DE10104094C1

DE10104094C1 - Verfahren zur Erhöhung der Virusvermehrung und Virusausbeute in Zellkulturen, durch Blockade der RNaseL-Aktivierung

Info

Publication number: DE10104094C1
Application number: DE2001104094
Authority: DE
Inventors: Angelika Vallbracht-Flehmig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2002-07-25
Anticipated expiration: 2021-02-01
Also published as: AU2002224974A8; WO2002061054A3; AU2002224974A1; WO2002061054A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Virusvermehrung und Virusausbeute in Zellkulturen, durch Blockade der RNaseL-Aktivierung durch den Zusatz von RNaseL-Inhibitoren oder von Inhibitoren der 2-5-Oligoadenylat(2-5A)Synthese zum Kulturmedium.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Erhöhung der Virus vermehrung und Virusausbeute in Zellkulturen, durch Blockade der RNaseL- Aktivierung durch Zusatz von RNaseL-Inhibitoren oder Inhibierung der 2-5-Oligoadenylat (2-5A) Synthese.

Viren werden in großem Umfang zur Herstellung von Impfstoffen, für diagnosti sche Zwecke und für die wissenschaftliche Forschung benötigt. Da die Viren sich nicht selbst vermehren, ist ihre Vermehrung nur in geeigneten Zellkulturen möglich. Die Isolation der so produzierten Viren erfolgt aus dem Zellüberstand oder aus dem Zellinhalt nach Aufschluß der Zellen, wobei die Gewinnung ausreichender Mengen mit einem hohen Kosten- und Zeitaufwand verbunden ist.

Es stellt sich daher die Aufgabe, die Kulturbedingungen so zu verändern, daß die Vermehrungsrate und Ausbeute an Viren gesteigert wird.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Hauptanspruchs gelöst und durch die der Unteransprüche gefördert.

Säugetiere und auch Menschen verfügen über ein mehrstufiges zelluläres anti virales Abwehrsystem, das auf der durch verschiedene Viren induzierten Inter feron-Sekretion basiert. In einer weiteren Stufe der Abwehrkaskade wird die Expression von 2'-5' Oligoadenylatsynthetasen (2-5AS) durch das Interferon (IFN) stark hochreguliert. In einem weiteren Schritt werden diese Moleküle durch ds RNA, welche aus den Viren stammen kann, aktiviert. Die aktivierte 2-5AS katalysiert die Synthese von 2'-5'Oligoadenylaten (2-5A), die mit hoher Affinität an die latente Endoribonuclease L (RNaseL) binden und diese via Dimerisierung aktivieren. Die aktivierte RNaseL spaltet einzelsträngige RNA (mRNA, 28SrmA), was zu einer Inhibition der Translation führt. Präferentiell aber wird von dieser aktivierten RNaseL virale RNA abgebaut und somit die Neubildung von Viren unterbunden. Die aktivierte RNaseL spielt somit als Effektormolekül eine wesentliche Rolle im zellulären Abwehrsystem, das auf der virusinduzierten Interferon-Sekretion basiert.

Es konnte aber gezeigt werden, daß bestimmte Viren, wie EMCV, Herpes oder HIV, über ihre RNA die Bildung eines RLI genannten Polypeptides in der Zelle induzieren, welches an die RNaseL bindet, die Aktivierung durch 2-5A hierdurch verhindert und das Interferon-induzierte Abwehrsystem über die RNaseL als Effektormolekül somit ausschaltet (Bisbal et al. "Cloning and characterization of RNaseL inhibitor", J. Biol. Chem. 270, 13308-17 (1995)). In der WO 96/10636 wird daher vorgeschlagen, Inhibitoren des RLI einzusetzen, um die antivirale Kette wiederherzustellen und eine natürliche über Interferon vermittelte Virusabwehr wieder in Funktion zu setzen.

