JP2012250940A

JP2012250940A - Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物

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Publication number: JP2012250940A
Application number: JP2011125440A
Authority: JP
Inventors: Kyoko Obara; 恭子小原; Akira Matsumori; 昭松森; Tomohiro Nishimura; 知裕西村; Michinori Obara; 道法小原
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science; Kumamoto University NUC
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science; Kumamoto University NUC
Priority date: 2011-06-03
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2012-12-20

Abstract

【課題】本発明は、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、インターフェロンα及びピクノジェノールを含む、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物、あるいは、ピクノジェノールを含む、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物であって、インターフェロンα投与を受けるＣ型肝炎患者に投与されることを特徴とする、前記組成物、に関する。
【選択図】なし

Description

本願発明は、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物に関する。

Ｃ型肝炎ウイルス
日本最大級の感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染者は、国内に１５０万人以上存在すると言われている。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓ）（以下、「ＨＣＶ」という。）は、１９８９年に、輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された。ＨＣＶは、エンベロープを有する直径３５−６５ｎｍの球状粒子の１本鎖プラス鎖型ＲＮＡウイルスであり、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のヘパチウイルス属（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）に属する。

ＨＣＶの伝播は血液を介して行われる。肝細胞の一部のリンパ球を標的細胞とし、宿主の免疫機構やインターフェロンからエスケープして持続感染を引き起こす。ＨＣＶの宿主免疫機構回避の機序はいまだ明らかではなく、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも、持続感染が成立することが多い。ＨＣＶ感染者の症状は、通常肝炎から始まり、上記持続感染により、多くの場合、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌へと進展する。肝細胞癌まで進展した場合、手術により患部を摘出しても、非癌部で引き続き持続感染が起こるため、肝細胞癌再発の危険性は高い。

ＨＣＶ感染者において、ＨＣＶの産生や増殖を抑制する方法、又はＨＣＶを消失させる方法としては、従来、インターフェロン療法が有効とされている。症状の進展を抑制して肝細胞癌の発症を遅延させることを目的として、インターフェロンの少量継続投与が行われている。インターフェロン療法は、抗ウイルス薬であるリバビリンの併用により効果が高まる。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いたインターフェロンのＰＥＧ化（ＰＥＧ化）などによって治療成績が改善することが報告されている。現在、行われているインターフェロン・リバビリン併用療法の例として下記のものが含まれる。

ＰＥＧ−ＩＦＮα２ａ（ペガシスＰｅｇａｓｙｓ（登録商標））＋リバビリン（コペガスＣｏｐｅｇｕｓ（登録商標））
ＰＥＧ−ＩＦＮα２ｂ（ペグイントロンＰｅｇｉｎｔｒｏｎ（登録商標））＋リバビリン（レベトールＲｅｂｅｔｏｌ（登録商標））
インターフェロン療法を用いても約５割のＨＣＶ感染者は、依然として肝細胞癌発症の危険性を抱えたままである。また、インターフェロンは、脱毛、食欲不振、鬱、吐き気、腹痛、血小板減少などの副作用を生じる場合がある。強い副作用のため、治療を断念する患者も存在する。副作用が少なく効果の高いＨＣＶ治療法の開発が望まれていた。

ピクノジェノール
ピクノジェノールは、フランス海岸松の樹皮などの植物材料から抽出される成分であり、オリゴメリックプロアントシアニジン（プロアントシアニジン、シアニジン、プロシアニジンとも呼ばれる）を主成分とし、その他多種類の有機酸を含む、ポリフェノール化合物混合物である。「ピクノジェノール」の名称は、本来、スイスのホーファー・リサーチ社の登録商標であるが、現在は、一般に、フランス海岸松樹皮抽出物に対して使用されている。

ピクノジェノールは、強力な抗酸化作用及び抗炎症作用を有し、抗炎症剤、抗酸化剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤として使用できることが知られている。例えば、非特許文献１は、ピクノジェノールが免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の宿主細胞への結合を抑制するのみでなく、インビトロの条件下で、感受性細胞に移行した後の複製も抑制することを記載している。

また、心臓・循環器系に対する生理活性としては、冠動脈の拡張及び血流の増大作用、心筋への血流増大作用を有する。このことからさらに、末梢血管の血流増加作用、鬱血した心筋の血流改善、血管系不整脈の正常化等の作用を示す。その結果、穏やかな脈拍頻度に復する作用、虚血再環流による心障害保護などの活性を示す。特許文献１は、ピクノジェノールが、心筋組織の壊死及び心筋細胞浸潤などを抑制することに基づき、ピクノジェノールを含む心筋炎の予防、治療又は改善用組成物を記載している。しかしながら、当該特許文献には、ピクノジェノールによるＨＣＶ産生抑制作用に関する具体的な記載はない。

