好ましくはせいぜい4重量%、より好ましくはせいぜい3重量%、さらにより好ましくはせいぜい2重量%、最も好ましくはせいぜい1重量%、そしてさらに最も好ましくはせいぜい0.5重量%を含む。
用語「cDNA」は、真核細胞から得られる熟成しスプライスされた、mRNA分子から逆転写することにより、調製することができる。cDNAは、通常相当するゲノムDNAに存在するイントロン配列が欠落している。最初プライマリーRNA転写物は、成熟し、スプライスされたmRNAとして存在する前の、一連の過程を介して処理されたmRNAに対する前駆物質である。これらの過程は、スプライシングと称する処理によりイントロン配列を除去することを含む。そのため、mRNAから誘導されるcDNAは、いずれのイントロン配列も無くなっている。
本明細書に使用される用語「核酸の構成物」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又はさもなければ天然に存在しない態様で、核酸のセグメントを含むよう修飾された、単一鎖又は2重鎖のいずれかの核酸分子を指している。用語「核酸の構成物」は、本発明のコード配列の発現に必要とされるコントロール配列を含む。
用語「コントロール配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な又は有利な全ての成分を含むものとして、本明細書に定義されている。各コントロール配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対し、生来的でも外来性であっても良い。こうしたコントロール配列は、リーダ、ポリアデニール化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナル・ペプチド配列、および転写ターミネータを含むが、それに限定されない。最少コントロール配列が、プロモータ、および転写シグナルや翻訳停止シグナルを含む。コントロール配列には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域と、コントロール配列の結合を容易にする特異的な制限酵素部位を導入する目的で、リンカー(linkers)を提供することができる。
用語「作用可能に連結された」は、本明細書においては、コントロール配列が、ポリペプチドのコード配列の発現を指令するようにポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置で、配置された配置を意味する。
コード配列:
用語「コード配列」は、タンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するヌクレオチド配列の意味である。コード配列の境界は、オープン・リーデングフレームによって決定され、通常ATG開始コドンあるいはGTGおよびTTGなどの開始コドンにより通常開始する。コード配列は、DNA、cDNA,又は組み替え形ヌクレオチド配列であっても良い。
用語「発現」は、転写、転写後の修飾、翻訳、翻訳後の修飾、および分泌などを含むがそれに限定されないポリペプチドの生成に関連するあらゆる過程を含む。
発現ベクター:
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その発現のために設けられた追加ヌクレオチドに遺伝子操作により結合された、直鎖、又は円形鎖のDNA分子として、本明細書に定義される。
本明細書に使用される用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構成物にて、形質転換、トランスフェクト、形質導入などである何れかの細胞型を含む。
用語「修飾」は、本明細書において、配列番号2乃至配列番号225のいずれか又は配列番号226から配列番号251のいずれか、又は配列番号252から配列番号274のいずれかのアミノ酸1乃至40から成るポリペプチドの何らかの化学的修飾、およびそのポリペプチドをコードするDNAの遺伝子操作の意味である。修飾は、アミノ酸の置換、欠失、そして/又は挿入、並びにアミノ酸側鎖の置き換え、又はアミノ酸配列において類似の特徴を有する非天然アミノ酸の使用を意味する。特に修飾は、C-末端のアミド化などのアミド化であることができる。
最初の観点において、本発明は、
アミノ酸配列(1)の1から40のアミノ酸:
G-X1-C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-C-H-X12-X13-C-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-G-G-X21-C- X22-X23-X24-X25-X26-X27-X20-C-X28-C-X29;
[ X1 = F,L,W又はI;好ましくはX1= F ;
X2 = N,R,Q,V,G,S,A,K,L,M,D,H又はY ;好ましくはX2 = N,R,Q,V,G,S,A,K 又はY ;より好ましくはX2 = N,R,S又はG;
X3 = G,R,A又はK ; 好ましくは X3 = G ;
X4 = P,A,L,V,K又はR ; 好ましくは X4 = P,K又はR ;
X5 = W又はR ;
X6 = D,A,G,K,L,T,N,F,H,M,P,Q,S,C,I,R,V又はY ;好ましくは X6 = D,A,G,K,L,T,N,F, H,M,P,Q,S,V又はR ;より好ましくは X6 = D,S,A,G又はN;
