WO2005045070A2 - Procede pour le pronostic du cancer du sein - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour le pronostic du cancer du sein pour le pronostic du cancer du sein chez un patient atteint d'un cancer du sein caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 68, c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles.

Description

Procédé pour le pronostic du cancer du sein

La présente invention concerne le domaine de la cancérologie. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour le pronostic d'un cancer du sein. 5 Chez la femme, le cancer du sein est la première cause de mortalité par cancer dans les pays industrialisés. Il est estimé que la taille minimale d'une tumeur rcpérablc par mammographie est de 1 cm. Les cancers du sein se développent lentement. Néanmoins, cette tumeur de petite taille présente un passé évolutif de 8 ans en moyenne lors du diagnostic. L'étiologie du cancer du sein n'est pas bien définie. Des prédispositions

10 familiales ont été mises en évidence. L'âge est le facteur de risque le plus important. Ainsi, le risque augmente de 0,5% par année d'âge dans les pays occidentaux. D'autres facteurs de risques sont connus tels que le nombre des grossesses et l'âge de la première grossesse, l'allaitement, l'âge de la puberté et de la ménopause, les traitements oestrogéniques après la survenue de la ménopause, le stress et la nutrition.

15 II existe différents traitements pour lutter contre le cancer du sein, et on peut citer notamment lTiormonothérapie, qui est utilisée dans les cancers du sein hormono- dépendants. Pour réagir à l'hormonothérapie, un cancer doit être hormonosensible, c'est-à- dire que les cellules de la tumeur doivent posséder des récepteurs hormonaux à leur surface.

20 On peut citer notamment les récepteurs à l'œstrogène ER (ERl et ER2) et le récepteur à la progestérone (PGR), qui sont les paramètres les plus connus pour prédire la réponse à une hormonothérapie dans le cancer du sein. Ainsi la teneur en ERl est utilisée comme indicateur pronostique, et pour prédire la réponse d'un patient à un traitement avec des anti oestrogènes, tels que le Tamoxifen® (Osbome C et al, Breast Cancer Res Treat 51 :227-

25 238, 1998 ; Goldhirsch et al, J Clin Oncol 19 :3817-3827, 2001). La présence du récepteur PGR est également utilisée pour le suivi d'une hormonothérapie, et comme marqueur de pronostic (Horwitz et al, Récent Prog Horm Res 41 : 249-316, 1995). On peut également citer le récepteur HER2, qui serait surexprimé dans environ ^lΛ des cancers du sein invasif (Slamon et al, Science, 1987, 235 :177-182). On peut citer également la chimiothérapie,

30 qui est, quant à clic, un traitement général du cancer puisque les médicaments, portés par la circulation sanguine, peuvent agir partout dans l'organisme. La chimiothérapie a une place importante dans l'arsenal thérapeutique, particulièrement depuis une dizaine d'années, avec l'apparition de nouvelles molécules. Les médicaments sont le plus souvent administrés en perfusion par voie veineuse, en voie sous-cutanée, en intra- musculaire.

Parce qu'il existe différents types de cancers du sein, et différents pronostics du cancer du sein, les femmes qui en sont atteintes ne suivent pas toutes le même traitement et le médecin doit proposer à chaque patiente un traitement adapté à sa situation, afin d'obtenir les meilleures chances de guérison. En particulier, il existe des patientes présentant un fort risque de rechute après le traitement d'un cancer du sein, qui est étroitement lié au stade d'évolution du cancer au moment de son diagnostic. Cette rechute est généralement due à la persistance de cellules tumorales qui ont échappé au traitement. Il est donc très utile de disposer d'un outil permettant de déterminer les risques de rechute dès le 1^er diagnostic du cancer du sein afin de proposer à la patiente un traitement adapté le plus rapidement possible. Bien que l'on puisse citer comme indice de risque de récidive, la présence de cellules cancéreuses dans les ganglions lymphatiques, la taille de la tumeur, son grade, il n'existe pas d'outil reconnu pour discriminer aisément les patientes ayant un risque important de rechute, des patientes ayant un risque faible de rechute. La présente invention propose un nouveau procédé pour le pronostic du cancer du sein, qui permet de discriminer les patients ayant un risque de rechute important, afin d'adapter au mieux le traitement dès le 1^er diagnostic. D'une manière surprenante, lès inventeurs ont mis en évidence que l'analyse de l'expression de gènes cibles sélectionnés parmi 68 gènes tel que présenté dans le tableau 1 ci après, est très pertinente dans la lutte contre le cancer du sein, puisque ces gènes sont exprimés différentiellement selon que la patiente présente un fort risque de rechute ou un faible risque de rechute. Tableau 1 - liste des 68 gènes cibles selon l'invention

