JPH11239498A - 精製哺乳動物由来インターフェロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子組換えの手段により得た哺乳動物由来
インターフェロンから、ほぼ完全に夾雑蛋白を除去する
簡単な方法を開発し、効率よく精製哺乳動物由来インタ
ーフェロンを得る手段を提供すること。 【解決手段】 組換えバキュロウイルスを用いて生産し
た哺乳動物由来インターフェロン含有溶液を、陽イオン
交換カラムに付すか、シリカゲルカラム、金属キレート
カラム及びレクチンカラムに付す精製哺乳動物由来イン
ターフェロンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えバキュロウ
イルスを用いて生産した哺乳動物由来インターフェロン
含有溶液を精製し、精製哺乳動物由来インターフェロン
を製造する方法に関し、更に詳細には、昆虫細胞由来の
夾雑物を効率的に除去し、経済的により精製哺乳動物由
来インターフェロンを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターフェロン（以下、「ＩＦＮ」と
略す）は、抗ウイルス作用を示す蛋白質を主成分とする
生理活性物質で、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤等の医薬の有
効成分として用いられているものである。ＩＦＮには、
３種の異なるタイプのものがあり、それぞれＩＦＮ−
α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γと呼ばれている。

【０００３】近年、ＩＦＮの製造には遺伝子操作の手法
が採用されており、動物細胞を用いる方法、組換え大腸
菌、組換え酵母菌、あるいは組換えバキュロウイルスを
用いて製造する方法等が知られ、各タイプのＩＦＮが得
られている。

【０００４】ところで、ＩＦＮの医薬品としての実用化
に当たっては、大量生産手段の開発も重要であるが、こ
れと並び効率的な精製手段の開発が求められる。 すな
わち、遺伝子操作の手段により得られるＩＦＮには、利
用する宿主細胞由来の夾雑蛋白が存在する可能性があ
り、この夾雑蛋白を完全に除去することができる精製手
段が求められている。

【０００５】しかし、実際には製造手段により異なる利
用細胞の種類毎に夾雑蛋白の種類も異なり、また、ＩＦ
Ｎと近似した性質を有する夾雑蛋白が多く、複雑な精製
方法を組み合わせて精製を行っても、高純度の精製物を
得ることは困難であった。例えば、ヒトＩＦＮ−γの精
製に関して、ＣＰＧ（ガラスビーズ）、ＣｏｎＡ（レク
チン）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ１００（ゲルろ過）カラム
を使用する方法（The Journal of Biological Chemistr
y, vol.259, No.11, 6790-6797, 1984）や、マウスＩＦ
Ｎ−γについて組換え大腸菌培養からの精製に関して、
陰イオン交換カラム、疎水性カラム、ゲルろ過カラムを
使用する方法（IRL Press, Oxford,29-52, 1987 ）等が
報告されている。しかし、本発明者等はこれらの報告ど
おりの方法を用いてバキュロウイルスの発現系からの精
製を試みたが、純度の高いＩＦＮ−γの精製物を得るこ
とはできなかった。さらに、組換えバキュロウイルスを
感染させた昆虫虫体を製造に用いる場合には、昆虫細胞
培養法に比べ、高レベルの組換え蛋白が分泌されるもの
の、昆虫虫体由来の夾雑物が多いため、夾雑物と組換え
蛋白の分離は極めて困難であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、簡単な手段でほぼ完全に夾雑蛋白を除去する方法を
開発し、効率よく精製ＩＦＮを得る手段を提供すること
である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、昆虫ある
いは昆虫細胞を宿主とし、組換えバキュロウイルスを用
いる遺伝子操作の手法で経済的に哺乳動物由来のＩＦＮ
を得る方法の研究を行っていたところ、ＩＦＮは陽イオ
ン交換カラムの利用により、あるいはシリカゲルカラ
ム、金属キレートカラム及びレクチンカラムを組み合わ
せ利用することにより容易に昆虫細胞由来の夾雑蛋白等
と分離できることを知り、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明はインターフェロン蛋白
をコードする遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイル
スをその宿主に感染させることにより生産したインター
フェロン含有液を、シリカゲルカラム、金属キレートカ
ラム及びレクチンカラムに付す工程を含むことを特徴と
する精製インターフェロンの製造方法である。また、本
発明はインターフェロン蛋白をコードする遺伝子を組み
込んだ組換えバキュロウイルスをその宿主に感染させる
ことにより生産したインターフェロン含有液を、陽イオ
ン交換カラムに付す工程を含むことを特徴とする精製イ
ンターフェロンの製造方法である。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明により、精製哺乳動物由来
ＩＦＮ（以下、「精製ＩＦＮ」という）を得るには、昆
虫あるいは昆虫細胞を宿主とし、組換えバキュロウイル
スを利用して得た哺乳動物由来のＩＦＮを含む溶液（以
下、「ＩＦＮ溶液」という）を次のいずれかの方法で処
理することが必要である。