X7 = E,G,A,L,C,Q又はS; 好ましくは X7 = E,G又はS ;
X8 = D,F,G,N,V,Y,H,K,L,P,S,T,W,I,M,A,C又はR ;好ましくはX8 = D,F,G,N,V,Y,H,K,L, P,S,T,W,I,M又はR ;より好ましくは X8 = D,G又はN;
X9 = D又はQ ; 好ましくは X9 = D ;
X10 = M,R,S,V,A,F,G,L,T,Y,W,E,又はK ;好ましくは X10 = M,R,S,V,G,Y,L,F,T,W又はK ;
X11 = Q,R,L,F,G,H,S,A,C,I,K,M,P,T,V,W又はY ;好ましくはX11 = Q,R,L,F,G,H,S,K又はY ;
より好ましくはX11 = Q,K,R又はF;
X12 = N,R,I,Y,V,K,T,Q,S,F,A,W,E又はH ;より好ましくはX12 = N,R,V又はQ;
X13 = H,A,F,Q,T,V又はL ;好ましくはX13 = H又はL ;
X14 = K,Q又はR ;好ましくはX14 = K又はR ;
X15 = S,A,V,N又はF ;
X16 = I,L,M,T,W又はV ;好ましくはX16 = I,L又はV ;
X17 = K,T又はR ;
X18 = G,H,K,A,P,F,I,Q,R,S,T,Y又はN ;好ましくはX18 = G,H,R,K又はN ;
より好ましくはX18 = G又はR;
X19 = Y,H,K,L,M,N,Q,S,V又はR ;好ましくはX19 = Y又はR ;
X20 = K,F,H,T,C又はR ;好ましくはX20 = K又はR ;
X22 = A,K,N,Q,T,E,H,I,R,S,V,G又はY ;好ましくはX22 = A,K,N,Q,T,S又はY ;
より好ましくはX22 = A,S又はT;
X23 = K,R又はT ;好ましくはX23 = K又はR ;
X24 = G,K,Q.E,N,S,T,A又はR ;好ましくはX24 = G,K,Q,A又はR ;
より好ましくはX24 = G又はA;
X25 = G,K,H,W又はR ;好ましくはX25 = G,K又はR ;
X26 = F,A,H,I,M,V,W,R又はL ;好ましくはX26 = F又はL ;
X27 = V,L,M,I,K,Q,R又はT ;好ましくはX27 = V,L,M又はT ;より好ましくはX27 = V又はL;
X28 = K,H,N又はR ;好ましくはV28 = K又はR ;
X29 = Y,I,YRCG又はYR ;好ましくはX29 = Y又はYR、
アミノ酸配列(1)の1から40のアミノ酸:
G-F-G-C-X1-G-X2-X3-X4-X5-X6-D-X7-X8-C-H-X9-X10-C-X11-S-X12-X13-X14-X15-X16-G-G-X17-X18-K-X19-X20-X21-X22-C-K-C-X23;
この配列において、
X2 = P,K又はR;
X3 = W又はR ;
X4 = D,A,G,K,L,T,N,F,H,M,P,Q,S,V又はY ; 好ましくは X4 = D,S,A,G又はN ;
X5 = E,G又はS ;
X6 = D,F,G,N,V,Y,H,K,L,P,S,T,W,I,M又はR ;好ましくは X6 = D,G又はN;
X7 = M,R,S,V,G,Y,L,F,T,W又はK; 好ましくは X7 = M,L,G又はV ;
X8 = Q,R,L,F,G,H,S,K又はY ;好ましくはX8 = Q,K,R又はF ;
X9 = N,R,I,Y,V,K,T,S,Q又はH ; 好ましくは X9 = N,R,V又はF ;
X10 = H又はLK ;
X12 = I,L又はV;
X13 = K又はR ;
X14 = G,H,R,K又はN ;好ましくはX14 = G又はR ;
X15 = Y又はR ;
X16 = K又はR ;
X17 = Y,F,R又はW ;
X18 = A,K,N,Q,T,S又はY ;好ましくはX18 = A,S又はT ;
X19 = G,K,Q,A又はR ;好ましくはX19 = G又はA ;
X20 = G,K又はR ;
X22 = V,L,M又はT ;好ましくはX22 = V又はL ;
X23 = Y又はYR ]、
であり、少なくとも70%の同一性(好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少なくとも97%の同一性、そして特異的には100%の同一性)を有し、そして配列番号1の1から40のアミノ酸と100%弱の同一性を有する、アミノ酸配列を含み、好ましくはそのアミノ酸配列から成る抗菌作用を有するポリペプチドである。
別の例において、アミノ酸配列(1)および/又は(II)は、配列番号1の1乃至40のアミノ酸と、少なくとも60%の同一性を、好ましくは少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する。
用語「配列番号2から配列番号225の何れか」は、配列番号2又は 配列番号3から配列番号225の何れかの意味を意図している。
