CN100595565C - 一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒 - Google Patents

一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法。方法包括将痕量环境内分泌干扰物与雌激素受体结合后，受体变构二聚化，识别并结合含有雌激素反应元件核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’的DNA双链探针，形成配体-ER-DNA探针复合物，并采用单克隆抗体对其吸附并分离，然后进行实时荧光定量PCR定量扩增，从而评估样本中EDCs的生物学效应。本发明方法操作简便、快捷，灵敏度高，达到甚至超过HPLC-MS/GS分析化学方法。可广泛用于食品、环境检测等领域。本发明还涉及所述方法所采用的试剂盒，使用操作简便、快捷、灵敏，检测范围100pM～1nM。

Description

一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒
技术领域
本发明涉及环境内分泌干扰物检测领域，具体涉及一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒。
背景技术
随着工业污染加剧，环境内分泌干扰物(EDCs，又称环境雌激素)对人类健康的影响，日益引起各国政府的关注。EDCs是指干扰生物体内维持自稳及调节发育过程中激素的产生、释放、代谢、结合、排泄、交互作用的外源性物质，对人类内分泌、免疫系统等有干扰作用，主要有多氯联苯类、二恶英类、烷基酚类、邻苯二甲酸酯类、农用化学品类、天然或合成的激素药物等。由于EDCs通常以痕量混合物的形式存在，且化学性质差异很大，采用传统的萃取富集、高效液相色谱-质谱/气相色谱(HPLC-MS/GS)方法分离出单一成分并测定含量，其分析手段复杂、操作繁琐、设备昂贵、需要专门高级训练，并且很难达到所有痕量成分的完全解析。另一方面，每一类EDCs中，不是所有的化合物都具有内分泌干扰作用。例如，二恶英类化合物有上百种，仅有一部分有内分泌干扰作用，典型的是PCDD二恶英。目前世界上仅有20家实验室能对生物来源的二恶英进行监测。此外，全世界每天都在产生4000多种新的化合物，传统的免疫学检测或生物学标志物检测方法显得力不从心。虽然免疫学技术检测灵敏度和通量较高，但仅能检测具备特异抗体的部分EDCs。
实际上，评估痕量混合物的内分泌干扰生物学效应/累加毒性当量(TEQ)更有意义。目前常用报告基因实验、细胞增殖实验等评价痕量混合物的内分泌干扰综合效应，或用DNA阵列检测痕量EDCs的生物标记。但是，由于这些方法本身的局限，如细胞培养的不稳定性、细胞不能精确定量等，使得这些方法通量低、周期长、系统误差很大，准确性和灵敏度差，只能半定量，而且样品中的EDCs也可能被细胞降解。
目前已知，雌激素受体α(ERα)是一种重要的细胞核受体，与其配体雌激素的结合具有高度专一性和亲和力，并在pmol级实现。ERα分为A/B，C，D，E/F4个区域，见附图1，其中C区为DNA结合区(DBD)，能与雌激素受体反应元件(estrogen response element，ERE)特异结合；E/F区为激素结合区(HBD)，结合激素并能使ERα发生变构及二聚化。ERα一旦与雌激素结合，就会激活变构形成二聚体，然后与ERE结合，刺激靶基因转录，从而表现出各种生理效应。ERE的核心序列为5’-GGTCAnnnTGACC-3’(n为任意核苷酸)。
环境雌激素(即EDCs)是以与内源雌激素类似的形式与雌激素受体结合，并和内源雌激素一样通过雌激素受体介导而产生相应的生理效应。目前基于受体配体结合的筛选方法，既可以反映EDCs的结合量，又能反映EDCs的综合雌激素样TEQ活性，且易于实现高通量，是最近几年EDCs高通量筛选和监测的新方向。Kim等制备了荧光-ER的EDCs阵列玻片筛选技术，用酶标仪测定结合的荧光强度而对EDCs定量，但因其采用波片固相，使其结合受到限制，此方法检出在μM～nM水平，灵敏度和准确性尚不理想。
综上所述，对于环境中为数众多、增长迅速的化合物中的EDCs来说，目前的环境污染物分析技术的进展还远远不能满足监测要求，发展快速、高通量、灵敏度高且重复性好的廉价筛选技术是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目之一的是提供一种廉价、快速、高通量的基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法，本发明的另一目的是提供用于所述检测方法的高效、灵敏、快速的检测试剂盒。
