JPH11511324A - 細胞培養でインターフェロン産生を高める方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 動物細胞でインターフェロンの製造を高める方法を記載する。この方法は、ある種のインターフェロン産生誘発物質の細胞レベル、特に二本鎖ＲＮＡ依存キナーゼ（ｄｓＲＮＡ−ＰＫＲまたはＰＫＲ）の細胞レベルを操作するものである。ＰＫＲを過剰産生する細胞培養で高レベルのインターフェロン合成が誘発され、ウィルスによる従来のインターフェロン誘発を行わないで著しい量のインターフェロンを回収することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞培養でインターフェロン産生を高める方法 序 技術分野 本発明は、細胞培養でインターフェロン産生を高める方法に関する。背景 ＩＦＮはその一次配列により主に２つの群に分類される。インターフェロンＩ 型、ＩＦＮ−αおよびＩＦＭ−βは、ＩＦＮ−α遺伝子類およびただ１種のＩＦ Ｎ−β遺伝子から成るイントロンの無い遺伝子上科によってコードされる。イン ターフェロンII型、即ちＩＦＮ−γは、ただ１種のタイプのみから成り、リンパ 球（Ｔ−細胞およびナチュラルキラー細胞）に限られる。インターフェロンＩ型 は、抗ウィルス活性の誘発、細胞の成長及び分化の調節、並びに免疫機能の調整 を含む多様な生物学的過程を仲介する(G.C．Sen & P．Lengyel，J．Biol．Chem. ，267:5017-5020(1992); S．Pestka & J.A．Langer，Ann．Rev．Biochem.，56:7 27-777(1987))。Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β遺伝子類を含む）の 発現誘発は典型的にはウィルス感染に続いて検出される。多くの研究によって、 Ｉ型ＩＦＮの発現調節に必要なプロモータ成分および転写因子が同定された（W ．Du，D．Thanos & T．Maniatis，Cell 74:887-898(1993); T．Matsuyama，T．K imura，M．Kitagawa，K．Pfeffer，T．Kawakami，N．Watanabe，T.M．Kundig，R ．Amakawa，K．Kishihara，A．Wakeham，J．Potter，C.L．Furlonger，A．Naren dran，H．Suzuki，P.S．Ohashi，C.J．Paige，T．Taniguchi & T.W．Mak，Cell 75:83-97(1993); N．Tanaka & T．Taniguchi，Adv．Immunol.，52:263-281(1992 )）。しかしながら、ウィルス感染を細胞に知らせる生化学上のきっかけおよび 必要な報知メカニズムが何であるかは不明のままである（インターフェロン系に 関する最近の概説については、Jaramillo ら、Cancer Investigation 13:327-33 7(1995)を参照されたい）。 ＩＦＮは、正常および癌化表現型を有する種々の細胞の成長を抑制する能力を 有する負の成長因子類に属する。ＩＦＮ治療は、ヒトの悪性疾患、例えばカポジ 肉腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキン型リンパ腫および毛様細胞白血病の治療と ともに感染性疾患、例えばパピローマウィルス（性器いぼ）並びにＢおよびＣ型 肝炎の治療に有益であることが示されている(概説：Gutterman，Proc．Natl．Ac ad．Sci.，91:1198-1205(1994))。最近、遺伝子工学的に細菌で産生されたＩＦ Ｎ−βは、米国だけで少なくとも 250,000人が罹患している比較的一般的な神経 疾患である多発性硬化症の治療用に承認された。 現在のところ、治療用インターフェロンは２つの主要な源から製造される。ヒ ト白血球または白血球細胞系由来の天然ＩＦＮおよび細菌細胞で製造される組換 えＩＦＮがそれである。天然ＩＦＮは、それがその完全な捕体からなり、かつ適 切な構造を有するので優れていると考えられるが、高価で製造に時間を必要とす る。