本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸を、D型又はL型から独立して選択することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドが、デフェンシン(defensin)・ポリペプチド、好ましくはアルファ・デフェンシン(defensin)、ベータ・デフェンシン(defensin)、又は昆虫(節足動物)デフェンシン(defensin)である。
N5R, N5Q, N5V, N5G, N5S, N5A, N5K, N5L, N5M, N5D, N5H又はN5Y;
G6R,G6A,又はG6K;
P7A,P7L,P7V,P7K,またはP7R;
W8R;
D9A, D9G, D9K, D9L, D9T, D9N, D9F, D9H, D9M, D9P, D9Q, D9S, D9C, D9I, D9R, D9V又はD9R;
E10G, E10A, E10L, E10C, E10Q又は, E10S;
D11F, D11G, D11N, D11V, D11Y, D11H, D11K, D11L, D11P, D11S, D11T, D11W, D11I, D11M, D11A, D11C又はD11R
D12P;
M13R, M13S, M13V, M13A, M13F, M13G, M13L, M13T, M13Y, M13W, M13E又はM13K;
N17R, N17I, N17Y, N17V, N17K, N17T, N17S, N17Q, N17F, N17A, N17W, N17E又はN17H;
H18A, H18F, H18Q, H18T, H18V又はH18L;
K20Q又はK20R;
S21A,S21V,S21N又はS21F;
I22L,I22M,I22T,I22W又はI22V;
K23R又はK23T;
G24H, G24K, G24A, G24P, G24F, G24I, G24Q, G24R, G24S, G24T, G24Y又はG24N;
Y25H, Y25K, Y25L, Y25M, Y25N, Y25Q, Y25S, Y25V又はY25R;
K26F, K26H, K26T, K26C又はK26R;
A31K, A31N, A31Q, A31T, A31E, A31H, A31I, A31R, A31S, A31V, A31G又はA31Y;
K32R又はK32T;
G33K, G33Q, G33E, G33N, G33S, G33T, G33A又はG33R;
G34K,G34H,G34W又はG34R;
F35A, F35H, F35I, F35M, F35V, F35W, F35R又はF35L;
V36L, V36M, V36I, V36K, V36Q, V36R又はV36T;
K38H,K38N又はK38R;および
Y40I,Y40YRCG又はY40YR;、
から選択される。
1例において、親の抗菌性ポリペプチドが、デフェンシン(defensin)・ポリペプチド;より好ましくはアルファ・デフェンシン(defensin)、ベータ・デフェンシン(defensin)、又は昆虫(節足動物)デフェンシン(defensin)である。好ましくは、親のアミノ酸配列は、抗菌作用を示す。
本発明のポリペプチドのN-末端の拡張は、1乃至50のアミノ酸、好ましくは2乃至20のアミノ酸、特に3乃至15のアミノ酸から成るのが適切である。1例において、N-末端ペプチドの拡張は、Arg(R)を含んでいない。別の例においてN-末端ペプチドの拡張は、さらに下記に明示されているような、kex2又はkex様の開裂部位を含む。好ましい例において、N-末端の拡張は、以下、EAE,EE,DEそしてDDの1を含むN-末端の拡張など、少なくとも2のGlu(E)および/又はAsp(D)を含むペプチドである。
Kex2部位(たとえば、Methods in Enzymology Vol 185,ed.D.Goeddel,Academic Press Inc(1990),San Diego,CA,「Gene Expression Technology」)およびkex2-様部位は、幾つかのタンパク質のプロペプチドコード領域および熟成領域との間に見出される2塩基性認識部位(すなわち切断部位)である。特別な場合において、Kex2部位又はkex2様部位の挿入が、プロ・ペプチドの切断部位で正しいエンドペプチダーゼのプロセシングを改良を示し、その結果タンパク質の分泌水準が増大する。本発明の記載内容において、kex2又はkex2様部位に挿入が起こると、N-末端部の拡張において特定位置で切断の可能性が生じ、その結果、配列番号2から配列番号225のいずれか、又は配列番号226から配列番号251のいずれか、配列番号252から配列番号274のいずれかの1乃至40のアミノ酸と比較して、抗菌性ポリペプチドにおいて拡張することになる。
さらに本発明のポリペプチドが、融合されたポリペプチド又は開裂可能な融合ポリペプチドを含み、そこに別のポリペプチドが、本発明のポリペプチド又はその断片のN末端又はC末端で融合される。融合されたポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列(又はその1部)に別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(又はその1部)を融合することにより、生成される。融合ポリペプチドの生成技術は、技術的に周知であり、そしてこれらがフレーム内であり、融合ポリペプチドの発現が、同じプロモータおよびターミネータのコントロール下であるようポリペプチドをコードするコード配列を結合することを含む。