特許文献２は、ブルーベリー葉の抗ＨＣＶ活性有効性分がプロシアニジンであることを特定したことに基づき、プロシアニジンからなる組成物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス複製抑制剤を記載している。プロシアニジンはピクノジェノールの主成分の１種である。しかしながら、当該文献には、インターフェロン療法においてピクノジェノールを併用することについて記載も示唆もしていない。

特開２００５−２３９５８１特開２０１０−５９０９６

Jpn. J. Infect. Dis., 61, 279-285, 2008

インターフェロン療法によっても約５割のＨＣＶ感染者は、依然として肝細胞癌発症の危険性を抱えたままである。また、インターフェロンは、脱毛、食欲不振、鬱、吐き気、腹痛、血小板減少などの副作用を生じる場合がある。強い副作用のため、治療を断念する患者も存在する。

本願発明は、インターフェロンαの抗ＨＣＶ効果を高め、インターフェロンの使用量を減少させるための組成物、及び方法を提供するものである。

本発明者らは、Ｃ型肝炎を予防、治療又は改善するための方法において、インターフェロンαとともに、ピクノジェノールを投与すると、インターフェロンαの効果が高まり、ＨＣＶの感染及び／又は複製が有効に抑制できることを見出し、本発明を想到した。

限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１］
インターフェロンα及びピクノジェノールを含む、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物。

［態様２］
ピクノジェノールを含む、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物であって、インターフェロンα投与を受けるＣ型肝炎患者に投与されることを特徴とする、前記組成物。

［態様３］
Ｃ型肝炎ウイルスの感染又は複製を抑制する、態様１又は２に記載の組成物。
［態様４］
さらにリバビリンを含む、あるいは、リバビリンとともに投与される、態様１ないし３に記載の組成物。

［態様５］
経口摂取される、態様１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
［態様６］
医薬組成物又は食品組成物である、態様１ないし５に記載の組成物。

本発明において、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物が提供される。本願発明の組成物は、インターフェロン療法においてピクノジェノールを併用することにより、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善効果を相乗的に高めるものである。本明細書の例えば、実施例３、図７に記載の通り、ピクノジェノールをインターフェロンαと併用することで、ＨＣＶ−レプリコン細胞を用いた、ＨＣＶ複製活性測定において、インターフェロンによる抗ＨＣＶ複製効果を約２倍増強することが判明した。これにより、インターフェロン使用量を半分にすることができる。

さらに、ＨＣＶの感染抑制効果については、ピクノジュノールの主成分であるプロシアニジンでＩＦＮとの相加効果が観察された。
ピクノジェノールは、特に経口摂取の安全が確認されており、アンチエイジングサプリメントとして世界中で販売されている。本発明により、例えば、既に安全性の確認されたサプリメントであるピクノジェノールを用いてインターフェロン療法の効率化が期待できる。