細菌によって製造される組換えＩＦＮは、安価で製造はより効率的であるが 、細菌産生タンパク質に対する拒絶反応率、特に長期使用後の拒絶反応率がはる かに高いことが研究によりわかった。例えば、抗体生成によって反映されるよう に細菌産生ＩＦＮに対する拒絶反応発生率は、天然ＩＦＮ−αでわずか 1.2％で あるのに較べ20〜38％もの高さを有することが、これまでの医学的実験によって 示された(Antonelliら、J．Inf．Disease，163:882-885(1991):Quesadaら、J．C lin．Oncology，3:1522-1528(1985)）。したがって、製造価格を下げる天然ＩＦ Ｎ産生増大法は、利点を有するであろう。 ＩＦＮは、その同系のレセプターに結合し、続いてシグナルを伝達し、ＩＦＮ 刺激遺伝子（ＩＳＧ）の誘発をもたらすことによってその生物学的活性を誘導す る。ＩＳＧの幾つかは、性状が決定され、かつその生物学的活性が調べられてい る。もっともよく解明されたＩＳＧの例として、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）依 存キナーゼ（ｄｓＲＮＡ−ＰＫＲ、または単にＰＫＲ、以前にはｐ６８キナーゼ として知られていた）、2'−5'連結オリゴアデニレート（２−５Ａ）合成酵素お よびＭｘタンパク質が挙げられる（J.L．Taylor & S.E．Grossberg，Virus Rese arch，15:1-26(1990); B.R.G．Williams，Eur．J．Biochem.，200:1-11(1991)） 。 ＰＫＲ（タンパク質キナーゼRNA 依存“protein kinase RNA-dependent”の略 ）は、キナーゼ活性を有することが知られている唯一の同定されたｄｓＲＮＡ結 合 タンパク質である。ＰＫＲは、その酵素活性のためにｄｓＲＮＡとの結合および その結果の自己リン酸化を必要とするセリン／トレオニンキナーゼである(J．Ga labru & A．Hovanessian，J．Biol．Chem.，262:15538-15544(1987); E．Meurs ，K．Chong，J．Galabru，N.S．Thomas，I.M．Kerr，B.R.G．Williams & A.G．H ovanessian，Cell 62:379-390(1990))。ＰＫＲは文献ではまた、ｄｓＲＮＡ活性 化タンパクキナーゼ、Ｐ１／ｅ１Ｆ２キナーゼ、ｄｓＲＮＡ活性化抑制物質のた めのＤＡＩまたはｄｓＩ、およびｐ６８（ヒト）またはｐ６５（ネズミ）キナー ゼと呼ばれている。類似の酵素がウサギの網状赤血球、ネズミの種々の組織、お よびヒト末梢血の単核球で報告されている(Farrelら、Cell，11:187-200(1977); Levinら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75:1121-1125(1987); Hovanessian，Bi ochimie，62:775-778(1980);Krustら、Virology 120:240-246(1982); Buffet-Ja nvresseら、J．Interferon Res.，6:85-96(1986))。最もよく性状が調べられた ＰＫＲのインビボ基質は真核細胞の開始因子−２のアルファサブユニット（euka ryotic initiation factor-2(eIF-2a)）で、これは一旦リン酸化されると細胞お よびウイルスタンパク質の合成を完全に抑制する(J.W.B．Hershey，Ann．Rev．B iochem．60:717-755(1991))。ＰＫＲのこの特定の機能は、ＩＦＮ−αおよびＩ ＦＮ−βの抗ウィルスおよび抗増殖活性を仲介するために必要なメカニズムの１ つとして示唆された。ＰＫＲのまた別の生物学的機能はシグナル誘導物質（tran sducer）としての推定される役割である。クマー(Kumar)らは、ＰＫＲがＩκＢ αをリン酸化でき、その結果、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の遊離および活性化を 生じることを示した（A．Kumar，J．Haque，J．Lacoste，J．Hiscott & B.R.G． Williams，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:6288-6292(1994)）。