本发明利用配体-受体生物学激活效应的高效、特异性和实时荧光定量PCR扩增的高灵敏性和定量的准确性，建立痕量环境内分泌干扰物(EDCs)累加毒性当量(TEQ)的快速定量检测技术(即配体-ER-DNA探针复合体PCR检测，ERC-PCR)，实现痕量EDCs TEQ的廉价、快速、高通量监测。
本发明的第一目的是通过以下的技术方案实现的：即痕量环境内分泌干扰物配体(EDCs)与雌激素受体(ERα)结合后，受体变构二聚化，识别并结合含有雌激素反应元件(ERE)核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’(n为任意核苷酸)的DNA双链探针，形成配体-ER-DNA探针复合物(ER-DNA probe complex，ERC)，采用ER特异的单克隆抗体(ER McAb)吸附并分离ERC，洗去未结合的DNA探针，然后针对ERC中的DNA探针进行实时荧光定量PCR(FQ-PCR)定量扩增，从而评估样本中EDCs的生物学效应。只要有100个左右的DNA分子结合二聚化ER，即可检测得到，从而达到pmol检测水平。
因此，本发明涉及的一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法，包括以下步骤：(参见附图2)
(1)表达并纯化具有生物活性的重组人雌激素受体α(hERα)：采用pSG5载体与人ERαcDNA构建质粒pSG5-hERα，酶切后导入杆状病毒真核表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)，得到杆状病毒表达质粒hER-Bacmid，转染Sf 9细胞高效表达hERα，分离并纯化hERα；
(2)设计DNA双链探针，其全序列中含有雌激素反应元件(ERE)核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’，其中n为任意核苷酸；
(3)制备雌激素受体α(hERα)特异的单克隆抗体(ERαMcAb)：肽合成仪合成hERαA/B区一段18个氨基酸的多肽，将其共价连接于载体钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，与弗氏佐剂一起免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与小鼠B细胞瘤株Sp2/0杂交融合形成杂交瘤株，筛选hERα抗原特异性杂交瘤株，再克隆，挑取单克隆培养，取培养液采用饱和硫酸氨分级沉淀法分离纯化，获得能特异结合hERα的McAb；
(4)针对步骤(2)所述DNA双链探针，设计荧光定量PCR检测探针MGB-TaqMan和相应引物，FAM为报告基团，MGB为淬灭基团，其序列为：
MGB-TaqMan：FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB
上游引物FP：5’-TGGCCTGGCGTGGAAGT-3’
下游引物RP：5’-ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3’
(5)将步骤(1)所得hERα与待检样品在结合缓冲液中4℃振摇孵育4h，使EDCs与hERα结合，受体发生变构，暴露受体DNA结合结构域，形成配体-ERα复合物；
(6)向步骤(5)复合物中加入步骤(2)所述双链DNA探针，4℃过夜，形成配体-ERα-DNA探针复合物(ERC)；
(7)向步骤(6)所得ERC溶液中加入步骤(3)所制备的ERαMcAb，形成ERC-McAb，用磁珠包被的二抗羊抗鼠IgG结合McAb，形成ERC-McAb-磁珠IgG复合物，用磁力架吸附分离此复合物，洗去未结合的探针；
(8)加热步骤(7)所分离复合物，使DNA双链探针游离出来；
(9)对游离出来的DNA双链探针，用步骤(4)所述MGB-TaqMan探针和引物，进行实时荧光定量PCR定量扩增，25μl反应体系：2X Taqman探针主要反应混合液12.5μl，MGB-Taqman探针0.3μl、引物FP和RP各0.5μl、HotStar DNA聚合酶0.4μl、DNA模板2μl、加去离子水至总量25μl，扩增条件：95℃预变性15min，95℃5s、59.5℃25s，40个循环，与以雌二醇(E2)为标准品所作的标准曲线比对，确定待测样品中具有类雌激素作用物质的累计当量。