図１は、ピクノジェノール処理（７２時間）によるＨＣＶ−レプリコン細胞系Ｒ６に対する効果を示す。図１Ａは、ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ；ＲｅｌａｔｉｖｅＬｕｃｉｆｅｒａｓｅｕｎｉｔ）を用いたレポーターアッセイによりＨＣＶ複製活性を調べた結果である。未処理の場合の複製活性を１００％とする。図１Ｂは、ＷＳＴ８を用いて細胞内脱水素酵素により還元されて生成する水溶性のホルマザンを４５０ｎｍの吸光度で直接測定することにより細胞代謝活性を調べた結果を示す。未処理の場合の細胞活性を１とする。ピクノジェノールは実験に用いた５０μｇ／ｍＬの範囲ではＲ６細胞に対する細胞毒性がないことが確認された。対照として、インターフェロンα １ＩＵ／ｍＬ（ＩＦＮ１）及び１０ＩＵ／ｍＬ（ＩＦＮ１０）で７２時間処理した場合の効果も示した。図２は、ピクノジェノール処理（７２時間）によるＨＣＶ−レプリコン細胞系ＦＬＲ３−１に対する効果を示す。図２Ａは、ルシフェラーゼ活性を用いたレポーターアッセイによりＨＣＶ複製活性を調べた結果である。未処理の場合の複製活性を１００％とする。図２Ｂは、ＷＳＴ８を用いて細胞内脱水素酵素により還元されて生成する水溶性のホルマザンを４５０ｎｍの吸光度で直接測定することにより細胞代謝活性を調べた結果を示す。未処理の場合の細胞活性を１とする。ピクノジェノールは実験に用いた５０μｇ／ｍＬの範囲ではＦＬＲ３−１細胞に対する細胞毒性がないことが確認された。対照として、インターフェロンα １ＩＵ／ｍＬ（ＩＦＮ１）及び１０ＩＵ／ｍＬ（ＩＦＮ１０）で７２時間処理した場合の効果も示した。図３は、ピクノジェノール処理によるＨＣＶ−レプリコン細胞系ＪＦＨ−１に対する効果を示す。具体的には、ルシフェラーゼ活性を用いたレポーターアッセイによりＨＣＶ複製活性を調べた結果を示した。未処理の場合の複製活性を１００％とする。ピクノジェノールを１０μｇ／ｍＬの濃度で用いた場合でも、ＨＣＶ複製活性は未処理の場合の７０％保持されている。対照として、インターフェロンα １０ＩＵ／ｍＬで７２時間処理した場合の効果も示した。図４は、ピクノジェノール処理後のＨＣＶ−レプリコン細胞系Ｒ６、ＦＬＲ３−１及びＪＦＨ−１における、ＨＣＶＮＳ３タンパク質の発現をウエスタンブロット分析で調べた結果を示す。Ｒ６細胞及びＦＬＲ３−１細胞では、ピクノジェノールで７２時間処理後、ＨＣＶＮＳ３タンパク質の発現が有意に減少したが、ＪＦＨ−１細胞では未処理の場合と比較して有意な減少は観察されなかった。対照として、インターフェロンα １０ＩＵ／ｍＬで７２時間処理した場合の効果も示した。図５は、Ｒ６細胞をピクノジェノール及びインターフェロンαで２４時間処理した場合の効果を示す。ｎｏｎ：未処理ＰＧ１、ＰＧ５、ＰＧ１０、ＰＧ２０：各々ピクノジェノール１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び２０μｇ／ｍＬＩＦＮ１、ＩＦＮ５、ＩＦＮ１０：各々インターフェロンα １ＩＵ／ｍＬ、５ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ図５Ａは、ルシフェラーゼ活性を用いたレポーターアッセイによりＨＣＶ複製活性を調べた結果である。縦軸は未処理の場合のルシフェラーゼ活性を１００％とする。ＰＧ５＋ＩＦＮ５で、各々単体で使用した場合よりも相乗的に強力なＨＣＶ複製抑制効果を示した。図５Ｂは、ＷＳＴ８を用いて細胞内脱水素酵素により還元されて生成する水溶性のホルマザンを４５０ｎｍの吸光度で直接測定することにより細胞代謝活性を調べた結果を示す。縦軸は未処理の場合の細胞活性を１００％とする。ピクノジェノール、インターフェロンα及び双方の組み合わせは実験に用いた濃度範囲ではＲ６細胞に対する細胞毒性がないことが確認された。図６は、Ｒ６細胞をピクノジェノール及びインターフェロンαで４８時間処理した場合の効果を示す。横軸及び縦軸は図５と同様である。図６Ａは、ルシフェラーゼ活性を用いたレポーターアッセイによりＨＣＶ複製活性を調べた結果である。ＰＧ５＋ＩＦＮ５で、各々単体で使用した場合よりも相乗的に強力なＨＣＶ複製抑制効果を示した。