乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体的是涉及乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片。
背景技术
目前,乳腺癌的治疗方法主要有内分泌治疗和化学治疗,内分泌治疗指通过药物或内分泌腺体的切除调整乳腺癌患者体内的雌激素水平,抑制癌细胞的分裂,使肿瘤的发展减慢,其作用速度较化学治疗慢。采用化学抗癌药物治疗癌症,简称“化疗”,在乳腺癌的治疗过程中包括手术前、中和后的化疗,尤以术后的辅助化疗最为常用,其目的是消灭手术后残留的微小癌病灶。
乳腺是性激素依赖性器官,其生长、发育和细胞的增殖均受雌激素和孕激素的影响,雌激素受体(ESR1)、孕激素受体(PGR)是与乳腺癌密切相关的二种激素受体,ESR1和PGR在乳腺癌的形成、发展和对激素反应中起关键的作用。PGR是雌激素作用的最终产物,PGR的合成必须有雌激素启动,PGR的存在说明ESR1酶活正常,两者均位于细胞核内。单独ESR1阳性对内分泌治疗有阳性反应的占55%,ESR1和PGR同时阳性时,对内分泌治疗有阳性反应的可达75%~80%。研究表明,乳腺癌细胞分化程度高,恶性程度低,其ESR1和PGR阳性表达越高,内分泌治疗效果越好,预后越好。因此,检测乳腺癌中ESR1和PGR水平作为乳腺癌内分泌治疗和判断预后的一个重要指标日益受到重视。此外,乳腺癌疗效预测相关的基因还包括:促进增殖基因(MKI67、AURKA、MYBL2、CCNB1和BIRC5);促进肿瘤转移基因(MMP11和CTSL2);激素相关基因(BCL2和SCUBE2);ER2相关基因(GRB7)等。
1.雌激素受体1(Estrogen Receptor 1,ERα,ER,ESR1)
雌激素在乳腺癌发生发展过程中起重要作用,它通过与雌激素受体(ER)的结合,激活含雌激素应答元件(ERE)基因和含有其他转录因子结合元件基因的表达,这些基因参与调控细胞的增殖和分化,进而与乳腺癌的发生和发展密切相关。ER分为ERα(ESR1)和ERβ,其中对ESR1的研究一直是乳腺癌研究的热点。ESR1定位于6号染色体,由595个氨基酸组成,属于核受体超家族成员。早期的乳腺癌病人大约有60%为ESR1阳性,其中2/3的病人对内分泌治疗有效,而且随着肿瘤的发展,部分ESR1阳性病人可能转变为ESR1阴性,同时内分泌治疗也失去疗效。由此可见,乳腺癌发生发展过程中ESR1的表达水平对于乳腺癌疗效预测有重要意义。
2、孕酮受体(progesterone receptor,PGR,PR)
孕酮发挥生理作用是通过其受体PGR介导的,有研究表明,PGR的表达与细胞学分级有密切关系,在反映肿瘤恶性程度上具有重要价值,其阳性表达率越高,则肿瘤的恶性程度越低,患者的预后越好。说明PGR作为乳腺癌的预后因素,对乳腺癌患者的抗雌激素治疗,有一定指导意义。
3、增殖细胞核抗原(antigen identified by monoclonal antibody Ki-67,MKI67,Ki-67)
MKI67抗原是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研究中的热门生物指标,通过MKI67抗原的检测,可以了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。肿瘤增殖MKI67表达范围覆盖除G0期以外的各增殖周期细胞,MKI67在低分化腺癌组织中的表达较在中高分化腺癌组织的表达明显升高,表明MKI67染色阳性程度与组织学分级的相关性,其对乳腺癌的治疗效果及预后评价有重要的参考价值。
4、极光激酶A,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶6(Serine/threonine-protein kinase 6,AURKA)
AURKA属于有丝分裂中丝氨酸-苏氨酸激酶家族。在细胞周期中调节微管的形成过程和纺锤体的稳定过程,AURKA存在于分裂间期细胞的中心小体内和有丝分裂期的纺锤体两端。在细胞的分裂周期中,主要存在于G1和G2期,对于正常细胞的增殖起着重要的作用。同时,它也是致瘤的条件,在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等肿瘤细胞中均过表达。
5、成髓细胞血症致癌基因(v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog(avian)-like 2,MYBL2)
MYBL2是癌基因家族中的一员,其与细胞周期相关,可以导致纤维原细胞的异常增生。
6、细胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)
CCNB1是细胞周期调节蛋白中的成员,在细胞周期中表达不同的量以不同程度地活化周期素依赖性蛋白激酶,从而调节细胞周期的进度。CCNB1蛋白在G2期开始出现,在有丝分裂期间达到最大值,而在细胞分裂周期结束之前又迅速减少。相比普通细胞和组织,肿瘤细胞中CCNB1呈过表达,可作为乳腺癌预后和疗效预测的因素。
7、存活素(Baculoviral IAP Repeat-containing 5(survivin),BIRC5)
BIRC5是IAP家族的一个新成员,是迄今发现最强的凋亡抑制因子,位于17q 25,长度为15kb,含有3个内含子和4个外显子。BIRC5在成人分化成熟的组织中一般不表达或低表达,而在大多数肿瘤组织中表达。对乳腺癌患者临床资料的分析时发现,BIRC5的表达与临床分期之间存在显著性差异,临床分期愈晚,BIRC5蛋白的阳性表达率愈高,提示BIRC5的表达与乳腺癌恶性生物学行为有关,可能参与乳腺癌的发生与发展,是一个有潜在价值的肿瘤标记物。
8、基质金属蛋白酶11(matrix metalloproteinase-11,MMP11)
基质金属蛋白酶(MMPs)是一个Zn+依赖性内肽酶超家族,主要降解细胞外基质中的蛋白质,MMPs通过促进血管形成、刺激生长因子的释放并激活其受体、调节生长因子的活性等而调控肿瘤的发生和肿瘤细胞的生长,协同参与肿瘤的浸润和转移的一系列复杂过程,同时在肿瘤的发生发展,诱导血管生成方面也发挥重要作用。
MMP-11是与乳腺癌转移相关的第一个被分离出的MMPs,功能为降解基质蛋白酶和蛋白多糖的核心蛋白。
9、组织蛋白酶L2(cathepsin L2,CTSL2)
CTSL2编码蛋白属于肽酶C1家族,是一种在角膜生理过程中起重要作用的溶酶体半胱氨酸蛋白酶,这种蛋白仅仅在结直肠癌和乳腺癌中表达,而在正常的结肠、乳腺和癌旁组织均没表达。CTSL2的主要作用是参与溶酶体中的蛋白再循环,同时还广泛地参与了其它生理和病理的过程,包括II类MHC复合体的形成,骨头形状的改变、角化细胞的分化、肿瘤组织的发生和转移,风湿性关节炎等。
10、信号肽,CUB域,EGF样2(signal peptide,CUB domain,EGF-like 2,SCUBE2)
SCUBE2属于进化保守的SCUBE蛋白家族,该蛋白的组成为:N-端与9个EGF样的重复元件相连的信号肽序列结构域,一个间隙区域,三个半胱氨酸富集的重复基序,C端为CUB结构域。研究表明,该基因与乳腺癌疗效预测相关。