ＩＦＮ−βプ ロモータに十分に性状が明らかにされたＮＦ−κＢ部位が与えられると、ＩＦＮ −β転写のｄｓＲＮＡ活性化をＰＫＲが仲介するメカニズムを明らかにするかも しれない（K.V．Visvanathan & S．Goodbourne，EMBO J.，8:1129-1138(1989)） 。 驚くべきことに、本発明者らはある種のＩＳＧの発現操作がインターフェロン 製造に有益な用途をもつことを見出した。ＰＫＲタンパク質の過剰発現は、ＩＦ Ｎ−αおよびＩＦＮ−βインターフェロンの過剰産生を誘発し、これは、動物細 胞培養でインターフェロンの産生を高めるのに有用である。関連文献 現在のところインターフェロンの大規模製造には２つの主要な方法がある。細 菌細胞もしくはホ乳類細胞で組換えＩＦＮを製造するか、またはウィルスもしく は他のＩＦＮ誘発因子による刺激後、ヒト白血球細胞から天然ＩＦＮを得るもの である。米国特許第 5,376,567号および同 4,966,843号は、チャイニーズハムス ター卵巣細胞での組換えヒトインターフェロンの製造を開示し、米国特許第 5,1 96,323号は、大腸菌細胞(E．coli)での組換えヒトＩＦＮ−αの製造を開示する 。多数の特許が、種々のプロトコルを用いてヒト白血球細胞でのインターフェロ ンの製造を開示している。例えば、米国特許第 4,745,053号は、ウィルス性誘発 因子を用いて完全なヒトの血液からインターフェロンを製造する方法を開示し、 米国特許第 4,680,261号は、アスコルビン酸誘導体または無機バナジウム化合物 を用いてホ乳類細胞培養でインターフェロン産生を誘発する方法を開示し、さら に米国特許第 4,548,900号は、予備処理(priming)段階で多価アルコールを用い てインターフェロンを誘発する方法を開示している。これまでのインターフェロ ン製造方法の主要な欠点は、ウィルス以外の誘発物質では殆どの実用的な目的に 見合う十分に高いインターフェロンレベルを誘発することができないので、ＩＦ Ｎ誘発物質として典型的にはウィルスが用いられるということである。その後、 このウィルスは使用前にインターフェロンから除去しなければならないが、この ためにこの製造方法には時間とコストが付加される。さらに、誘発物質としてウ ィルスを使用することは、最終的にはインターフェロン産生細胞の死をもたらし 、その結果、細胞のリサイクルと再使用は不可能である。 本発明は、高レベルのインターフェロン産生を達成するためにウィルス誘発物 質の使用を必要としないインターフェロン産生系を提供することによってこれら の問題を克服した。ウィルス誘発物質を本発明の系で用いることができるが、Ｉ ＦＮを使用する前に除去を必要とする他の誘発物質もまた実用的に許容できるレ ベルでＩＦＮを産生させることができる。 発明の要旨 本発明の目的は、誘発物質としてウィルスを添加することなく、動物細胞培養 でインターフェロン産生を高める方法を提供することである。 本目的は一般に、インターフェロン遺伝子の発現が正常な発現レベルより実質 的に増加した動物細胞培養を提供することによって達成される。これは、インタ ーフェロンレベルを調節するためにインビボで機能する因子の発現レベルを操作 することによって達成できるが、これら因子には、インターフェロン転写調節因 子（例えばＩＲＦ１）、インターフェロンレセプターおよびインターフェロン刺 激遺伝子産物（例えばＰＫＲおよび２−５Ａ合成酵素）が含まれる。 したがって、ＩＮＦの産生増大および以下で明らかになる本発明の他の目的は 、インターフェロン調節タンパク質活性、特に二本鎖ＲＮＡ依存キナーゼ（ＰＲ Ｋ）および2'−5'オリゴアデニレート合成酵素（２−５Ａ合成酵素）に対する活 性が正常レベルより顕著に増加した動物細胞培養でインターフェロン製造を実施 することによって達成される。 図面の簡単な説明 図１。ｐＣＭＶ−ＰＫＲおよびｐＭＴ−ＰＫＲの模式図。１（Ａ）はヒトサイ トメガロウィルスの極初期遺伝子（immediate early gene）由来プロモータ配列 によって駆動されるセンス方向にあるヒトＰＫＲｃＤＮＡを表示するｐＣＭＶ− ＰＫＲの模式図。１（Ｂ）はカドミウム誘発性メタロチオネインIIプロモータに よって駆動されるセンス方向にあるヒトＰＫＲｃＤＮＡを表示するｐＭＴ−ＰＫ Ｒの模式図。 