【００１０】本発明において使用されるＩＦＮ溶液の例
としては、哺乳動物由来のＩＦＮ遺伝子、例えばヒト、
ウシ、ウマ、ネコまたはイヌ由来のＩＦＮ遺伝子を組み
込んだ組換えバキュロウイルスを感染させたカイコ細胞
（ＢｍＮ細胞、ＢｏＭｏ細胞等）、鱗翅目ヤガ科の昆虫
細胞［Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞（ハスモンヨトウガ；
Spodoptera frugiperda 由来）、Ｔｎ−５細胞（イラク
サキンウワバ；Trichoplusia ni 由来）］の培養上清
や、これを適当な緩衝液で希釈したものが挙げられる。
また、別の例としては同じ組換えバキュロウイルスを
カイコ虫体または鱗翅目ヤガ科の昆虫（キンウワバ；Au
tographa californica、Spodoptera frugiperda 、Tric
hoplusia ni 等）の虫体に感染させ、飼育した後の虫体
から得た体液や虫体の摩砕液もしくはこれらを適当な緩
衝液で希釈したもの等が挙げられる。

【００１１】本発明の第一の方法は、上記ＩＦＮ溶液を
平衡化した陽イオン交換カラムに通液し、洗浄した後適
当な溶離液を用いて溶出させる方法である。この第一の
方法は、ＩＦＮの中でも特にＩＦＮ−γの精製に限定さ
れず、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βにも適用できる。

【００１２】使用される陽イオン交換カラムとしては、
Ｍｏｎｏ Ｓ（ファルマシア社製）、ＳＰ セファロース
ＦＦ（ファルマシア社製）、ＣＭ セファロースＦＦ
（ファルマシア社製）等を使用することができ、また、
洗浄や平衡化には、ｐＨが７〜１０程度のグリシン緩衝
液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が利用され、さ
らに溶離液としては、洗浄に用いるよりも塩化ナトリウ
ム濃度を高くした、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液等が利用される。

【００１３】また、第二の方法は、ＩＦＮ溶液をシリカ
ゲルカラム、金属キレートカラム及びレクチンカラムに
付し、精製ＩＦＮを得る方法である。この第二の方法
は、インターフェロン含有液として組換えバキュロウイ
ルスが感染したそのバキュロウイルスの宿主である昆虫
の虫体の体液又は磨砕液を用いる場合に適しており、ま
た、この方法は、ＩＦＮ−γの精製のみならず、ＩＦＮ
−α又はＩＦＮ−βの精製にも利用できる。

【００１４】本方法において最初に使用されるシリカゲ
ルカラムとしては、カセイゲル ３００−７５（東京化
成工業社製）、ＰＧ ２４０−２００（シグマ社製）等
のシリカゲルを利用することができる。この工程では、
上記のシリカゲルカラムにＩＦＮ−γ溶液をアプライ
し、吸着させた後、例えば、ＮａＣｌ／トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８）等により洗浄し、次いでＮａＣｌ及びエチ
レングリコールを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）を溶
離液として用いることにより、一次精製ＩＦＮ溶液が得
られる。

【００１５】また、二次精製に用いられる金属キレート
カラムは、ニッケル、銅、亜鉛イオンを結合したカラム
であり、例えばキレーティングセファロースＦＦ（ファ
ルマシア社製）、キレートセルロファイン（生化学工業
社製）等が利用できる。この工程では、前記の一次精製
ＩＦＮ溶液をアプライし、その素通り画分を集めること
により、夾雑タンパク質が除去された二次精製ＩＦＮ溶
液が得られる。