Parmi ces gènes, on peut distinguer des gènes dont la fonction est connue mais qui n'ont jamais été mis en relation avec le cancer du sein (SEQ ID N°2 à 7 ; 9 ; 11 ; 12 ; 15 à 19 ; 21 ; 22 ; 23 ;26 ; 28 ; 29 ; 32 ; 33 ; 35 à 37 ; 40 à 42 ; 44 à 46 ; 48 ; 53 ; 56 à 61 ; 63 ; 64 ; 66 ; 68 ainsi que des gènes dont la fonction est inconnue (SEQ ID N°10 ; 13 ; 14 ; 20 ; 24; 25 ; 27 ; 31 ; 38 ; 43 ; 47 ; 49 ; 50 ; 52 ; 54 ; 55 ; 65 ; 67). n est bien entendu que si différentes isoformes de ces gènes existent, toutes les isoformes sont relevantes pour la présente invention, et pas uniquement celles présentées dans le précèdent tableau. A ce titre, il convient notamment de noter qu'il existe deux variants pour le gène cible de SEQ ID N°3, seul le premier

est présenté dans le tableau ci dessus, mais le deuxième variant, ayant pour numéro d'accession Genbank L26336 est tout aussi pertinent au sens de la présente invention. D'une manière comparable, il existe un deuxième variant pour le gène cible de SEQ ID N°15 ayant pour numéro d'accession Genbank W25892 ; un deuxième variant pour le gène cible de SEQ ID N°25 ayant pour numéro d'accession Genbank AB007958, un deuxième variant pour le gène cible de SEQ ID N°41 ayant pour numéro d'accession Genbank XM_496907; un deuxième variant pour le gène cible de SEQ ID N°47 ayant pour numéro d'accession Genbank AB019568, un deuxième variant pour le gène cible de SEQ ID N°50 ayant pour numéro d'accession Genbank XM_375469, un deuxième variant pour le gène cible de SEQ ID N°52 ayant pour numéro d'accession Genbank AK90400 (correspondant au gène Homo sapiens mRNA for FLJ00227 protein), un deuxième variant pour le gène cible de SEQ JT) N°55 ayant pour numéro d'accession Genbank AF060511, un deuxième variant pour le gène cible de SEQ ID N°56 ayant pour numéro d'accession Genbank L11373, un deuxième variant pour le gène cible de SEQ ID N°58 ayant pour numéro d'accession Genbank BC016731. A noter également que la SE IQ N°23 corrcspodant au gène Scptin 11, et la SEQ ID N°24 correspond au gène YTH domain family 3. 5 L'analyse de l'expression d'un panel de gènes cibles est connue dans la lutte contre le cancer du sein, et on peut citer notamment l'analyse d'un panel de 176 gènes qui est exprimé différentiellement entre des patientes exprimant le récepteur ER et des patients n'exprimant pas le récepteur ER (Bertucci et al, Human Molecular Genetics, 2000 ; 9 :

10 2981-2991). Toutefois, si ce panel de gènes permet de déterminer si une patiente répondra à une hormonothérapie, il ne permet nullement de connaître, après cette hormonothérapie, si la patiente présente un risque important de rechuter après ce 1^er traitement. On peut citer également l'analyse d'un panel de 70 gènes qui est exprimé différentiellement entre des patientes développant une rechute après 5 ans ou ne développant pas de rechute après 5 ans