図６Ｂは、ＷＳＴ８を用いて細胞内脱水素酵素により還元されて生成する水溶性のホルマザンを４５０ｎｍの吸光度で直接測定することにより細胞代謝活性を調べた結果を示す。ピクノジェノール、インターフェロンα及び双方の組み合わせは実験に用いた濃度範囲ではＲ６細胞に対する細胞毒性がないことが確認された。図７は、Ｒ６細胞をピクノジェノール及びインターフェロンαで７２時間処理した場合の効果を示す。横軸及び縦軸は図５と同様である。図７Ａは、ルシフェラーゼ活性を用いたレポーターアッセイによりＨＣＶ複製活性を調べた結果である。ＰＧ５＋ＩＦＮ５で、各々単体で使用した場合よりも相乗的に強力なＨＣＶ複製抑制効果を示した。図７Ｂは、ＷＳＴ８を用いて細胞内脱水素酵素により還元されて生成する水溶性のホルマザンを４５０ｎｍの吸光度で直接測定することにより細胞代謝活性を調べた結果を示す。ピクノジェノール、インターフェロンα及び双方の組み合わせは実験に用いた濃度範囲ではＲ６細胞に対する細胞毒性がないことが確認された。図７より５ＩＵ／ｍＬのＩＦＮα処理（ＩＦＮ５）はＨＣＶ複製を４７％抑制したのに対し、さらに、５μｇ／ｍＬのピクノジェノールを加えた場合（ＩＦＮ５＋ＰＧ５）は、９７％抑制した。図８は、図５Ａ、図６Ａ及び図７Ａに示したＨＣＶ複製活性を、２４時間−７２時間の処理時間の経時変化として示した図である。図８Ａの縦軸は、ルシフェラーゼ活性（単位ＲＬＵ）である。図８Ｂは、未処理の場合を１００％として比較した図である。図９は、図５Ａ、図６Ａ及び図７Ａに示した細胞代謝活性を、２４時間−７２時間の処理時間の経時変化として示した図である。図９Ａの縦軸は、４５０ｎｍの吸光度である。図９Ｂは、未処理の場合を１００％として比較した図である。図１０は、Ｒ６細胞におけるピクノジェノール、インターフェロンα及びリバビリンの併用（２４時間）の相互作用を解析した結果を示す。ＲＢＶ：リバビリン図１０Ａは、ルシフェラーゼ活性を用いたレポーターアッセイによりＨＣＶ複製活性を調べた結果である。未処理の場合のルシフェラーゼ活性を１００％とする。ＩＦＮ１ＩＵ／ｍＬで約ＩＣ５０であり、ＲＢＶ５μｇ／ｍＬでＨＣＶ複製活性は約８０％に、そして、ＩＦＮ１＋ＲＢＶ５で約５２％に抑制される。これに対し、ＩＦＮ１＋ＲＢＶ５＋ＰＧ１０で、ＨＣＶ複製活性は約２６％にまで抑制された。ピクノジェノールは特に、インターフェロン及びリバビリンとの併用により高い効果が期待される。図１０Ｂは、ＷＳＴ８を用いて細胞内脱水素酵素により還元されて生成する水溶性のホルマザンを４５０ｎｍの吸光度で直接測定することにより細胞代謝活性を調べた結果を示す。未処理の場合の細胞活性を１００％とする。ピクノジェノール、インターフェロンα、リバビリンは実験に用いた濃度範囲ではＲ６細胞に対する細胞毒性がないことが確認された。図１１は、Ｒ６細胞におけるピクノジェノール、インターフェロンα及びリバビリンの併用（４８時間）の相互作用を解析した結果を示す。ＲＢＶ：リバビリン図１１Ａは、ルシフェラーゼ活性を用いたレポーターアッセイによりＨＣＶ複製活性を調べた結果である。未処理の場合のルシフェラーゼ活性を１００％とする。ＩＦＮ１ＩＵ／ｍＬでＨＣＶ複製活性は約３６％に、ＲＢＶ５μｇ／ｍＬで約５３％に、そして、ＩＦＮ１＋ＲＢＶ５で約１７％に抑制される。これに対し、ＩＦＮ１＋ＲＢＶ５＋ＰＧ１０で、ＨＣＶ複製活性は約８％にまで抑制された。ピクノジェノールは特に、インターフェロン及びリバビリンとの併用により高い効果が期待される。図１１Ｂは、ＷＳＴ８を用いて細胞内脱水素酵素により還元されて生成する水溶性のホルマザンを４５０ｎｍの吸光度で直接測定することにより細胞活性を調べた結果を示す。未処理の場合の細胞活性を１００％とする。ピクノジェノール、インターフェロンα、リバビリンは実験に用いた濃度範囲ではＲ６細胞に対してほぼ細胞毒性がないことが確認された。図１２は、ＨＣＶ感染細胞におけるピクノジェノール、プロシアニジン及びインターフェロンαの感染抑制効果を示す。ＰＳ：プロシアニジンリアルタイム検出ＰＣＲを用いて細胞から抽出したＲＮＡ中のＨＣＶのコピー数（図１２）を調べた。図１２に示されるように、ＩＦＮ単独使用の場合と比較してもＰＳ２５（μｇ／ｍＬ）と併用した方が、細胞中のＨＣＶ−ＲＮＡ量が約５０％減少した。