为实现本发明的第二目的采用的技术方案是这样的：即一种环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征在于其组成包括：
重组人雌激素受体α(hERα)及其特异的单克隆抗体(hERαMcAb)、双链DNA探针、检测探针和引物、二抗、结合缓冲液、荧光定量PCR反应混合液、标准品；其中：
重组人雌激素受体α(hERα)为杆状病毒表达系统所表达；
特异的单克隆抗体(hERαMcAb)为鼠抗人ERαA/B区的单克隆抗体；
双链DNA探针为80～110bp的能特异识别配体-ERα二聚体的序列，该序列含有雌激素反应元件(ERE)核心序列：5’-GGTCAnnnTGACC-3’，n为任意核苷酸；
检测探针为MGB-TaqMan探针，包括报告基团FAM、淬灭基团MGB，引物为针对此检测探针所设计引物，其序列为：
MGB-TaqMan：FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB
上游引物FP：5’-TGGCCTGGCGTGGAAGT-3’
下游引物RP：5’-ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3’。
本技术的优点在于：(1)和HPLC-MS/GS分析法相比，本技术没有鉴定复杂混合物的困难，由于模拟类雌激素生物学过程，既可以反映EDCs的结合量，又能反映EDCs的综合雌激素样TEQ活性；HPLC-MS/GS分析操作繁琐、技术要求高、成本昂贵，目前世界上仅20多家实验室能对生物来源的类雌激素物质二恶英进行监测，且单样本检测费用在1000-2000美元左右，本技术费用低，单样本检测费用在200-300人民币左右。(2)和报告基因、细胞增殖实验相比，前者需要约2～3周时间且只能半定量，本技术2-3天内能出具结果、定量误差较小；(3)和现有受体配体结合检测技术相比，本技术通过配体受体激活效应以及PCR将循环放大，灵敏度高，达到甚至超过HPLC-MS/GS分析化学方法，检测达到pM级。(4)本发明试剂盒操作简便、快捷，技术平台要求不高，普通实验室即可开展，可广泛用于食品、环境检测等领域。
附图说明
附图1为雌激素受体α(ERα)结构示意图；
附图2为本发明检测原理示意图；
附图3为本发明中重组hERα质粒构建及蛋白表达示意图；
附图4为重组hERα与野生型hERαWestern blotting图；
附图5显示了各种类雌激素与重组hERα结合能力。
具体实施方式
实施1重组人ERα(hERα)活性蛋白的获取，示意图见附图3：
1.杆状病毒转移载体的构建：用BamH I和EcoR I酶切pSG5、hERαcDNA，将线性化载体大片段和1875bp的hERαDNA片段连接，获得保存hERαDNA的pSG5-hERα质粒。BamH I和EcoR I酶切pSG5-hERα质粒、pFastBac1质粒，并将hERα与载体大片段连接，获得hERα杆状病毒转移载体pFast-hERα。酶切反应在37℃进行，连接所用酶为T4DNA连接酶。
2.杆状病毒表达载体的构建及hERα的表达：将pFast-hERα转化含有杆状病毒穿梭载体(杆粒，Bacmid)的大肠杆菌DH10BAC感受态细胞，使pFast-hERα的hERαDNA与Bacmid发生位点特异性转座，构建重组hERα-Bacmid。转化Sf 9细胞，经蓝白斑筛选，挑选白色菌落，碱法提取Bacmid DNA。经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将构建成功的hERα-Bacmi d，转染Sf 9细胞高效表达重组hERα，分离纯化此hERα。
步骤1、2中涉及的质粒及感受态细胞等均购自美国Invitrogen公司的杆状病毒真核表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)。
3.重组hERα的分离、纯化：2mLNi-NTA琼脂糖相用洗涤缓冲液(20mM TrisHCL，pH7.5，300mM NaCl，20％甘油，0.1mg/mL木炭处理的BSA，和10mM咪唑)洗涤，再在含100mL的重组受体溶液的柱子内孵育，16小时后，琼脂糖相用洗涤缓冲液洗涤，然后受体用5mL抽提缓冲液(20mM Tris HCL，pH7.5，300mMNaCl，20％甘油，0.1mg/mL木炭处理的BSA，和100mM咪唑)洗提。通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色后Western Blotting鉴定重组hERα，结果见附图4。富含重组hERα溶液组分的洗提液冰冻干燥得hERα冻干粉。