11、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma 2,BCL2)
BCL2基因家族包括抑制凋亡的BCL2基因及促进凋亡的bax、bak等基因。BCL2基因位于18q21,其凋亡控制失调是乳腺癌形成的一个重要机制。研究表明,乳腺癌中约60%有BCL2基因表达,并受雌激素的调节,与ER正相关,与表皮生长因子受体、c-cerbB-2、p53呈负相关。BCL2基因及表达与乳腺癌细胞对化疗多药耐药、敏感性差有关,因此BCL2基因也成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。有研究表明,BCL2基因及表达与乳腺癌患者的预后关系密切,可用于判断乳腺癌的预后,以指导有效合理治疗。
12、生长因子受体结合蛋白-7(growth factor receptor-bound protein 7,GRB7)
GRB7是一种与细胞侵染相关的接头分子。
13、谷胱苷肽S-转移酶M1(glu-tathione S-transferase M1,GSTM1)
GSTs家族是人体内参与生物代谢的二相酶系,把活泼带电子的有致癌能力的化合物转化为灭活、无致癌活性的无毒物质后经其他途径排出体外,在人体的生物代谢中起着重要的作用。GSTM1基因属于GSTs基因家族成员,定位于染色体1p13.3区,GSTM1纯合性缺失基因型可导致其产物GSTM1I酶蛋白的表达缺失从而使其对外界的某些致癌物(如多环芳烃化合物)解毒作用缺陷。研究表明,GSTM1基因的纯合性缺失与某些肿瘤,如肺癌、乳腺癌等的发生相关。
14、CD68抗原(CD68 Antigen,CD68)
CD68存在于骨髓和各神经组织的巨噬细胞,用于粒细胞白血病、各种单核细胞来源肿瘤、包括恶性纤维组织细胞瘤的疗效预测。
15、BCL2结合抗凋亡基因1(BCL2-associated athanogene,BAG1)
BAG1基因是一种抗凋亡基因,虽然BAG1不属于Bcl-2家族成员,但是它可以与Bcl-2形成复合物,从而促进抗细胞凋亡的能力。BAG1在正常组织中几乎不表达,而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌及甲状腺癌中均有阳性表达的报道。BAG1可与激素受体结合从而降低激素药物对激素依赖性乳腺癌的治疗作用。
16、聚ADP-核糖聚合酶-1(Polymerase Family Member 1,PARP1)
有研究表明,PARP1基因在转录和翻译水平上的过表达与乳腺癌的分期、病理分级、病理类型、肿瘤转移等临床预后相关因子有关。
17、同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN,MMAC1,TEP1)
抑癌基因PTEN,定位于人染色体10q23,有研究表明,乳腺癌中存在PTEN基因的缺失和突变,乳腺癌15%PTEN蛋白阴性,18%PTEN蛋白表达减弱。PTEN表达的缺失或减弱,不能拮抗蛋白激酶P13K的作用,不能负调控P13K/PKB/Akr信号转导途径,出现该信号转导途径功能异常,从而使乳腺腺泡上皮细胞失去正常细胞的周期调控,细胞过度增殖,细胞恶化。PTEN在乳腺癌中存在异常表达,在乳腺癌的发生、发展中起一定作用,是乳腺癌预后和疗效预测的重要因素。
18、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)
VEGFA与肿瘤的生长与转移关系密切,它介导血管生成、细胞增殖和转移,为肿瘤的血管生成和侵润转移提供了基础。在乳腺癌组织中,肿瘤细胞增殖活性随着VEGFA的表达的增强而增强,淋巴结转移组的微血管密度(MVD)值也随着VEGFA表达增强明显高于未转移组。大量研究报道证实,MVD值的增高预示着瘤体生长速度的加快,转移可能性增大和患者生存期缩短,可作为独立的预后判断因素和治疗效果的指标。
19、内参基因:酸性核糖体磷蛋白大亚基P0(RPLP0)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)、β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶(GUSB)、铁传递蛋白受体(TFRC)
内参基因一般在体内可稳定表达,但由于这种稳定表达是相对的,在一定的病理状态或用药情况下,某些常用的内参基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中稳定表达的基因作内参基因,对保证检测结果的准确性至关重要。因此,本发明从一定数量的常用持家基因中进行筛选,确定5个合适的内参基因,分别是:酸性核糖体磷蛋白大亚基P0(RPLP0)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)、β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶(GUSB)、铁传递蛋白受体(TFRC)。
基于以上基因的mRNA表达水平与乳腺癌疗效预测的相关性,专家推荐乳腺癌患者应当进行相关基因mRNA表达水平的检测,帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案,以提高药物疗效,减少药物毒副作用的发生。
目前,对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有:逆转录定量PCR法、实时荧光定量PCR法、RNA原位核酸杂交(RISH)等。其中,RISH主要用于分析组织或细胞内RNA分布以了解特定基因的表达情况,且其过程较长、操作繁琐,不适合用于临床应用;而逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法,首先,这两种方法均需要进行RNA抽提、逆转录,检测的结果受RNA降解影响大;其次,这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增,容易产生非特异性结合,从而导致假阳性高;再次,这两种方法一般只有一个持家基因作对照,其准确性容易受到病理状态的影响;因此,逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作为临床应用均存在着难以克服的技术缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平液相检测芯片。
实现上述目的的技术方案如下:
一种乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片,主要包括有:
(1)针对不同目标基因的、与胺基修饰的支持探针偶联的微球,每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1,所述支持探针包括有针对ESR1基因的SEQ.ID NO.1和针对PGR基因的SEQ.ID NO.2,每种微球具有不同的荧光编码;