図２。Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞およびコントロールＵ９３７−ｎｅｏ細胞のイ ンターフェロン誘発。Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞およびＵ９３７−ｎｅｏ細胞(0.5 ×10⁶／ｍｌ)は、５％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養し た。細胞を10ｎＭのＰＭＡで20時間予備処理（“primed”と称する）するかまた は予備処理しないで、続いて10μｇ／ｍｌのポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）または 0.1ＴＣＩＤ₅₀／細胞のＥＭＣＶで20時間誘発した。誘発後24時間して、培養上 清を採集し、ＩＦＮ−αについてアッセイした。白色棒線はＵ９３７−ｎｅｏ細 胞を示し、斜線入り棒線はＵ９３７−ＰＫＲ＋細胞を示す。実験群は以下の種々 の処理を表示している。１は処理なし、２はポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）誘発の み、３はＥＭＣＶ誘発のみ、４はＰＭＡ予備処理のみ、５はＰＭＡ予備処理とポ リｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）誘発、６はＰＭＡ予備処理とＥＭＣＶ誘発である。 具体的な態様の説明 本発明は、細胞培養におけるインターフェロン産生レベルが、インビボでイン ターフェロン発現およびインターフェロン活性を通常調節するある種の因子の発 現または活性を操作することによって調節できるという発明者らが見出したこと に一部依拠する。これらの因子には、インターフェロン特異的転写調節因子（特 にＩＲＦ１）、インターフェロンレセプター、及びある種のインターフェロン刺 激遺伝子（インターフェロン仲介抗ウィルス反応とも呼ばれる）の遺伝子産物が 含まれる。これら因子のいずれかの発現または活性を高めると、正常レベルより 高いインターフェロン遺伝子発現がもたらされる。この正常より高いインターフ ェロン発現の結果の１つは、はるかに効率がよくコストが低いインターフェロン 製造を達成できるということである。本明細書の以下の部分ではＰＫＲを例に説 明するが、本明細書で述べる他のインターフェロン増強因子をＰＫＲの代わりに 用いることができることは理解されよう。 動物細胞でＰＫＲタンパク質（したがってＰＫＲ活性）レベルを高めることに よって、インターフェロン産生を増大させることができる。ＰＫＲをより高い構 造的レベルで発現する動物細胞培養またはＰＫＲ発現がより高いレベルにまで誘 発可能な動物細胞培養は、したがってインターフェロン製造に役立つ。細胞培養 でインターフェロンを産生させることと密接な関係がある問題、例えば収量の低 さ、インターフェロン発現を誘発するために用いたウィルスの混入は、本発明の 方法では排除される。したがって、高収量のインターフェロンタンパク質をウィ ルスによる誘発なしに（さらに高いＩＮＦ産生のためにウィルスを用いることが できるが）得ることができる。 本方法は、インターフェロン源としてＰＫＲ−過剰産生細胞を使用することに よるが、インターフェロン産生について既に知られているかまたは後に発見され る何れの方法も用いることができる。典型的には非ウィルス性インターフェロン 誘発物質が用いられるという点を除いて、インターフェロン産生の特別な方法は 要求されない。特に本方法は、(a)ＰＫＲを過剰産生するのに十分な条件下でＰ ＫＲまたはＰＫＲの類似体もしくは相同体を過剰産生することができる動物細胞 培養を培養する工程、および(b)インターフェロン遺伝子、特にＩＦＮ−βおよ びＩ ＦＮ−αの発現を適切に誘発するように細胞培養を処理する工程を有する。これ らの工程は一般に産生インターフェロンの精製を伴う。いくつかの事例では、過 剰産生されるものはＰＫＲそれ自体ではなくＰＫＲの類似体である。ＰＫＲの類 似体とは、インターフェロン転写のｄｓＲＮＡ活性化を仲介することができる非 天然タンパク質キナーゼを指す（これらは選択動物細胞系由来の特定のＰＫＲを コードする遺伝子の遺伝子工学的操作によって通常得られる）。