15 (Van't Veer et al, Nature, 2002, 415 : 530-535). Toutefois, les patientes ne présentaint pas de cellules épithéliales au niveau ganglionnaire, ce qui donne déjà une indication au clinicien quant à la virulence du cancer. De plus, ces patientes étaient soit ER+, soit ER-. En pratique, certain gènes de ce panel étant directement liés à l'expression du gène ER, ces gènes n'apportent donc pas d'informations supplémentaires au clinicien par rapport à

20 celles qu'il a pu obtenir par une analyse immuno-histochimïque, le renseignant sur le statut ER de sa patiente.

A ce titre, l'invention concerne un procédé pour le pronostic du cancer du sein chez un patient atteint d'un cancer du sein caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 25 a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 68 ; 30 c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles. Au sens de la présente invention, on entend par pronostic la prévision de l'évolution d'une maladie. En particulier, on entend la prévision de réponse d'un malade au regard d'un traitement particulier, tel qu'une hormonothérapie, radiothérapie, chimiothérapie...

Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon prélevé chez un patient, et susceptible de contenir un matériel biologique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive, tissu, de tumeur, de moelle osseuse, de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon tissulaire, préfércntiellemcnt un échantillon de tumeur ou de moelle osseuse.

Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrits de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARNr issus d'autres gènes que le gène cible.

Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on extrait le matériel biologique de l'échantillon biologique par tous les protocoles d'extraction et de purification d'acides nucléiques bien connus de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléiques peut être réalisée par : • une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les cellules du patient. A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet: o WO 00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO 99/53304 sur la lyse électrique, o WO 99/15321 sur la lyse mécanique.

L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyscs chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809). une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adaptée à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet: WO-A-97/45202 et WO-A- 99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep^® Silica, Promega: MagneSil™ Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulairc paramagnétique (Whatman: DEAE-

Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-Bind^{1 M}). Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'éthanol 100%. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en solution . Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement les ARN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter les ARN avec de l'éthanol 100%. Les ARN peuvent alors être culotés par centrifugation, lavés et remis en solution.

Lors de l'étape b, et au sens de la présente invention, on entend par réactif spécifique, un réactif qui, lorsqu'il est mis en contact avec du matériel biologique tel que défini précédemment, se lie avec le matériel spécifique dudit gène cible. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine nucléique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet l'hybridation du réactif spécifique avec le matériel spécifique du gène cible. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et tliymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G-C). L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons A-T et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringcnce est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidiquc, ou oligonucléotidc, ou polynucléotidc, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphoriques, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidiquc, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy - 2

- ribose, dans TARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science,

254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US 4,683,195,

US 4,683,202 et US 4,800,159, LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP

0 201 184, RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO 90/06995, NASBA (Nuclcic Acid Séquence- Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques d'un gène cible, permettant l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifiques d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible). Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription inverse, on parle de RT-PCR.

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend préférentiellement une sonde d'hybridation. Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant au moins 5 motifs nucléotiques, tel que comprenant notamment de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Kcllcr G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249], Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un 5 signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétric, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose- 6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique

10 détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les

15 molécules radioactives comme ³²P, ³⁵S ou ¹²⁵L Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection « molecular beacons » telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature Biotechnol.,

20 1996, 14 :303-308). Ces "molecular beacόns" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient.

25 Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut utiliser des séquences cibles marquées, directement (notamment par l'incorporation d'un marqueur au sein de la séquence cible) ou indirectement (notamment par l'utilisation d'une sonde de détection telle que définie précédemment) la séquence cible. On peut notamment réaliser avant l'étape d'hybridation une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible, par

30 exemple en utilisant un désoxyribonucléotidc triphosphatc marqué lors de la réaction d'amplification enzymatique. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'i idazole et de chlorure de manganèse. La séquence cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde de détection selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO 91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR2 780059.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la sonde de détection comprend un fluorophore et un quencher. Selon un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, la sonde d'hybridation comprend un flurophorc FAM (6-carboxy-fluorcscein) ou ROX (6-carboxy-X-rhodajτιine) en son extrémité 5' et un quencher (Dabsyl) en son extrémité 3'.