(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列,所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有:针对ESR1基因的选自SEQ.ID NO.24-SEQ.ID NO.28中的2条以上、和针对PGR基因的选自SEQ.ID NO.29-SEQ.ID NO.33中的2条以上;
(3)扩增延伸探针,每条扩增延伸探针包括有5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5,3’端还修饰有生物素;所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有:针对ESR1基因的选自SEQ.ID NO.166-SEQ.ID NO.175中的5条以上,和针对PGR基因的选自SEQ.IDNO.176-SEQ.IDNO.185中的5条以上;所述P5为不存在发夹结构,探针内部和探针间不形成二聚体、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
优选地,所述P5的碱基组成为SEQ.ID NO398所示。
或,一种乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片,主要包括有:
(1)针对不同目标基因的、与胺基修饰的支持探针偶联的微球,每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1,所述支持探针包括有针对ESR1基因的SEQ.ID NO.1和针对PGR基因的SEQ.ID NO.2,每种微球具有不同的荧光编码;
(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列,所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有:针对ESR1基因的选自SEQ.ID NO.24-SEQ.ID NO.28中的2条或2条以上;和针对PGR基因的选自SEQ.ID NO.29-SEQ.ID NO.33中的2条或2条以上;
(3)扩增延伸探针,每条扩增延伸探针包括有5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5;所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有:针对ESR1基因的选自SEQ.IDNO.166-SEQ.IDNO.175中的5条或5条以上,和针对PGR基因的选自SEQ.ID NO.176-SEQ.ID NO.185中的5条或5条以上;所述P5为不存在发夹结构,探针内部和探针间不形成二聚体、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列;
(4)标记探针,所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的、序列(优选为SEQ.ID NO.443),且具有生物素修饰。
优选地,所述乳腺癌预后相关基因RNA表达水平检测液相芯片,所述支持探针还包括有以下5种基因中的1种以上:针对RPLPO基因的SEQ ID NO.3、针对GAPDH基因的SEQ IDNO.4、针对GUSB基因的SEQ ID NO.5、针对ACTB基因的SEQ ID NO.6和针对TFRC基因的SEQ ID NO.7;
所述支持延伸探针的特异性序列P2还包括有以下5种基因中的1种以上:针对RPLPO基因的选自SEQ.ID NO.34-SEQ.ID NO.38中的2条以上、针对GAPDH基因的选自SEQ.IDNO.39-SEQ.ID NO.44中的2条以上、针对GUSB基因的SSEQ.ID NO.45-SEQ.ID NO.49中的2条以上、针对ACTB基因的SEQ.ID NO.50-SEQ.ID NO.54中的2条以上和针对TFRC基因的SEQ.ID NO.55-SEQ.ID NO.59中的2条以上;
所述扩增延伸探针的特异性序列P4还包括有以下5种基因中的1种以上:针对RPLPO基因的选自SEQ.ID NO.186-SEQ.ID NO.195中的5条以上、针对GAPDH基因的选自SEQ.IDNO.196-SEQ.ID NO.206中的5条以上、针对GUSB基因的SSEQ.ID NO.207-SEQ.IDNO.216中的5条以上、针对ACTB基因的SEQ.IDNO.217-SEQ.IDNO.226中的5条以上和针对TFRC基因的SEQ.ID NO.227-SEQ.ID NO.237中的5条以上。
优选地,还包括有:填充序列,针对ESR1基因的选自SEQ ID NO.399-SEQ ID NO.403中的1条以上,针对PGR基因的选自SEQ ID NO.406-SEQ ID NO.408中的1条以上。
更进一步地,所述乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片,所述支持探针还包括有以下16种基因中的1种以上:针对MKI67基因的SEQ ID NO.8、针对AURKA基因的SEQID NO.9、针对MYBL2基因的SEQ ID NO.10、针对CCNB1基因的SEQ ID NO.11、针对BIRC5基因的SEQ ID NO.12、针对MMP11基因的SEQ ID NO.13、针对CTSL2基因的SEQ ID NO.14、针对SCUBE2基因的SEQ ID NO.15、针对BCL2基因的SEQ ID NO.16、针对GRB7基因的SEQID NO.17、针对GSTM1基因的SEQ ID NO.18、针对CD68基因的SEQ ID NO.19、针对BAG1基因的SEQ ID NO.20、针对PARP1基因的SEQ ID NO.21、针对PTEN基因的SEQ ID NO.22和针对VEGFA基因的SEQ ID NO.23;
所述支持延伸探针的特异性序列P2还包括有针对以下16种基因中的1种以上:针对MKI67基因的选自SEQ ID NO.60-SEQ ID NO.64中的2条以上、针对AURKA基因的选自SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.69中的2条以上、针对MYBL2基因的选自SEQ ID NO.70-SEQID NO.75中的2条以上、针对CCNB1基因的选自SEQ ID NO.76-SEQ ID NO.g0中的2条以上、针对BIRC5基因的选自SEQ ID NO.81-SEQ ID NO.85中的2条以上、针对MMP11基因的选自SEQ ID NO.86-SEQ ID NO.90中的2条以上、针对CTSL2基因的选自SEQ ID NO.91-SEQID NO.96中的2条以上、针对SCUBE2基因的选自SEQ ID NO.97-SEQ ID NO.101中的2条以上、针对BCL2基因的选自SEQ ID NO.102-SEQ ID NO.106中的2条以上、针对GRB7基因的选自SEQ ID NO.107-SEQ ID NO.111中的2条以上、针对GSTM1基因的选自SEQ ID NO.112-SEQ ID NO.116中的2条以上、针对CD68基因的选自SEQ ID NO.117-SEQ ID NO.122中的2条以上、针对BAG1基因的选自SEQ ID NO.123-SEQ ID NO.127中的2条以上、针对PARP1基因的选自SEQ ID NO.128-SEQ ID NO.132中的2条以上、针对PTEN基因的选自SEQID NO.133-SEQ ID NO.137中的2条以上和针对VEGFA基因的SEQ ID NO.138-SEQ IDNO.142中的2条以上;