インターフェロ ン産生に用いられる細胞培養は、インターフェロン産生に用いられる何れの動物 細胞株由来のＰＫＲも過剰産生させることができる。これらは、例えばウサギ網 状赤血球、種々のマウス組織またはヒト末梢血単核球で通常見出されるＰＫＲで ある。通常は、特定の細胞系の天然ＰＫＲ（外来性ＰＫＲに対して）が過剰産生 に用いられる。好ましくはネズミｐ６５キナーゼ、最も好ましくはヒトｐ６８キ ナーゼが、それぞれ対応するネズミまたはヒト細胞培養で過剰産生される。 ＰＫＲ遺伝子を過剰産生させることができる動物細胞培養は、当業界で周知の 多くの方法を含むいずれの方法でも単離できる。そのような方法には、より高レ ベルのＰＫＲを発現する細胞の選別、構造的プロモータ（例えばＣＭＶ、ＲＳＶ またはＳＶ４０プロモータ）の制御下のＰＫＲ遺伝子（またはｃＤＮＡ）を含む ベクターによる核酸感染、または誘発可能プロモータ（例えば熱ショックプロモ ータ、メタロチオネインプロモータまたはグルココルチコイドプロモータ）の制 御下のＰＫＲ遺伝子またはｃＤＮＡを含むベクターによる核酸感染が含まれる。 核酸感染を、以前に記載したように行い、核酸感染体をＰＫＲの過剰産生につい て選別する。ＰＫＲの過剰産生とは、正常レベルより高いＰＫＲ活性を意味する 。正常とは、用いる細胞系にとって正常な条件下にあることを意味し（これにつ いては、例えば商業ルートにある細胞のカタログ、特にアメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ロックビル、メ リーランド、USA)から入手可能なATCC菌細胞株カタログ、または用いられる細胞 株について記載されている学術的刊行物（該細胞系が商業ルートで入手できない 場合）で示唆している培養条件を参照されたい）、さらに種々の態様において、 産生細胞系が遺伝子工学的に選別または作製される親細胞系と他の点で同一な条 件下におけるＩＦＮ産生を意味する。正常レベルより高いとは、正常なＰＲＫレ ベ ルの好ましくは少なくとも 150％、より好ましくは少なくとも 200または 300％ 、最も好ましくは少なくとも 500％を意味する。ＰＫＲ過剰産生細胞培養は、培 養を単離または調製するのに用いられた特定の方法により、ＰＫＲ過剰産生につ いて構造的であってもよいし、ＰＫＲ過剰産生について誘発可能であってもよい 。好ましくはＰＫＲ過剰産生細胞培養は、ＩＦＮ誘発に利用されるＰＫＲレベル を調節するためにＰＫＲ過剰産生を誘発することができるものであろう。ＰＫＲ 過剰産生細胞培養が過剰産生を誘発することができる場合、過剰産生についての ＰＫＲ活性を誘発条件下でアッセイできることは明白であろう。ＰＫＲ活性は、 当業界で既知であるかまたは以下の実施例で述べるいずれの方法でも測定できる 。 ＰＫＲ過剰産生細胞培養を作製するための親株として、既知の多数の細胞培養 のいずれも有用である。正常にインターフェロンを産生できるいずれの細胞も親 株として適切であり、Ｂ細胞および単球を含む線維芽細胞または免疫細胞由来の 細胞が特に適切である。特に適切な細胞培養は、原始単球Ｕ９３７細胞、Ｎａｍ ａｌｗａ（Ｂ類リンパ芽球）細胞およびＭＲＣ−５細胞（ヒト線維芽細胞）であ る。また適切な細胞はＷＩ−３８細胞、Ｆｌｏｗ１０００細胞、Ｆｌｏｗ４００ ０細胞、ＦＳ−４およびＦＳ−７細胞、ＭＧ−６３細胞、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞お よびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞である。 ＰＫＲ過剰産生細胞培養でのインターフェロン産生は、当業界で周知の方法に よって達成される。一般にインターフェロン産生細胞は適切ないずれかの培養液 で培養され、インターフェロン発現を誘発するために誘発物質（ＰＫＲが誘発可 能なプロモータの制御下にある場合はＰＫＲ遺伝子の誘発物質）で処理され、イ ンターフェロン産生の誘発に続いてインキュベートする。その後、インターフェ ロンを単離する。細胞は予備処理剤(Priming agent)の添加により誘発前に予備 処理される。インターフェロン誘発物質は当業界で多数存在し周知であるが、ほ ぼ全ての既知のインターフェロン誘発物質を本発明に用いることができる。