本発明のポリペプチドが、どのような属の微生物からも得ることができる。本発明の目的として、与えられた資源に加えて本明細書の使用される用語「から得られる」は、ヌクレオチド配列によりコード化されたポリペプチドが、資源からのヌクレオチド配列を挿入している資源又は菌株により生成されることを意味する。好ましい観点において、所定資源から得られるペプチドが、細胞外に分泌される。
これらの種の菌株は、American Type Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、およびAgricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL)など、公共的な多くの培養収集施設より容易にアクセスすることができる。
さらに本発明は、本発明のポリペプチドとしてコードするヌクレオチド配列を有するポリペプチドに関する。具体的に、本発明は、本発明のポリペプチドとしてコードするヌクレオチド配列から成るポリペプチドに関する。遺伝子コードの変性により、当業者は、本発明のそれぞれのペプチドをコードする幾つかのヌクレオチド配列を調製できることを、容易に認識することができよう。ヌクレオチドが、本発明のポリペプチドのアミノ酸をコードするコドンを構成することが、技術的に良く知られている。
さらに本発明は、コントロール配列と適合可能な条件下で、適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指令する1又は複数の配列に作用可能に連結される、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構成物に関する。本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、ポリペプチドの発現のために提供される種々の方法で操作することができる。ベクターに挿入する前にポリヌクレオチド配列の操作が、発現ベクターにより要望され、又は必要とされ得る。組み換えDNA法を使用してポリヌクレオチド配列を修飾する技術が、技術的に良く知られている。
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、転写シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む、組み換え発現ベクターに関する。上記の種々の核酸およびコントロール配列を、1又は複数の従来の制限部位を含む組み換え発現ベクターを生成するために一緒に連結し、発現ベクターへの、こうした部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にする。あるいは、本発明のヌクレオチド配列は、発現に適切なベクター中へヌクレオチド配列又は配列を含む核酸構成物を挿入することにより、発現させることができる。発現ベクターの生成において、コード配列を、発現に適切なコントロール配列にて作用可能に結合するように、コーデング配列がそのベクター内に配置される。
自発性複製のため、ベクターは、問題の宿主細胞中でベクターを自律的に複製できるよう、複製の開始点(origin)を含むことができる。複製の開始点(origin)は、細胞内で機能する自律的複製を介在するいずれかのプラスミド複製物であることができる。用語「複製の開始点」又は「プラスミド複製物」は、プラスミド又はベクターをin vivoにおいて複製できるようなヌクレオチド配列として、本明細書に明示されている。
さらに本発明は、ポリペプチドの組み換え生成物において都合よく使用される、本発明のポリヌクレオチドを含む、組み換え宿主細胞に関する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは宿主細胞に導入される、したがってそのベクターが、最初に記載したように染色体組み込み物として、又は自己複製の染色体外ベクターとして保持される。用語「宿主細胞」は、複製中に発生する変異化により親細胞に対し同一性のない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその資源に大幅に依存することになる。
さらに本発明は、
(a)野生型において、ポリペプチドを生成するために行われる条件の下、ポリペプチドを生成できる細胞を培養する工程;そして、
(b)そのポリペプチドを回収する工程、
を含む本発明のポリペプチドの生成方法に関する。
さらに本発明は、
(a)ポリペプチドを生成するために行われる条件の下、宿主細胞を培養する工程;そして、
(b)そのポリペプチドを回収する工程、
を含む本発明のポリペプチドの生成方法に関する。
さらに本発明は、ポリペプチドを回収可能な量にて発現および生成するように、本発明の抗菌作用を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で、形質転換された遺伝子導入植物、植物の1部、又は植物細胞に関する。ポリペプチドを、植物又は植物の1部から回収することができる。選択肢として、組み換えポリペプチドを含む植物又は植物の1部を、食物又は飼料を改良するため、たとえば、栄養価、味覚、そしてレオロジカルな特性、又は抗栄養因子の破壊を改良するためになどに使用することができる。