以下、本発明を実施するための形態を説明する。
本発明は、インターフェロンα及びピクノジェノールを含む、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物に関する。

本発明は、また、ピクノジェノールを含む、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物であって、インターフェロンα投与を受けるＣ型肝炎患者に投与されることを特徴とする、前記組成物に関する。

ピクノジェノール
本発明における「ピクノジェノール」は、フランス海岸松（学名：ＰＩＮＵＳＰＩＮＡＳＴＥＲ）と呼ばれる松の樹皮を溶媒を用いて抽出することにより得られる成分を指す。ピクノジェノールは、通常、オリゴメリックプロアントシアニジン（プロシアニジン（ＰＳ）、プロアントシアニジン、シアニジンとも称される）及び有機酸を含む混合物であり、原料及び抽出方法によりその組成は異なる。好ましくは、少なくとも５０％はプロシアニジンを含む。

ピクノジェノールの抽出に用いられる溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールのようなアルコール；酢酸エチルエステルのような低級アルキルエステル；その他、エチルエーテル、アセトン、酢酸などの公知の水溶性溶媒を挙げることができる。ピクノジェノールは、特に、エタノールを用いて抽出されたものであることが好ましい。

ピクノジェノールは、上記の方法により得られた抽出液をそのまま用いてもよいが、この抽出液から、例えば、減圧乾燥、凍結乾燥等の公知の乾燥方法により得られた植物エキス乾燥物であってもよい。また、抽出液の濃縮物であってもよい。

またピクノジェノールは、ホーファー・リサーチ株式会社（商品名：Ｐｙｃｎｏｇｅｎｏｌ（登録商標））、株式会社東洋新薬（商品名：フラバンジェノール（登録商標）などから市販されており、市販品を使用してもよい。

さらに、本発明におけるピクノジェノールとインターフェロンαとの併用による効果は、ピクノジェノールの主成分であるプロシアニジンを使用した場合でも同様の効果が得られると考えられる（図１２）。よって、本発明において「ピクノジェノール」の使用は、その主成分であるプロシアニジンを使用する態様を含む。

インターフェロンα
本発明は、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善のための方法において、インターフェロンαとともに、ピクノジェノールを投与すると、インターフェロンαの効果が高まり、ＨＣＶの感染及び／又は複製が有効に抑制できる、という発見に基づく。

インターフェロンαによる治療は周知であり、特に限定されない。限定されるわけではないが、インターフェロンαは好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によりＰＥＧ化（ペグ化）されている。本発明の方法に使用しうるインターフェロンαの例として、ＰＥＧ−ＩＦＮα２ａ（ペガシスＰｅｇａｓｙｓ（登録商標））、ＰＥＧ−ＩＦＮα２ｂ（ペグイントロンＰｅｇｉｎｔｒｏｎ（登録商標））が含まれる。

インターフェロンαは一般には注射（皮下注射、皮内注射、筋肉内注射）により投与されることが多い。一方、ピクノジェノールは好ましくは経口投与される。よって、本発明において、ピクノジェノールは、好ましくはインターフェロンαとは別の組成物として投与される。あるいは、インターフェロンαとピクノジェノールの双方を含む組成物としてもよい。

リバビリン
本発明において、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善するための方法において、ピクノジェノールの投与により、インターフェロンαとリバビリンの併用による効果も高める。よって、本発明の組成物は、さらにリバビリンを含む、あるいは、リバビリンとともに投与される、ことが好ましい。

本明細書において、「リバビリン」とは、多数のウイルスに効果を示す抗ウイルス薬で、現在日本では、Ｃ型肝炎に対して認可されている。経口剤としてインターフェロン（注射）とともに用いる方法が標準的治療法である。

「リバビリン」は、ＩＵＰＡＣ命名法による物質名が、１−［（２Ｒ、３Ｒ，４Ｓ、５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−カルボキサミドであり、以下の式Ｉ構造を有する。

式Ｉ

リバビリンは、「コペガスＣｏｐｅｇｕｓ（登録商標）」「レベトールＲｅｂｅｔｏｌ（登録商標）」などが市販されており、これらを使用することも可能である。
医薬組成物
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤等と配合し、一般的な形態の製剤とされる。

賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類；バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、；結晶セルロース等の各種セルロース類；無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。

結合剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられ
る。

崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。

潤沢剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。
付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトール等が挙げられる。

製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、トローチ剤、フラッシュメルト錠剤等の経口投与剤；外用剤（経皮パッチ、鼻腔内スプレー剤など）、座剤等の非経口投与剤等などの各種製剤形態を挙げることができる。好ましくは経口投与剤である。

製剤中のピクノジェノールの含有量は、投与対象の年齢、性別、症状、製剤の形態、投与経路、期待される効果などにより異なり一概に定めることはできないが、１日投与量が体重１ｋｇ当たり、０．１〜１０ｍｇ程度となる量含まれていることが好ましく、１〜２ｍｇ／ｋｇ程度となる量含まれていることがより好ましい。例えば、１日３回投与する製剤であれば、１剤中にはこの３分の１の量が含まれていればよい。

また製剤とする場合の、組成物中のピクノジェノールの含有比率としては、例えば１〜１５重量％程度、好ましくは５〜１０重量％程度の比率を挙げることができる。
本明細書中の実施例においてピクノジェノールは５０μｇ／ｍＬの濃度で培養細胞に投与しても細胞毒性を有しないことが示された。よって、限定されるわけではないが、本発明の組成物は５μｇ／ｍＬないし５０μｇ／ｍＬの濃度のピクノジェノールを含む。