【００１６】三次精製において使用されるレクチンカラ
ムとしては、ＣｏｎＡセファロース（ファルマシア社
製）、ＰＨＡアガロース（生化学工業社製）、ＰＮＡア
ガロース（生化学工業社製）等のカラムが利用される。
本工程においては、前記した二次精製ＩＦＮ溶液をレク
チンカラムにアプライ、吸着させた後、ＮａＣｌ含むリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７）等で洗浄し、最後にＮａＣｌとα
−メチル−Ｄ（＋）−グルコシド等の糖を含むトリスま
たはリン酸緩衝液を溶離液として溶出させることによ
り、最終の精製ＩＦＮ溶液が得られる。

【００１７】上記の第一の方法あるいは第二の方法で得
られた精製ＩＦＮ溶液は、必要により例えば凍結乾燥等
の手段により乾燥粉末とすることもできる。

【００１８】得られた精製ＩＦＮは、後記実施例で示す
ごとく、いずれも蛋白質１ｍｇ当たりのＩＦＮ活性（比
活性）が高くなり、高度に精製されていることがわか
る。特に、カイコ虫体を用いた場合は、活性の低いＩＦ
Ｎ溶液から極めて精製度の高いＩＦＮが得られており、
カイコ虫体を利用したＩＦＮの発現とあわせ、本発明は
経済的に有利なＩＦＮの生産方法を提供するものであ
る。即ち、カイコ等の虫体を利用すると、精製ＩＦＮは
糖鎖の付加したものが得られるため、大腸菌等の発現系
を使用して製造されたＩＦＮに比べ、より有効な生理活
性を持つなど優れている。また、昆虫細胞を含め樹立細
胞を利用した蛋白発現系では、得られる蛋白はＣ末端の
アミド化が一般に起こりにくいが、カイコなどの幼虫を
用いて発現させた場合には、虫体内にアミド化酵素など
関連する酵素類があるため、アミド化されたものが得ら
れる。さらにカイコ虫体を利用した場合は、バキュロウ
イルスとその宿主の培養細胞を利用した発現系より著し
く有利である。例えば、ヤガ科昆虫Ｔｎ−５細胞培養細
胞を利用した発現系に比べても約２０倍という高濃度の
ＩＦＮ含有液が得られる。

【００１９】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるも
のではない。なお、得られたＩＦＮ−γの活性は、ウシ
腎由来細胞（ＭＤＢＫ細胞）と、シンドビスウイルス
（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）を用い、一般に知られ
ている抗ウイルス活性の測定法［日本化学会編 新生化
学実験講座、第１２巻、３７２−３７８（１９８９）東
京化学同人］に従って測定した。

【００２０】すなわち、まず最初に継代中のＭＤＢＫ細
胞を１.５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＭＥＭ
（Ｅａｇｌｅ必須培地）＋５％ＦＢＳ（牛胎児血清）培
地で調整し、この細胞浮遊液を各ウェル１００μｌづつ
９６穴プレートに分注する。３７℃で２４時間、５％炭
酸ガスインキュベータで培養した後、各ウエルに２倍段
階希釈した被検ウシ由来ＩＦＮ−γ（以下「ＢｏＩＦＮ
−γ」という）と標準ＢｏＩＦＮ−γ（比活性５.１×
１０⁶Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＨＩＢＡ-
ＧＥＩＧＹ社製）を５０μｌづつ添加する。

【００２１】次いで、３７℃で６〜２４時間、５％炭酸
ガスインキュベータで培養した後、培地を捨て、ＭＥＭ
培地で約１×１０⁵ｐｆｕ／ｍｌに調整したシンドビス
ウイルス液を添加して更に５％炭酸ガスインキュベータ
中、３７℃で培養を続ける。５〜６日後、細胞変異効果
（ＣＰＥ）が観測されたところで培地を捨て、紫外線照
射してウイルスの不活化を行った後、ホルマリンを添加
して細胞の固定化を行う。