植物の1部分の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子、及び塊茎、並びにたとえば表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織などの植物の1部分を含む個々の組織である。
(a) ポリペプチドの産生のための実施条件の基、本発明の抗菌作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子導入植物、又は植物細胞を培養する工程;および、
(b) ポリヌクレオチドを回収する工程、
を含む、本発明のポリペプチド含む、本発明のポリペプチドを生成するための方法に関する。
さらに本発明は、本発明のポリペプチドを含む医薬組生物などの組生物に関する。好ましくは、組生物が、こうしたポリペプチドにおいて増強(enriched)されている。用語「増強された(enriched)」は、組生物の抗菌作用が、たとえば1.1の強化因子を用いて増大してきたことを示す。さらに組生物が、上記抗菌作用剤を示す別の抗菌性ポリペプチドなど、付加的な殺生剤又は生物スタテック薬剤など別の医薬作用剤を含むことができる。
さらに本発明は、抗菌作用を有するポリペプチドを使用する方法を対象としている。抗菌作用は、典型的に細菌、真菌(fungi)、酵母、又は藻類により感染を受ける遺伝子座にとって有効である。典型的に遺伝子座が、冷却水系、洗濯リンス用水などの水溶性系に、そして切削油、潤滑油、オイル分野などのオイル系などにあり、こうした系は、微生物を殺生する必要性か又は増殖を制御する必要性のいずれかである。しかしながら、本発明は、周知の抗菌性組成物が、木材、ラテックス、接着剤、クルー、紙、ボール紙、織物、レザー、プラスチック、コーキング、および食物の保護などに有効である。
本発明の化合物は、治療として投与するために種々の成形物に組み入れることができる。より具体的には、本発明の化合物が、医薬的に適切に受け入れ可能な担体、又は希釈材と組み合わせることにより、医薬組生物に成形され、そして錠剤、カプセル、粉末、顆粒物、軟膏、クリーム、フォーム(forms)、溶液、座薬、注入液、吸気、ゲル、微小球、ローション、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体又は気体の形状に調製し、成形することができる。このようにして、化合物の投与が、経口、直腸、非経口、腹腔、皮内、経皮的に、きょう膜内(intracheal)などの投与を含む、種々の方法にて行われる。本発明の抗菌性ポリペプチドは、投与後に全身作用が可能であり、又は移植部位で作用する投与量を保持するように作用する、移植物又は他の成形物を使用し局在化することができる。
本方法に使用するために、本発明の抗菌性ポリペプチドが、他の医薬剤としての作用剤と、具体的には抗菌剤を伴い生成することができる。関心のある他の作用剤は、技術的に知られた多彩な抗生物質を含む。抗生物質の分類は、ペニシリンG、ペニシリンV、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリンなどのペニシリン;たとえばセファクロア(cefaclor)、セファゾリン(cefazolin)、セフロキシム(cefuroxime)、モクサラクタム(moxalactam)などのベータラクタマーゼ阻害剤としてセファロスポリン(cephalosporins)と組み合わせたペニシリン;カルバペネムス(carbapenems);モノバクタムス(monobactams)、アミノグリコシドス(aminoglycosides)、テトラサイクリン(tetracyclines);マクロリデス(macrolides);リンコマイシン(liincomycins);ポリミキシン(polymyxins);スルホンアミド(sulfonamides);キノロン(quinolones);クロラムフェニコール(cloramphenical);メトロニダゾル(metronidazole);リンコマイシン(lincomycins)、トリメトプリム(trimethoprim);バンコマイシン(vancomycin);などがあげられる。
本発明の抗菌性ペプチドが、技術的に知られた従来の方法を使用し、In vitroの合成により調製することができる。種々の商業的合成装置が、たとえば、Applied Biosystems Inc.Beckmanらにより自動化されている合成装置を利用することができる。合成装置を使用することにより、天然に生成するアミノ酸が、非天然のアミノ酸、具体的にはたとえば、D-アラニンおよびD-イソロイシンなどのD-異性体(又はD-型)、ジアステロイソマー、異なる長さや機能性を有する側鎖と置換することができる。具体的な配列および調製方法が、有用性のある、経済的で、要求される純度どにより決定されることになる。
さらに本発明は、動物の飼料中に抗菌作用を有するポリペプチドを使用するための方法、および本発明の抗菌性ペプチドを含む食物組生物および食物添加物を対象とする。用語「動物」はヒトを含む全ての動物を含む。動物の例は、牛、ヒツジ、およびウマなどの非反芻動物、および反芻動物である。非反芻動物が、単一胃の動物で、たとえば、ブタ又はイノシシ(子ブタ、成長したブタ、およびメスブタを含むがそれに限定されない)、七面鳥およびトリなどの家禽類(ブロイラー・トリ、レイアーを含むがそれに限定されない)、子牛、および魚(サケを含むがそれに限定されない)を含む。