实施2设计能与hERα特异性结合的双链DNA探针
根据雌激素反应元件(ERE)，设计89bp的短片断DNA探针，其全序列为：5’-GTCTGGCCTGGCGTGGAAGTTTGGTCTGGCTCACTGCAGAGGTCAaggTGACCCACGTAGTCACTTGTCTAAAAGGGATGGTTTGTGTG-3’，含有雌激素反应元件(ERE)核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’(n为任意核苷酸)，核心序列周围的核苷酸可作调整。
实施3hERα单克隆抗体的制备
肽合成仪合成hERαA/B区一段18个氨基酸的多肽：Ala-Phe-Tyr-Arg-Pro-Asn-Ser-Asp-Asn-Arg-Arg-Gln-Gly-Gly-Arg-Glu-Arg-Leu，将其共价连接于载体钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，与弗氏佐剂一起免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与小鼠B细胞瘤株Sp2/0杂交融合形成杂交瘤株，筛选抗原特异性杂交瘤株，再克隆，挑取单克隆培养，取培养液采用饱和硫酸氨分级沉淀法分离纯化，获得能特异结合hERα的McAb。
实施4荧光定量PCR检测探针MGB-TaqMan和相应引物。FAM为报告基团，MGB为淬灭基团，其序列为：
MGB-TaqMan：FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB
上游引物FP：5’-TGGCCTGGCGTGGAAGT-3’
下游引物RP：5’-ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3’
实施5痕量EDCs与hERα的结合
重组hERα与样品中EDCs的结合在下列体系和条件进行：结合缓冲液为1％Tween-20，20mM Tris HCl，5mM二硫赤藓糖醇，2mg/mL BSA，10pM ATP，pH7.5。500μL体系，4℃孵育数小时。
实施6痕量EDCs与hERα的亲和力结合试验
将雌激素及具有类雌激素功能的物质如E1、E2、E3、双酚A(BPA)等代表性参考分子作为竞争剂与[3H]-E2进行竞争结合实验：0.75pmol重组hERα、2nM[3H]-E2，与系列浓度的不同竞争剂(E1、E2、E3、BPA)在实施5的条件下分别反应，结合和游离的配体用分离液(结合缓冲液中加2％木炭和0.2％右旋糖苷)分离，混合物4℃离心。用液体闪烁器计数上清[3H]放射活性。竞争剂抑制[3H]-E2达50％时的浓度为IC50。E2IC50值大约是5.9nM，与野生型hERα值接近。结合能力顺序为E2＞E3≈E1＞BPA＞。见附图5。
实施7PCR扩增
配体-ERα-DNA探针复合物(ERC)经加热，使得双链DNA探针解离，进行实时荧光定量多聚酶链反应(PCR)定量扩增。MGB-Taqman探针和引物由上海基康生物技术有限公司合成，荧光素设定：报告基团FAM，淬灭基团MGB。25μl反应体系：2XTaqman探针主要反应混合液12.5μl，MGB-Taqman探针0.3μl、引物FP和RP各0.5μ1、HotStar DNA聚合酶0.4μl、DNA模板2μl、加去离子水至总量25μl。扩增条件：95℃预变性15min，95℃变性5s、59.5℃退火延伸25s，40个循环，荧光检测，与雌二醇(E2)系列标准品比较测定样品模板数。系列标准品的浓度可分为：1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6M。
实施8观察检测体系对痕量EDCs的检测能力(准确性、灵敏度)
配制不同浓度的EDC标准品，测定检测体系的灵敏度(检测下限)和准确性(回收率)。以传统报告基因实验和GC/HPLC/MS分析结果为对照方法，进行比较。本技术可在3天内出具定量结果，灵敏度可达pM级，以传统方法相比，本方法具有快速、高效、高通量以及准确性、灵敏度高的优点。
实施9检测体系的试剂盒化
一种快速检测环境内分泌干扰物(EDCs)的试剂盒，它包括重组人雌激素受体α(hERα)及其特异的单克隆抗体(ERαMcAb)、双链DNA探针、检测探针和引物。还包括二抗、结合缓冲液、荧光定量PCR反应混合液、标准品。