さらに、本発明の実施例において、ピクノジェノールは特に１ＩＵ／ｍＬないし５ＩＵ／ｍＬの濃度のインターフェロンαと共投与された場合に、インターフェロンαを有するＨＣＶ感染及び複製抑制効果を示した。よって、限定されるわけではないが、本発明の組成物は、１ＩＵ／ｍＬないし５ＩＵ／ｍＬの濃度のインターフェロンαと共投与される。

食品組成物
また本発明の組成物は、ピクノジェノールを食品に添加した食品組成物であってもよい。

食品の種類は特に限定されず、例えば、飲料（炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、アルコール飲料、果汁飲料、茶類、栄養飲料、スープ等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、菓子類（ガム、キャンディー、クッキー、グミ、せんべい、ビスケット、ゼリー等）、パン、麺類、シリアル、調味料（ソース、ドレッシング等）等を例示できる。

本発明の食品組成物は、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品等として使用できる。
本発明の食品組成物には、必要に応じて、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、糊剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤（防ばい剤）、イーストフード、ガムベース、香料、酸味料、調味料、豆腐用凝固剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、かんすい、膨脹剤、栄養強化剤等の食品衛生上許容される食品添加物を適宜添加してもよい。

食品組成物中のピクノジェノールの含有量は、対象の症状、年齢、性別、期待される効果などにより異なるが、１日摂取量が１〜３００ｍｇ程度となる量含まれていることが好ましく、１日摂取量が５０〜２００ｍｇ程度となる量含まれていることがより好ましい。また食品組成物中のピクノジェノールの含有比率は、食品の種類によっても異なるが、固形食品の場合、０．０１〜１重量％程度が好ましく挙げられ、０．０２〜０．１重量％がより好ましく挙げられる。また液体食品の場合、１０ｍｇ／１００ｍＬ〜２００ｍｇ／１００ｍＬ（重量／容量）％程度が好ましく挙げられ、４０〜１００ｍｇ／ｍＬ（重量／容量）％がより好ましく挙げられる。

Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善のための方法
本発明はまた、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善のための方法であって、インターフェロンα及びピクノジェノールを、必要な患者に投与することを含む、前記方法を提供する。

本発明はさらに、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善のための方法であって、ピクノジェノールを、インターフェロンα投与を受けるＣ型肝炎患者に投与することを含む、前記方法を提供する。

ピクノジェノール（及びインターフェロン）は、それ単独で投与することもできるが、上述した本発明の医薬組成物又は食品組成物の形態で投与することもできる。
ピクノジェノールの投与量は、投与対象の年齢、性別、症状、製剤の形態、投与経路、期待される効果などにより異なり一概に定めることはできないが、ピクノジェノール投与又は医薬組成物の形態で投与する場合、１日投与量を、体重１ｋｇ当たり、０．１〜１０ｍｇ程度とすることが好ましく、５０〜３００ｍｇ程度とすることがより好ましい。また１日当たり１〜５回程度を、製剤形態に従った方法で投与すればよい。

また食品組成物の形態で投与する場合は、１日当たり１〜３００ｍｇ程度を投与することが好ましく、５０〜３００ｍｇ程度を投与することがより好ましい。
Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制効果及び複製抑制効果
本発明の組成物は、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善のために使用されうる。理論に縛られるわけではないが、本発明の組成物によりインターフェロンαのＣ型肝炎ウイルスの感染抑制効果及び複製抑制効果が高められる。

本明細書において、ＨＣＶ感染活性とは「ＨＣＶが細胞に感染する活性」を意味する。ウイルスの「感染」とは、限定されるわけではないが、ウイルスが細胞に吸着・侵入し、脱核して自身の核酸を細胞内に放出し、自身の核酸と同じものを合成する「複製」の段階を経て、翻訳段階でウイルス構成タンパク質を作り、それがウイルス粒子を形成した細胞外に出芽する、というライフサイクル全体を意味する。

ＨＣＶの感染活性は、限定されるわけではないが、例えば、本明細書の実施例５に記載の、ＨＣＶｍＲＮＡ量又はゲノムＤＮＡ量の定量によりウイルスのコピー数を調べることによって測定できる。あるいは、その他にウイルスタンパク質のＥＬＩＳＡによる定量等の公知の方法を用いて調べることができる。

本明細書において、ＨＣＶ複製活性とは「細胞に感染したＨＣＶが細胞内で複製する活性」を意味する。ウイルスの「複製」とは、限定されるわけではないが、ウイルスライフサイクルの１過程である、自身の核酸と同じものを合成する段階を意味する。ＨＣＶの複製活性は、限定されるわけではないが、例えば、本明細書の実施例１−４に記載の、ＨＣＶレプリコン細胞レポーターアッセイによるレポ−ターの活性（ルシフェラーゼ活性）を測定することによって測定することができる。