(a) 食物に直接添加する(または栄養タンパク質の処理過程に直接添加)、又は
(b) 後に食物に添加する(又は処理過程において使用)食物添加物又は食物混合物など1又は複数の中間組生物の生成に使用、
を可能にする。上記の純度は、上記の(a)を用いても(b)を用いたとしても、元の抗菌性ポリペプチド調製物の純度を指している。
具体的例において、栄養タンパク質源が、ビート、糖ビート、ほうれん草又はキノアなどのクルシフェラセアエ(Cruciferaceae)ファミリーの1又は複数の植物からの物質である。栄養タンパク質源の別の例は、ナタネナ、およびキャベツである。ダイズが好ましい栄養資源である。栄養タンパク質源の別の例は、大麦、小麦、ライ麦、カラス麦、ロウモロコシ(cor)、稲、およびモロコシなどの穀物である。
さらに本発明は以下の実施例により記載され、本実施例が、本発明の範囲を限定するものとして構成されたものではない。
配列番号1の変異物である3種の抗菌性ポリペプチドの抗菌作用を試験した。異なる微生物に対し最少有効濃度法(MEC、μg/mLとして表現される)を、3つのプレクタシン(plectasin)の変異物であるY40YR,N17R,およびY25Rを使用し、the book of Methods in Molecular Biology、Vol78,Antibacterial peptide protocol William M,Human Pressに記載された手順に従って行った。プレクタシン(plectasin)の変異物「Y40YR」が、プレクタシン(plectasin)アミノ酸配列の末端で、アルギニン残基を付加することで構成されている。得られた結果は、細菌であるバシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびブドウ球菌・エピダミデス(Staphylococcus epidermidis)に対抗する野生型プレクタシン(plectasin)(配列番号1)と比較された3種の抗菌ペプチド全てに、改良された作用を示した。
配列番号1(プレクタシン(Plectasin))の変異物である、一連の抗菌性ポリペプチドは、S.cerevisae中で発現させることにより、そしてブドウ球菌・カモサス(Staphylococcus camosus) ATCC51365に対する抗菌作用には、酵母の形質転換物の上澄みを選別することにより、抗菌作用を試験をした。
配列番号1の変異物である一連の抗菌性ポリペプチドを、TAP方法で試験した。TAPS法の使用は、標的細胞を殺生するか又は増殖を阻害できるペプチドをコードする新規又は改良した遺伝子を同定することができる(PCT出願 WO 2004/033715を参照)。Tans Acting Peptide Systemの頭文字であるTAPS法は、指示菌株に対しその作用をトランス(trans)にスクリーニングすることに基づいている。この方式の利点は、抗菌ペプチドを、グラム陰性菌の大腸菌中で発現させ、そしてその抗菌作用を、グラム陰性菌、グラム陽性菌、又は真菌類(fungi)を含む異なる菌類上にて、モニターすることに基づいている。さらにTAPSが、宿主細胞中でジスルフィド結合を含む正しく折りたたまれたAMPsを生成し、これにより抗菌作用を保持する確率を提示する。
TAP方法において、および/又は酵母菌方式において改良された作用を示した、プレクタシン(plectasin)の野生型(配列番号1)およびプレクタシン(plectasin)の5種の変異物が、発現および精製された。最少阻害濃度(Minimal Inhibitory Concentration(MIC,μg/mL)を、NCCLSの指針(Clinical and Laboratory Standards Institute;Formerly known as National Committee for Clinical and Laboratory Standards)に従って抗菌作用に対する試験を決定した。その結果を、ブドウ球菌アウレウス(Stapylococcus aureus)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびバシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)に対し野生型プレクタシン(plectasin)と比較すると、プレクタシン(plectasin)変異物全てが、作用を改良したことを示した。
プレクタシン(plectasin)の野生型(配列番号1)およびプレクタシン(plectasin)のいく種類かの変異物を発現させ、そして精製した。最少阻害濃度(Minimal Inhibitory Concentration(MIC)を、CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute;Formerly known as National Committee for Clinical and Laboratory Standards)からNCCLSの指針に従って抗菌作用に対する試験を決定した。
A: スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、ATCC 29213
B: スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、ATCC 25923