【００２２】最後に、ナフトールブルーブラック等にて
生細胞の染色を行い、ＯＤ₆₅₅値等の測定によりＩＣ₅₀
等を求める。被検ＩＦＮのＩＣ₅₀等を標準ＩＦＮの測定
値等と比較し、その活性値を求めることにより、被検液
のＩＦＮ濃度を測定することができる。

【００２３】実 施 例 １ ＢｏＩＦＮ−γ遺伝子組換えバキュロウイルスの調製： （１）ＢｏＩＦＮ−γ ｃＤＮＡのクローニング；ま
ず、フィコール法により、ヨーネ菌実験感染牛の末梢血
単球を分離した。次いで、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ転写を
促進するため、ヨーネ菌またはその分泌抗原であるヨー
ニンＰＰＤで４時間刺激した後、塩酸グアニジン法によ
りＲＮＡを抽出した。

【００２４】後記の２種類のプライマーを用いたＲＴ−
ＰＣＲ法（Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｄｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）使用）で分
泌シグナルコード領域を含む５００ｂｐのＢｏＩＦＮ−
γ ｃＤＮＡを増幅した。 ５’ａｔｇａａａｔａｔａｃａａｇｃｔａｔｔｔｃｔｔａｇｃｔ ３’ ５’ｃｃａｔｔａｃｇｔｔｇａｔｇｃｔｃｔｃｃｇｇｃｃｔｃｇ ３’

【００２５】得られたＢｏＩＦＮ−γ ｃＤＮＡを、ク
レノーフラグメント（ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ：
ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて平滑処理した後（２５℃、３
０分間）、Ｔ₄ＤＮＡ リガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ ｓｙｓｔｅｍ Ｖｅｒ.１（ＴＡＫＡＲＡ社製）使
用）を用い、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉ
ｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＴＯＹＯＢＯ製）で
５’末端脱リン酸化処理したクローニングベクター Ｂ
ｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ−（ＴＯＹＯＢＯ製）の
ＳｍａＩ制限酵素切断部位に連結した。更にこれをコン
ピテントセルＪＭ１０９（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇ
ｈ（ＴＡＫＡＲＡ社製））へ形質転換し、常法に従って
クローニングした。

【００２６】（２）ＢｏＩＦＮ−γ組換えＡｃバキュロ
ウイルス（ＢｏＩＦＮ−γ・ＡｃＮＰＶ）の作製；Ｂｏ
ＩＦＮ−γ ｃＤＮＡがクローニングされたプラスミド
（ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ−／ＢｏＩＦＮ−
γ）をＰｌａｓｍｉｄ ＭａｘｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ
社製）を使用して精製した後、ＥｃｏＲＩで切断した。
次いで、クレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ：ＴＯＹＯＢＯ社製）で平滑処理後、Ｂａｍ
Ｈｌリンカーを連結した。ＢａｍＨＩで消化し、ＢｏＩ
ＦＮ−γ ｃＤＮＡを切り出した。

【００２７】得られたＢｏＩＦＮ−γ ｃＤＮＡを、Ｔ₄
ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅ
ｍ Ｖｅｒ.１（ＴＡＫＡＲＡ社製））を用い、オートグ
ラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ）バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）
用のトランスファーベクターｐＡｃＹＭｌのＢａｍＨＩ
制限酵素切断部位に連結した。 このベクターでコンピ
テントセルＪＭ１０９（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇ
ｈ：ＴＡＫＡＲＡ社製）を形質転換した後、常法により
クローニングしてＢｏＩＦＮ−γ遺伝子組換えトランス
ファーベクターｐＡｃＹＭｌ／ＢｏＩＦＮ−γを得た。

【００２８】最後にトランスファーベクターｐＡｃＹＭ
ｌ／ＢｏＩＦＮ−γと、バキュロウイルスＡｃＬａｃＺ
のＤＮＡとをＳｆ２１ＡＥ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来）細胞で相同組換えを行い、Ｂ
ｏＩＦＮ−γ遺伝子組換えバキュロウイルス（ＢｏＩＦ
Ｎ−γ・ＡｃＮＰＶ）を得た。