La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous là forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO- A-94/12670, d'une particule. On peut également immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. En particulier, on peut utiliser comme support une biopuce sur laquelle peuvent être immobilisées un grand nombre de sondes. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où est fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopuce, ou puce à ADN, date du début des années 90. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire: le phénomène d'hybridation, c'cst-à-dirc l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucléotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromcs. Les sondes de capture sont positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes cibles. Pour analyser l'expression d'un gène cible, on peut alors réaliser une biopuce portant de très nombreuses sondes qui correspondent à tout ou partie du gène cible, qui est transcrit en ARNm. On hybride alors par exemple les ADNc ou les ARNc spécifiques d'un gène cible que l'on souhaite analyser sur des sondes de capture spécifique. Après hybridation, le support ou puce est lavé(e), et les complexes ADNc ou ARNc marquées / sondes de capture sont révélés par un ligand de forte affinité lié par exemple à un marqueur de type fluorochrome. La fluorescence est lue par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Chee et al., Science, 1996, 274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de 25 nucléotides. D'autres exemples de biopuces sont donnés dans les publications¹ de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n°16, p. 40-44 ;' F. Ginot, Human Mutation, 1997, n°10, p.1-10; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n°l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Mds Research, 1994, n° 22(15), p. 2915- 2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n° 16, p. 541-546 ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A-5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucléotidiques cibles tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection.

Pour l'immobilisation des sondes sur le support, on distingue trois grands types de fabrication. II y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes présynthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par un dispositif de type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille allant de quelques bases (5 à 10) jusqu'à des tailles relativement importantes de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) : L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jet d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluide (volume <1 ni) et à un rythme pouvant atteindre 4000 gouttes/secondes. L'impression n'implique aucun contact entre le système libérant le fluide et la surface sur laquelle il est déposé. La micro-déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques dizaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots, dit zones de reconnaissance, d'ADN sur une surface d'un peu moins de 4 cm2. Il ne faut toutefois pas oublier l'emploi de membranes de Nylon, dites « macroarrays », qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un diamètre de 0,5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces. On peut toutefois déposer en fond de plaque de microtitration un certain volume d'échantillon dans chaque puits, comme c'est le cas dans les demandes de brevet WO-A-00/71750 et FR 00/14896, ou déposer au fond d'une même boîte de Pétri un certain nombre de gouttes séparées les unes des autres, selon une autre demande de brevet FR00/ 14691. La deuxième technique de fixation des sondes sur le support ou puce est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ (voir notamment les demandes de brevet WO 89/10977 et WO 90/03382), et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'oligonucléotides. Elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'oligonucléotides, le long de la surface de verre. Enfin, la troisième technique est appelée la photolithographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. D s'agit également d'une synthèse in situ. La photolithographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par la fixation de groupements chimiques photolabilcs pouvant être activés par la lumière. Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec l'extrémité 3' d'un oligonucléotide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut iUuminer et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des quatre nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'oligonucléotides sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carré (μm2). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs centaines de milliers de spots sur une surface de quelques centimètres carré (cm2). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de Nmères en seulement 4 x N cycles. Toutes ces techniques sont utilisables avec la présente invention. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le au moins un réactif spécifique de l'étape b) définie précédemment comprend au moins une sonde d'hybridation, qui est préférentiellement immobilisée sur un support. Ce support est préférentiellement une biopuce telle que définie précédemment.

Lors de l'étape c) la détermination de l'expression d'un gène cible peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier. D'une manière générale, l'expression d'un gène cible peut être analysée par la détection des ARNm (ARN messagers) qui sont transcrits du gène cible à un instant donné ou par la détection des protéines issues de ces ARNm.