典型 的な誘発物質にはポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）、センダイウィルス、ニューカッスル 病ウィルス、コンカナバリンＡ、クラミジア、リケッチア、有糸分裂促進剤、脂 質多糖類が含まれる。誘発物質は非ウィルス性誘発物質であるのが好ましい。よ り好ましくは、誘発物質はポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ （Ｃ）である。細胞がウィルスに曝されることによってもたらされる有害な結果 を受けず、したがって製造コストを下げることができる再使用のために細胞を再 生利用できるので、非ウィルス性誘発物質が好ましい。典型的な予備処理剤には ホルボールミリステートアセテート、カルシウムイオノフアおよびインターフェ ロンが含まれる。 当業界で周知の標準的技術でＩＦＮを精製する。このような技術には、抗体親 和性カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、タンパク質沈 澱および遠心分離（米国特許第 5,391,713号）；ＣＭ−アガロース、ｃｏｎＡ− アガロースおよびフェニルアガロースを用いるクロマトグラフィー（米国特許第 4,658,017号）；ガラスソルベント(sorbent)による三段階クロマトグラフィー （米国特許第 4,732,683号）；免疫親和性クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、 陽イオン交換カラムおよびゲルろ過（米国特許第 4,765,903号）；溶媒としてグ アニジンＨＣｌを用いるＨＩＣカラムクロマトグラフィー（米国特許第 4,845,0 32号）が含まれる。 調製物中のＩＦＮ−αレベルは、国立アレルギー感染症研究所(National Inst itute of Allergy and Infectious Diseases)の参照スタンダードG-023-901-527 (Lau ら、J．Clin．Invest．82:1415-1421(1988))に対してＬ９２９（ネズミの 線維芽細胞）細胞で抗ウィルス活性を定量することによって決定できる。この方 法では、５×10⁴Ｌ９２９細胞を96ウェルの微量定量盤の各ウェルに播種し、続 いて２倍段階希釈の培養上清とともに16時間インキュベートする。続いてこの細 胞をＥＭＣＶまたはセンダイウィルス(0.1または0.01ＴＣＩＤ／細胞）で攻撃す る。顕微鏡的検査および0.1％クリスタルバイオレットの５％エタノール溶液で 細胞を染色することによりウィルス誘発細胞障害効果を調べる。ＩＦＮ力価は、 ウィルス誘発細胞障害効果から細胞を50％保護することができる培養上清の最高 希釈の逆数として表される。 以下の実施例で上記の工程の具体的な例を説明する。しかしながら、多くの変 更が可能であり、さらにこれら実施例は例示を目的とし、特定しないかぎり本発 明を制限するものではないことは当業者には明白であろう。 実施例 実施例１：構造的ＰＫＲ過剰発現細胞培養の調製 プラスミドｐＣＭＶ−ＰＫＲは、ｐＲＣ／ＣＭＶベクターのＨｉｎｄIII部位 にｐＢＳ−８．６Ｒから得たＰＫＲ ｃＤＮＡを挿入し、その結果ＰＫＲをコー ドする配列の発現がＣＭＶプロモータによって制御されるようにして調製した。 ｐＲＣ／ＣＭＶプラスミド（Invitrogen）は真核細胞での発現に一般的に用いら れている。このベクターはＰＫＲ転写に適切な以下の特性を提供する。i)高レベ ル転写に必要なヒトＣＭＶ（サイトメガロウィルス）の極初期遺伝子（immediat e early gene）のプロモータ配列;ii)ＲＮＡ安定性強化に必要なウシ成長ホルモ ン（ＢＧＨ）遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列；iii)エピソ ーム性複製および簡単なベクター回収に必要なＳＶ４０複製開始点;iv)センスお よびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写に必要な多数のクローニング部位に接 するＴ７およびＳｐ６ ＲＮＡプロモータ；およびv)大腸菌(E．