【００２９】（３）ＢｏＩＦＮ−γ組換えＢｍバキュロ
ウイルス（ＢｏＩＦＮ−γ・ＢｍＮＰＶ）の作製；Ｂｏ
ＩＦＮ−γ ｃＤＮＡがクローニングされたプラスミド
（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ−／ＢｏＩＦＮ−
γ）を精製し（Ｐｌａｓｍｉｄ ＭａｘｉＫｉｔ（ＱＩ
ＡＧＥＮ社製）使用）、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化し
た。

【００３０】得られた消化断片を、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼ
（ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ Ｖｅｒ.１
（ＴＡＫＡＲＡ社製））を用い、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒ
ｉ（カイコ）バキュロウイルス（ＢｍＮＰＶ；カイコ核
多角体病ウイルス）用のトランスファーベクターｐＢｍ
０５０のＸｂａＩとＥｃｏＲＩの制限酵素切断部位に連
結した。

【００３１】このベクターでコンピテントセルＪＭ１０
９（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ：ＴＡＫＡＲＡ社
製）を形質転換し、常法によりクローニングしてＢｏＩ
ＦＮ−γ遺伝子組換えトランスファーベクターｐＢｍ０
５０／ＢｏＩＦＮ−γを得た。

【００３２】最後にトランスファーベクターｐＢｍ０５
０／ＢｏＩＦＮ−γとバキュロウイルスＢｍＮＰＶＴ₃
のＤＮＡとをカイコＢｍＮ細胞中で相同組換えを行い、
ＢｏＩＦＮ−γ遺伝子組換えバキュロウイルス（ＢｏＩ
ＦＮ−γ・ＢｍＮＰＶ）を得た。

【００３３】実 施 例 ２ ＡｃＮＰＶ培養細胞発現系より得られたＢｏＩＦＮ−γ
（ＡｃＢｏＩＦＮ−γ）の精製方法：下記の方法によ
り、宿主として、Ｔｎ−５（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ
ｎｉ）、培地として、ＥＸ ＣＥＬＬ ４０１（ＪＲＨ
社）を用い、組換え体ウイルスＢｏＩＦＮ−γ・ＡｃＮ
ＰＶによりＢｏＩＦＮ−γを発現させ、これを精製して
精製ＢｏＩＦＮ−γを得た。

【００３４】まず、Ｔｎ−５細胞を７×１０⁵ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌに調整し、２２５ｃｍ²の培養ボトルに４５ｍ
ｌ接種した。接種２時間後に培地を捨て、ＢｏＩＦＮ−
γ・ＡｃＮＰＶをｍｏｉ＝１.０で接種した。次いで、
２時間後にウイルス液を捨て、４５ｍｌの新鮮培地を添
加し、２７℃で培養を行い、ウイルス感染後２日目に培
養上清（粗ＡｃＢｏＩＦＮ−γ液）を回収した。この粗
ＡｃＢｏＩＦＮ−γ液中に含まれるＩＦＮ−γの抗ウイ
ルス活性は、ＭＤＢＫによるシンドビスウイルス増殖抑
制試験を用いて測定したところ、６.３２×１０⁶Ｕｎｉ
ｔ／ｍｌであった。

【００３５】得られた粗ＡｃＢｏＩＦＮ−γ液を、グリ
シン緩衝液で適当な濃度に希釈し、これを陽イオン交換
カラムのＭｏｎｏ Ｓ（ファルマシア社製）カラムへア
プライした。このカラムをグリシン緩衝液で洗浄した。
次に、グリシン緩衝液の塩濃度を上昇させることにより
溶出を行い、精製ＢｏＩＦＮ−γを得た。