ＨＣＶ複製活性は、ＨＣＶの感染活性と密接に関連しており、ウイルスＲＮＡ量の定量、ウイルスタンパク質の定量によって調べることもできる。
ＨＣＶ複製活性の抑制（活性又は効果）とＨＣＶ感染活性の抑制（活性又は効果）を併せて、「抗ＨＣＶ活性又は効果」と言うこともある。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

材料及び実験手法
本明細書の実施例は、特に言及しない限り、以下の材料及び実験手法を用いて行った。
１．細胞培養
遺伝子型１ｂ型のＨＣＶサブゲノム−レプリコン細胞系Ｒ６、ＦＬＲ３−１及びＪＦＨ−１の３種の細胞系を構築した。具体的な作成方法は、Ｉｎｏｕｅｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４５，９２１−８，２００７；Ｔａｋａｎｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｉｎｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従った。

これらの細胞を、ダルベッコの改変イーグル培地ＧｌｕｔａＭａｘＩ（ＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭａｘＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及び５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃（５％ＣＯ_２）で培養した。

２．試薬
ピクノジェノールは、松森昭博士（世界心臓連合次期理事長、アジア太平洋心臓病学会次期理事長・科学諮問委員会委員長、アジアハートネットワーク副理事長、東京医科大学客員教授）より提供された。インターフェロンα（ＩＦＮ）は、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＪａｐａｎＩｎｃ．）より提供された。リバビリンは、和光純薬工業株式会社（ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）より入手した。

３．ＨＣＶレプリコン細胞レポーターアッセイ
ＨＣＶのレプリコン細胞中での複製活性を調べるために、レポーターアッセイを行った。レポーターとしてはホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）のルシフェラーゼを用いた。具体的手法は、Ｉｎｏｕｅｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４５，９２１−８，２００７；Ｔａｋａｎｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｉｎｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従った。

細胞を９６ウェルプレート（コースター型）に、（１×１０^４細胞／ウェル）で播布した。３７℃（５％ＣＯ_２）で２４時間インキュベートとした後、培地を除き、培養培地中に各図に示された濃度のピクノジェノール、ＩＦＮα及び／又はリバビリンを投与した。２４時間、４８時間又は７２時間後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット（ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてルシフェラーゼ活性を調べた。ルシフェラーゼシグナルは、ＡｃｃｕＦＬＦＸＬｕｍｉ４００照度計（Ａｌｏｋａ）を用いて３回測定し、対照に対する平均パーセンテージを得た。

ピクノジェノール、ＩＦＮα及び／又はリバビリンの各ＨＣＶ−レプリコン細胞に対する細胞毒性は、ＷＳＴ−８細胞数カウントキット（同人堂、熊本、日本）を用いて測定した。

４．ウエスタンブロット分析
ＨＣＶレプリコン細胞（２×１０^５）を６０ｍｍ細胞培養ディッシュで培養した。細胞をピクノジェノール又はＩＦＮ（対照）で７２時間処理した。細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＳＤＳ、０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌジチオスレイトール及び１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス）で溶解した。全タンパク質（３０μｇ）を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、次いで、ポリビニリデンジフルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；ミリポア、ビレリカ、ＭＡ）に写した。ＨＣＶの非構造タンパク質３（ＮＳ３）を、ウサギ抗−ＮＳ３（Ｒ２１２）ポリクローナル抗体を用いて検出した。ウサギ抗−ＮＳ３（Ｒ２１２）ポリクローナル抗体は、財団法人東京都医学総合研究所の小原道法博士より提供された。

対照として、βアクチンを抗−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ）を用いて検出した。
５．ＨＣＶｍＲＮＡ量のｑＲＴ−ＰＣＲによる定量
リアルタイム逆転写ＰＣＲを用いて、ＨＣＶｍＲＮＡを定量した。ピクノジェノール、ＩＦＮα及び／又はリバビリンで処理したＨＣＶ−レプリコン細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（登録商標）ＲＮＡ抽出キットを用いてＨＣＶＲＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎ化学に基くリアルタイム逆転写ＰＣＲを用いてＨＣＶＲＮＡを定量した。具体的には、ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ１９９９；１１６；６３６−６４３記載のプライマー、プローブ、手法に従い、ＨＣＶウイルスゲノムの定量を行った。

実施例１ピクノジェノール処理によるＨＣＶ−レプリコン細胞系に対する効果
本実施例では、ピクノジェノール処理（７２時間）によるＨＣＶ−レプリコン細胞系に対する効果を調べた。ＨＣＶ−レプリコン細胞系としては、「１．細胞培養」で構築した細胞系Ｒ６、ＦＬＲ３−１及びＪＦＨ−１を用いた。ＨＣＶ複製活性及び細胞毒性は、「３．ＨＣＶレプリコン細胞レポーターアッセイ」に記載の方法を用いて調べた。