所述扩增延伸探针的特异性序列P4还包括有以下16种基因中的1种以上:针对MK167基因的选自SEQ ID NO.238-SEQ ID NO.247中的5条以上、针对AURKA基因的选自SEQ IDNO.248-SEQ ID NO.256中的5条以上、针对MYBL2基因的选自SEQ ID NO.257-SEQ IDNO.266中的5条以上、针对CCNB1基因的选自SEQ ID NO.267-SEQ ID NO.275中的5条以上、针对BIRC5基因的选自SEQ ID NO.276-SEQ ID NO.285中的5条以上、针对MMP11基因的选自SEQ ID NO.286-SEQ ID NO.295中的5条以上、针对CTSL2基因的选自SEQ IDNO.296-SEQ ID NO.306中的5条以上、针对SCUBE2基因的选自SEQ ID NO.307-SEQ IDNO.316中的5条以上、针对BCL2基因的选自SEQ IDNO.317-SEQ ID NO.326中的5条以上、针对GRB7基因的选自SEQ ID NO.327-SEQ ID NO.336中的5条以上、针对GSTM1基因的选自SEQ ID NO.337-SEQ ID NO.346中的5条以上、针对CD68基因的选自SEQ ID NO.347-SEQ ID NO.358中的5条以上、针对BAG1基因的选自SEQ ID NO.359-SEQ ID NO.368中的5条以上、针对PARP1基因的选自SEQ ID NO.369-SEQ ID NO.378中的5条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.379-SEQ ID NO.388中的5条以上和针对VEGFA基因的SEQ IDNO.389-SEQ ID NO.397中的5条以上。
优选地,还包括有:填充序列,针对ESR1基因的选自SEQ ID NO.399-SEQ ID NO.403中的1条以上;针对SCUBE2基因的选自SEQ ID NO.404-SEQ ID NO.405中的1条以上,针对PGR基因的选自SEQ ID NO.406-SEQ ID NO.408中的1条以上、针对BCL2基因的选自SEQID NO.409-SEQ ID NO.411中的1条以上、针对RPLPO基因的选自SEQ ID NO.412-SEQ IDNO.413中的1条以上、针对GAPDH基因的SEQ ID NO.414、针对GUSB基因的选自SEQ IDNO.415-SEQ ID NO.417中的1条以上、针对ACTB基因的选自SEQ ID NO.418-SEQ IDNO.422中的1条以上、针对MKI67基因的选自SEQ ID NO.423-SEQ ID NO.425中的1条以上、针对CCNB1基因的SEQ ID NO.426、针对CTSL2基因的SEQ ID NO.427、针对GSTM1基因的SEQ ID NO.428、针对CD68基因的SEQ ID NO.429-SEQ ID NO.431中的1条以上、针对BAG1基因的SEQ ID NO.432-SEQ ID NO.434中的1条以上、针对PARP1基因的SEQ IDNO.435-SEQ ID NO.436中的1条以上、针对PTEN基因的SEQ ID NO.437-SEQ ID NO.441中的1条以上、针对CCNB1基因的SEQ ID NO.442。
本发明的主要优点在于:
(1)本发明所设计的各种探针,能够在均一的反应条件下进行杂交反应,且各种探针之间基本不存在非特异性结合;所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时,多种探针的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
(2)运用本发明所述的液相芯片和检测方法,对乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平进行检测的,无需RNA提取、逆转录、PCR等步骤,检测结果受样本中RNA的质量影响较小,保证了检测结果的准确性;另一方面,以持家基因作对照((n:1~5个),检测结果不易受病理状态的影响,准确性高使检测结果更为可靠。
(3)本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大,而不是PCR扩增的方法,提高了检测信号,实现了检测的特异性,避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
(4)本发明所述的液相芯片和检测方法适用于新鲜组织、石蜡包埋固定组织、组织切片、穿刺组织等样本类型,对比起其他的mRNA检测方法,有着操作简易、准确性高、特异性高的特点。
(5)本发明所述液相芯片能够在ESR1和PGR液相芯片的基础上,根据实际检测基因种类的需要,加入目标检测基因的探针和引物,在一个样品中同步检测多个基因,实现并行检测,大大节约检测时间,节省样品,检测结果更为可靠。
综上所述,本发明的液相芯片和检测方法,适用于新鲜组织、石蜡包埋固定组织、组织切片、穿刺组织等样本类型;各种探针之间基本不存在非特异性结合,特异性好、信噪比高;无需RNA提取、逆转录、PCR等步骤,检测结果受样本中RNA的质量影响较小,保证了检测结果的准确性;可以多个持家基因作对照(n:1~5个),检测结果不易受病理状态的影响,准确性高使检测结果更为可靠。且本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大,而不是PCR扩增的方法,提高了检测信号,实现了检测的特异性,避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
具体实施方式
本领域的人员所知,所述间隔臂序列为用于将支持探针与微球表面间隔开来,在支持延伸探针与扩增延伸探针内部也存在间隔臂序列,通过在探针序列与胺基之间、探针内部设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂(间隔臂长度优选2-4)。本发明间隔臂优选为poly(dT),在中国,T的合成技术比较成熟,成本相对较低。
本发明所述对乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平进行检测的方法,主要包括以下步骤:主要包括以下步骤:
(一)裂解样本释放总RNA,得裂解混合液;