【００３６】精製前の粗ＡｃＢｏＩＦＮ−γ液がＳＤＳ
−ＰＡＧＥのクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染
色像で幅広いバンドが認められたのに対し、得られた精
製ＢｏＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−γに相当する分子量の領
域に３本のバンドのみが認められ、それら全てが抗Ｂｏ
ＩＦＮ−γ抗体を用いたウエスタンブロッテイングで陽
性反応を示し、ＩＦＮ−γであることが確認できた（図
１）。また、精製ＢｏＩＦＮ−γ（図１中、レーン４）
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色結果をＮＩＨイメージ
で解析したところ、純度は９７.４％であった（図
２）。さらに、精製ＢｏＩＦＮ−γの抗ウイルス活性は
培養上清の１.６３×１０⁸Ｕｎｉｔ／ｍｇから２.８３
×１０⁸Ｕｎｉｔ／ｍｇに上昇しており、粗ＡｃＢｏＩ
ＦＮ−γ液からの精製ＢｏＩＦＮ−γの回収率は４９％
であった（表１）。以上の結果から、本精製法により細
胞培養液上清中の夾雑物が効率的に除去され、高純度の
ＢｏＩＦＮ−γが調製できることが明らかとなった。

【００３７】

【表１】

【００３８】実 施 例 ３ ＢｍＮＰＶとカイコ虫体を用いた発現系より得られたＢ
ｏＩＦＮ−γ（ＢｍＢｏＩＦＮ−γ）の精製方法
（１）： （１）カイコ磨砕液の取得；カイコを宿主とし、組換え
体ウイルスであるＢｏＩＦＮ−γ・ＢｍＮＰＶを用い、
下記方法でＢｏＩＦＮ−γを発現させた。

【００３９】すなわち、５齢１日のカイコにＢｏＩＦＮ
−γ・ＢｍＮＰＶを接種し、人工飼料を用いて飼育し
た。 感染後４日目のカイコ２０頭に対し、２００ｍｌ
の磨砕用液（１ｍＭ ジチオトレイトール及び１ｍＭ エ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含むリン酸緩衝
液）を加えてホモジェナイザーにて磨砕し、１２,００
０ｒｐｍにて３０分間遠心分離して上清を得た。

【００４０】この上清を、３０〜５０％硫酸アンモニウ
ム条件で塩析し、１２,０００ｒｐｍにて１５分間遠心
分離した。 得られた上清を６５〜８０％硫酸アンモニ
ウム条件で再度塩析し、１２,０００ｒｐｍにて１５分
間遠心分離して、沈澱を得た。得られた沈澱を、５０ｍ
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）約１０００ｍｌに溶解
し、磨砕液（粗ＢｏＩＦＮ−γ磨砕液）とした。

【００４１】（２）カイコ磨砕液より得られたＢｏＩＦ
Ｎ−γの精製；上記（１）で得た粗ＢｏＩＦＮ−γ磨砕
液をシリカゲルカラム（ゲル：カセイゲル３００−７
５；東京化成工業社製）にアプライした。 このカラム
を１Ｍ ＮａＣｌ含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）にて洗浄した後、３Ｍ ＮａＣｌ及び３０％エチレ
ングリコール含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）にて溶出して一次精製液を得た。

【００４２】次いでこの溶出液を、ニッケルイオンを含
むキレーティング・セファロースＦＦ（Ｃｈｅｌａｔｉ
ｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ；ファルマシア社製）カ
ラムにアプライし、溶出液を得た。更に、この溶出液を
ゲルとしてＣｏｎＡセファロース（ファルマシア社製）
を用いるレクチンカラムにアプライし、リン酸緩衝液
（ｐＨ７）で洗浄した。

【００４３】最後に、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍ
Ｍ α−メチル−Ｄ（＋）−グルコシドを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液５０ｍｌにて溶出し、精製ＢｏＩＦＮ
−γ溶液４０ｍｌを得た。得られた精製ＢｏＩＦＮ−γ
はＳＤＳ−ＰＡＧＥでの染色像から、粗ＢｏＩＦＮ−γ
磨砕液中に含まれていた大部分の夾雑物が除去されてい
ることが明らかとなった。精製ＢｏＩＦＮ−γは、５.
４６×１０⁷Ｕｎｉｔ／ｍｇの抗ウイルス活性を有し、
粗ＢｏＩＦＮ−γ磨砕液からの回収率は２３.８％であ
った。この結果をまとめて表２に示す。

【００４４】

【表２】

【００４５】実 施 例 ４ ＢｍＮＰＶとカイコ虫体を用いた発現系より得られたＢ
ｏＩＦＮ−γ（ＢｍＢｏＩＦＮ−γ）の精製方法
（２）： （１）カイコ体液の取得；カイコを宿主とし、組換え体
ウイルスであるＢｏＩＦＮ−γ・ＢｍＮＰＶを用い、下
記方法でＢｏＩＦＮ−γを発現させた。