其中：重组人雌激素受体α(hERα)为冻干粉末。双链DNA探针为80～110bp的短片断序列，实施例中的序列全长89bp为：5’-GTCTGGCCTGGCGTGGAAGTTTGGTCTGGCTCACTGCAGA GGTCAaggTGACCCACGTA GTCACTTGTCTAAAAGGGATGGTTTGTGTG-3’，含有雌激素反应元件(ERE)，其核心序列为5’-GGTCAnnnTGACC-3’(n为任意核苷酸)。检测探针为MGB-TaqMan探针，包括报告基团FAM、淬灭基团MGB，引物为针对此检测探针所设计引物，其序列为：MGB-TaqMan：FAM-TGGTCTGGCTCA CTGC-MGB，上游引物FP：5’-TGGCCTGGCGTGGAAGT-3’，下游引物RP：5’-ACAAACCATCCC TTTTAGACAAGTG-3’。二抗为羊抗兔IgG。结合缓冲液为1％Tween-20，20mM TrisHCl，5mM二硫赤藓糖醇，2mg/mLBSA，10nM ATP(pH 7.5)混合液。荧光定量PCR反应混合液主要成分为HotStar DNA聚合酶，dNTPs以及Mg2+。标准品为系列浓度(10pM～1nM)的雌二醇(E2)。
实施10检测流程
环境样品加入含游离hERα、DNA探针的结合缓冲体系，ERC复合物与ERαMcAb结合，用二抗包被的免疫磁珠吸附并分离，加热变性使探针游离，用特异性MGB-TaqMan探针和实时荧光定量PCR法进行检测。根据标准曲线得到环境样品中EDCs的相对雌激素效应TEQ(相对于E2)量。如果结合时加入固定量的E2，进行竞争结合抑制实验，则可反映EDCs的抗雌激素效应。
与本发明有关的核苷酸序列：
<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120>一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒
<160>4
<170>ABI PRIMER EXPRESS 2.0
<210>1
<211>13
<212>DNA
<213>人种(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(6，7，8)
<223>n＝a或g或c或t
<400>1
ggtcannntg acc
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>MGB-TaqMan
<223>根据被检测序列而设计，两端分别结合有报告基团FAM、淬灭基团MGB，作为检测探针
<400>2
tggtctggct cactgc
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>FP
<223>根据检测探针而设计，作为上游引物FP
<400>3
tggcctggcg tggaagt
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据检测探针而设计，作为下游引物RP
<400>4
cacttgtcta aaagggatgg tttgt

Claims (7)

1一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)表达并纯化具有生物活性的重组人雌激素受体α(hERα)：采用pSG5载体与人ERαcDNA构建质粒pSG5-hERα，酶切后导入杆状病毒真核表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)，得到杆状病毒表达质粒hER-Bacmid，转染Sf9细胞高效表达hERα，分离并纯化hERα；
(2)设计DNA双链探针，其全序列中含有雌激素反应元件(ERE)核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’，其中n为任意核苷酸；
(3)制备重组人雌激素受体α(hERα)特异的单克隆抗体(ERαMcAb)：肽合成仪合成hERα A/B区一段18个氨基酸的多肽，将其共价连接于载体钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，与弗氏佐剂一起免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与小鼠B细胞瘤株Sp2/0杂交融合形成杂交瘤株，筛选hERα抗原特异性杂交瘤株，再克隆，挑取单克隆培养，取培养液采用饱和硫酸氨分级沉淀法分离纯化，获得能特异结合hERα的McAb；
(4)针对步骤(2)所述DNA双链探针，设计荧光定量PCR检测探针MGB-TaqMan和相应引物，FAM为报告基团，MGB为淬灭基团，其序列为：
MGB-TaqMan：FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB
上游引物FP：5’-TGGCCTGGCGTGGAAGT-3’
下游引物RP：5’-ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3’
(5)将步骤(1)所得hERα与待检样品在结合缓冲液中4℃振摇孵育4h，使EDCs与hERα结合，受体发生变构，暴露受体DNA结合结构域，形成配体-ERα复合物；
(6)向步骤(5)复合物中加入步骤(2)所述双链DNA探针，4℃过夜，形成配体-ERα-DNA探针复合物，也即ERC；
(7)向步骤(6)所得ERC溶液中加入步骤(3)所制备的ERαMcAb，形成ERC-McAb，用磁珠包被的二抗羊抗鼠IgG结合McAb，形成ERC-McAb-磁珠IgG复合物，用磁力架吸附分离此复合物，洗去未结合的探针；
(8)加热步骤(7)所分离复合物，使DNA双链探针游离出来；
(9)对游离出来的DNA双链探针，用步骤(4)所述MGB-TaqMan探针和引物，进行实时荧光定量PCR定量扩增，25μl反应体系：2X Taqman探针主要反应混合液12.5μl，MGB-Taqman探针0.3μl、引物FP和RP各0.5μl、HotStar DNA聚合酶0.4μl、DNA模板2μl、加去离子水至总量25μl，扩增条件：95℃预变性15min，95℃5s、59.5℃25s，40个循环，与以雌二醇(E2)为标准品所作的标准曲线比对，确定待测样品中具有类雌激素作用物质的累计当量。
2、根据权利要求1所述的一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法，其特征在于：步骤(5)中的结合缓冲液为1％Tween-20，20mM Tris HCl，5mM二硫赤藓糖醇，2mg/mL胎牛血清(BSA)，10nM ATP构成的混合液。
3一种环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征在于其组成包括：
重组人雌激素受体α(hERα)及其特异的单克隆抗体(hERαMcAb)、双链DNA探针、检测探针和引物、二抗、结合缓冲液、荧光定量PCR反应混合液、标准品；其中：
重组人雌激素受体α(hERα)为杆状病毒表达系统所表达；
特异的单克隆抗体(hERαMcAb)为鼠抗人ERαA/B区的单克隆抗体；
双链DNA探针为80～110bp的能特异识别配体-ERα二聚体的序列，该序列含有雌激素反应元件(ERE)核心序列：5’-GGTCAnnnTGACC-3’，n为任意核苷酸；
检测探针为MGB-TaqMan探针，包括报告基团FAM、淬灭基团MGB，引物为针对此检测探针所设计引物，其序列为：
MGB-TaqMan：FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB
上游引物FP：5’-TGGCCTGGCGTGGAAGT-3’
下游引物RP：5’-ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3’。
4、根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征是：重组人雌激素受体α(hERα)为冻干粉末。
5、根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征是：所述结合缓冲液为1％Tween-20，20mM Tris HCl，5mM二硫赤藓糖醇，2mg/mLBSA，10nM ATP构成的混合液，其pH＝7.5。
6、根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征是：所述荧光定量PCR反应混合液主要成分为HotStar DNA聚合酶，dNTPs和Mg2+。
7、根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征是：所述标准品为系列浓度的雌二醇(E2)。
8、根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征在于：所述二抗为磁珠包被的羊抗鼠IgG。
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