(二)将裂解混合液、偶联有支持探针的微球、支持延伸探针,扩增延伸探针密封于杂交板中,54℃±1℃,600rpm震荡孵育过夜,支持延伸探针的序列P3与支持探针的P1互补结合,支持延伸探针的特异性序列P2与目标mRNA特异结合,从而将目标mRNA结合到微球上;扩增延伸探针带有生物素标记,扩增延伸探针的P4与目标mRNA特异结合从而实现目标mRNA信号的级联放大;
(三)步骤(二)的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应;
(四)通过荧光检测仪检测。
或包括以下步骤:
(一)裂解样本释放总RNA,得裂解混合液;
(二)将裂解混合液、偶联有支持探针的微球、支持延伸探针,扩增延伸探针密封于杂交板中,54℃±1℃,600rpm震荡孵育过夜,支持延伸探针的序列P3与支持探针的P1结合互补结合,支持延伸探针的特异性序列P2与目标mRNA特异结合,从而将目标mRNA结合到微球上;扩增延伸探针的P4与目标mRNA特异结合;
(三)再加入标记探针,标记探针带有生物素标记,50℃±1℃,600rpm震荡孵育1小时,标记探针与扩增延伸探针的序列P5互补配对结合,从而实现目标mRNA信号的级联放大;
(四)步骤(三)的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应;
(五)通过荧光检测仪检测。
以下通过具体实施例,对本发明做进一步的阐述,但不用于限定本发明。
实施例1:乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片试剂盒,主要包括有:
一、偶联有支持探针(SP)的微球
支持探针由三部分组成,5’端是与微球结合的胺基端,3’端是与支持延伸探针结合的特异序列P1,长度为16nt,中间是8个寡聚核苷酸T的间隔臂序列,每个目标基因选用一种微球,并选用一条支持探针,每种微球具有不同的荧光编码。每个目标基因的支持探针如表1所示:
表1不同的目标基因及其选用微球的编号、支持探针(SP)
基因 |
微球号 |
SP序列(5’→3’)NH2+poly(dT)+P1 |
P1:SEQID |
ESR1 |
29 |
NH2-TTTTTTTT-GATTTGTAGTAAGATT |
1 |
PGR |
45 |
NH2-TTTTTTTT-TTGAGTAATTGAATTG |
2 |
RPLPO |
35 |
NH2-TTTTTTTT-TGAAATGAATGAATGA |
3 |
GAPDH |
36 |
NH2-TTTTTTTT-ATTGATTGTGAATGAA |
4 |
GUSB |
38 |
NH2-TTTTTTTT-ATTGTTGAAAAGTGTA |
5 |
ACTB |
47 |
NH2-TTTTTTTT-ATTATGAAGTAAGTTA |
6 |
TFRC |
61 |
NH2-TTTTTTTT-TGAAGATTATGAATTG |
7 |
MKI67 |
13 |
NH2-TTTTTTTT-TTAGTGAAGAAGTATA |
8 |
AURKA |
25 |
NH2-TTTTTTTT-TGAAGATTTGAAGTAA |
9 |
MYBL2 |
43 |
NH2-TTTTTTTT-TGTAATGAGTATTGTA |
10 |
CCNB1 |
55 |
NH2-TTTTTTTT-GTTAGTTATTGAGAAG |
11 |
BIRC5 |
51 |
NH2-TTTTTTTT-ATTGTTGATGATTGAT |
12 |
MMP11 |
44 |
NH2-TTTTTTTT-AGTATAAAGAAAGATT |
13 |
CTSL2 |
21 |
NH2-TTTTTTTT-TGATTTGAGATTAAAG |
14 |
SCUBE2 |
34 |
NH2-TTTTTTTT-ATGAATTGGTATGTAT |
15 |
BCL2 |
56 |
NH2-TTTTTTTT-GTATATGAGTAAATTG |
16 |
GRB7 |
37 |
NH2-TTTTTTTT-ATTGAAAGATGAAAAG |
17 |
GSTM1 |
12 |
NH2-TTTTTTTT-AAAGAAAGAAAGTGTA |
18 |
CD68 |
20 |
NH2-TTTTTTTT-GATTGTATTGAAGTAT |
19 |
BAG1 |
14 |
NH2-TTTTTTTT-GTATAGTAAGATGTAT |
20 |
PARP1 |
28 |
NH2-TTTTTTTT-TTGATAATGTTTGTTT |
21 |
PTEN |
48 |
NH2-TTTTTTTT-ATTATTGAGATGTGAA |
22 |
VEGFA |
57 |
NH2-TTTTTTTT-GTAATGATAAAGATGA |
23 |
所有探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的支持探针用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的捕获探针(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5ul的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有支持探针的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0),1mmol/LEDTA]中,2-8℃避光保存。
二、与目标基因mRNA特异结合的支持延伸探针(SE)、扩增延伸探针(AE)
1)支持延伸探针(SE)是连接支持探针(SP)与目标基因mRNA之间的序列,SE由三部分组成,5’端是能与目标基因mRNA结合的特异性序列P2,3’端是能与支持探针5’端P1序列通过碱基互补结合的特异性序列P3,中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列。每个目标基因分别设计5至7条支持延伸探针,以提高检测的特异性。使用时,针对每种目标基因,选择2条或2条以上支持延伸探针即可完成检测,特异性和稳定性都很好(实验数据省略),优选于使用4至6条支持延伸探针,以使特异性达到最好。合成后的每条探针分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。目标基因的支持延伸探针(SE)见表2、
表3。
SE序列(5’→3’):P2+poly(dT)+P3
表2目标基因的支持延伸探针P2序列
表3目标基因的支持延伸探针的P3序列
基因 |
P3序列(5’→3’) |
SEQID |
ESR1 |
AATCTTACTACAAATC |
143 |
PGR |
CAATTCAATTACTCAA |
144 |
RPLPO |
TCATTCATTCATTTCA |
145 |
GAPDH |
TTCATTCACAATCAAT |
146 |
GUSB |
TACACTTTTCAACAAT |
147 |
ACTB |
TAACTTACTTCATAAT |
148 |
TFRC |
CAATTCATAATCTTCA |
149 |
MKI67 |
TATACTTCTTCACTAA |