【００４６】すなわち、５齢１日のカイコにＢｏＩＦＮ
−γ・ＢｍＮＰＶを接種し、人工飼料を用いて飼育し
た。 カイコ体液は、感染後４日目に、病虫の足をシリ
ンジで刺して回収した。 回収した体液に最終濃度５ｍ
Ｍとなる量のＤＴＴ（ジチオスレイトール）を添加し、
−８０℃で保存した。この体液（粗ＢｍＢｏＩＦＮ−γ
体液）の抗ウイルス活性は、８.５６×１０⁶Ｕｎｉｔ／
ｍｇであった。

【００４７】（２）カイコ体液より得られたＢｏＩＦＮ
−γの精製；カイコ１６頭分の粗ＢｍＢｏＩＦＮ−γ体
液約１０ｍｌを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ（ｐＨ８.
０）にて５倍に希釈した。

【００４８】この希釈液５０ｍｌを、カセイゲル ３０
０−７５（東京化成工業社製）を用いるシリカゲルカラ
ムにアプライした。次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ.−ＨＣ
ｌ／１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８.０）で洗浄後、１００ｍｌ
の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ.−ＨＣｌ／３Ｍ ＮａＣｌ／３０
％エチレングリコール（ｐＨ８.０）で溶出させて一次
精製液を得た。

【００４９】この溶出液を、９００ｍｌの５０ｍＭ リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で１０倍希釈し、ニッケルイ
オンを結合したキレーティング・セファロースＦＦ（フ
ァルマシア社製）カラムにアプライした。

【００５０】溶出した画分を、ＣｏｎＡセファローズ
（ファルマシア社製）カラムにアプライした。このカラ
ムを、５０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で洗浄し
た後、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び５００ｍＭ α−メチル
−Ｄ（＋）−グルコシドを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩
衝液５０ｍｌ（ｐＨ８.０）で溶出し、精製ＢｏＩＦＮ
−γ液３５ｍｌを得た。粗ＢｏＩＦＮ−γ体液のＳＤＳ
−ＰＡＧＥでのＣＢＢ染色像は多数の濃厚な染色バンド
が広域分子量に認められたが、精製ＢｏＩＦＮ−γは、
ＩＦＮ−γの分子量（約１９ｋＤａ）相当領域に３本の
バンドのみが認められ、それらは抗ＢｏＩＦＮ−γ抗体
を用いたウエスタンブロッテイングで陽性に染色され、
ＢｏＩＦＮ−γであることが確認できた（図３）。ま
た、精製ＢｏＩＦＮ−γ（図３中、レーンＣ）のＳＤＳ
−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色結果をＮＩＨイメージで解析し
たところ、純度は９５.７％であった（図４）。さら
に、精製ＢｏＩＦＮ−γの抗ウイルス活性は、未精製の
カイコ体液の８.５６×１０⁶Ｕｎｉｔ／ｍｇから１.５
５×１０⁸Ｕｎｉｔ／ｍｇに上昇し、比活性の上昇が認
められ、粗ＢｍＢｏＩＦＮ−γ体液からの回収率は２９
％であった（表３）。以上の結果から、本精製法により
カイコ体液中の夾雑物が効率よく除去され、高純度、高
活性のＢｏＩＦＮ−γが調製できることが明らかとなっ
た。

【００５１】

【表３】

【００５２】

【発明の効果】本発明方法によれば、組換えバキュロウ
イルスにより産生される哺乳動物ＩＦＮを効率的かつ経
済的に精製し、精製哺乳動物ＩＦＮを得ることができ
る。従って本発明方法は、ヒトの他、ウシ、ウマ、ネ
コ、イヌ等のＩＦＮを医薬品として開発するために極め
て有利なものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例２で得たＢｏＩＦＮ−γの精製前後の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色の結果（図中、ａ）およ
びウエスタンブロッティングの結果（図中、ｂ）を示す
電気泳動の写真。