In experimentellen Untersuchungen konnten wir zeigen, daß das Hepatitis A-Virus (HAV) in menschlichen und nichtmenschlichen Primatenzellen in vitro nicht zur Induktion von Interferon α oder β führt. Es konnten weder biologisch aktive IFNe noch Transkripte der Interferongene detektiert werden. Der vorstehend geschil derte Abwehrmechanismus ist daher gegen HAV nicht aktiviert. Um so überraschender war der Befund, daß in HAV-infizierten Zellen durch Zugabe von RLI eine signifikante Erhöhung der HAV-Replikationsrate erreicht wurde. Dieser erstaunliche Befund spricht für eine IFN-unabhängige Regulation der HAV- Replikation in Zellkulturen, die aber ebenfalls über die RNaseL als Effektormolekül abläuft, welche in einer bisher unbekannten Weise aktiviert wird. Die unabhängig von IFN aktivierte RNaseL könnte durch eine kontinuierliche Degradation der viralen RNA das Kontrollprinzip sein, das über die Begrenzung der Viruslast zum beobachteten Gleichgewicht von Zellmetabolismus und Virusreplikation und somit zur Persistenz des HAV in der Zellkultur führt. Zur Gewinnung von HAV aus geeigneten Zellkulturen jedweder Herkunft z. B. zur Produktion von HAV- Impfstoffen oder HAV-Antigen für diagnostische Zwecke kann daher durch Ausschalten dieses Kontrollprinzips die Ausbeute signifikant gesteigert werden. Eine besonders vorteilhafte Zuführung von RLI besteht in einer genetischen Veränderung der Zellkultur durch Einfügen eines RLI-codierenden Gens in das Erbgut der Zellen, wodurch RLI von der Zelle selbst kontinuierlich gebildet wird. Auf diesem Weg wird daher der über die RNaseL gesteuerte Abbau der viralen RNA unterbunden.

Experimentelle Untersuchungen, die in den folgenden Beispielen zusammen gefaßt sind, bestätigen, daß die Transfektion von FRhK4-Zellen mit dem RNaseL Inhibitor RLI zu einer signifikanten Steigerung der Ausbeute an infektiösem HAV und HAV-Antigen führt. Das Ausschalten des Effektorenzyms RNaseL kann aber auch über ein antisense Konstrukt oder in dominant negativen bzw. knock out RNaseL Zellen erreicht werden (Maitra et al. "Regulation of human immunodeficiency virus replication by 2',5'-oligoadenylate-dependent RNaseL" J. Virol 72, 1146-52 (1998); Hassel et al. "A dominant negativ mutant of 2-5A- dependent RNaseL suppresses antiproliferative and antiviral effects of interferon" EMBO J. 12, 3297-304 (1993)) als auch anstelle von RLI durch andere Agenzien, die als RNaseL Inhibitoren beschrieben sind (z. B. 2-5A Analoge und 2-5A Abbau produkte) (Cayley, P. J. et al. "Activation of the ppp(A2'p)_nA system in interferon treated, Herpes simplex virus-infected cells and evidence for novel inhibitors of the ppp (A2'p)_nA-dependent RNase" Eur. J. Biochem. 143, 165-74 (1984); Watling, D. et al. "Analogue inhibitor of 2-5A action: effect on the interferon-mediated inhibition of encephalomyocarditis virus replication" EMBO J. 4, 431-36 (1985); Williams, G. J. et al. "Inhibition of 2',5'-oligo (A)-dependent endoribonuclease by 2',5'-oligo (A) degradation products" Virol. 151, 233-42 (1986)).

Aus der wissenschaftlichen Literatur ist nur bekannt, daß die Aktivierung der RNaseL über die von der aktivierten 2-5AS produzierten 2-5A stattfindet. Folgerichtig muß angenommen werden, daß die beobachtete RNaseL-Aktivierung in der HAV-infizierten Zelle über eine Aktivierung der 2-5AS via dsHAV-RNA abläuft. Somit liegt der Schluß nahe, daß neben dem oben beschriebenen direkten Ausschalten des Effektorenzyms RNaseL auch die direkte Blockade des 25A Aktivators oder insbesondere die Blockade des Produzenten des Aktivators, der 2- 5AS, über antisense 2-5AS-Konstrukte (Yaffee, A. et al. "Inhibition of 2-5A synthetase expression by antisense RNA interferes with interferon-mediated antiviral and antiproliferative effects and induces anchorage-independent cell growth" Cell Growth Diff. 8, 969-78 (1996)) zu einer deutlichen Steigerung der HAV-Vermehrung führen muß.