150 |
AURKA |
TTACTTCAAATCTTCA |
151 |
MYBL2 |
TACAATACTCATTACA |
152 |
CCNB1 |
CTTCTCAATAACTAAC |
153 |
BIRC5 |
ATCAATCATCAACAAT |
154 |
MMP11 |
AATCTTTCTTTATACT |
155 |
CTSL2 |
CTTTAATCTCAAATCA |
156 |
SCUBE2 |
ATACATACCAATTCAT |
157 |
BCL2 |
CAATTTACTCATATAC |
158 |
GRB7 |
CTTTTCATCTTTCAAT |
159 |
GSTM1 |
TACACTTTCTTTCTTT |
160 |
CD68 |
ATACTTCAATACAATC |
161 |
BAG1 |
ATACATCTTACTATAC |
162 |
PARP1 |
aaacaaacattatcaa |
163 |
PTEN |
TTCACATCTCAATAAT |
164 |
VEGFA |
TCATCTTTATCATTAC |
165 |
2)扩增延伸探针(AE)是连接目标基因mRNA与信号检测组分之间的序列,AE由三部分组成,5’端是能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4,3’端是能与标记探针互补配对的序列P5,(如不运用标记探针检测时,则3’端还修饰有生物素),中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列。每个目标基因分别设计9至12条扩增延伸探针,从而将检测信号进行级联放大。合成后的每条探针分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。目标基因的扩增延伸探针(AE)见表4。所述P5的设计按照本领域的探针设计的公知常识,其为不存在内部发夹结构,探针内部和探针间都不形成二聚体、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合,GC含量为50%-65%的序列,本发明优选为碱基组成为CCTATGCCTCCCGTGTCTA。使用时,针对每种目标基因,选择5条或5条以上扩增延伸探针即可完成检测,特异性和稳定性都很好(实验数据省略),优选于使用9条或以上扩增延伸探针,以使特异性达到最好。
AE序列(5’→3’):P4+poly(dT)+P5
表4目标基因的扩增延伸探针P4序列
表5目标基因的扩增延伸探针P5序列
3)填充序列(FS),将目标基因mRNA中没有与SE、AE特异结合的区域封闭,以减少后续反应中生物素或标记探针的非特异性结合,从而减少检测背景。填充序列的Tm值应与SE、AE接近,如表6所示。
表6目标基因的填充序列(FS)
三、标记探针(LP)
标记探针(LP)由两部分组成,其序列是能与扩增延伸探针3’端的序列P5互补结合的序列,5’端带有生物素标记,通过与扩增延伸探针结合实现目标mRNA信号的级联放大。
表7标记探针(LP)
实施例2运用实施例1所述的乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下:
一、裂解样本释放总RNA
1.将待检测样品放入1.5ml离心管中,加入300ul匀浆缓冲液和3ul蛋白酶K(50ug/ul),混合均匀,65℃消化2h。
2.消化2h后的样品,室温下13,000rpm离心5分钟,吸取中间澄清的溶液转移至新的1.5ml离心管中备用。(如溶液仍不澄清,则重复本步骤1~2次。)
二、目标mRNA通过与探针特异性结合固定在微球上
1.取出探针工作液于室温融解,然后在95℃变性5分钟,马上置于冰上。
2.按下表配制工作液,混合均匀
3.将上述配制好的工作液分装至杂交板上,60ul/孔。然后将上述处理好的样品以40ul/孔分别加入杂交板中;空白对照加入匀浆缓冲液40ul/孔。密封杂交板,54℃±1℃,600rpm震荡孵育过夜(16-22h)。
4.用洗涤缓冲液润湿滤板1分钟,除去洗涤缓冲液。
5.将杂交板取出,500×g离心1分钟,将反应液全部转移至滤板中。
6.除去溶液,用200ul洗涤缓冲液洗涤3次。
三、通过杂交反应将目标RNA信号放大
1.加入标记探针工作液100ul/孔。50℃±1℃,600rpm震荡孵育1小时。
2.除去溶液,用200ul洗涤液洗涤2次。
四、与SA-PE结合,并在液相芯片阅读仪上检测
1.加入SA-PE工作液100ul/孔,600rpm震荡室温孵育30min。
2.抽滤除去溶液,用200ul SA-PE洗涤液洗涤2次,用吸水纸吸干滤板底部。
3.加入SA-PE洗涤液130ul/孔。室温,600rpm震荡孵育2至5分钟。
4.在液相芯片仪上读取数据。
五、数据分析
在23个目标基因中,其中目标基因18个:ESR1、PGR、MKI67、AURKA、MYBL2、CCNB1、BIRC5、MMP11、CTSL2、SCUBE2、BCL2、GRB7、GSTM1、CD68、BAG1、PARP1、PTEN、VEGFA;
持家基因5个,分别是:RPLP0、GAPDH、ACTB、GUSB、TFRC;
将读取的荧光值按照以下方法进行均一化处理:
步骤1:获得原始数据(MFI值)
步骤2:样品的MFI减去空白孔N的MFI=net MFI
步骤3:每个样品的五个持家基因的net MFI值分别取几何平均值,得到相应的G1、G2、G3......Gn
步骤4:每个样品目标基因mRNA的netMFI除以对应的Gn得到相应的Nn。Nn即为已排除上样量差异,可在样品间进行相对表达量比较的数值。
本实施例中对10例样品同时进行23种基因的检测,检测结果如下所示:
表810例样品原始数据(MFI值)之一
Sample |
ESR1 |
PGR |
MKI67 |
AURKA |
MYBL2 |
CCNB1 |
BIRC5 |
MMP11 |
CTSL2 |
SCUBE2 |
BCL2 |
N |
3 |
7 |
8 |
2 |
9 |
6 |
5 |
2 |
1 |
25 |
3 |
1 |
229 |
26 |
1451 |
961 |
1214 |
199 |
895 |
3759 |
29 |
571 |
409 |
2 |
251 |
289 |
52 |
150 |
47 |
36 |
40 |
34 |
29 |
4960 |
485 |
3 |
318 |
67 |
2183 |
3565 |
895 |
386 |
801 |
4023 |
35 |
679 |
273 |
4 |
406 |
60 |
1763 |
877 |
1143 |
426 |
511 |
1038 |
70 |
987 |
508 |
5 |
2224 |
25 |
3718 |
9455 |
4726 |
1358 |
952 |
13340 |
174 |
4410 |
2226 |
6 |
1177 |
474 |
373 |
417 |
252 |
66 |
82 |
197 |
20 |
3644 |
832 |
7 |
169 |
23 |
138 |
172 |
145 |
26 |
124 |
377 |
12 |
665 |
156 |
8 |
1985 |
26 |
669 |
908 |
754 |
301 |
507 |
1418 |
117 |
840 |
1057 |
9 |
304 |
37 |
4773 |
3533 |
4280 |
1003 |
1079 |
3800 |
438 |
996 |
446 |
10 |
1561 |
288 |
289 |
391 |
214 |
72 |
73 |
583 |
13 |
1290 |
1099 |
表910例样品原始数据(MFI值)之二
Sample |
GRB7 |
GSTM1 |
CD68 |
BAG1 |
PARP1 |
PTEN |
VEGFA |
RPLP0 |
GAPDH |
ACTB |
GUSB |
TFRC |
N |
5 |
7 |
5 |
4 |
5 |
5 |
5 |
5 |
6 |
5 |
3 |
4 |
1 |
36 |
47 |
2583 |
3130 |
1208 |
841 |
407 |
7148 |
1623 |
6249 |
258 |
2045 |
2 |
51 |
13 |
427 |
1668 |
371 |
911 |
389 |
11687 |
1602 |
6900 |
510 |
612 |
3 |
4216 |
79 |
2284 |
6175 |
1467 |
2349 |
1052 |
23919 |
7352 |
10702 |
473 |
2315 |
4 |
7735 |
274 |
1550 |
3531 |
2932 |
1888 |
1187 |
22120 |
6849 |
17795 |
798 |
1672 |
5 |
13318 |
20 |
8796 |
12797 |
4159 |
4775 |
2998 |
21405 |
8625 |
23102 |
1345 |
11112 |
6 |
218 |
11 |
1048 |
6620 |
1254 |
1319 |
667 |
19963 |
3063 |
7568 |
543 |
743 |
7 |
567 |
11 |
269 |
1044 |
245 |
343 |
180 |
4143 |
649 |
1955 |
77 |
391 |
8 |
293 |
11 |
2717 |
2950 |
1228 |
1130 |
660 |
17795 |
4071 |
12447 |
978 |
1007 |
9 |
334 |
267 |
2786 |
4428 |
3188 |
2365 |
6229 |
23703 |
9967 |
21583 |
726 |
3493 |
10 |
286 |
11 |
908 |
13463 |
2150 |
1216 |
2000 |
15904 |
3942 |
6683 |
703 |
917 |
表1010例样品各基因的相对表达量之一
Sample |
ESR1 |
PGR |
MKI67 |
AURKA |
MYBL2 |
CCNB1 |
BIRC5 |
MMP11 |
CTSL2 |
1 |
0.109 |
0.009 |
0.699 |
0.464 |
0.584 |
0.093 |
0.431 |
1.820 |
0.013 |
2 |
0.119 |
0.135 |
0.021 |
0.071 |
0.018 |
0.015 |
0.017 |
0.015 |
0.013 |
3 |
0.069 |
0.013 |
0.474 |
0.776 |
0.193 |
0.083 |
0.174 |
0.876 |
0.007 |
4 |
0.078 |
0.010 |
0.342 |
0.170 |
0.221 |
0.082 |
0.099 |
0.202 |
0.013 |
5 |
0.243 |
0.002 |
0.406 |
1.035 |
0.517 |
0.148 |
0.104 |
1.461 |
0.019 |
6 |
0.414 |
0.165 |
0.129 |
0.146 |
0.086 |
0.021 |
0.027 |
0.069 |
0.007 |
7 |
0.243 |
0.023 |
0.191 |
0.249 |
0.200 |
0.030 |
0.174 |
0.550 |
0.016 |
8 |
0.511 |
0.005 |
0.170 |
0.234 |
0.192 |
0.076 |
0.129 |
0.365 |
0.030 |
9 |
0.045 |
0.004 |
0.718 |
0.532 |
0.644 |
0.150 |
0.162 |
0.573 |
0.066 |
10 |
0.510 |
0.092 |
0.092 |
0.127 |
0.067 |
0.022 |
0.022 |
0.190 |
0.004 |
表1110例样品各基因的相对表达量之二
Sample |
SCUBE2 |
BCL2 |
GRB7 |
GSTM1 |
CD68 |
BAG1 |
PARP1 |
PTEN |
VEGFA |
1 |
0.264 |
0.197 |
0.015 |
0.019 |
1.249 |
1.514 |
0.583 |
0.405 |
0.195 |
2 |
2.365 |
0.231 |
0.022 |
0.003 |
0.202 |
0.797 |
0.175 |
0.434 |
0.184 |
3 |
0.142 |
0.059 |
0.917 |
0.016 |
0.496 |
1.344 |
0.318 |
0.511 |
0.228 |
4 |
0.187 |
0.098 |
1.505 |
0.052 |
0.301 |
0.687 |
0.570 |
0.367 |
0.230 |
5 |
0.480 |
0.243 |
1.458 |
0.001 |
0.963 |
1.401 |
0.455 |
0.522 |
0.328 |
6 |
1.275 |
0.292 |
0.075 |
0.001 |
0.368 |
2.331 |
0.440 |
0.463 |
0.233 |
7 |
0.938 |
0.225 |
0.824 |
0.005 |
0.387 |
1.525 |
0.352 |
0.496 |
0.257 |
8 |
0.210 |
0.272 |
0.074 |
0.001 |
0.699 |
0.759 |
0.315 |
0.290 |
0.169 |
9 |
0.146 |
0.067 |
0.050 |
0.039 |
0.419 |
0.667 |
0.480 |
0.356 |
0.938 |
10 |
0.414 |
0.359 |
0.092 |
0.001 |
0.295 |
4.403 |
0.702 |
0.396 |
0.653 |
实施例3:乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片对ESR1和PGR的检测(没有内参基因)
一、液相芯片的制备的设计(ESR1和PGR的mRNA表达水平检测液相芯片)