【図２】 実施例２で得た精製ＢｏＩＦＮ−γのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色をＮＩＨイメージで解析した結
果を示す図面。

【図３】 実施例４で得たＢｏＩＦＮ−γの精製前後の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色の結果（図中、ａ）およ
びウエスタンブロッティングの結果（図中、ｂ）を示す
電気泳動の写真。

【図４】 実施例４で得た精製ＢｏＩＦＮ−γのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色をＮＩＨイメージで解析した結
果を示す図面。

【符号の説明】

図１中、１はマーカー、２は培養上清（１／５）、３は
イオン交換カラム非吸着画分、４はイオン交換カラム吸
着画分（精製ＢｏＩＦＮ−γ）のレーンである。図３
中、Ａはマーカー、Ｂは感染蚕体液、Ｃは精製ＢｏＩＦ
Ｎ−γ、Ｄはマーカーのレーンである。 以 上

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 石山 誠司 埼玉県狭山市大字下奥富字宮後1548番地 片倉工業株式会社中央蚕研事業所内 (72)発明者 柿 宏樹 埼玉県狭山市大字下奥富字宮後1548番地 片倉工業株式会社中央蚕研事業所内 (72)発明者 横溝 祐一 茨城県つくば市並木４−919−103 (72)発明者 森 康行 茨城県つくば市吾妻２−809−101 (72)発明者 犬丸 茂樹 茨城県つくば市並木４−10−908−201 (72)発明者 下地 善宏 茨城県つくば市吾妻４−209−601 (72)発明者 谷川 雅俊 東京都江戸川区北葛西１−16−13 第一製 薬株式会社東京研究開発センター内 (72)発明者 内山 明彦 東京都江戸川区北葛西１−16−13 第一製 薬株式会社東京研究開発センター内 (72)発明者 佐伯 欣之 東京都江戸川区北葛西１−16−13 第一製 薬株式会社東京研究開発センター内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターフェロン蛋白をコードする遺伝
   子を組み込んだ組換えバキュロウイルスをその宿主に感
   染させることにより生産したインターフェロン含有液
   を、シリカゲルカラム、金属キレートカラム及びレクチ
   ンカラムに付す工程を含むことを特徴とする精製インタ
   ーフェロンの製造方法。
2. 【請求項２】 インターフェロン蛋白をコードする遺伝
   子を組み込んだ組換えバキュロウイルスをその宿主に感
   染させることにより生産したインターフェロン含有液
   を、陽イオン交換カラムに付す工程を含むことを特徴と
   する精製インターフェロンの製造方法。
3. 【請求項３】 インターフェロン含有液が、組換えバキ
   ュロウイルスの感染した宿主昆虫虫体から得られた昆虫
   体液又は当該昆虫磨砕液である請求項１又は２記載の製
   造方法。
4. 【請求項４】 インターフェロン含有液が、ヒトインタ
   ーフェロン、ウシインターフェロン、ウマインターフェ
   ロン、ネコインターフェロンまたはイヌインターフェロ
   ンの各々の含有液である請求項１乃至３のいずれか１項
   に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 インターフェロン含有液が、インターフ
   ェロン−γ含有液である請求項１乃至４のいずれか１項
   に記載の製造方法。
6. 【請求項６】 インターフェロン含有液が、ウシインタ
   ーフェロン−γ含有液である請求項１乃至３のいずれか
   １項に記載の製造方法。
7. 【請求項７】 組換えバキュロウイルスが、組換えカイ
   コ核多角体病ウイルス（Bombyx mori Nuclear Polyhedr
   osis Virus）である請求項１乃至６のいずれか１項に記
   載の製造方法。
8. 【請求項８】 組換えバキュロウイルスが、組換えオー
   トグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Auto
   grafa californica Nuclear Polyhedrosis Virus）であ
   る請求項１乃至６のいずれか１項に記載の製造方法。
9. 【請求項９】 組換えバキュロウイルスの宿主として、
   昆虫の虫体を用いたものである請求項１乃至８のいずれ
   か１項に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 組換えバキュロウイルスの宿主が、当
    該ウイルスの昆虫の培養細胞である請求項１、２、４乃
    至８のいずれか１項に記載の製造方法。