coli)での選別 と維持に必要なアンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）およびＣｏｌＥ１複製開始点 である。このベクターはまたＧ４１８耐性マーカー（ＮＥＯ）を含み、真核細胞 に移された後このプラスミドの選別及び同定を可能にする。ｐＣＭＶ−ＰＫＲの 構造を図１Ａに示す。 安定な核酸感染体は、ＤＥＡＥデキストラン（50ｍｇ／ｍｌ）含有無血清ＲＰ ＭＩ−１６４０中で各プラスミド10ｍｇ、ジーンパルサー(Gene Pulser)装置(Bi oRad)（500μＦ、 250Ｖに設定）を用いて対数増殖期の５×10⁶個のＵ９３７細 胞に電気的穿孔を施して得た。安定な核酸感染体の大集団をジェネチシン（gene ticin）400μｇ／ｍｌ(GIBCO-BRL)による３週間の選別で得た。限定希釈クロー ニングにより続いてクローン系を得た。細胞系を10％ウシ胎児血清及びジェネチ シンを含むＲＰＭＩ−１６４０（完全培養液）で培養した。核酸感染細胞系の代 表例を１つ選別し、“Ｕ９３７−ＰＫＲ＋”と名付けた。Ｕ９３７−ＰＫＲ＋で 産生されるＰＫＲレベルを調べたところ、正常（親）レベルの約５倍に増加して いることが分かった。コントロールとして、Ｕ９３７細胞をｐＲＣ／ＣＭＶで核 酸感染し、代表的な核酸感染細胞系を単離し、“Ｕ９３７−ｎｅｏ”と名付けた 。予備処理剤および／または誘発物質の存在下または非存在下でＩＦＮ産生に ついて、この核酸感染細胞系を調べた。 Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞およびＵ９３７−ｎｅｏ細胞をウシ胎児血清補充ＲＰ ＭＩ１６４０培養液で培養した。細胞をホルボールミリステートアセテート（Ｐ ＭＡ）（10ｎＭ）の存在下または非存在下で20時間予備処理し、続いてこれをポ リｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）（10μｇ／ｍｌ、20時間）で刺激し、または刺激を与えな かった。ポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）による刺激後24時間して、培養上清をＩＦＮア ッセイのために採集した。 図２に示すように、予備処理剤または誘発物質の非存在下ではいずれの核酸感 染細胞株も偶発的なＩＦＮを産生しなかった。ポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）に応 答して、コントロールのＵ９３７−ｎｅｏ細胞は、ＰＭＡ予備処理がある場合も ない場合もごく少ないＩＦＮ−αの合成を示した（白棒線２および５）。対照的 に、Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞は、ＰＭＡの予備処理がある場合もない場合もポリ ｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）に応答してＩＦＮ産生が増大し、ポリｒ（Ｉ）：ポリｒ （Ｃ）及びＰＭＡの双方で処理した場合、4000Ｕ／ｍｌのレベルに達した。ＰＭ Ａ予備処理を行なわない場合、ＥＭＣＶは両方の核酸感染細胞系で高レベルのＩ ＦＮを誘発し（1000Ｕ／ｍｌ超）、Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞でそのレベルは僅か に高かった（棒線３）。ＥＭＣＶまたはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）誘発物質の 非存在下で、Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞は、単独ＰＭＡ予備処理に応答するＵ９３ ７−ｎｅｏ細胞よりも高レベルのＩＦＮを産生した（棒線４）。ＰＭＡ予備処理 とＥＭＣＶ誘発を用いた場合、両核酸感染細胞系は4000Ｕ／ｍｌを越える高いＩ ＦＮを産生した（棒線６）。総合すれば、これらの結果から、ＰＭＡによる予備 処理に続いて、Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞は、誘発物質としてポリｒ（Ｉ）：ポリ ｒ（Ｃ）を用いた場合、誘発物質としてウィルスを用いた場合のコントロール細 胞と同じように効率的にＩＦＮを産生することがわかる。