C: スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、ATCC 29737
D: スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、MRSA ST5(2001)、multi-resistant clinical human isolate from Statens Serum Institut,Denmark;
E: スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、MRSA ST80(2003)、multi-resistant clinical human isolate from Statens Serum Institut,Denmark;
0:>100%のプレクタシン(Plectasin))野生型MIC;
1:80-100%のプレクタシン(Plectasin))野生型MIC;
2 : 50-80%のプレクタシン(Plectasin))野生型MIC;
3 : < 50%のプレクタシン(Plectasin))野生型MIC;
本発明の多数の抗菌ペプチドを、以下に記載されたスタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)の異なる6種の菌株に対し試験した。
スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、ATCC 29213、MSSA、NCCLS標準菌株
スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、ATCC 25923、MSSA、NCCLS標準菌株
スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、ATCC 29737、MSSA;
スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、E33235、MSSA;
スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、698-01、MRSA ST5, Str, Kan,Oxa;
スタヒロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、566-03、MRSA ST80、Oxa,Tet,Fus,Kan;
にて暴露した。すべてのペプチドを精製し、HPLCにて定量化し、そして濃縮されたペプチド(>160μg/mL)を、ペプチド希釈緩衝液(0.1%BSA,0.01%の酢酸)中で160μg/mLに希釈した。
隠れマルコフモデル・プロファイル(HMMプロファイル)を使用する配列の分析は、自由に入手可能で、良く知られたソフトウエア・パッケイジであるHMMERを使用し、インターネットにおけるオンラインか又は、構内コンピュターのいずれかで行うことができる。最新版は、2003年10月よりのHMMER2.3.2である。
[・デフェンシン(defensin)・ベータ又は「ベータ・デフェンシン(defensin)」アクセス番号:PF00711;
・デフェンシン(defensin)・propep「デフェンシン(defensin)・プロペプチド」アクセス番号:PF00879;
・デフェンシン(defensin)・1又は「哺乳動物のデフェンシン(defensin)」アクセス番号:PF00323;
・デフェンシン(defensin)・2又は「節足動物のデフェンシン(defensin)」アクセス番号:PF01097
・ ガンマー・チオニン又は「ガンマー・チオニン・ファミリー」アクセス番号:PF00304.]
の1に属する場合、アミノ酸配列は、本発明によるデフェンシン(defensin)である。
配列の分析が、端末でhmmpfamプログラムを使用し実施された時、PFAMデータ・ベースからHMMプロファイルを得ること(ダウンロード)が必要である。2のプロファイルは、それぞれのファミリーに対し存在する;xxxが総合検索に対し.hmmであり、そして局所検索に対しxxx fs.(「xxx」はファミリーの名称)である。それは、上記5つのファミリー対して総計10個のプロファイルを作成する。
Claims (17)
- 配列番号2の1から40のアミノ酸:
G-X1-G-C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-C-H-X12-X13-C-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-G-G-X21-C- X22-X23-X24-X25-X26-X27-C-X28-C-X29;
と少なくとも80%の同一性を有し、
ここで、
[ X1 = F,L,W又はI;好ましくはX1= F ;
X2 = N,R,Q,V,G,S,A,K,L,M,D,H又はY ;好ましくはX2 = N,R,Q,V,G,S,A,K 又はY ;,
X3 = G,R,A又はK ; 好ましくは X3 = G ;
X4 = P,A,L,V,K又はR ; 好ましくは X4 = P,K又はR ;
X5 = W又はR ;
X6 = D,A,G,K,L,T,N,F,H,M,P,Q,S,C,I,R,V又はY ;好ましくは X6 = D,A,G,K,L,T,N,F, H,M,P,Q,S,V又はY ;