Ｒ６に対する結果を図１Ａ及び図１Ｂに、ＦＬＲ３−１に対する結果を図２Ａ及び図２Ｂに、そして、ＪＦＨ−１に対する結果を図３に示す。
実施例２ＨＣＶ−レプリコン細胞系における、ＨＣＶＮＳ３タンパク質の発現
本実施例では、ピクノジェノール処理後のＨＣＶ−レプリコン細胞系Ｒ６、ＦＬＲ３−１及びＪＦＨ−１における、ＨＣＶＮＳ３タンパク質の発現をウエスタンブロット分析で調べた。具体的な手法は、「４．ウエスタンブロット分析」に記載した方法に従った。
結果を図４に示す。

Ｒ６細胞及びＦＬＲ３−１細胞では、ピクノジェノールで７２時間処理後、ＨＣＶＮＳ３タンパク質の発現が有意に減少したが、ＪＦＨ−１細胞では未処理の場合と比較して有意な減少は観察されなかった。

実施例３Ｒ６細胞をピクノジェノール及びインターフェロンαで処理した場合の効果
本実施例では、Ｒ６細胞をピクノジェノール及びインターフェロンαで２４時間、４８時間、及び７２時間処理した場合の効果を示す。ＨＣＶ複製活性及び細胞毒性は、「３．ＨＣＶレプリコン細胞レポーターアッセイ」に記載の方法を用いて調べた。

結果を図５−８に示す。２４時間、４８時間、７２時間のいずれにおいても、ＰＧ５＋ＩＦＮ５で、各々単体で使用した場合よりも相乗的に強力なＨＣＶ複製抑制効果を示した。特に７２時間の結果を示した図７から理解されるように、５ＩＵ／ｍＬのＩＦＮα処理（ＩＦＮ５）はＨＣＶ複製を４７％抑制したのに対し、さらに、５μｇ／ｍＬのピクノジェノールを加えた場合（ＩＦＮ５＋ＰＧ５）は、９７％抑制した）。

一方、ピクノジェノール、インターフェロンα及び双方の組み合わせは実験に用いた濃度範囲ではＲ６細胞に対する細胞毒性がないことが確認された。
実施例４Ｒ６細胞をピクノジェノール、インターフェロンα及びリバビリンで処理した場合の効果
本実施例では、Ｒ６細胞をピクノジェノール、インターフェロンα及びリバビリンで２４時間又は４８時間処理した場合の効果を示す。ＨＣＶ複製活性及び細胞毒性は、「３．ＨＣＶレプリコン細胞レポーターアッセイ」に記載の方法を用いて調べた。

結果を図１０および図１１に示す。ＨＣＶ複製抑制に関し、ピクノジェノールは特に、インターフェロン及びリバビリンとの併用により高い効果を示した。ピクノジェノール、インターフェロンα、リバビリンは実験に用いた濃度範囲ではＲ６細胞に対する細胞毒性がないことが確認された。

実施例５ＨＣＶ感染細胞におけるピクノジェノール、プロシアニジン及びインターフェロンαの感染抑制効果
本実施例では、ピクノジェノール、プロシアニジン及びインターフェロン、並びにプロシアニジンとインターフェロンを併用した場合のＨＣＶ感染に対する抑制効果を調べた結果を示す。

ＨＣＶ感染に用いた細胞の調製及び感染方法は、例えば、Ｍ．Ｓａｔｏｈらの“ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ２−１５２ａＳｕｐｐｒｅｓｓｅｓＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎＴｈｏｒｏｕｇｈＢｅｔａｉｎｅ／ＧＡＢＡＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−１”（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓｉｎｐｒｅｓｓ）等に記載の方法に従った。感染の定量の具体的手法は、「５．ＨＣＶｍＲＮＡ量のｑＲＴ−ＰＣＲによる定量」に記載した方法に従った。

結果を図１２に示す。

Claims

インターフェロンα及びピクノジェノールを含む、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物。
ピクノジェノールを含む、Ｃ型肝炎の予防、治療又は改善用組成物であって、インターフェロンα投与を受けるＣ型肝炎患者に投与されることを特徴とする、前記組成物。
Ｃ型肝炎ウイルスの感染又は複製を抑制する、請求項１又は２に記載の組成物。
さらにリバビリンを含む、あるいは、リバビリンとともに投与される、請求項１ないし３に記載の組成物。
経口摂取される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
医薬組成物又は食品組成物である、請求項１ないし５に記載の組成物。