CN102703591B - 用于雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性焦磷酸检测的引物 - Google Patents
用于雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性焦磷酸检测的引物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于雌激素受体α基因内含子1PvuII和XbaI多态性焦磷酸检测的引物，所述引物包括从样本核酸中扩增雌激素受体α基因PvuII和XbaI核酸片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物。采用焦磷酸测序法技术，通过本发明的特异性的扩增引物和焦磷酸测序引物，可检测出与激素依赖性疾病相关的雌激素受体α基因内含子1PvuII和XbaI多态性，特异性好，准确度高。可以用于临床作为原因不明月经过少及其他一些激素依赖性相关疾病的早期预防、早期诊断的辅助性指标及筛选。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种用于雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性焦磷酸检测的引物序列，采用焦磷酸测序法技术，能对人类雌激素受体α基因多态性进行检测，特异性好，准确度高。
背景技术
年轻女性月经过少， 是妇科常见症状。其危害是影响孕卵在子宫内膜种植，导致反复流产、不孕等，是闭经的前驱症状。雌激素是调节月经的主要激素，但临床上发现一类病人其雌激素水平正常，无内外科及先天性疾病，我们称为原因不明月经过少。同时，我们对大量原因不明月经过少患者进行宫腔镜检查发现，月经过少患者中有许多病员的子宫内膜光滑菲薄，表现为生长发育不良。与传统的子宫内膜损伤、疤痕学说并不吻合。此类患者雌激素水平正常。N ilsson 等认为ER基因单核苷酸多态性( single nucleo t idepo lymo rph ism，SN P) 可能导致基因在转录、翻译水平失调，导致ERα表达、功能异常。在ERα 基因上游有多种多态性位点存在，其中2 个限制性酶切片段长度多态性的确切酶切位点已被确定，在内含子1 存在P vuII 或X baI 多态性。所以从ERα 基因多态性探讨原因不明月经过少的发病机制， 为进一步深入研究和治疗提供理论依据。
在临床实验室中，目前检测雌激素受体α基因P vuII 和X baI多态性的常用方法为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RELP）法。该技术为第一代DNA分子标记技术，利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，该方法的缺陷在于检测灵敏度低且只能检测大概型别，不能具体到突变比例。
本发明在原有的基础上进行焦磷酸测序检测，不仅能检测到多态性位点的具体突变情况，也能根据图谱辨别出突变比例，使检测结果更加具体化。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供用于雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性焦磷酸检测的引物。
用于雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性焦磷酸检测的引物，所述引物包括从样本核酸中扩增雌激素受体α基因P vuII 和X baI核酸片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其特征在于，
从样本核酸中扩增雌激素受体α基因P vuII 和X baI核酸片段的特异性引物序列为：
Xba IF:: 5'- GATTCCAGGCATGAACCACC-3' （SEQ ID No.1）
Xba IR:: 5'-GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3' （SEQ ID No. 2）
PVuII F: 5'-GATTCCAGGCATGAACCACC-3' （SEQ ID No.3）
PVuII R: 5'- GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3'（SEQ ID No.4）
其中Xba IF和PVuII R为5' 端生物素标记引物；
对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物序列为：
Xba IS: 5'-CAATGCTCATCCCAAC-3' （SEQ ID No.5）
PVuII S: 5'-TTCCAAATGTCCCAG-3' （SEQ ID No.6）
本发明将测序技术应用于雌激素受体α基因多态性位点的检测，设计出将Erα基因多态性位点包含在内的扩增引物和焦磷酸测序引物，进行PCR扩增（扩增片段长度为471bp）并进行焦磷酸测序分析。
采用焦磷酸测序法技术，通过本发明的特异性的扩增引物和焦磷酸测序引物，可检测出与激素依赖性疾病相关的雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性，特异性好，准确度高。可以用于临床作为原因不明月经过少及其他一些激素依赖性相关疾病的早期预防、早期诊断的辅助性指标及筛选。
附图说明
图1是 XbaI野生型。
图2是 XbaI杂合型。
图3是 XbaI突变型。
图4是 PvuII野生型。
图5是 PvuII杂合型。
图6是 PvuII突变型。
具体实施方式
本发明用于雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性焦磷酸检测的引物，包括从样本核酸中扩增雌激素受体α基因P vuII 和X baI核酸片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其中，
从样本核酸中扩增雌激素受体α基因P vuII 和X baI核酸片段的特异性引物序列为：
Xba IF:: 5'- GATTCCAGGCATGAACCACC-3' （SEQ ID No.1）
Xba IR:: 5'-GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3' （SEQ ID No. 2）
PVuII F: 5'-GATTCCAGGCATGAACCACC-3' （SEQ ID No.3）
PVuII R: 5'- GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3'（SEQ ID No.4）
其中Xba IF和PVuII R为5' 端生物素标记引物；
对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物序列为：
Xba IS: 5'-CAATGCTCATCCCAAC-3' （SEQ ID No.5）
PVuII S: 5'-TTCCAAATGTCCCAG-3' （SEQ ID No.6）
采用焦磷酸测序法技术，通过本发明的特异性的扩增引物和焦磷酸测序引物，可检测出与激素依赖性疾病相关的雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性，具体步骤如下：
1.1 核酸提取
试剂： 红细胞裂解液 ，核酸提取液。