したがって、ＰＫＲ過 剰産生細胞を使用する場合、ＩＦＮ産生に生ウィルスの使用を避けることができ る。 ポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）による誘発に続いて、Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞を トリパンブルー排除アッセイを用いて生存度について調べた。95％を越える細胞 が生細胞であることが分かった。対照的に、誘発物質としてＥＭＣＶを用いた場 合、全細胞が死滅した。したがって、Ｕ９３７−ＰＫＲ＋細胞はＩＦＮの連続産 生に再利用することができる。実施例２：誘発可能ＰＫＲ過剰発現細胞培養の調製 プラスミドｐＭＴ−ＰＫＲは、ｐＣＭＶ−ＰＫＲのＰＫＲクローニング部位の 上流のＣＭＶプロモータをカドミウム誘発可能メタロチオネインIIプロモータで 置き換えることによって作製した(Hewisonら、J．Immunol．153:5709-5719(1994 ))。ｐＭＴ−ＰＫＲの構造を図ＩＢに示す。Ｕ９３７細胞への安定なｐＭＴ−Ｐ ＫＲ核酸感染体を、ｐＣＭＶ−ＰＫＲ核酸感染体について実施例１で述べたよう に単離した。ＭＴIIプロモータは亜鉛またはカドミウムイオンで誘発可能である 。核酸感染体のＰＫＲ活性レベルを、核酸感染させたＰＫＲ遺伝子を20μＭ塩化 カドミウムを添加して誘発した後測定した。 本明細書で述べた全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物および特許出 願が具体的にかつ個々に参照により本明細書に含まれるように、参照により本明 細書に含まれる。 本発明をこれまでのところで十分に説明してきたが、多くの変更および改変が 本発明の範囲を逸脱することなく為しえることは当業者には明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロウ、アラン、エス. アメリカ合衆国 94110 カリフォルニア 州 サンフランシスコ ポトレロ アベニ ュー 1001 ユニバーシティ オブ カリ フォルニア デパートメント オブ ペデ ィアトリックス ルーム ６イー６ エス エフジーエイチ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．動物細胞培養でインターフェロンを製造する方法であって、(a)ＰＫＲを過 剰産生するのに十分な条件下で動物細胞培養を培養する工程、及び(b)培養を処 理してインターフェロン産生を誘発する工程を有する、上記方法。 ２．動物細胞培養でインターフェロンを製造する方法であって、(a)ＰＫＲの類 似体を過剰産生するのに十分な条件下で動物細胞培養を培養する工程、及び(b) 培養を処理してインターフェロン産生を誘発する工程を有する、上記方法。 ３．類似体がマウス組織から得ることができる請求項２記載の方法。 ４．類似体がネズミｐ６５キナーゼである請求項３記載の方法。 ５．類似体がウサギ網状赤血球から得ることができる請求項２記載の方法。 ６．類似体がヒト末梢血単核球から得ることができる請求項２記載の方法。 ７．ＰＫＲがヒトｐ６８キナーゼである請求項１記載の方法。 ８．インターフェロン産生が非ウィルス性誘発物質で誘発される請求項１記載の 方法。 ９．非ウィルス性誘発物質がポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）またはポリｒ（Ｉ）：ポリ ｒ（Ｃ）である請求項８記載の方法。 10．工程(a)が予備処理剤で処理することをさらに有する請求項１記載の方法。 11．産生されたインターフェロンを精製する工程をさらに有する請求項１記載の 方法。 12．動物細胞培養が、常態でインターフェロンを産生することができる親細胞に 由来する請求項１記載の方法。 13．ＰＫＲの過剰産生が、プロモータの制御下でＰＫＲをコードするＤＮＡを含 むベクターを親細胞に核酸感染させることによって達成される請求項12記載の方 法。 14．プロモータが誘発可能プロモータである請求項13記載の方法。 15．誘発可能プロモータがメタロチオネインプロモータである請求項14記載の方 法。 16．親細胞がＵ９３７細胞である請求項12記載の方法。