以ESR1和PGR的mRNA表达水平检测液相芯片为例,对样品进行检测,并以样品11的ESR1和PGR的mRNA表达水平作为参考的标准,定义为1,其他样品的ESR1和PGR的mRNA表达水平分别除以样品11的ESR1和PGR的mRNA表达水平,所得的相对值进行比较。具体设计如实施例1所示。支持探针、支持延伸探针、扩增延伸探针的合成,anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品11-15进行检测,检测结果如下(表中数据为检测荧光值):
表12样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)
ESR1和PGR的mRNA表达水平检测液相芯片,通过相对值可以看到,不同样品其ESR1和PGR的mRNA表达水平各异,出现表达量上调和下调的情况,其他基因在没有内参基因的情况下,依然能够得到其相对的表达量,具体数据省略。
实施例4:乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片对ESR1和PGR的检测
一、液相芯片的制备的设计(ESR1、PGR与内参基因的mRNA表达水平检测液相芯片)
以ESR1、PGR和内参基因TFRC的mRNA表达水平检测液相芯片为例,对样品进行检测,并以各样品中的内参基因TFRC的mRNA表达水平作为参考的标准,各样品的ESR1、PGR分别除以内参基因TFRC的mRNA表达水平,得到表达水平的相对值,比较不同样品种的ESR1和PGR的mRNA表达水平的相对值。具体设计如实施例1所示。支持探针、支持延伸探针、扩增延伸探针的合成,anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品21-30进行检测,检测结果如下(表中数据为检测荧光值):
表13样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)
ESR1和PGR的mRNA表达水平检测液相芯片,以TFRC的mRNA表达水平为内参,通过相对值可以看到,不同样品其ESR1和PGR的mRNA表达水平各异,出现表达量上调和下调的情况,其他基因在拥有1个或以上内参基因的情况下,依然能够得到其相对的表达量,具体数据省略。
实施例5:乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片对样品的检测
一、液相芯片的制备的设计
以ESR1、PGR、MKI67、AURKA、MYBL2和内参基因GAPDH、ACTB的mRNA表达水平检测液相芯片为例,对样品进行检测,比较不同样品中的ESR1、PGR、MKI67、AURKA和MYBL2的mRNA表达水平的相对值。
其中,针对MKI67的mRNA表达水平检测液相芯片,方案一为有填充序列,方案二为无填充序列;
具体设计如实施例1所示。支持探针、支持延伸探针、扩增延伸探针的合成,anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法和各基因相对量的计算方法等如实施例1和实施例2所述。
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品31-40进行检测,检测结果如下(表中数据为检测荧光值):
表14样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)
表15各基因的相对表达量
针对MKI67的mRNA表达水平检测液相芯片,填充序列的有无,检测结果依然稳定可靠,而有填充序列的检测效果更佳,其它基因其mRNA表达水平的检测,填充序列有无,检测结果依然稳定可靠,具体数据省略。
实施例6:不同间隔臂的液相芯片对乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平的检测
一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)
分别以所述液相芯片对ESR1和PGR检测的支持探针为例,分别选用不同的间隔臂,具体设计如表16所示。探针SP、SE与AE的合成、SP序列包被微球、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表16间隔臂及其长度
间隔臂种类 |
长度 |
实验组 |
poly(dT) |
8 |
1 |
poly(dA) |
8 |
2 |
(CH2)n |
15 |
3 |
poly(TTG) |
3 |
4 |
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品41-45进行检测,检测结果如下(表中数据为检测荧光值):)
表17样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)
将4组设计的检测荧光值进行统计学分析,证明4组设计的检测效果没有差异。因此,这5种间隔臂的设计是等效的,从结果可见,当间隔臂为poly(dT)时,检测效果最佳。其它针对支持延伸探针、扩增延伸探针内部不同的间隔序列的液相芯片,其结果依然稳定可靠,具体数据省略。
实施例7:标记探针的运用
一、液相芯片制备的设计(信号检测组分)
所述信号检测组分有两种选择,1)扩增延伸探针3’端序列P5的3’端带有生物素标记;2)扩增延伸探针3’端序列P5与标记探针(LP)通过碱基互补配对结合,同时标记探针的5’端带有生物素标记。这两种信号检测组分均能实现信号放大,检测到正常信号。其中,使用标记探针的生物素活性更加稳定,效果较优。
以所述对ESR1和PGR检测的液相芯片为例,设计信号检测组分,具体设计如表18所示。所述液相芯片的组成分别为:
实验组1:支持探针偶联的微球、支持延伸探针、填充序列同实施例1,扩增延伸探针具有生物素标记;没有标记探针;
实验组2:支持探针偶联的微球、支持延伸探针、填充序列、标记探针同实施例1,扩增延伸探针不具有生物素标记。
表18信号检测组分
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,检测方法:实验组2同实施例2所述检测过程和方法对样品46-50进行检测,实验组1所述检测方法,省略(三、通过杂交反应将目标RNA信号放大)该
步骤,其余同实施例2。
检测结果如下(表中数据为检测荧光值):
表19样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)
将两组设计的检测荧光值进行统计学分析,证明两组设计的检测结果没有差异,因此,这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。其中,使用标记探针的信号检测组分,由于其生物素的活性更为稳定,效果较优。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明,但该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更,均应包含于本发明的专利范围中。