操作步骤：取500ul 全血，放入到1.5ml的离心管中，加入1ml 红细胞裂解液。上下翻转，使完全混匀，旋转摇动15秒后放入离心机中离心，离心速率为5000rpm，10min.。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。加入500ul红细胞裂解液，重复此裂解步骤一次。离心5000rpm，5min，最后用移液管吸净所有上层液弃去， 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液，在沉淀里加入60ul核酸提取液（取之前反复吹打），用枪头混匀，金属浴100度10分钟，12000 rpm，5min，取上清-20度保存待用。
1.2 PCR扩增
PCR扩增体系：5* Buffer 12μl，dNTP 3μl， Taq酶3μl，上游引物3μl，下游引物3μl，纯水24μl，加2μl逆转录产物到48μl扩增体系中，总体积为50μl。反应条件为95度5分钟，98度10秒；56度20秒；68度30秒，40个循环，68度 2分钟。
1.3 电泳
取PCR 扩增产物3μl进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功，目的条带清晰较亮的进行后续焦磷酸测序反应。
1.4 焦磷酸测序
试剂：75%乙醇，Denaturation Solution，Binging Buffer，Annealing Buffer，1 × Wash Buffer，Streptavidin Sepharase High Performance（bead），PyroMark Gold Q96 Reagents（E\S\dNTP），DMSO。
步骤：按照PyroMark Q96（美国QIAGEN公司）操作说明书进行操作。
1.5 实验结果分析。
检测过程中，四种dNTP (dATPS、dTTP、dCTP、dGTP)依序被加入反应体系中。在每一轮测序反应中，只加入其中一种。如被加入的dNTP与DNA模板配对，DNA聚合酶可以催化该dNTP与primer的3'端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi)就被释放出来。加入的dNTP和释放出来的PPi的mole数目是相等的。接着，ATP sulfurylase催化APS和PPi形成ATP，此ATP和PPi的mole数目也是一致的。利用ATP作为能源，luciferase可将荧光素氧化为氧化荧光素(oxyluciferin)，进而发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测，并由pyrogramTM转为波形讯号。每个波峰的高度(光信号)与反应中加入的核苷酸数目成正比。
图1-6为焦磷酸测序图（注：划线部分表示为多态性位点）。
Xba I：TCTAGA 由于为反向测序，所以待分析序列为：TCTAGA，多态性位点为T。
图1的序列为：TCTAGA，为纯合子T。
图2的序列为：TCT/CAGA，为杂合子T/C。
图3的序列为：TCCAGA，为纯合子C。
PvuII：CAGCTG 该位点为正向测序，所以待分析序列为：---CTG，多态性位点为T。
图4的序列为：CTG，为纯合子T。
图5的序列为：CT/CG，为杂合子T/C
图6的序列为：CCG，为纯合子C。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京艾迪康医学检验所有限公司
<120> 用于雌激素受体a基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性焦磷酸检测的引物
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gattccaggc atgaaccacc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccgtctgtt gcagcaaaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gattccaggc atgaaccacc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccgtctgtt gcagcaaaa 19
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caatgctcat cccaac 16
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttccaaatgt cccag 15
Claims (1)
1.用于雌激素受体α基因内含子1 P vuII 和X baI 多态性焦磷酸检测的引物，所述引物是从样本核酸中扩增雌激素受体α基因P vuII 和X baI核酸片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其特征在于，
从样本核酸中扩增雌激素受体α基因P vuII 和X baI核酸片段的特异性引物序列为：
Xba IF:: 5'- GATTCCAGGCATGAACCACC-3' （SEQ ID No.1）
Xba IR:: 5'-GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3' （SEQ ID No. 2）
PVuII F: 5'-GATTCCAGGCATGAACCACC-3' （SEQ ID No.3）
PVuII R: 5'- GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3'（SEQ ID No.4）
其中Xba IF和PVuII R为5' 端生物素标记引物；
对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物序列为：
Xba IS: 5'-CAATGCTCATCCCAAC-3' （SEQ ID No.5）
PVuII S: 5'-TTCCAAATGTCCCAG-3' （SEQ ID No.6）；
用上述序列扩增和检测雌激素受体α基因P vuII 和X baI核酸片段的具体步骤如下：
（1）核酸提取：取500ul 全血，放入到1.5ml的离心管中，加入1ml 红细胞裂解液；上下翻转，使完全混匀，旋转摇动15秒后放入离心机中离心，离心速率为5000rpm，10min.；倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀；加入500ul红细胞裂解液，重复此裂解步骤一次；离心5000rpm，5min，最后用移液管吸净所有上层液弃去， 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液，在沉淀里加入60ul核酸提取液，取之前反复吹打，用枪头混匀，金属浴100度10分钟，12000 rpm，5min，取上清-20度保存待用；
（2）PCR扩增：PCR扩增体系：5* Buffer 12μl，dNTP 3μl， Taq酶3μl，上游引物3μl，下游引物3μl，纯水24μl，加2μl逆转录产物到48μl扩增体系中，总体积为50μl；反应条件为95度5分钟，98度10秒；56度20秒；68度30秒，40个循环，68度 2分钟；
（3）电泳：取PCR 扩增产物3μl进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功，目的条带清晰较亮的进行后续焦磷酸测序反应；
（4）焦磷酸测序。
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