Eine signifikante Steigerung der Virusausbeute über die Blockade der RNaseL Aktivität kann auch in Virus/Zellkultursystemen erreicht werden, in denen in vitro das Kontrollprinzip über die virusinduzierte IFN-Produktion abläuft. Literaturdaten aus in vivo und in vitro Untersuchungen zeigen, daß das 2-5AS/RNaseL System bei einer Vielzahl von Virusinfektionen aktiviert ist (z. B. Picorna-, Vaccinia-, Reo-, Hepatitis C-, Hepatitis B-, HI-Virus) (Goodbourn et al. "Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral responses and virus countermeasures" J. Gen. Virol. 81, 2341-64 (2000)).

Erfindungsgemäß verwendbare Fetal Rhesus Kidney (FRhK4)-Zellen sind bei der American Type Culture Collection unter ATCC No. CRL 1688 und humane Fibro plasten der Type MRc5 unter ATCC No. CCL 171 frei verfügbar. Die Verwendung menschlicher embryonaler Stammzellen und menschlicher Keimzellen ist gemäß EU-Richtline für biotechnologische Erfindungen Art. 6 2b) und c) ausgeschlossen.

Beispiele

Fetal Rhesus Kidney (FRhK4)-Zellen wurden stabil transfiziert mit dem Plasmid pcDNA3/RLI' das die Sequenz der RLI cDNA enthält (Bisbal et al. "Cloning and characterization of RNaseL inhibitor", J. Biol. Chem. 270, 13308-17 (1995)) und uns freundlicherweise von Dr. T. Salehzada und Dr. C. Bisbal, Montpellier, zur Verfügung gestellt wurde. Als Kontrollen dienten nicht transfizierte und mit dem Plasmid pcDNA3/RLI3'- (aus dem das RLI-ORF durch Restriktionsspaltung entfernt wurde) transfizierte FRhK4-Zellen. Die stabil transfizierten Klone FRhK4 RLI+ und FRhK4 RLI- als auch nicht transfizierte FRhK4-Kontrollzellen wurden mit dem HAV Stamm GBM mit einer m. oi. von 0.05 infiziert und bei 37°C über 15 Tage inkubiert. Zu den in den Tabellen angegebenen Zeiten wurden die Zellen aufgeschlossen und der Zellinhalt zusammen mit dem Überstand quantitativ auf infektiöses HAV (TCID50) und HAV-Antigen (ELISA) getestet.

Tabelle 1 zeigt den Verlauf der Produktion von infektiösem HAV (TCID50) über 15 Tage. Aus Tabelle 1 wird ersichtlich, daß bereits 2 Tage p. i, ein um das 10-fache, 4 Tage p. i. ein um das 100-fache erhöhter Titer in den RLI+ Zellen erreicht wird. Die Differenz zu den nichttransifizierten FRhK4-Zellen betrug im Endtiter nach 15 Tagen eine log₁₀ Stufe.

Tabelle 2 zeigt die signifikante Produktionserhöhung von HAV-Antigen 10 bzw. 15 Tage p. i. in RLI+ Zellen im Vergleich zu RLI- und nicht transfizierten Kontroll zellen.

Vergleichbare Ergebnisse konnten, wie in Tabelle 1 und 2 dargestellt, mit dem HAV Stamm HAV/HM175 und HAV_cytHB1.1/HM175 erzielt werden.

Claims

1. Verfahren zur Erhöhung der Virusvermehrung und Virusausbeute in Zell kulturen, gekennzeichnet durch Blockade der RNaseL-Aktivierung durch den Zusatz von RNaseL-Inhibitoren oder von Inhibitoren der 2-5-Oligoadenylat (2-5A) Synthese zum Kulturmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Viren Hepa titis A-Viren sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Kulturlösung RLI oder andere RNaseL-Inhibitoren zugefügt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen ein konstitutiv exprimiertes RLI-Gen enthalten oder die Produktion von RNaseL inhibiert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen verwendet werden, die keine 2-5AS exprimieren und/oder die Aktivierung der 2-5AS oder der Aktivator 2-5A inhibiert ist.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß FRhK4, humane Fibroblasten insbesondere, humane Nierenzellen oder Verozellen verwendet werden.

7. Verfahren zur Verbesserung und Beschleunigung von Hepatitis A-Virusnach weisverfahren in vitro zum Nachweis der Restinfektiösität in inaktivierten Viruspräparationen oder der Infektiösität von Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendet.