EP1694868A2 - Procede pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein - Google Patents

Procede pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein

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Publication number
EP1694868A2
EP1694868A2 EP04816515A EP04816515A EP1694868A2 EP 1694868 A2 EP1694868 A2 EP 1694868A2 EP 04816515 A EP04816515 A EP 04816515A EP 04816515 A EP04816515 A EP 04816515A EP 1694868 A2 EP1694868 A2 EP 1694868A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
primer
nucleotide
seq
nucleotide sequence
sequence seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04816515A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Thibaut Verjat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1694868A2 publication Critical patent/EP1694868A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the diagnosis / prognosis of breast cancer.
  • the invention also relates to amplification primers and hybridization probes which can be used in this method, as well as a breast cancer diagnosis / prognosis kit.
  • Breast cancer is a common disease: one in eleven women develop breast cancer during her lifetime. However, because there are different types of breast cancer, and different prognosis of breast cancer, not all women with breast cancer receive the same treatment: the doctor offers each patient a treatment adapted to their situation, in order to get the best chance of recovery.
  • Hormone therapy which is a general treatment in breast cancer, is used in hormone-dependent breast cancer, that is to say in the case of tumors expressing hormone receptors on the surface of their cells.
  • rhormonotherapy can be used alone or in conjunction with adjuvant chemotherapy. In the context of a recurrence of the disease, hormone therapy can be prescribed either alone, or in combination or in conjunction with chemotherapy.
  • Chemotherapy is a general treatment for cancer since drugs, carried by the bloodstream, can act everywhere in the body. Chemotherapy has an important place in the therapeutic arsenal, particularly for the past ten years, with the appearance of new molecules.
  • the drugs are most often administered as an intravenous, subcutaneous, intramuscular infusion.
  • hormone receptors on the surface of hormonal cells, the treatment will be oriented towards hormone therapy or not. Mention may in particular be made of the estrogen receptors ESR1 and ESR2 and the progesterone receptor (PGR), which are the best known parameters for predicting the response to hormone therapy in breast cancer.
  • the ESR1 content is used as a prognostic indicator, and to predict a patient's response to treatment with antiestrogens, such as Tamoxifen® (Osborne C et al, Brest Cancer Res treat 51 227-238, 1998; Goldhirsch et al, J Clin Oncol 19: 3817-3827, 2001).
  • antiestrogens such as Tamoxifen®
  • the presence of the PGR receptor is also used for monitoring hormone therapy, and as a prognostic marker (Horwitz et al, Récent Prog Horm Res 41: 249-316, 1995).
  • the present invention provides a new method for the diagnosis / prognosis of breast cancer. This process uses in particular new nucleotide sequences which can be used as amplification primers or hybridization probes. The method according to the invention makes it possible in particular to determine which treatment is the most suitable for a patient suffering from breast cancer.
  • the invention relates to a method for the diagnosis / prognosis of breast cancer comprising the following steps: A - the nucleic material is extracted from a biological sample, B - at least one pair of primers is used amplification to obtain amplicons of at least one target sequence of the nucleic material C - at least one detection probe is used to detect the presence of said amplicons characterized in that, during step B, said primer pair comprises at at least one amplification primer comprising at least 10 nucleotide units of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 24 and / or during step C), said detection probe comprises at least 10 nucleotide motifs of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 20.
  • nucleotide sequence comprising at least 10 nucleotide motifs of a nucleotide sequence chosen from SEQ IDs No. 1 to SEQ ID No. 20 is very relevant as an amplification primer for amplifying target sequences, such as the gene encoding ESR1,
  • the inventors have also discovered that the use of a nucleotide sequence comprising at least 10 nucleotide motifs of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20 as a hybridization probe is very relevant for specific hybridization on target sequences, such as the genes encoding ESR1, ESR2, PGR or HER2.
  • the term “biological sample” means any sample capable of containing a nucleic material as defined below.
  • This biological sample can be taken from a patient and can in particular be a sample of tissues, blood, serum, saliva, circulating cells of the patient. Preferably, this biological sample is taken from a tumor.
  • This biological sample is available by any type of sample known to those skilled in the art.
  • the nucleic material comprises a nucleic acid sequence such as a deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) sequence.
  • the nucleic material comprises a sequence of deoxyribonucleic acids.
  • the nucleic material is extracted from a biological sample taken from a patient.
  • nucleotide sequence or nucleic acid sequences or nucleotide fragment or oligonucleotide, or polynucleotide
  • nucleotide sequence is meant a chain of nucleotide motifs assembled together by phosphoric ester bonds, characterized by the informational sequence of natural nucleic acids, capable of hybridize to another nucleic acid sequence, the sequence being able to contain monomers of different structures and to be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and / or by chemical synthesis.
  • nucleotide motif means a derivative of a monomer which can be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in DNA the sugar is deoxy-2-ribose, in RNA the sugar is ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogen base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine; or the monomer is a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements; for example, the modification may occur either at the bases, with modified bases such as inosine, methyl-5convergesoxycyti 'dine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5 deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the sugar level, for example the replacement of at least one deoxyribose by
  • This nucleic material comprises at least one target sequence.
  • the sequence of nucleotide motifs is specific for a target gene, such as preferably the gene coding for ESR1, ESR2, PGR or HER2.
  • the target sequence is included in a gene chosen from genes encoding ESR1, ESR2, PGR or HER2. In the remainder of the presentation, we will speak of target sequence whether it is single strand or double strand.
  • the nucleic material is extracted from a biological sample by any protocol known to those skilled in the art.
  • the extraction of nucleic acids can be carried out by a step of lysis of the cells present in the biological sample, in order to release the nucleic acids contained in the protein and / or lipid envelopes of the cells (such as cellular debris which disrupt subsequent reactions).
  • lysis methods as described in patent applications WOOO / 05338 on mixed magnetic and mechanical lysis, WO99 / 53304 on electrical lysis, and WO99 / 15321 on mechanical lysis.
  • This lysis step can also be followed by a purification step, allowing the separation between the nucleic acids and the other cellular constituents released in the lysis step.
  • This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acids, and can be adapted to the purification of DNA or RNA.
  • nucleic acid purification step is particularly advantageous if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids.
  • a particularly interesting embodiment of these magnetic particles is described in patent applications WO97 / 45202 and WO99 / 35500.
  • Another interesting example of a nucleic acid purification method is the use of silica either in the form of a column or in the form of inert particles (Boom R. et al., J. Clin.
  • amplification primer means a nucleic sequence comprising from 10 to 100 nucleotide units, preferably from 15 to 25 nucleotide units.
  • This amplification primer comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of a sequence chosen from SEQ ID Nos. 1 to 20.
  • a amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of • a sequence homologous to SEQ ID No. 1 to SEQ ID No.
  • SEQ ID NO: 20 ie the sequence complementary or sufficiently complementary to SEQ ID NO: 20 o a sequence having sufficient homology to hybridize to SEQ ID NO: l to SEQ ID: 20 or the sequence complementary to SEQ ID ° to SEQ ID No. 20, • a sequence comprising a sequence from SEQ ID No 1 to SEQ ID No 20 (or a sequence homologous to SEQ ID No 1 to SEQ ID No 20 as defined above) in which the uracil bases are substituted for the thymine bases, and which would have the same function as the amplification primer according to the invention, that is to say amplifying all or part of the gene encoding ESR1, ESR2, PGR or HER2, is considered to be equivalent to the amplification primer according to invention.
  • a pair of amplification primers allows the initiation of an enzymatic polymerization, such as in particular an enzymatic amphfication reaction.
  • enzymatic amplification reaction is meant a process generating multiple copies (or amplicons) of a nucleic sequence by the action of at least one enzyme.
  • amplicons is understood to mean the copies of the target sequence obtained during an enzymatic amplification reaction.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LCR Liigase Chain Reaction
  • RCR Repair Chain Reaction
  • 3SR Self Sustained Sequence Replication
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • these enzymatic amplification reactions generally involve a succession of cycles comprising the following stages: o the denaturation of the target sequence if it is in double strand in order to obtain two target strands, complementary, o the hybridization of each of the target strands, obtained during the previous denaturation step with at least one primer amplification, o the formation from the amplification primers of the strands complementary to the strands on which they are hybridized in the presence of an enzyme polymerase and of nucleoside triphosphate (ribonucleoside triphosphate and / or deoxyribonucleoside triphosphate according to the techniques) this cycle being repeated one number of times determined to obtain the target sequence in a sufficient proportion to allow its detection.
  • nucleoside triphosphate ribonucleoside triphosphate and / or deoxyribonucleoside triphosphate according to the techniques
  • hybridization is meant the process during which, under appropriate conditions, two nucleic acid sequences such as in particular an amplification primer and a target sequence or a hybridization probe and a target sequence, bind with stable hydrogen bonds and specific to form a double strand. These hydrogen bonds are formed between the complementary bases Adenine (A) and
  • T Ihymine (or uracil (U)) (we speak of A-T binding) or between the complementary bases Guanine (G) and cytosine (C) (we speak of GC binding).
  • the hybridization of two nucleic acid sequences can be total (we then speak of complementary sequences), that is to say that the double strand obtained during this hybridization only comprises AT bonds and C-G bonds.
  • This hybridization can be partial (we then speak of sufficiently complementary sequences), that is to say that the double strand obtained comprises AT bonds and CG Houses making it possible to form the double strand, but also bases not linked to a complementary base. .
  • the hybridization between two complementary or sufficiently complementary sequences depends on the operating conditions which are used, and in particular on the stringency.
  • Stiingency is defined in particular as a function of the base composition of the two nucleic sequences, as well as by the degree of mismatch between these two nucleic sequences.
  • the stringency can also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature. All these data are well known û the appropriate conditions can be determined by a person skilled in the art. More specifically, NASBA is an isothermal amplification technology for nucleic acid based on the joint action of three enzymes (reverse transcriptase
  • RNA targets more than a billion times in 90 minutes.
  • the amplification reaction occurs at 41 ° C and gives single stranded RNA molecules as the final product.
  • NASBA requires a primer pair, at least one of which includes a promoter for initiating transcription by a bacteriophage T7 polymerase.
  • a primer is preferably chosen from SEQ ID Nos. 21 to 24.
  • said pair of primer comprises at least one amplification primer comprising a promoter allowing the initiation of transcription by a bacteriophage T7 polymerase.
  • said pair of primers, used in step B is chosen from the following primer pairs: ⁇ a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and again more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No.1 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2; by way of indication, when the first primer has the sequence SEQ ID No. 1, and the second primer has the sequence SEQ ID No.
  • an amplicon, specific for the gene encoding ESR1, of a size of 202 pairs is obtained base, which corresponds to the sequence 1427-1629 on the sequence of the gene encoding reference ESR1 (Genbank X03635).
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • first primer has the sequence SEQ ID N ° 3
  • second primer has the sequence SEQ ID N ° 4
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 5
  • a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • an amplicon, specific for the ESR2 gene, of a size of 210 pairs is then obtained base, which corresponds to the sequence 1640-1850 on the sequence encoding ESR2 reference (Genbank MN_001437) ⁇ a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID N ° 7 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • the second primer has the sequence SEQ ID No. 16
  • an amplicon, specific for the gene encoding PGR, of a size of 658 is then obtained. base pairs, which corresponds to the sequence 2319-2977 on the reference PGR coding sequence (Genbank NM_000926).
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 17
  • a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 18; by way of indication, when the first primer has the sequence SEQ ID No. 17, and the second primer has the sequence SEQ ID No.
  • an amplicon, specific for the gene encoding ESR2, of a size of 702 is then obtained base pairs, which corresponds to the sequence 1246-1948 on the sequence encoding ESR2 reference (Genbank MN_001437).
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 19 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 20; by way of indication, when the first primer has the sequence SEQ ID No. 19, and the second primer has the sequence SEQ ID No.
  • said pair of primers, used in step B comprises a first primer comprising a promoter allowing the initiation of h transcription by a polymerase of bacteriophage T7, is chosen from among the pairs of the following primer: ⁇ a first amplification primer of SEQ ID No. 21 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ JD No.
  • ⁇ a first amplification primer of SEQ ID No. 22 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ TD No. 4; ⁇ a first amplification primer of SEQ ID No. 23 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 6; ⁇ a first amplification primer of SEQ ID No. 24 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ JD No. 8;
  • the expression of a target gene can be normalized by the simultaneous determination of the expression of a so-called gene. of household, whose expression is similar in the different groups of patients. By achieving a relationship between the expression of the target gene and the expression of the housekeeping gene, this corrects any variability between the different experiments.
  • Those skilled in the art may refer in particular to the following publications: Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29: 23-39; Giulietti A Methods, 2001, 25: 386-401.
  • at least one pair of amplification primers is used during step B to obtain specific amplicons for a household gene.
  • household gene is meant a gene whose expression is stable in a given tissue, and whatever the physiological situation.
  • the housekeeping gene is the PPIB gene which codes for cyclophyline B.
  • said amplification primer for obtaining specific amplicons of a gene of household comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of a sequence chosen from SEQ ID N ° 25 to 29.
  • said pair of amplification primers for obtaining specific amplicons of a housekeeping gene is chosen from the following primer pairs: ⁇ a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 27 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 28 ;
  • an amplicon, specific for the PPIB gene of a size of 239 pairs is obtained.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID N ° 25 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 26;
  • an amplicon, specific for the PPIB gene of a size of 639 pairs is obtained.
  • said pair of amplification primers used to obtain amplicons specific for a gene for household includes a first primer comprising a promoter allowing the initiation of the transcription by a bacteriophage T7 polymerase.
  • Said first amplification primer is preferably of SEQ ID No. 30 and said second amplification primer preferably comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 0 28.
  • step C at least one detection probe is used to detect the presence of said amplicons.
  • This detection step can be carried out by all the protocols known to those skilled in the art relating to the detection of nucleic acids.
  • the term “hybridization probe” is intended to mean a nucleic sequence of 10 to 100 nucleotide units, in particular 15 to 35 nucleotide units, having specific hybridization under specific conditions to form a hybridization complex with a target nucleic sequence.
  • the hybridization probe can comprise a marker allowing its detection. We then speak of detection probes.
  • detection is meant either a direct detection by a physical method, or an indirect detection by a detection method using a marker. Many detection methods exist for the detection of nucleic acids.
  • marker is meant a tracer capable of generating a signal that can be enjoyed.
  • a non-limitative list of these tracers includes the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; the groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, variation of contact angle or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunnel effect, etc. ; radioactive molecules like 32 P, 35 S or 125 I.
  • the hybridization probe can be a so-called detection probe.
  • the so-called detection probe is marked by means of a marker as defined above. Thanks to the presence of this marker, it is possible to detect the presence of an ixybridization reaction between a given detection probe and the specific target sequence of a given species.
  • the detection probe can in particular be a “molecular beacon” detection probe as described by Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14: 303-308).
  • the hybridization probe can also be a so-called capture probe.
  • the so-called capture probe is immobilized or immobilizable on a solid support by any suitable means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or adsorption. The hybridization reaction between a given capture probe and a target sequence is then detected.
  • labeled target sequences can be used, directly (in particular by incorporating a marker within the target sequence) or indirectly (in particular by the use of a detection probe as defined above) the target sequence.
  • the cleavage can be achieved in particular by the action of imidazole and manganese chloride.
  • the target sequence can also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a detection probe according to the sandwich hybridization technique described in document WO 91/19812.
  • solid support use may be made of synthetic materials or natural materials, optionally chemically modified, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose or dex rane, polymers, copolymers, in particular based on monomers of the styrene type, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers such as nylon; mineral materials such as silica, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels etc.
  • the solid support can be in the form of a microtiter plate, of a membrane as described in application WO 94/12670, of a particle.
  • the detection probe comprises a fluorophore and a quencher.
  • the hybridization probe comprises a FAM (6-carboxy-fluorescein) or ROX (6-carboxy-X-rhodamine) fluorophore at its 5 ′ end and a quencher (Dabsyl ) at its 3 'end.
  • FAM 6-carboxy-fluorescein
  • ROX 6-carboxy-X-rhodamine
  • steps B and C are carried out at the same time.
  • This preferred mode can be implemented by "real-time NASBA” which brings together in a single step the NASBA amplification technique and real-time detection which uses “molecular beacons”.
  • the NASBA reaction takes place in the tube, producing single-stranded RNA with which the specific "molecular beacons” can hybridize simultaneously to give a fluorescent signal.
  • the formation of new RNA molecules is measured in real time by continuous monitoring of the signal in a fluorescent reader.
  • T amplification in NASBA can be done in the presence of DNA in the sample. It is therefore not necessary to verify that the DNA has indeed been completely eliminated during the extraction of the RNAs.
  • step b) when it is desired to detect the target gene encoding PGR (reference sequence NCBI accession number: NM_000926), use is preferably made in step b) p of a first primer of SEQ ID N ° 3 or 22 P a second primer of SEQ ID No 4 and during step c) p a detection probe comprising SEQ ID No 10
  • step b) when it is desired to detect the target gene encoding ESR2 (reference sequence NCBI accession number: MN_001437), it is preferentially used during step b) p a first primer of SEQ ID No 5 or 23 p a second primer of SEQ ID No 6 and from step c) p a detection probe comprising SEQ ID No.
  • a first primer of SEQ ID is preferably used during step b) P N ° 7 or 24 p a second primer of SEQ ID N ° 8 and during step c) p a detection probe comprising SEQ ID N ° 12
  • PPIB reference sequence NCBI accession number: M60857
  • use is preferably made in step b) P a first primer of SEQ ID No 27 or 30 p a second primer of SEQ ID No 28 and during step c) p a detection probe comprising SEQ ID No. 29
  • the housekeeping gene is the PPIB gene which codes for cyclophyline B and the detection probe comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID N ° 27 to 29.
  • this detection probe comprises a fluorophore and a quencher.
  • the invention also relates to an amplification primer comprising at least 10, preferably 15, and even more preferably 20 nucleotide units of a nucleotide sequence chosen from SEQ JD No. 1 to SEQ ID No. 20.
  • the amplification primer comprises a promoter allowing the initiation of transcription by a polymerase of bacteriophage T7.
  • This primer can in particular be any one of SEQ ID Nos. 21 to 24, and is preferably used in a NASBA amplification reaction.
  • the invention also relates to a pair of primer chosen from the following pairs of primers: p a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 4; for information, when the first primer has the sequence SEQ ID No.
  • the second primer has the sequence SEQ ID No. 4, an amplicon, specific for the gene encoding PGR, of a size of 184 base pairs, which corresponds to the sequence 2761-2945 on the reference PGR coding sequence (Genbank NM_000926).
  • P a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 5 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • the second primer has the sequence SEQ ID No. 16
  • an amplicon, specific for the gene encoding PGR, of a size of 658 is then obtained. base pairs, which corresponds to the sequence 2319-2977 on the reference PGR coding sequence (Genbank NM_000926).
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 17
  • a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 18; by way of indication, when the first primer has the sequence SEQ ID No. 17, and the second primer has the sequence SEQ ID No.
  • an amplicon, specific for the gene encoding ESR2, of a size of 702 is then obtained base pairs, which corresponds to the sequence 1246-1948 on the sequence encoding ESR2 reference (Genbank MN_001437) p a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID No. 19 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 20; As an indication, when the first primer has the sequence SEQ ID No. 19, and the second primer has the sequence SEQ ID No.
  • said first primer comprises a promoter allowing the initiation of transcription by a polymerase of bacteriophage T7.
  • This primer can in particular be any one of SEQ ID 21 to
  • the first primer comprises a promoter allowing the initiation of transcription by a bacteriophage T7 polymerase
  • this first primer is preferably included in a pair of primers chosen from the following primer pairs: P a first amplification primer of SEQ ID No. 21 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2; P a first amplification primer of SEQ ID No. 22 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 4; p a first amplification primer of SEQ ID No.
  • a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID N 0 6;
  • P a first amplification primer of SEQ ID No. 24 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ TD No. 8;
  • the invention also relates to the use of at least one tehe amplification primer as defined above and or at least one primer pair as defined above during a NASBA amplification reaction.
  • the invention also relates to an amplification primer for obtaining specific amplicons of a housekeeping gene.
  • This amplification primer preferably comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of a sequence chosen from SEQ ID Nos. 25 to 29.
  • the invention also relates to a pair of amplification primers for obtaining specific amplicons of a household gene, chosen from the following pairs: P a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 27 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 28; As an indication, when the first primer has the sequence SEQ ID No 27, and the second primer has the sequence SEQ ID No 28, an amplicon, specific for the PPIB gene, of a size of 239 pairs is obtained.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID N ° 25 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 26;
  • an amplicon, specific for the PPIB gene of a size of 639 pairs is obtained.
  • base which corresponds to the sequence 11-650 on the reference PPIB sequence (Genbank M60857).
  • said pair of amplification primers used to obtain specific amplicons of a housekeeping gene comprises a first primer comprising a promoter allowing the initiation of transcription by a bacteriophage polymerase T7.
  • Said first amplification primer is preferably of SEQ ID No. 30 and said second amphfication primer preferably comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence
  • the invention also relates to a detection probe comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide patterns of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 20.
  • this detection probe comprises a fluorophore and a quencher.
  • the invention also relates to a hybridization probe for detecting specific amplicons of a housekeeping gene.
  • this detection probe comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID N ° 27 to 29.
  • this detection probe comprises a flurophore and a quencher.
  • the invention also relates to the use of at least one primer as defined above and or of at least one pair of primers as defined above and / or of at least one detection probe as defined above for the diagnosis / prognosis of breast cancer.
  • the invention finally relates to a kit for the diagnosis / prognosis of breast cancer comprising at least one primer as defined above and / or at least one pair of primers as defined above and / or at least a detection probe as defined above.
  • the kit when it is desired to detect the target gene encoding ESR1, the kit preferably comprises p a first primer of SEQ ID No 1 or 21 p a second primer of SEQ ID No 2 p a detection probe comprising SEQ ID N ° 9.
  • the kit when it is desired to detect the target gene encoding PGR, the kit preferably comprises p a first primer of SEQ ID No. 3 or 22 p a second primer of SEQ ID No. 4 p a detection probe comprising SEQ ID No. 10
  • the kit when it is desired to detect the target gene coding for ESR2 (reference sequence NCBI accession number: MN_0O1437), the kit preferably includes a first primer of SEQ ID No.
  • the kit when it is desired to detect the target gene coding HER2 (NCBI accession number reference sequence: NM_0O448), the kit preferably comprises p a first primer of SEQ ID N ° 7 or 24 p a second primer of SEQ ID N ° 8 p a detection probe comprising SEQ ID N ° 12
  • the kit further comprises p a first primer of SEQ ID No 27 or 30 p a second primer of SEQ ID No 28 P a detection probe comprising SEQ ID N ° 29
  • p a first primer of SEQ ID No 27 or 30
  • p a second primer of SEQ ID No 28 P
  • a detection probe comprising SEQ ID N ° 29
  • FIG. 1 represents the standard curves obtained for the ESR1 (fig la), PGR (fig lb), ESR2 (fig le), HER2 (fig ld), and PPIB (fig le) genes as described in example l- 3a.
  • Each standard curve, obtained for each gene from a reference sequence which is specific for the gene, transcribed into RNA in vitro in a plasmid represents the time of appearance of the exponential phase of the amplification (we also speak of TTP: time to positivity, threshold time) as a function of the number of RNA copies present at the start of NASBA amplification (the greater the quantity of starting RNA copies at the start of amplification, the longer the time of appearance of the exponential phase is short).
  • PGR PGR
  • T47D not expressing the ESR1 receptor and expressing the PGR receptor
  • BT- 549 expressing neither the ESR1 receptor nor the PGR receptor.
  • LBA radioligand
  • the LBA technique informed us about the presence of functional ER and PR receptors in the cytosol of cells.
  • the expression in HER2 was previously determined by quantitative PCR (informing us about the amplification of the HER2 gene) and ELISA (informing us about the expression of the membrane protein encoded by the HER2 gene) according to a conventional technique known to man. of career.).
  • RNA samples were extracted from cell lines, by the use of Trizol® Reagent according to the recommendations of the kit supplier (Invitrogen, Canada). The quality and quantity of RNA were determined at 260 and 280 nm and checked on agarose gel. The RNAs were then frozen at -70 ° C until use. Total RNA was also extracted in a comparable manner from tumors of patients with breast cancer. 3) Amplification by NASBA
  • the NASBA amphfication reaction is based on the simultaneous activity of a reverse transcriptase from the avian myeloblast virus (AMV-RT), an RNAse H of E. coli and an RNA polymerase from bacteriophage T7 (Compton J, 1991, Nature, 350: 91-92).
  • AMV-RT avian myeloblast virus
  • RNAse H of E. coli avian myeloblast virus
  • RNA polymerase from bacteriophage T7
  • Real-time detection of amplicons is carried out using a Nuclisens EasyQ® reader (bioMérieux BV, The Netherland) and “molecular beacon” detection probes, as defined above.
  • the quantification in NASBA is based on the use of a standard curve, obtained from a sequence of reference, specific for the target gene, transcribed into RNA in vitro in a plasmid.
  • This standard curve represents the time of appearance of the exponential phase of the amplification as a function of the number of RNA copies present at the start of the NASBA amplification (the greater the quantity of starting RNA copies at the start of amplification, the shorter the time for the exponent phase to appear).
  • a first primer of SEQ ID No. 13 5 'TACAGGCCAA ATTCAGATAA TCGAC 3' and a second primer of SEQ JD No. 14 5 'GGAACCGAGAT was used.
  • GATGTAGCCA 3 ' located respectively in positions 808-832 and 1646-1666 of the reference sequence, in order to generate in PCR (a 1st denaturation cycle (95 ° C; 1 min); then 35 cycles comprising the following steps: denaturation : 94 ° C; 1 min; hybridization: 60 ° C; 1 min; elongation: 72 ° C; 2 min) and a last cycle comprising a denaturation step: 72 ° C; 7 min) an amplicon of 858 base pairs, specific for the gene encoding ESR1 (we will speak of "amplicon ESR1").
  • the ESR1 amplicons obtained as described above were then cloned into plasmid pGEM-T (Promega, Madison, USA).
  • ESR1 amplicons The sequence of these ESR1 amplicons was verified by sequencing (Biofidal, Vaulx in Vehn, France), in order to make sure that it corresponded well to the sequence of the target gene which it was desired to amplify.
  • the amplicons obtained were very specific for the ESR1 gene.
  • RNA polymerase T7 or SP6 (Megascript® t, A ⁇ ibion, Austin, USA), depending on the orientation of F amplicon).
  • T7 or SP6 Megascript® t, A ⁇ ibion, Austin, USA
  • the RNAs were purified by Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and quantified (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).
  • RNAs obtained above were diluted to different concentrations (stock solution: 0.2.10 ⁇ copies / ⁇ l, cascade dilution 0.2.10 u copies / ⁇ l to 0.2.10 2 copies / ⁇ l). These cascade dilutions are amplified by NASBA using the Nuclisens basic® kit
  • the fluorescence curve as a function of time makes it possible to define the time when the exponential phase of the amplification will start (also called TTP: pull to positivity, threshold time)
  • the standard curve ESR1 shows the number of transcripts present at the start in the solution as a function of the TTP detected during the NASBA amplification. Using a standard curve, the number of copies of the target gene is calculated absolutely. Finally, this value is normalized using a housekeeping gene, in this case the PPIB gene.
  • This standard curve ESR1 shown in FIG. Standard curve of the coda target gene nt PGR
  • the curve of the target gene encoding PGR was produced according to the same principle as for ESR1, with the exception of the amplification primers used and “molecular beacons”, which were specific for PGR.
  • RNA polymerase 17 or SP6 (Megascript® Ht, Ambion, Austin, USA), depending on the orientation of F amplicon).
  • SP6 Megascript® Ht, Ambion, Austin, USA
  • the RNAs were purified by Rneasy® Mini Kit (Qiagcn, Hilden, Germany) and quantified
  • RNAs obtained above were diluted to different concentrations (stock solution:
  • a first PGR primer of SEQ ID No. 3 5 'TCCCTGCCAA TATCTTGGGT A 3' comprising, at its 5 'end, and indicated in lower case, a sequence comprising the T7 polymerase promoter, i.e. a first primer whose entire sequence is SEQ ID No.
  • the curve of the target gene encoding ESR2 was performed according to the same principle as for
  • GGACCCCGTGA TGGAGGACTT 3 ' located respectively in position 1246- 1263 and 1928-1948 of the reference sequence.
  • the sequence of these ESR2 amphcons was verified by sequencing (Biofidal, Vaulx en Velin, France), to ensure that it corresponded well to the sequence of the target gene that we wanted to amplify.
  • the amphcons obtained were very specific to the ESR2 gene.
  • the amphcons were then transcribed into RNA in vitro by the use of an RNA polymerase (17 or SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), depending on the orientation of
  • RNAs were purified by Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and quantified
  • RNA6000Nano Agilent Technologies, Walbronn, Germany.
  • the RNAs obtained above were diluted to different concentrations (stock solution:
  • a first ESR2 primer of SEQ ID No. 5 5 'TGAGCAGATG TTCCATGCCC T 3' comprising, at its 5 'end, and indicated in lowercase the promoter of the T7 polymerase, that is to say a first primer whose entire sequence is SEQ ID N ° 23: 5 'aattctaata cgactcacta tagggagaag gTGAGCAGAT GTTCCATGCC CT 3'
  • p 0.2 ⁇ M of a second ESR2 primer of SEQ ID N ° 6 5 'TCCAGTATGT ACCCTCTGGT 3' p 0.1 ⁇ M of “molecular beacons” comprising SEQ ID No.
  • the curve of the target gene encoding HER2 was performed according to the same principle as for
  • HER2 was verified by sequencing (Biofidal, Vaulx en Velin, France), to ensure that it corresponded well to the sequence of the target gene that we wanted to amplify.
  • the amphcons obtained were very specific for the HER2 gene.
  • the sequence of these FIER2 amphcons has been verified by sequencing (Biofidal, Vaulx in
  • RNA polymerase 17 or SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA)
  • SP6 Megascript® kit, Ambion, Austin, USA
  • the RNAs were purified by Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and quantified
  • RNAs obtained above were diluted to different concentrations (stock solution: 0.2.10 11 copies / ⁇ l, cascade dilution 0.2.10 11 copies / ⁇ l to 0.2.10 2 copies / ⁇ l). These cascade dilutions are amplified by NASBA using the Nuclisens basic® kit
  • a first HER2 primer of SEQ ID No. 7 5 'GAGCCAGCCC GAAGTCTGTA 3' comprising, at its 5 'end, and indicated in small letters the promoter of the polymerase T7, that is to say a first primer whose entire sequence is SEQ ID No 24: 5 'aattctaata cgactcacta tagggagaag g GAGCCAGC CCGAAGTCTG TA 3', p 0.2 ⁇ M of a second HER2 primer of SEQ ID No 8 5 'TCTTAGACCA TGTCCGGGAA A 3', p 0.1 ⁇ M of “molecular beacons” used included SEQ ID No.
  • Standard curve of the PPIB target gene The curve of the PPIB target gene was performed according to the same principle as for ESR1, with the exception of the amplification primers and “molecular beacons”, which were specific for PPIB.
  • CCTACTCCTT 3 ' located respectively in positions 11-30 and 631-650 of the reference sequence.
  • the sequence of these PPIB amplicons was verified by sequencing (Biofidal, Vaulx en Velin, France), to ensure that it corresponded well to the sequence of the target gene that we wanted to amplify.
  • the amplicons obtained were very specific to the PPIB gene.
  • RNA polymerase T7 or SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), according to the orientation of
  • RNAs were purified by Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and quantified
  • RNAs obtained above were diluted to different concentrations (stock solution:
  • cascade dilutions are amplified by NASBA using the Nuclisens basic® kit (bioMérieux BV, The Netherlands) in the presence of: p 0.2 ⁇ M of a first PPIB primer of SEQ ID No. 27 5 'CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3 ', comprising, at its 5' end, and indicated in lower case a sequence comprising the T7 polymerase promoter, ie a first primer whose entire sequence is SEQ ID No.
  • NASBA amplification reaction bl) Duplex amplification of the ESR1 and PPIB genes This amplification reaction was carried out using a Nuclisens basic® kit (bioMérieux BV, The Netherlands). For this, 5 ng of total RNA, extracted from the different cell lines, were added to 10 ⁇ l of NASBA buffer (final concentration in 20 ⁇ l of reaction medium: 40 mM Tris HCl pH 8.5, 12 mM MgC12, 70 mM KC1 , 5mM dithiotreitol, 15% v / v DMSO, ImM from each dNTP, 2mM from each NTP).
  • “molecular beacons” comprising p SEQ ID No. 9 5 'GATCCTGATGATTGGTCTCG 3', marked with a FAM fluorophore (6-carboxy-fluorescein) in 5 ', and with a “ quencher '(Dabsyl) in 3' (complete sequence: 5 'FAM-cg ⁇ tcgGATC CTGATGATTG GTCTCGcg t cg-Dabsyl 3', for the detection of RNA of the ESRl P gene SEQ ID No.
  • RNAse H 32U of T7 RNA polymerase, 6.4 U of AMV-RT
  • a 90-minute incubation was carried out at 41 ° C.
  • the quantification of the transcribed RNAs was determined in real time (NucliSens EasyQ, bioMérieux), the NASBA reaction producing amplicons with which the specific "molecular beacons" can hybridize simultaneously to give a fluorescent signal.
  • the formation of new RNA molecules is measured in real time by continuous signal monitoring in a fluorescent reader, the NucliSens EasyQ analyzer. The analysis and the automated communication of the data are ensured by the software Nuclisens TTP (bioMérieux BV, The Netherlands).
  • the standard curve, as defined above (dilution of transcribed RNA: 10 8 to 10 2 copies) was used for the quantification of the expression of each of the target gene ESR1 and of the gene ⁇ household PPIB, in order to extrapolate the number of copies of mRNA per sample.
  • the quantification of the expression of a target gene was expressed by number of copies of mRNA / 5ng of total RNA.
  • Table 1 shows the expression of the ESR1 gene quantified from 5 ng of total RNA coming from the MCF-7, T47D and BT-549 cell lines.
  • ESR1 gene was expressed by the ratio between the number of mRNA copies of the target gene and the number of mRNA copies of the housekeeping gene.
  • ESR1 mRNAs were expressed in MCF-7 cells while they were not detected in BT-549 cells, in accordance with the expression of hormone receptors in these cells. Note that ESR1 mRNAs were expressed in T47D cells, while only the PGR receptor was expressed, suggesting post-transcriptional regulation of the ESR1 gene.
  • Table 2 presents the expression of the ESR1 gene quantified from 50 ng of total RNA originating from IHC + tumors, that is to say expressing nuclear hormone receptors for tumor cells, or from IHC- tumors. say not expressing nuclear hormone receptors (average on 3-7 tumors).
  • the expression of the ESR1 gene was expressed by the ratio between the number of mRNA copies of the target gene and the number of mRNA copies of the housekeeping gene. Overexpression of the ESR1 gene was observed in IHC + tumors. From the ESRl and PPIB standard curves rehashed previously, the detection limit and the quantification limit were determined for the ESRl and PPIB genes amplified in duplex. The limit of quantification was observed at 100 copies of mRNA for ESR1 and PPIB. The detection limit was 100 copies of mRNA for ESR1 and PPIB.
  • ESR1 PPIB duplex The specificity of the ESR1 PPIB duplex was tested by carrying out the amplification of ESR1 in the presence of “molecular beacon” specific for PGR, and by carrying out the amplification of PGR in the presence of “molecular beacon” specific for ESRl. No signal was detected. Likewise, no signal was observed when NASBA was produced from total RNA from the BT-549 cell gene, ESR1 and negative PGR.
  • RNA total RNA, extracted from the different cell lines, were added to 10 ⁇ l of NASBA buffer (final concentration in 20 ⁇ l of reaction medium: 40 mM Tris HCl pH 8.5, 12 mM MgC12, 70 mM KC1 , 5mM dithiotreitol, 15% v / v DMSO, ImM from each dNTP, 2mM from each NTP).
  • “molecular beacons” comprising p SEQ ID No. 10 5 'CGGGCACTGAGTGTTGAATT 3', labeled with a FAM fluorophore (6-carboxy-fluorescein) at their 5 'end, and a “quencher” (Dabsyl) at its 3 ′ end (complete sequence: 5 ′ FAM- cgatcgCGGG CACTGAGTG T TGAATTcg at cg-Dabsyl 3 ′) for the detection of RNA encoding PGR during the PGR / cyclophyhne B duplex, p SEQ JD N ° 29 5 'GATCCAGGGCGGAGAGACTTCA 3', marked with a ROX fluorophore (6-carboxy-X-rhoclamine) in 5 ', and with a quencher (Dabsyl) in 3' (complete sequence: 5 'ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAG
  • a first PGR primer of SEQ ID No. 3 5 ′ TCCCTGCCAA TATCTTGGGT A 3 ′ comprising, at its 5 ′ end, and indicated in lower case, a sequence comprising the promoter of polymerase 17, ie a first primer whose entire sequence is SEQ ID No. 22: 5 'aattctaata cgactcacta tagggagaag gTCCCTGCCA ATATCTTGGG TA 3'
  • Pre-incubation was carried out for 2 minutes at 65 ° C before a 2-minute incubation at 41 ° C.
  • a volume of 5 ⁇ l of an enzyme mixture (0.08U of RNAse H, 32U of T7 RNA polymerase, 6.4 U of AMV-RT) was added, and a 90-minute incubation was carried out at 41 ° C.
  • the quantification of the transcribed RNAs was determined in real time according to a principle comparable to what has been described for ESR1.
  • the standard curve, as defined above (dilution of transcribed RNA: 10 8 to 10 2 copies) was used for the quantification of the expression of the target gene PGR and the housekeeping gene PPIB, in order to extrapolate the number of copies d 'MRNA per sample.
  • the quantification of the expression of a target gene was expressed by number of copies of mRNA / 5ng of total RNA.
  • Table 3 shows the expression of the PGR gene quantified from 5 ng of total RNA from the cefular lines MCF-7, T47D and BT-549.
  • the expression of the PGR gene was expressed by the ratio between the number of mRNA copies of the target gene and the number of mRNA copies of the housekeeping gene.
  • PGR mRNAs were expressed in MCF-7 and T47D cells when they were not not detected in BT-549 cells, consistent with the expression of hormone receptors in these cells.
  • Table 4 shows the expression of the PGR gene quantified from 50 ng of total RNA originating from IHC + tumors, that is to say expressing hormone receptors on the surface of tumor cells, or from IHC-, c 'tumors. i.e. not expressing hormone receptors on their surface (average on 3-7 tumors).
  • the expression of the PGR gene was expressed by the ratio between the number of mRNA copies of the target gene and the number of mRNA copies of the housekeeping gene. Overexpression of the PGR gene was observed in IHC + tumors.
  • the detection limit and the quantification limit were determined for the PGR and PPIB genes amplified in duplex.
  • the limit of quantification was determined to be 100 and 1000 copies of mRNA for PGR and PPIB respectively.
  • the detection limit was 100 copies of mRNA for PGR and PPIB.
  • the specificity of the PGR PPIB duplex was tested by carrying out the amplification of PGR in the presence of “molecular beacon” specific for ESR1. No signal was detected. Likewise, no signal was observed when NASBA was produced from total RNA from the BT-549 cell line, PGR negative.
  • RNA was added to 10 ⁇ l of NASBA buffer (final concentration in 20 ⁇ l of reaction medium: 40 mM Tris HCl pH 8.5, 12 mM MgC12, 70 mM KCl , 5mM dithiotreitol, 15% v / v DMSO, ImM from each dNTP, 2mM from each NTP).
  • NASBA buffer final concentration in 20 ⁇ l of reaction medium: 40 mM Tris HCl pH 8.5, 12 mM MgC12, 70 mM KCl , 5mM dithiotreitol, 15% v / v DMSO, ImM from each dNTP, 2mM from each NTP.
  • a first ESR2 primer of SEQ ID No. 5 5 'TGAGCAGATG TTCCATGCCC T 3' comprising, at its 5 'end, and indicated in lowercase the promoter of polymerase 17 , ie a first primer whose entire sequence is SEQ ID No. 23: 5 'aattctaata cgactcacta tagggagaag gTGAGCAGAT GTTCCATGCC CT 3', P 0.2 ⁇ M of a second ESR2 primer of SEQ ID No. 6 5 'TCCAGTATGT ACCCTCTGGT 3', p 0.2 ⁇ M of a first PPIB primer of SEQ ID No.
  • Pre-incubation was carried out for 2 minutes at 65 ° C before a 2-minute incubation at 41 ° C.
  • a volume of 5 ⁇ l of an enzyme mixture (0.08U of RNAse H, 32U of RNA polymerase 17, 6.4 U of AMV-RT) was added, and a 90-minute incubation was carried out at 41 ° C.
  • RNAs The quantification of the transcribed RNAs was determined in real time (NucliSens EasyQ, bioMérieux), the NASBA reaction producing amplicons with which the specific "molecular beacons" can hybridize simultaneously to give a fluorescent signal.
  • the formation of new RNA molecules is measured in real time by continuous signal monitoring in a fluorescent reader, the NucliSens EasyQ analyzer.
  • the detection limit and the quantification limit were determined for each of the genes.
  • the limit of quantification was observed at 1,000 and 10,000 copies of mRNA for ESR2 and
  • the detection limit was 1000 copies of mRNA for ESR2 and PPIB.
  • ESR2 / PPIB duplex The specificity of the ESR2 / PPIB duplex was tested by carrying out the amplification of ESR2 in the presence of “molecular beacon” specific for HER2, and by carrying out the amplification of
  • RNA total RNA, extracted from the different cellular cells, were added to 10 ⁇ l of NASBA buffer (final concentration in 20 ⁇ l of reaction medium: 40 mM Tris HCl pH 8.5, 12 mM MgC12, 70 mM KCl , 5mM dithiotreitol, 15% v / v DMSO, ImM from each dNTP, 2mM from each NTP).
  • “molecular beacons” comprising P SEQ ID No. 12 5 'GGAGGATGTG CGGCTCGTAC 3', marked with a FAM fluorophore (6-carboxy-fluorescein) at their 5 'end, and d 'a' quencher '(Dabsyl) at its 3' end for the detection of RNA coding HER2 during the HER2 / PPIB duplex, p SEQ ID N ° 29 5 'GATCCAGGGC GGAGACTTCA 3', labeled with a fluorophore ROX (6-carboxy -X-rhodamine) in 5 ', and of a "quencher” (Dabsyl) in 3' (complete sequence: 5 'ROX-cg tcgGATC CAGGGCGGAG ACTTCAcg ⁇ t cg-Dabsyl 3', for the detection of RNA of the PPIB gene coding for the detection of RNA of the PPIB gene
  • Pre-incubation was carried out for 2 minutes at 65 ° C before a 2-minute incubation at 41 ° C.
  • a volume of 5 ⁇ l of an enzyme mixture (0.08U of RNAse H, 32U of RNA polymerase 17, 6.4 U of AMV-RT) was added, and a 90-minute incubation was carried out at 41 ° C.
  • RNAs The quantification of the transcribed RNAs was determined in real time (NucliSens EasyQ, bioMérieux), the NASBA reaction producing amplicons with which the specific "molecular beacons" can hybridize simultaneously to give a fluorescent signal.
  • the formation of new RNA molecules is measured in real time by continuous signal monitoring in a fluorescent reader, the NucliSens EasyQ analyzer.
  • the detection limit and the quantification limit were determined for each of the genes.
  • the limit of quantification was determined at 1,000 and 10,000 copies of mRNA for HER2 and
  • the detection limit was 100 copies of mRNA for HER2 and
  • the specificity of the HER2 / PPIB duplex was tested by carrying out the amplification of ESR2 in the presence of “molecular beacon” specific for HER2, and by carrying out the amplification of HER2 in the presence of “molecular beacon” specific for ESR2. No signal was detected. Results obtained at the messenger RNA level by the NASBA technique for the gene

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes : A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique, C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°1 à SEQ ID N°24 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N° l à SEQ ID N°20. L'invention concerne également des amorces d'amplification et des sondes d'hybridation qui peuvent être mises en œuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic du cancer du sein.

Description

Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein
La présente invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein. L'invention concerne également des amorces d'amplification et des sondes d'hybridation qui peuvent être mises en oeuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic du cancer du sein.
Le cancer du sein est une maladie fréquente : une femme sur onze développe un cancer du sein au cours de sa vie. Cependant, parce qu'il existe différents types de cancers du sein, et différents pronostic du cancer du sein, les femmes qui en sont atteintes ne suivent pas toutes le même traitement : le médecin propose à chaque patiente un traitement adapté à sa situation, afin d'obtenir les meilleures chances de guérison. Ainsi, l'hormonothérapie, qui est un traitement général dans les cancers du sein, est utilisé dans les cancers du sein hormono- dépendants, c'est à dire dans le cas de tumeurs exprimant des récepteurs hormonaux à la surface de leurs cellules. En post-opératoire, rhormonothérapie peut être utilisée seule ou en relais de la chimiothérapie adjuvante. Dans le cadre d'une récidive de la maladie, l'hormonothérapie peut être prescrite soit seule, soit associée ou en relais d'une chimiothérapie. La chimiothérapie, est quant à elle, un traitement général du cancer puisque les médicaments, portés par la circulation sanguine, peuvent agir partout dans l'organisme. La chimiothérapie a une place importante dans l'arsenal thérapeutique, particulièrement depuis une dizaine d'années, avec l'apparition de nouvelles molécules. Les médicaments sont le plus souvent administrés en perfusion par voie veineuse, en voie sous-cutanée, en intra- musculaire. Ainsi, en fonction de l'expression des récepteurs hormonaux à la surface des cellules hormonales, le traitement sera orienté vers une hormonotérapie ou non. On peut citer notamment les récepteurs à l'œstrogène ESR1 et ESR2 et le récepteur à la progestérone (PGR), qui sont les paramètres les plus connus pour prédire la réponse à une hormonothérapie dans le cancer du sein. Ainsi la teneur en ESR1 est utilisé comme indicateur pronostic, et pour prédire la réponse d'un patient à un traitement avec des antioestrogènes, tels que le Tamoxifen® (Osborne C et al, Brest Cancer Res treat 51 227-238, 1998 ; Goldhirsch et al, J Clin Oncol 19 :3817-3827, 2001). La présence du récepteur PGR est également utilisée pour le suivi d'une hormonothérapie, et comme marqueur de pronostic (Horwitz et al, Récent Prog Horm Res 41 : 249-316, 1995). On peut également citer le récepteur HER2, qui serait surexprimé dans environ VA des cancers du sein invasif (Slamon et al, Science, 1987, 235 :177-182) Afin de proposer aux patients un traitement adapté, il est donc essentiel de connaître l'expression de gènes codant des récepteurs hormonaux, tels que ESR1, ESR2, HER2 et
PGR. Cette expression est étudiée le plus souvent sur la tumeur prirnitive et le plus souvent par immunotastochirnie. Dans les cas douteux, l'étude d'une amplification génique par hybridation in situ (FISH) est la méthode de référence, notamment dans le cas de HER2. Depuis quelques années, des tumeurs de petites tailles peuvent être détectées, permettant un diagnostic précoce d'un cancer du sein, mais le pronostic de ce cancer reste alors difficile de part la faible quantité de tissu tumoral qui rend difficile la quantification protéique des récepteurs hormonaux mentionnés précédemment. Les techniques de biologie moléculaire deviennent alors indispensable pour la quantification de récepteurs hormonaux, puisqu'elles nécessitent de plus petites quantités de tissu tumoral (Fuqua et al, Natl Cancer Inst 82 :859-861, 1997 ; Fasco et al, Anal Biochem, 245 : 167-178, 1997 ; Poola et al, Anal Biochem, 258 : 209-215, 1998). La présente invention propose un nouveau procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein. Ce procédé met notamment en oeuvre de nouvelles séquences nucléotidiques qui peuvent être utilisées en tant qu'amorces d'amplification ou de sondes d'hybridation. Le procédé selon l'invention permet notamment de déterminer quel est le traitement le plus adapté à un patient atteint d'un cancer du sein. A ce titre, l'invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes : A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence ssdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l à SEQ ID N°24 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l à SEQ ID N°20.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont ainsi découvert que l'utilisation, dans un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein, d'une séquence nucléotidique comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID N°l à SEQ ID N°20 est très pertinent en tant qu'amorce d'amplification pour amplifier des séquences cibles, tels que le gène codant ESR1,
ESR2, PGR ou HER2. Les inventeurs ont également découvert que l'utilisation d'une séquence nucléotidique comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID N°l à SEQ ID N°20 en tant que sonde d'hybridation est très pertinente pour une hybridation spécifique sur des séquences cibles, tels que les gènes codant ESR1, ESR2, PGR ou HER2.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon susceptible de contenir un matériel nucléique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être prélevé chez un patient et peut être notamment un échantillon de tissus, de sang, de sérum, de salive, de cellules circulantes du patient. Préférentiellement, cet échantillon biologique est prélevé d'une tumeur. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides nucléiques telle que séquence d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ou d'acides ribonucléiques (ARN). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides désoxyribonucléiques. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique est extrait d'un échantillon biologique prélevé chez un patient.
Par séquence nucléotidique (ou séquences d'acides nucléiques ou fragment nucléotidique ou oligonucléotide, ou polynucléotide), on entend un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à une autre séquence d'acides nucléiques, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique el/ou par synthèse chimique. Par motif nucléotidique, on entend un dérivé d'un monomère qui peut être un nucleotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucleotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycyti'dine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates. Ce matériel nucléique comprend au moins une séquence cible. Par séquence cible, on entend une séquence dont l'enchaînement en motifs nucléotidiques est spécifique d'un gène cible, tel que préférentiellement le gène codant ESR1, ESR2, PGR ou HER2. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la séquence cible est comprise dans un gène choisi parmi les gènes codant ESR1, ESR2, PGR ou HER2. Dans la suite de l'exposé, on parlera de séquence cible qu'elle soit en simple brin ou en double brin.
Lors de l'étape A, on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique par tout protocole connu de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des cellules (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet WOOO/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, WO99/53304 sur la lyse électrique, et WO99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809). Cette étape de lyse peut également être suivie d'une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adapté à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de œs particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO97/45202 et WO99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep® Silica, Promega: MagneSil™ Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-Bind™). Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'alcool 100%. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en suspension .
Lors de l'étape B, on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification une séquence nucléique comprenant de 10 à 100 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 15 à 25 motifs nucléotidiques. Cette amorce d'amplification comprend au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID N°l à 20. Au sens de la présente invention, une amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de • une séquence homologue à la SEQ ID N° 1 à SEQ ID N°20, c' est à dire o la séquence complémentaire ou suffisamment complémentaire de la SEQ ID N°l à 20 o une séquence présentant une homologie suffisante pour s'hybrider à la SEQ ID N°l à SEQ ID °20 ou à la séquence complémentaire à la SEQ ID °l à SEQ ID No20, • une séquence comprenant une séquence de SEQ ID N°l à SEQ ID N°20 (ou une séquence homologue à SEQ ID N°l à SEQ ID N°20 telle que définie précédemment) dans laquelle les bases uracile sont substituées aux bases thymine, et qui aurait la même fonction que l'amorce d'amplification selon linvention, c'est à dire amplifier tout ou partie du gène codant ESR1, ESR2, PGR ou HER2, est considérée comme équivalente à l'amorce d'amplification selon l'invention.
Une paire d'amorces d'amplification permet l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amphfication enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies (ou amplicons) d'une séquence nucléique par l'action d'au moins une enzyme. Au sens de la présente invention, on entend par amplicons les copies de la séquence cible obtenues lors d'une réaction d'amplification enzymatique. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment la PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159 ; la LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0 201 184 ; la RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069 ; la 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995 ; la NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818, ou encore la TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491. D'une manière générale, ces réactions d'amplification enzymatique mettent généralement une succession de cycle comprenant les étapes suivantes : o la dénaturation de la séquence cible si celle ci est en double brin afin d'obtenir deux brins cibles, complémentaires, o l'hybridation de chacun des brins cibles, obtenus lors de l'étape de dénaturation précédente avec au moins une amorce d'amplification , o la formation à partir des amorces d'amplification des brins complémentaires aux brins sur lesquels elles sont hybridées en présence d'une enzyme polymérase et de nucléosides triphosphate (ribonucléoside triphosphate et/ou desoxyribonucléoside triphosphate selon les techniques) ce cycle étant répété un nombre de fois déterminé pour obtenir la séquence cible dans une proportion suffisante pour permettre sa détection.
Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux séquences nucléiques telle que notamment une amorce d'amplification et une séquence cible ou une sonde d'hybridation et une séquence cible, se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et
Ihymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison GC). L'hybridation de deux séquences nucléiques peut être totale (on parle alors de séquences complémentaires), c'est à dire que le double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons AT et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le double brin obtenu comprend des liaisons AT et des Maisons C-G permettant de former le double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire.
L'hybridation entre deux séquences complémentaires ou suffisamment complémentaires dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stiingence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux séquences nucléiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre ces deux séquences nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues û les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. D'une façon plus précise, la NASBA est une technologie d'amplification isotherme de l'acide nucléique reposant sur l'action conjointe de trois enzymes (transcriptase inverse
AMV, Rnase-H et polymérase-ARN T7). Associée à des amorces d'amplification spécifiques d'une séquence cible, elle amplifie les cibles ARN plus d'un milliard de fois en 90 minutes. La réaction d'amplification se produit à 41 °C et donne des molécules d'ARN simple brin comme produit final. La NASBA nécessite une paire d'amorce, dont au moins une comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Une telle amorce est préférentiellement choisie parmi les SEQ ID N°21 à 24. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorces, utilisée de l'étape B, est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°l, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°2, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant ESR1, d'une taille de 202 paires de base, qui correspond à la séquence 1427-1629 sur la séquence du gène codant ESR1 de référence (Genbank X03635). α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°3, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°4, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant PGR, d'une taille de 184 paires de base, qui correspond à la séquence 2761-2945 sur la séquence codant PGR de référence (Genbank NM_000926). α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°5, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°6, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène ESR2, d'une taille de 210 paires de base, qui correspond à la séquence 1640-1850 sur la séquence codant ESR2 de référence (Genbank MN_001437) α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°7, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°8, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant HER2, d'une taille de 185 paires de base, qui correspond à la séquence 2567-2752 sur la séquence codant HER2 de référence (Genbank NM_00448). α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°13 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°14 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°13, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°14, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant ESR1, d'une taille de 858 paires de base, qui correspond à la séquence 808-1666 sur la séquence codant ESR1 de référence (Genbank X03635). α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°15 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ TO N°16 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°15, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°16, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant PGR, d'une taille de 658 paires de base, qui correspond à la séquence 2319-2977 sur la séquence codant PGR de référence (Genbank NM_000926). α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°17 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°18 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°17, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°18, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant ESR2, d'une taille de 702 paires de base, qui correspond à la séquence 1246-1948 sur la séquence codant ESR2 de référence (Genbank MN_001437). p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°19 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°20 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°19, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°20, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant HER2, d'une taille de 928 paires de base, qui correspond à la séquence 2123-3051 sur la séquence codant HER2 de référence (Genbank NM_004448). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorces, utilisée de l'étape B, comprend une première amorce comprenant un promoteur permettant l'initiation de h transcription par une polymérase du bactériophage T7, est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : α une première amorce d'amplification de SEQ ID N°21 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ JD N°2; α une première amorce d'amplification de SEQ ID N°22 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ TD N°4 ; α une première amorce d'amplification de SEQ ID N°23 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; α une première amorce d'amplification de SEQ ID N°24 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ JD N°8 ;
Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes de la réaction d'amplification, on peut normaliser l'expression d'un gène cible par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401. Selon un mode particulier de réahsation de l'invention, on utihse, en outre, lors de l'étape B, au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage. Par gène de ménage, on entend un gène dont l'expression est stable dans un tissu donné, et quelque soit la situation physiologique. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le gène de ménage est le gène PPIB qui code la cyclophyline B. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite amorce d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage comprend au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID N°25 à 29.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°27 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°28; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°27, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°28, on obtient un amplicon, spécifique du gène PPIB, d'une taille de 239 paires de base, qui correspond à la séquence 231-470 sur la séquence PPIB de référence (Genbank M60857) α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°25 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°26; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°25, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°26, on obtient un amplicon, spécifique du gène PPIB, d'une taille de 639 paires de base, qui correspond à la séquence 11-650 sur la séquence PPIB de référence (Genbank M60857) Selon un mode particuher de réahsation de l'invention, ladite paire d'amorces d'amplification utilisée pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage comprend une première amorce comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Ladite première amorce d'amplification est préférentiellement de SEQ ID N°30 et ladite deuxième amorce d'amplification comprend préférentiellement au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N028.
Lors de l'étape C on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons. Cette étape de détection, peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier concernant la détection d'acides nucléiques. Au sens de la présente invention, on entend par sonde d'hybridation, une séquence nucléique de 10 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 15 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléique cible. La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. On parle alors de sondes de détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple ricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453- 458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut délecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou lurninescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 125I. Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. Grâce à la présence de ce marqueur, on peut détecter la présence d'une réaction d'ixybridation entre une sonde de détection donnée et la séquence cible spécifique d'une espèce donnée.
La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection « molecular beacons » telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14 :303-308).
Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige- oucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient. La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. On détecte alors la éaction d'hybridation entre une sonde de capture donnée et une séquence cible.
Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut utiliser des séquences cibles marquées, directement (notamment par l'incorporation d'un marqueur au sein de la séquence cible) ou indirectement (notamment par l'utilisation d'une sonde de détection telle que définie précédemment) la séquence cible. On peut notamment réaliser avant l'étape d'hybridation une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué lors de la réaction d'amplification enzymatique. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. La séquence cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde de détection selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO 91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR2780059. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dex rane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO 94/12670, d'une particule.
Selon un mode préféré de réahsation de l'invention, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher. Selon un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, la sonde d'hybridation comprend un flurophore FAM (6-carboxy- fluorescein) ou ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en son extrémité 5' et un quencher (Dabsyl) en son extrémité 3'. Dans la suite de l'exposé, une telle sonde d'hybridation est appelée « molecular beacon ». Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les étapes B et C sont effectuées en même temps. Ce mode préféré peut être mise en oeuvre par «NASBA en temps réel » qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification NASBA et la détection en temps réel qui fait appel à des "molecular beacons". La réaction NASBA intervient dans le tube, produisant de l'ARN simple brin avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent. Contrairement à une amplification par RT-PCR, T amplification en NASBA peut se faire en présence d'ADN dans l'échantillon. H n'est donc pas nécessaire de vérifier que l'ADN a bien été complètement éliminé lors de l'extraction des ARN. Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant ESR1 (séquence de référence NCBI accession number : X03635), on utilise préférentiellement lors de l'étape b) α une première amorce de SEQ ID N°l ou 21 α une deuxième amorce de SEQ ID N°2 et lors de l'étape c) α une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°9. Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant PGR (séquence de référence NCBI accession number : NM_000926), on utilise préférentiellement lors de l'étape b) p une première amorce de SEQ ID N°3 ou 22 P une deuxième amorce de SEQ ID N°4 et lors de l'étape c) p une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°10 Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant ESR2 (séquence de référence NCBI accession number : MN_001437), on utihse préférentiellement lors de l'étape b) p une première amorce de SEQ ID N°5 ou 23 p une deuxième amorce de SEQ ID N°6 et lors de l'étape c) p une sonde de détection comprenant la SEQ ID N° 11 Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant HER2 (séquence de référence NCBI accession number : NM_00448), on utilise préférentiellement lors de l'étape b) P une première amorce de SEQ ID N°7 ou 24 p une deuxième amorce de SEQ ID N°8 et lors de l'étape c) p une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°12 Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène de ménage PPIB (séquence de référence NCBI accession number : M60857), on utilise préférentiellement lors de l'étape b) P une première amorce de SEQ ID N°27 ou 30 p une deuxième amorce de SEQ ID N°28 et lors de l'étape c) p une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°29
Lorsqu'on utilise, lors de l'étape B, une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage, lesdits amplicons spécifiques d'un gène de ménage peuvent être détectés comparablement à ce qui est décrit précédemment, par notamment l'utilisation d'une sonde de détection. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le gène de ménage est le gène PPIB qui code la cyclophyline B et la sonde de détection comprend au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°27 à 29. Préférentiellement, cette sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.
L'invention concerne également une amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15, et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ JD N° 1 à SEQ ID N°20.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'amorce d'amplification comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Cette amorce peut être notamment l'une quelconque des SEQ ID N° 21 à 24, et est préférentiellement utilisée dans une réaction d'amplification NASBA. L'invention concerne également une paire d'amorce choisi parmi les paires d'amorces suivantes : p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°l, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°2, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant ESR1, d'une taille de 202 paires de base, qui correspond à la séquence 1427-1629 sur la séquence codant ESR1 de référence (Genbank X03635). P une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°3, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°4, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant PGR, d'une taille de 184 paires de base, qui correspond à la séquence 2761-2945 sur la séquence codant PGR de référence (Genbank NM_000926). P une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°5, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°6, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant ESR2, d'une taille de 210 paires de base, qui correspond à la séquence 1640-1850 sur la séquence codant ESR2 de référence (Genbank MN_001437) P une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°7, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°8, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant HER2, d'une taille de 185 paires de base, qui correspond à la séquence 2567-2752 sur la séquence codant HER2 de référence (Genbank MN_004448). p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°13 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°14 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°13, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°14, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant ESR1, d'une taille de 858 paires de base, qui correspond à la séquence 808-1666 sur la séquence codant ESR1 de référence (Genbank X03635). p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°15 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°16 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°15, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°16, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant PGR, d'une taille de 658 paires de base, qui correspond à la séquence 2319-2977 sur la séquence codant PGR de référence (Genbank NM_000926). p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°17 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°18 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°17, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°18, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant ESR2, d'une taille de 702 paires de base, qui correspond à la séquence 1246-1948 sur la séquence codant ESR2 de référence (Genbank MN_001437) p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°19 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°20 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°19, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°20, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant HER2, d'une taille de 928 paires de base, qui correspond à la séquence 2123-3051 sur la séquence codant HER2 de référence (Genbank MN_004448). Selon un mode préféré de réahsation de l'invention, ladite première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Cette amorce peut être notamment l'une quelconque des SEQ ID 21 à
24. Lorsque première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7, cette première amorce est préférentiellement comprise dans une paire d'amorces choisie parmi les paires d'amorce suivantes : P une première amorce d'amplification de SEQ ID N°21 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2; P une première amorce d'amplification de SEQ ID N°22 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; p une première amorce d'amplification de SEQ ID N°23 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N06 ; P une première amorce d'amplification de SEQ ID N°24 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ TD N°8 ;
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce d'amplification tehe que définie précédemment et ou d'au moins une paire d'amorce telle que définie précédemment lors d'une réaction d'amplification NASBA.
L'invention concerne également une amorce d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage. Cette amorce d'amplification comprend préférentiellement au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID N°25 à 29.
L'invention concerne également une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage, choisie parmi les paires suivantes : P une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°27 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiehement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°28; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°27, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°28, on obtient un amplicon, spécifique du gène PPIB, d'une taille de 239 paires de base, qui correspond à la séquence 231-470 sur la séquence PPIB de référence (Genbank M60857) p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiehement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°25 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°26; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°25, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°26, on obtient un amplicon, spécifique du gène PPIB, d'une taille de 639 paires de base, qui correspond à la séquence 11-650 sur la séquence PPIB de référence (Genbank M60857).
Selon un mode particuher de réahsation de l'invention, ladite paire d'amorces d'amplification utilisée pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage comprend une première amorce comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Ladite première amorce d'amplification est préférentiellement de SEQ ID N°30 et ladite deuxième amorce d'amphfication comprend préférentiehement au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique
SEQ ID N°28.
L'invention concerne également une sonde de détection comprenant au moins 10, préférentiehement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l à SEQ ID N°20.
Préférentiellement, cette sonde de détection comprend un flurophore et un quencher. L'invention concerne également une sonde d'hybridation pour détecter des amplicons spécifiques d'un gène de ménage. Préférentiehement, cette sonde de détection comprend au moins 10, préférentiehement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°27 à 29. Préférentiellement, celte sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce telle que définie précédemment et ou d'au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment et/ou d'au moins une sonde de détection telle que définie précédemment pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein. L'invention concerne enfin un kit pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein comprenant au moins une amorce telle que définie précédemment et/ou d'au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment et/ou d'au moins une sonde de détection telle que définie précédemment.
Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant ESR1, le kit comprend préférentiehement p une première amorce de SEQ ID N°l ou 21 p une deuxième amorce de SEQ ID N°2 p une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°9. Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant PGR, le kit comprend préférentiellement p une première amorce de SEQ ID N°3 ou 22 p une deuxième amorce de SEQ ID N°4 p une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°10 Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant ESR2 (séquence de référence NCBI accession number : MN_0O1437), le kit comprend préférentiehement p une première amorce de SEQ ID N°5 ou 23 p une deuxième amorce de SEQ ID N°6 p une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°l 1 Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant HER2 (séquence de référence NCBI accession number : NM_0O448), le kit comprend préférentiellement p une première amorce de SEQ ID N°7 ou 24 p une deuxième amorce de SEQ ID N°8 p une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°12
Tel que présenté dans l'exemple ci après, et selon un mode particuher de réalisation de l'invention, le kit comprend en outre p une première amorce de SEQ ID N°27 ou 30 p une deuxième amorce de SEQ ID N°28 P une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°29 La figure suivante est donnée à titre ihustrative et n'a aucun caractère limitatif.
Elle permettra de mieux comprendre l'invention.
La figure 1 représente les courbes standards obtenues pour les gènes ESRl (fig la), PGR (fig lb), ESR2 (fig le), HER2 (fig ld), et PPIB (fig le) telles que décrites dans l'exemple l-3a. Chaque courbe standard, obtenue pour chaque gène à partir d'une séquence de référence qui est spécifique du gène, transcrits en ARN in vitro dans un plasmide, représente le temps d'apparition de la phase exponentielle de l'amplification (on parle également de TTP : time to positivity, temps seuil) en fonction du nombre de copies d'ARN présentes au début de l'amplification par NASBA (plus la quantité de départ de copies d'ARN est importante au début de l'amplification, plus le temps d'apparition de la phase exponentielle est court).
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ds permettront de mieux comprendre l'invention.
Exemple 1 - Amplification et détection en temps réel des ARNm codant ESRl, PGR, ESR2 et HER2
1/ Obtention et préparation des échantillons
Cet exemple a été réalisé à partir de trois lignées de cellules tumorales, dont l'expression en récepteurs hormonaux a préalablement été déterminée par IHC ou radioligand (ou LBA), ont été utilisées : MCF-7 (exprimant les récepteurs ESRl et
PGR), T47D (n'exprimant pas le récepteur ESRl et exprimant le récepteur PGR) et BT- 549 (n'exprimant ni le récepteur ESRl, ni le récepteur PGR). Ces lignées proviennent de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Ces lignées cehulaires ont été mises en culture dans un milieu DMEM (MCF-7) ou RPMI 1640
(T47D et BT-549), supplémenté en sérum fœtal de bœuf (10%), L glutamine (2mM), acides aminés non essentiels (1%) et streptomycine (10 μg/ml) à 37°C sous atmosphère comprenant 5% de CO2.
Cet exemple a également été réalisé à partir de tumeurs de patientes (n=102) atteintes d'un cancer du sein dont l'expression en récepteurs hormonaux ER et PR (appelé également ESRl et PGR) était préalablement déterminée par radioligand (LBA) selon une technique classique connue de l'homme du métier. La technique LBA nous renseignait sur la présence de récepteurs ER et PR fonctionnels dans le cytosol des cellules. L'expression en HER2 était préalablement déterminé par PCR quantitative (nous renseignant sur l'amplification du gène HER2) et ELISA (nous renseignant sur l'expression de la protéine membranaire codée par le gène HER2) selon une technique classique connue de l'homme du métier.).
2/ Extraction des ARN totaux
Les ARN totaux ont été extraits de lignées cehulaires, par l'utilisation de Trizol® Reagent selon les recommandations des fournisseur du kit (Invitrogen, Canada). La qualité et la quantité en ARN ont été déterminées à 260 et 280 nm et contrôlées sur gel agarose. Les ARN ont ensuite été congelés à -70°C jusqu'à utilisation. Des ARN totaux ont également été extraits d'une façon comparable de tumeurs de patientes atteintes d'un cancer du sein. 3) Amplification par NASBA
La réaction d'amphfication par NASBA est basée sur l'activité simultanée d'une reverse transcriptase du virus aviaire myéloblaste (AMV-RT), d'une RNAse H d'E. coli et d'une ARN polymérase du bactériophage T7 (Compton J, 1991, Nature, 350 : 91-92). La détection en temps réel des amplicons est réalisée par l'utilisation d'un lecteur Nuclisens EasyQ® (bioMérieux BV, The Netherland) et sondes de détection « molecular beacons », telles que définies précédemment. La quantification en NASBA est basée sur rutilisation d'une courbe standard, obtenue à partir d'une séquence de référence, spécifique du gène cible, transcrits en ARN in vitro dans un plasmide. Cette courbe standard représente le temps d'apparition de la phase exponentielle de l'amplification en fonction du nombre de copies d'ARN présentes au début de l'amplification par NASBA (plus la quantité de départ de copies d'ARN est importante au début de l'amplification, plus le temps d'apparition de la phase exponentiehe est court).
a) Amplification des gènes ESRl, PGR, ESR2, HER2 et du gène de ménage PPIB - Obtention d'une courbe standard Courbe standard du gène cible codant ESRl
Pour le gène cible codant ESRl (séquence de référence NCBI accession number : X03635), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N°13 5' TACAGGCCAA ATTCAGATAA TCGAC 3' et une deuxième amorce de SEQ JD N°14 5' GGAACCGAGAT GATGTAGCCA 3', localisées respectivement en position 808-832 et 1646-1666 de la séquence de référence, afin de générer en PCR (un 1er cycle de dénaturation (95°C; 1 min); puis 35 cycles comprenant les étapes suivantes : dénaturation: 94°C; 1 min ; hybridation: 60°C; 1 min ; élongation: 72°C; 2 min) et un dernier cycle comprenant une étape de dénaturation: 72°C; 7 min) un amplicon de 858 paires de bases, spécifique du gène codant ESRl (on parlera d' « amplicon ESRl »). Les amplicons ESRl obtenus tels que décrit ci dessus, ont ensuite été clones en plasmide pGEM-T (Promega, Madison, USA).
La séquence de ces amplicons ESRl a été vérifiée par séquençage (Biofidal, Vaulx en Vehn, France), afin de s'assurer qu'il correspondait bien à la séquence du gène cible que l'on souhaitait amplifier. Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène ESRl.
Les amplicons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymérase (T7 ou SP6 (Megascript® t, Aπibion, Austin, USA), selon l'orientation de F amplicon). Après éhmination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).
Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock : 0,2.10π copies/μl, dilution en cascade 0,2.10u copies/μl à 0,2.102 copies/μl). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic®
(bioMérieux BV, The Netherlands) en présence des amorces spécifiques ESRl SEQ ID
N° 1 et ESRl N°2 et du « molecular beacons » SEQ ID N°9 : p 0,2μM d'une première amorce ESRl de SEQ ID N°l 5' CTCCACCATG CCCTCTACAC A 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est la SEQ ID N°21 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCTCCACCAT GCCCTCTACA CA 3', p 0,2 μM d'une deuxième amorce ESRl de SEQ ID N°2 5' ACATGATCAA CTGGGCGAAG A 3'). p 0,lμM de «molecular beacons» comprenant la SEQ ID N°9 5' GATCCTGATGATTGGTCTCG 3', marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) en 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' FAM-cgatcgGATC CTGATGATTG GTCTCGcgat cg-Dabsyl 3'. Au cours de l'amplification le signal s'intensifie proportionnellement à la quantité d' amplicons produits. La courbe de fluorescence en fonction du temps permet de définir le temps ou la phase exponentielle de I amplification démarrera (encore appelé TTP : tirne to positivity, temps seuil). La courbe standard ESRl rehe le nombre de transcrit présent au départ dans la solution en fonction du TTP détecté lors de l'amplification NASBA. A l'aide d'une courbe standard, on calcule de manière absolue le nombre de copies du gène cible. Enfin cette valeur est normalisée grâce à un gène de ménage, en l'occurrence le gène PPIB. Cette courbe standard ESRl, représentée figure la. Courbe standard du gène cible codant PGR
La courbe du gène cible codant PGR a été réalisée selon le même principe que pour ESRl, à l'exception des amorces d'amplification utihsées et des «molecular beacons », qui étaient spécifiques de PGR.
Ainsi, pour le gène cible codant PGR (séquence de référence NCBI accession number :
NM_000926), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N°15 5'
TGACAAGTCT TAATCAACTA GG 3' et une deuxième de SEQ ID N°16 5' TCACTTTTTAT GAAAGAGAAG GG 3', localisées respectivement en position 2319-
2340 et 2955-2977 de la séquence de référence. La séquence de ces amplicons PGR a été vérifiée par séquençage (Biofidal, Vaulx en Velin, France), afin de s'assurer qu'il correspondait bien à la séquence du gène cible que l'on souhaitait amplifier. Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène PGR.
Les amplicons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymérase (17 ou SP6 (Megascript® Ht, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de F amplicon). Après élimination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy® Mini Kit (Qiagcn, Hilden, Germany) et quantifiés
(RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).
Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock :
0,2.10π copies/μl, dilution en cascade 0,2.10n copies/μl à 0,2.102 copies/μl). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic®
(bioMérieux BV, The Netherlands) en présence p 0,lμM d'une première amorce PGR de SEQ ID N°3 5' TCCCTGCCAA TATCTTGGGT A 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°22 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gTCCCTGCCA ATATCTTGGG TA 3', p 0,1 μM d'une deuxième amorce PGR de SEQ ID N°4 5' AGTTGTGTCG AGCTCACAGC 3', p 0,1 μM de « molecular beacons » utilisées comprenant la SEQ ID N°10 5' CGGGCACTGAGTGTTGAATT 3', marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) à leur extrémité 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) à son extrémité 3' (séquence complète : 5' FAM-cgatcgCGGG CACTGAGTGT TGAATTcgat cg-Dabsyl 3').
La courbe standard PGR est représentée figure 1B. Courbe standard du gène cible codant ESR2
La courbe du gène cible codant ESR2 a été réalisée selon le même principe que pour
ESRl, à l'exception des amorces d'amplification utilisées et des « molecular beacons », qui étaient spécifiques de ESR2.
Ainsi, pour le gène cible codant ESR2 (séquence de référence NCBI accession number : MN_001437), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N°17 5'
GCCGCCCCAT GTGCTGAT 3' et une deuxième amorce de SEQ ID N°18 5'
GGACCCCGTGA TGGAGGACTT 3', localisées respectivement en position 1246- 1263 et 1928-1948 de la séquence de référence. La séquence de ces amphcons ESR2 a été vérifiée par séquençage (Biofidal, Vaulx en Velin, France), afin de s'assurer qu'il correspondait bien à la séquence du gène cible que l'on souhaitait amplifier. Les amphcons obtenus étaient bien spécifiques du gène ESR2. Les amphcons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utihsation d'une ARN polymérase (17 ou SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de
F amplicon). Après éhmination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés
(RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany). Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock :
0,2.10π copies/μl, dilution en cascade 0,2.10H copies/μl à 0,2.102 copies/μl). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic®
(bioMérieux BV, The Netherlands) en présence de : p 0,2μM d'une première amorce ESR2 de SEQ ID N°5 5' TGAGCAGATG TTCCATGCCC T 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est la SEQ ID N°23 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gTGAGCAGAT GTTCCATGCC CT 3', p 0,2 μM d'une deuxième amorce ESR2 de SEQ ID N°6 5' TCCAGTATGT ACCCTCTGGT 3', p 0,1 μM de « molecular beacons » comprenant la SEQ ID N°ll 5' GATGCTTTGGTTTGGGTGAT 3', marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3'.
La courbe standard ESR2 est représentée figure 1C. Courbe standard du gène cible codant HER2
La courbe du gène cible codant HER2 a été réalisée selon le même principe que pour
ESRl, à l'exception des amorces d'amplification et des « molecular beacons », qui étaient spécifiques de HER2.
Ainsi, pour le gène cible codant HER2 (séquence de référence NCBI accession number : NM_00448), fl a été utihsée une première amorce de SEQ ID N°19 5' TGGTTGGCAT
TCTGCTGGTC GTGGT 3 'et une deuxième amorce de SEQ ID N°20 5'
TGGCCGACAT TCAGAGTCAA TCATC 3', localisées respectivement en position 2123-2147 et 3027-3051 de la séquence de référence. La séquence de ces amplicons
HER2 a été vérifiée par séquençage (Biofidal, Vaulx en Velin, France), afin de s'assurer qu'il correspondait bien à la séquence du gène cible que l'on souhaitait amplifier. Les amphcons obtenus étaient bien spécifiques du gène HER2. La séquence de ces amphcons FIER2 a été vérifiée par séquençage (Biofidal, Vaulx en
Velin, France), afin de s'assurer qu'il correspondait bien à la séquence du gène cible que l'on souhaitait amplifier. Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène
HER2.
Les amplicons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymérase (17 ou SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA)), selon l'orientation de F amplicon). Après élimination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés
(RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).
Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock : 0,2.1011 copies/μl, dilution en cascade 0,2.1011 copies/μl à 0,2.102 copies/μl). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic®
(bioMérieux BV, The Netherlands) en présence de : p 0,2μM d'une première amorce HER2 de SEQ ID N°7 5' GAGCCAGCCC GAAGTCTGTA 3', comprenant, en son extrémité 5',et indiqué en minuscule le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°24 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag g GAGCCAGC CCGAAGTCTG TA 3', p 0,2 μM d'une deuxième amorce HER2 de SEQ ID N°8 5' TCTTAGACCA TGTCCGGGAA A 3', p 0,1 μM de « molecular beacons » utihsées comprenait la SEQ ID N°12 5' GGAGGATGTG CGGCTCGTAC 3', marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) à leur extrémité 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) à son extrémité 3'.
La courbe standard HER2 est représentée figure ID. Courbe standard du gène cible PPIB La courbe du gène cible PPIB a été réalisée selon le même principe que pour ESRl, à l'exception des amorces d'amplification et des « molecular beacons », qui étaient spécifiques de PPIB.
Ainsi, pour le gène de ménage PPIB (séquence de référence NCBI accession number : M60857), il a été utihsée une première amorce de SEQ ID N°25 5' ACATGAAGGT
GCTCCTTGCC 3' et une deuxième amorce de SEQ ID N°26 5' GTCCCTGTGC
CCTACTCCTT 3', localisées respectivement en position 11-30 et 631-650 de la séquence de référence. La séquence de ces amplicons PPIB a été vérifiée par séquençage (Biofidal, Vaulx en Velin, France), afin de s'assurer qu'il correspondait bien à la séquence du gène cible que l'on souhaitait amplifier. Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène PPIB.
Les amphcons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utihsation d'une ARN polymérase (T7 ou SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de
F amplicon). Après éhmination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés
(RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).
Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock :
0,2.10u copies/μl, dilution en cascade 0,2.10n copies/μl à 0,2.102 copies/μl). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands) en présence de : p 0,2 μM d'une première amorce PPIB de SEQ ID N°27 5' CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°30 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3', p 0,2 μM d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N°28 5' AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3' p 0,1 μM de « molecular beacons » comprenant la SEQ ID N°29 5' GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6- carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX- cgatcgG ATC CAGGGCGGAG ACTTCAcgαt c^-Dabsyl 3'.
La courbe standard PPIB est représentée figure 1E. b) réaction d'amplification par NASBA : bl) Amplification en duplex des gènes ESRl et PPIB Cette réaction d'amplification a été réalisée a l'aide d'un kit Nuclisens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands). Pour cela, 5 ng d'ARN totaux, extraits des différentes lignées cellulaires, ont été ajouté à 10 μl de tampon NASBA (concentration finale dans 20 μl de milieu réactionnel : 40 mM de Tris HCl pH 8,5, 12mM MgC12, 70mM KC1, 5mM dithiotreitol, 15% v/v DMSO, ImM de chaque dNTP, 2mM de chaque NTP). Dans ce milieu a été ajouté, 0,lμM de « molecular beacons » comprenant p la SEQ ID N°9 5' GATCCTGATGATTGGTCTCG 3', marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' FAM-cgαtcgGATC CTGATGATTG GTCTCGcg t cg-Dabsyl 3', pour la détection des ARN du gène ESRl P la SEQ ID N°29 5' GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cgαtcgGATC CAGGGCGGAG ACTTCAcsαt c^-Dabsyl 3', pour la détection des ARN du gène PPIB, Dans ce milieu a également été ajouté : p 0,2μM d'une première amorce ESRl de SEQ ID N°l 5' CTCCACCATG CCCTCTACAC A 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est la SEQ ID N°21 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCTCCACCAT GCCCTCTACA CA 3', p 0,2 μM d'une deuxième amorce ESRl de SEQ ID N°2 5' ACATGATCAA CTGGGCGAAG A 3', p 0,2 μM d'une première amorce PPIB de SEQ ID N°27 5' CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase 17, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°30 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3', P 0,2 μM d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N°28 5' AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3'. Une préincubation a été réalisée durant 2 minutes à 65°C avant une incubation de 2 minutes à 41°C. Un volume de 5 μl d'un mélange d'enzyme (0,08U de RNAse H, 32U d'ARN polymérase T7, 6,4 U d'AMV-RT) a été ajoutée, et une incubation de 90 minutes a été réalisée à 41 °C. La quantification des ARN transcrits a été déterminée en temps réel (NucliSens EasyQ, bioMérieux), la réaction NASBA produisant des amplicons avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouveUes molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent, l'analyseur NucliSens EasyQ. L'analyse et la communication automatisée des données sont assurées par le logiciel Nuclisens TTP (bioMérieux B V, The Netherlands). La courbe standard, telle que définie précédemment (dilution ARN transcrits : 108 à 102 copies) a été utilisée pour la quantification de l'expression de chacun du gène cible ESRl et du gène œ ménage PPIB, afin d'extrapoler le nombre de copies d'ARNm par échantillon. La quantification de l'expression d'un gène cible a été exprimé par nombre de copies d'ARNm/ 5ng d'ARN totaux. Le tableau 1 présente l'expression du gène ESRl quantifiée à partir de 5 ng d'ARN totaux provenant des lignées cellulaires MCF-7, T47D et BT-549.
calculable) L'expression du gène ESRl a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Ainsi, des ARNm de ESRl étaient exprimés dans les cellules MCF-7 alors qu'ils n'étaient pas détectées dans les cellules BT-549, en accord avec l'expression en récepteurs hormonaux de ces cellules. A noter que des ARNm de ESRl étaient exprimés dans les cellules T47D, alors que seul le récepteur PGR était exprimé, suggérant une régulation post transcriptionnehe du gène ESRl.
Le tableau 2 présente l'expression du gène ESRl quantifiée à partir de 50 ng d'ARN totaux provenant de tumeurs IHC +, c'est à dire exprimant des récepteurs hormonaux nucléaires des cellules tumorales, ou de tumeurs IHC-, c'est à dire n'exprimant pas de récepteurs hormonaux nucléaires (moyenne sur 3-7 tumeurs).
Tableau 2 - Expression du gène ESRl dans les tumeurs IHC + et IHC -
L'expression du gène ESRl a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Une surexpression du gène ESRl était observée dans les tumeurs IHC +. A partir des courbes standards ESRl et PPIB réahsées précédemment, la limite de détection et la limite de quantification ont été déterminées pour les gènes ESRl et PPIB amplifiés en duplex. La limite de quantification était observée à 100 copies d'ARNm pour ESRl et PPIB. La limite de détection était de 100 copies d'ARNm pour ESRl et PPIB. La spécificité du duplex ESRl PPIB a été testée en réalisant l'amplification de ESRl en présence de «molecular beacon» spécifique de PGR, et en réalisant F amplification de PGR en présence de « molecular beacon» spécifique de ESRl. Aucun signal n'était détecté. De même, aucun signal n'était observé lorsque la NASBA était réalisé à partir d'ARN totaux issus de la hgnée cellulaire BT-549, ESRl et PGR négative.
Tous ces résultats ont été confirmés par l'utilisation d'une autre technique d'amplification (RT-PCR quantitative). De plus, les résultats obtenus au niveau ARN messager par la technique NASBA pour le gène ESRl était corrélés à ceux obtenus au niveau protéique par LBA (Ligand Binding Assay) (ESR : r = 0,77, p<0,0001 ; test statistique de corrélation Spearman). Ces résultats démontrent que l'expression des ARNm de ESRl est corrélé à la présence du écepteur fonctionnel dans le cytosol, confirmant l'intérêt d'étudier au niveau ARNm l'expression de ce gène.
Ces résultats démontrent que le duplex ESRl/PPIB en NASBA permet une quantification de l'expression du gène ESRl à partir d'une très faible quantité d'ARN totaux, et, d'une façon plus large, à partir d'une très faible quantité de cellules tumorales, et est parfaitement adapté pour étudier le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein, et la réponse d'un patient à un ttaitement donné. b2) Amplification en duplex des gènes PGR et PPIB Cette réaction d'amplification a été réalisée a l'aide d'un kit Nuchsens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands). Pour cela, 5 ng d'ARN totaux, extraits des différentes lignées cellulaires, ont été ajouté à 10 μl de tampon NASBA (concentration finale dans 20 μl de milieu réactionnel : 40 mM de Tris HCl pH 8,5, 12mM MgC12, 70mM KC1, 5mM dithiotreitol, 15% v/v DMSO, ImM de chaque dNTP, 2mM de chaque NTP).
Dans ce milieu a été ajouté, 0,lμM de « molecular beacons » comprenant p la SEQ ID N°10 5' CGGGCACTGAGTGTTGAATT 3', marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) à leur extrémité 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) à son extrémité 3' (séquence complète : 5' FAM- cgatcgCGGG CACTGAGTG T TGAATTcg at cg-Dabsyl 3') pour la détection des ARN codant PGR lors du duplex PGR / cyclophyhne B, p la SEQ JD N°29 5' GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhoclamine) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAG ACTTCAcgαt c^-Dabsyl 3' , pour la détection des ARN du gène PPIB,
Dans ce milieu a également été ajouté : p 0,lμM d'une première amorce PGR de SEQ ID N°3 5' TCCCTGCCAA TATCTTGGGT A 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase 17, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°22 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gTCCCTGCCA ATATCTTGGG TA 3', P 0,1 μM d'une deuxième amorce PGR de SEQ ID N°4 5' AGTTGTGTCG AGCTCACAGC 3', p 0,2 μM d'une première amorce PPIB de SEQ ID N°27 5' CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°30 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3', p 0,2 μM d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N°28 5' AGGAGAGAAA GGATTTGGCT3'. Une préincubation a été réalisée durant 2 minutes à 65 °C avant une incubation de 2 minutes à 41 °C. Un volume de 5 μl d'un mélange d'enzyme (0,08U de RNAse H, 32U d'ARN polymérase T7, 6,4 U d'AMV-RT) a été ajoutée, et une incubation de 90 minutes a été réalisée à 41°C. La quantification des ARN transcrits a été déterminée en temps réel selon un principe comparable à ce qui a été décrit pour ESRl. La courbe standard, telle que définie précédemment (dilution ARN transcrits : 108 à 102 copies) a été utilisée pour la quantification de l'expression du gène cible PGR et du gène de ménage PPIB, afin d'extrapoler le nombre de copies d'ARNm par échantillon. La quantification de l'expression d'un gène cible a été exprimé par nombre de copies d'ARNm/ 5ng d'ARN totaux. Le tableau 3 présente l'expression du gène PGR quantifiée à partir de 5 ng d'ARN totaux provenant des lignées cehulaires MCF-7, T47D et BT-549.
L'expression du gène PGR a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Ainsi, des ARNm de PGR étaient exprimés dans les cellules MCF-7 et T47D alors qu'ils n'étaient pas détectées dans les cellules BT-549, en accord avec l'expression en récepteurs hormonaux de ces cellules.
Le tableau 4 présente l'expression du gène PGR quantifiée à partir de 50 ng d'ARN totaux provenant de tumeurs IHC +, c'est à dire exprimant des récepteurs hormonaux à la surface des cellules tumorales, ou de tumeurs IHC-, c'est à dire n'exprimant pas de récepteurs hormonaux à leur surface (moyenne sur 3-7 tumeurs).
L'expression du gène PGR a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Une surexpression du gène PGR était observée dans les tumeurs IHC +.
A partir des courbes standards PGR et PPIB réalisées précédemment, la limite de détection et la limite, de quantification ont été déterminées pour les gènes PGR et PPIB amplifiés en duplex. La limite de quantification a été déterminée à 100 et 1000 copies d'ARNm pour PGR et PPIB respectivement. La limite de détection était de 100 copies d'ARNm pour PGR et PPIB. La spécificité du duplex PGR PPIB a été testée en réalisant l'amplification de PGR en présence de «molecular beacon» spécifique de ESRl. Aucun signal n'était détecté. De même, aucun signal n'était observé lorsque la NASBA était réalisé à partir d'ARN totaux issus de la lignée cellulaire BT-549, PGR négative.
Tous ces résultats ont été confirmés par l'utilisation d'une autre technique d'amplification (RT-PCR quantitative). De plus, les résultats obtenus au niveau ARN messager par la technique NASBA pour le gène PGR était corrélés à ceux obtenus au niveau protéique par LBA (Ligand Binding Assay) (PGR : r=0,87, p<0,0001, n=102; test statistique de con-élation Spearman). Ces résultats démontrent que l'expression des ARNm de PGR est corrélé à la présence du récepteur fonctionnel dans le cytosol, confirmant l'intérêt d'étudier au niveau ARNm l'expression de ce gène.
Ces résultats démontrent que le duplex PGR/PPIB en NASBA permet une quantification de l'expression du gène PGR à partir d'une très faible quantité d'ARN totaux, et, d'une façon plus large, à partir d'une très faible quantité de cellules tumorales, et est parfaitement adapté pour étudier le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein, et la réponse d'un patient à un traitement donné. b3) Amplification en duplex des gènes ESR2 et PPIB
Cette réaction d'amplification a été réalisée a l'aide d'un kit Nuchsens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands). Pour cela, 5 ng d'ARN totaux, extraits des différentes lignées cellulaires, ont été ajouté à 10 μl de tampon NASBA (concentration finale dans 20 μl de milieu réactionnel : 40 mM de Tris HCl pH 8,5, 12mM MgC12, 70mM KCl, 5mM dithiotreitol, 15% v/v DMSO, ImM de chaque dNTP, 2mM de chaque NTP). Dans ce milieu a été ajouté, 0,1 μM de « molecular beacons » comprenant p la SEQ ID N°ll 5' GATGCTTTGGTTTGGGTGAT 3, marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3', p la SEQ ID N°29 5' GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cgβtc,gGATC CAGGGCGGAG ACTICAcgat cg-Dabsyl 3', pour la détection des ARN du gène PPIB codant la cyclophyline B,
Dans ce milieu a également été ajouté : p 0,2μM d'une première amorce ESR2 de SEQ ID N°5 5' TGAGCAGATG TTCCATGCCC T 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule le promoteur de la polymérase 17, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est la SEQ ID N°23 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gTGAGCAGAT GTTCCATGCC CT 3', P 0,2 μM d'une deuxième amorce ESR2 de SEQ ID N°6 5' TCCAGTATGT ACCCTCTGGT 3', p 0,2 μM d'une première amorce PPIB de SEQ ID N°27 5' CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule le promoteur de la polymérase 17, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°30 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3', 0,2 μM d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N°28 5' AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3'.
Une préincubation a été réalisée durant 2 minutes à 65 °C avant une incubation de 2 minutes à 41°C. Un volume de 5 μl d'un mélange d'enzyme (0,08U de RNAse H, 32U d'ARN polymérase 17, 6,4 U d'AMV-RT) a été ajoutée, et une incubation de 90 minutes a été réalisée à 41°C.
La quantification des ARN transcrits a été déterminée en temps réel (NucliSens EasyQ, bioMérieux), la réaction NASBA produisant des amplicons avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent, l'analyseur NucliSens EasyQ.
L'analyse et la communication automatisée des données sont assurées par le logiciel
Nuchsens TTP (bioMérieux BV, The Netherlands). La courbe standard, telle que définie précédemment (dilution ARN transcrits : 108 à 102 copies) a été utilisée pour quantifier l'expression de chacun du gène cible ESR2 et du gène de ménage PPIB, ce qui a permis d'extrapoler le nombre de copies d'ARNm par échantillon.
A partir des courbes standards ESR2 et PPIB réalisées précédemment, la limite de détection et la limite de quantification ont été déterminées pour chacun des gènes. La limite de quantification était observée à 1000 et 10000 copies d'ARNm pour ESR2 et
PPIB. La limite de détection était de 1000 copies d'ARNm pour ESR2 et PPIB.
La spécificité du duplex ESR2/PPIB a été testée en réalisant l'amplification de ESR2 en présence de « molecular beacon » spécifique de HER2, et en réalisant l'amplification de
HER2 en présence de «molecular beacon» spécifique de ESR2. Aucun signal n'était détecté. Ces résultats démontrent que le duplex ESR2/PPIB en NASBA permet une amplification spécifique et sensible du gène ESR2 à partir d'une très faible quantité d'ARN totaux, rendant ce duplex parfaitement adapté pour étudier le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein, et la réponse d'un patient à un traitement donné. b2) Amplification en duplex des gènes HER2 et PPIB Cette réaction d'amphfication a été réalisée a l'aide d'un kit Nuchsens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands). Pour cela, 5 ng d'ARN totaux, extraits des différentes hgnées cellulaires, ont été ajouté à 10 μl de tampon NASBA (concentration finale dans 20 μl de milieu réactionnel : 40 mM de Tris HCl pH 8,5, 12mM MgC12, 70mM KCl, 5mM dithiotreitol, 15% v/v DMSO, ImM de chaque dNTP, 2mM de chaque NTP).
Dans ce milieu a été ajouté, 0,lμM de « molecular beacons » comprenant P la SEQ ID N°12 5' GGAGGATGTG CGGCTCGTAC 3', marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) à leur extrémité 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) à son extrémité 3' pour la détection des ARN codant HER2 lors du duplex HER2 / PPIB, p la SEQ ID N°29 5' GATCCAGGGC GGAGACTTCA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cg tcgGATC CAGGGCGGAG ACTTCAcgαt cg-Dabsyl 3', pour la détection des ARN du gène PPIB codant la cyclophyline B, Dans ce milieu a également été ajouté : p 0,2 μM d'une première amorce HER2 de SEQ ID N°7 5' GAGCCAGCCC GAAGTCTGTA 3', comprenant, en son extrémité 5',et indiqué en minuscule le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°24 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag g GAGCCAGC CCGAAGTCTG TA 3', p 0,2 μM d'une deuxième amorce HER2 de SEQ ID N°8 5' TCTTAGACCA TGTCCGGGAAA 3', p 0,2 μM d'une première amorce cyclophyline B de SEQ ID N°27 5' CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3', comprenant, en son extrémité 5',et indiqué en minuscule le promoteur de la polymérase 17, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N°30 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3', 0,2 μM d'une deuxième amorce cyclophyline B de SEQ ID N°28 5' AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3'.
Une préincubation a été réalisée durant 2 minutes à 65°C avant une incubation de 2 minutes à 41°C. Un volume de 5 μl d'un mélange d'enzyme (0,08U de RNAse H, 32U d'ARN polymérase 17, 6,4 U d'AMV-RT) a été ajoutée, et une incubation de 90 minutes a été réalisée à 41 °C.
La quantification des ARN transcrits a été déterminée en temps réel (NucliSens EasyQ, bioMérieux), la réaction NASBA produisant des amplicons avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent, l'analyseur NucliSens EasyQ.
L'analyse et la communication automatisée des données sont assurées par le logiciel
Nuclisens TTP (bioMérieux BV, The Netherlands). La courbe standard, telle que définie précédemment (dilution ARN transcrits : 108 à 102 copies) a été utihsée pour quantifier l'expression de chacun du gène cible HER2 et du gène de ménage PPIB, ce qui a permis d'extrapoler le nombre de copies d'ARNm par échantillon.
A partir des courbes standards HER2 et PPIB réahsées précédemment, la limite de détection et la limite de quantification ont été déterminées pour chacun des gènes. La limite de quantification a été déterminée à 1000 et 10000 copies d'ARNm pour HER2 et
PPIB respectivement. La limite de détection était de 100 copies d'ARNm pour HER2 et
PPIB.
La spécificité du duplex HER2/PPIB a été testée en réalisant l'amplification de ESR2 en présence de « molecular beacon » spécifique de HER2, et en réalisant l'amplification de HER2 en présence de «molecular beacon» spécifique de ESR2. Aucun signal n'était détecté. Les résultats obtenus au niveau ARN messager par la technique NASBA pour le gène
HER2 était corrélé au résultats obtenus en PCR quantitative (r = 0,54, p < 0,0001, n=97, test statistique de corrélation Sperman) et en ELISA (r = 0,50, p< 0,0001, n = 93; test statistique de corrélation Spearman). Ces résultats démontrent que l'expression des ARNm d'HER2 est corrélé à l'amplification du gène ainsi qu'a la surexpression du récepteur membranaire HER2, confirmant l'intérêt d'étudier au niveau ARNm l'expression de ce gène.
Ces résultats démontrent que le duplex HER2/PPIB en NASBA permet une amplification spécifique et sensible du gène HER2 à partir d'une très faible quantité d'ARN totaux, rendant ce duplex parfaitement adapté pour étudier le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein, et la réponse d'un patient à un traitement donné.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes : A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amphcons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l à SEQ ID N°20 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l à SEQ ID N°20.
2. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein selon la revendication 1 caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorces est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : P une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ; p une première amorce d'amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; rj une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 ; α une première amorce d'amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°13 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°14 ; α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°15 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°16 ; ci une première amorce d'amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°17 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°18 ; α une première amorce d'amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°19 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°20.
3. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein selon l'une quelconque des revendication 1 ou 2 dans lequel ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage 17.
4. Procédé pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel, lors de l'étape C, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel la séquence cible est comprise dans un gène choisi parmi ESRl, ESR2, PGR, HER2.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel les étapes B et C sont effectuées en même temps.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'on on utilise, en outre, lors de l'étape B, au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce l'amorce d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID N°25 à 29.
9. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que ladite paire d'amorces d'amphfication pour obtenir des amphcons spécifiques d'un gène de ménage est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : p une première amorce d'amphfication comprenant au moins lOmotifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°27 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°28 p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°25 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°26
10. Amorce d amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l à SEQ ID N°20 ; 25 à 29.
11. Amorce d'amphfication selon la revendication 10 comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage 17.
12. Paire d'amorce d'amphfication choisie parmi les paires d'amorces suivantes : α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ; α une première amorce d'amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; ci une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 ; p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°13 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°14 ; D une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°15 et une deuxième amorce d'amplification comprenant ai moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°16 ; α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°17 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°18 ; p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°19 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°20
13. Paire d'amorce selon la revendication 12 dans laquelle ladite première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage 17.
14. Utilisation d'au moins une amorce d'amphfication selon la revendication 10 ou 11 et/ou d'une paire d'amorce selon la revendication 12 ou 13 lors d'une réaction d'amplification NASBA
15. Sonde de détection comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l à SEQ ID N°20.
16. Sonde de détection selon la revendication 15 comprenant un flurophore et un quencher.
17. Utilisation d'au moins une amorce selon la revendication 10 ou 11 et/ou d'au moins une paire d'amorces selon la 12 ou 13 et/ou d'au moins une sonde de détection selon la revendication 15 ou 16 pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein.
18. Kit pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein comprenant au moins une amorce selon la revendication 10 ou 11 et/ou d'au moins une paire d'amorces selon la revendication 12 ou 13 et/ou d'au moins une sonde de détection selon la revendication 15 ou 16.
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