X7 = E,G,A,L,C,Q又はS ; 好ましくは X7 = E,G又はS ;
X8 = D,F,G,N,V,Y,H,K,L,P,S,T,W,I,M,A,C又はR ;好ましくはX8 = D,F,G,N,V,Y,H,K,L, P,S,T,W,I,M又はR ;
X9 = D又はP ; 好ましくは X9 = D ;
X10 = M,R,S,V,A,F,G,L,T,Y,W,E又はK ;好ましくは X10 = M,R,S,V,G,Y,L,F,T,W又はK ;
X11 = Q,R,L,F,G,H,S,A,C,I,K,M,P,T,V,W又はY ;好ましくはX11 = Q,R,L,F,G,H,S,K又はY ;
X12 = N,R,I,Y,V,K,T,Q,S,A,W,E又はH ;
X13 = H,A,F,Q,T,V又はL ;好ましくはX13 = H又はL ;
X14 = K,Q又はR ;好ましくはX14 = K又はR ;
X15 = S,A,V,N又はF ;
X16 = I,L,M,T,W又はV ;好ましくはX16 = I,L又はV ;
X17 = K,T又はR ;
X18 = G,H,K,A,P,F,I,Q,R,S,T,Y又はN ;好ましくはX18 = G,H,R,K又はN ;
X19 = Y,H,K,L,M,N,Q,S,V又はR ;好ましくはX19 = Y又はR ;
X20 = K,F,H,T,C又はR ;好ましくはX20 = K又はR ;
X21 = Y,F,R,A,H,L,M,S又はW ;好ましくはX21 = Y,F,R又はW ;
X22 = A,K,N,Q,T,E,H,I,R,S,V,G又はY ;好ましくはX22 = A,K,N,Q,T,S又はY ;
X23 = K,R又はT ;好ましくはX23 = K又はR ;
X24 = G,K,Q,E,N,S,T,A又はR ;好ましくはX24 = G,K,Q,A又はR ;
X25 = G,K,H,W又はR ;好ましくはX25 = G,K又はR ;
X26 = F,A,H,I,M,V,W,R又はL ;好ましくはX26 = F又はL ;
X27 = V,L,M,I,K,Q,R又はT ;好ましくはX27 = V,L,M又はT ;
X28 = K,H,N又はR ;好ましくはV28 = K又はR ;
X29 = Y,I,YRCG又はYR ;好ましくはX29 = Y又はYR ]、
であり、そして配列番号1の1から40のアミノ酸とほぼ100%の同一性を有する、
アミノ酸配列を含む抗菌作用を有するポリペプチド。 - アミノ酸配列が、配列番号2の1から40のアミノ酸と少なくとも85%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、又は配列番号2の1から40のアミノ酸と少なくとも95%の同一性を有する請求項1記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含む請求項1記載のポリペプチド。
- 配列番号3から配列番号225の何れか、若しくは配列番号226から配列番号251の何れか、又は配列番号252から配列番号274の何れかのアミノ酸配列を含む、請求項1乃至3の何れか1項記載のポリペプチド。
- 抗菌作用を有しそして6個のシステイン残基を含む、配列番号2のアミノ酸配列、又はその断片から成る、請求項1乃至3の何れか1項記載のポリペプチド。
- 抗菌作用を有しそして6個のシステイン残基を含む、配列番号3から配列番号225の何れか、若しくは配列番号226から配列番号251の何れか、又は配列番号252から配列番号274の何れかのアミノ酸配列、又はその断片から成る請求項5記載のポリペプチド。
- 請求項1乃至6の何れか1項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 発現する宿主細胞中でポリペプチドの産生を指令する1又は複数のコントロール配列に、作用可能に結合した請求項7記載のポリヌクレオチドを含む核酸構成物。
- 請求項8記載の核酸構成物を含む組み換え発現ベクター。
- 請求項8記載の核酸構成物を含む組み換え宿主細胞。
- (a)ポリペプチドを産生するための実施条件下で、請求項10記載の組み換え宿主細胞を培養し、そして(b) ポリペプチドを回収することを含む、請求項1乃至6記載のいずれか1項記載のポリペプチドの生成方法。
- 請求項1乃至6のいずれか1項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された遺伝子導入の植物、その植物の部分、又はその植物の細胞。
- 請求項1乃至6のいずれか1項記載にて明示された抗菌性ポリペプチドを含む組成物。
- 請求項1乃至6のいずれかで明示された抗菌性ポリペプチドと菌細胞とを接触させることを含む、菌細胞の殺生又はその増殖の阻害方法。
- 家畜又はヒトの治療の薬剤若しくは抗菌剤、又は予防剤として使用する、請求項1乃至6の何れかで明示された抗菌性ポリペプチド。
- 細菌感染の治療又は予防として使用する、家畜又はヒトの治療剤を調製する請求項1乃至6の何れかに明示された抗菌性ポリペプチドの使用。
- 動物の食餌に請求項1乃至6の何れかに明示された少なくとも1の抗菌性ポリペプチドの使用。
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