L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression d'un gène cible par la détection des ARNm issus de ce gène cible selon tous les protocoles bien connus de l'homme du métier. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on détermine simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, par la détection de plusieurs ARNm différents, chaque ARNm étant issus d'un gène cible.

Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification, on peut, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux (comprenant les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosomaux (ARNr) et les ARN messagers (ARNm)) d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription inverse afin d'obtenir les ADN complémentaires (ou ADNc) desdits ARNm. A titre hdicatif, cette réaction de transcription inverse peut être réalisée à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment d'ADN complémentaire. On peut utiliser notamment l'enzyme reverse transcriptase provenant de l'AMV (Avian Myoblastosis Virus) ou de MMLV (Moloney

Murine Leukaemia Virus). Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADNc des ARNm, on réalise cette étape de transcription inverse en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription inverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des

ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible). 2) on met en contact la ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible avec les ADNc spécifique du gène cible et les ADNc non spécifique du gène cible. La ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible s'hybrident avec les ADNc spécifique du gène cible et on amplifie spécifiquement une région prédéterminée, de longueur connue, des ADNc provenant des ARNm issus du gène cible. Les ADNc non spécifiques du gène cible ne sont pas amplifiés, alors qu'on obtient alors une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible. Au sens de la présente invention, on parle indifféremment d' « ADNc spécifiques du gène cible » ou d' « ADNc provenant des ARNm issus du gène cible ». Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment. En PCR, on peut également amplifier simultanément plusieurs ADNc différents, chacun étant spécifique de différents gènes cibles par l'utilisation de plusieurs couples d'amorces d'amplification différents, chacune étant spécifique d'un gène cible: on parle alors d'amplification en multiplex. 3) on détermine l'expression du gène cible en détectant et quantifiant les ADNc spécifiques du gène cible obtenus lors de l'étape 2) ci dessus. Cette détection peut être réalisée après migration par électrophorèse des ADNc spécifiques du gène cible en fonction de leur taille. Le gel et le milieu de migration peuvent comprendre du bromure d'éthydium afin de permettre la détection directe des ADNc çécifiques du gène cible lorsque le gel est placé, après un temps de migration donné, sur une table lumineuse à rayons UV (ultra violet) par l'émission d'un signal lumineux. Ce signal est d'autant plus lumineux que la quantité des ADNc spécifiques du gène cible est importante. Ces techniques d'électrophorèse sont bien connues de l'homme du métier. Les ADNc spécifiques du gène cible peuvent également être détectés et quantifiés par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription inverse, PCR...), on peut normaliser l'expression d'un gène cible de différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, c'est à dire en réalisant un rapport entre la quantité d'ADNc spécifiques du gène cible, et la quantité d'ADNc spécifiques du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA, Mol Endocrinol , 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methoάs, 2001, 25 : 386-401.

Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription inverse, telle que décrite précédemment afin des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible). 2) on met en contact tous les ADNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ADNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ADNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux tels qu'indiqués précédemment. Selon un mode préféré de réalisation, la sonde d'hybridation est immobilisée sur un support. Préférentiellement, le support est une biopuce. La réaction d'hybridation peut être précédée d'une étape d'amplification enzymatique des ADNc spécifique du gène cible telle que décrite précédemment pour obtenir une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible et augmenter la probabilité qu'un ADNc spécifiques d'un gène cible s'hy bride sur une sonde de capture spécifique du gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ADNc spécifiques du gène cible telle que décrite précédemment, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotidc triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le clivage peut être réalisé 5 notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. L'ADNc spécifique du gène cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. D'autres modes particuliers préférentiels de marquage et/ou clivage d'acides nucléiques sont décrit dans les demandes WO 99/65926, WO 01/44507, WO

10 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319. 3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybrides les sondes de capture spécifiques du gène cible avec les ADNc spécifiques du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le

15 marqueur. Lorsque l'ADNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur.

Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer

20 l'expression d'un gène cible de la manière^' suivante: 1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription inverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation

25 d'une enzyme polymerase de type T7 polymérase qui fonctionne sous la dépendance d'un promoteur et qui permet d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible. 0 2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s' hybridant pas sur les sondes de capture. Lorsque l'on souhaite analyser simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, on peut immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment. 3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifiques du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utilisation d'ARNc est particulièrement avantageux lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybride un grand nombre de sondes.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les étapes B et C sont effectuées en même temps. Ce mode préféré peut être notamment mise en oeuvre par «NASBA en temps réel » qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification NASBA et la détection en temps réel qui fait appel à des "molecular beacons". La réaction NASBA intervient dans le tube, produisant de l'ARN simple brin avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent. Contrairement à une amplification par RT- PCR, l'amplification en NASBA peut se faire en présence de contamination en ADN dans l'échantillon. Il n'est donc pas nécessaire de vérifier que l'ADN a bien été complètement éliminé lors de l'extraction des ARN.

L'analyse de l'expression d'un gène cible choisi parmi l'une quelconque des SEQ ID N°l à 68 permet alors de disposer d'un outil pour le pronostic du cancer du sein. On peut par exemple analyser l'expression d'un gène cible chez un patient dont on ne connaît pas le risque de rechute, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients ayant un fort risque de rechute et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients ayant un faible risque de rechute. Ceci permet de déterminer si le patient a un fort ou un faible risque de rechute, afin de lui proposer un traitement adapté.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 57 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 57 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 57 desdits gènes cibles.

Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins au moins 5, au moins 10, au moins 15, au moins 20, au moins 25, au moins 30, au moins 35, au moins 40, au moins 45, au moins 50 ou au moins 55 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 57 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins au moins au moins 5, au moins 10, au moins 15, au moins 20, au moins 25, au moins 30, au moins 35, au moins 40, au moins 45, au moins 50 ou au moins 55 desdits gènes cibles.

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 10 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 10 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N° 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55 et on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9 desdits gènes cibles. L'utilisation de panel de gènes restreint est particulièrement adapté pour obtenir un outil de pronostic. En effet, l'analyse de l'expression d'une dizaine de gènes ne nécessite pas la fabrication à façon de puce à ADN, et peut être mise en œuvre directement par des techniques de PCR ou de NASBA, ou puce de basse densité, ce qui présente un atout économique important et une mise en œuvre simplifiée.

L'invention concerne également un support tel que défini précédemment comprenant au moins une sonde d'hybridation spécifique d'au moins un gène cible présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 68. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le support comprend au moins 68 sondes d'hybridation choisis parmi les sondes spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 68. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le support comprend au moins 57 sondes d'hybridation choisis parmi les sondes spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 57. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le support comprend au moins 10 sondes d'hybridation choisis parmi les sondes spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55.

L'invention concerne également l'utilisation d'un support tel que défini ci dessus pour le pronostic d'un cancer du sein.

L'invention concerne enfin un kit de pronostic d'un cancer du sein comprenant un support tel que défini ci dessus.

Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemples explicatifs et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention. La figure 1 présente la classification de 40 échantillons de tumeurs issus de patientes ayant un fort risque de rechute (R) ou un faible risque de rechute (NR) grâce à l'analyse d'un panel de gènes selon l'invention (57 gènes ayant une séquence nucléotidiquc choisie parmi les SEQ ID N°l à 57 présentées précédemment dans le tableau 1). Les cercles représentent la probabilité qu'un patient donné soit un patient NR alors que les triangles représentent la probabilité que le patient soit un patient R. A titre indicatif, le patient «442 NR » est classé comme un patient NR avec une probabilité d'environ 95 %. La figure 2 est établie selon les mêmes principes que la figure 1 et représente la classification de 40 échantillons de tumeurs ssus de patientes ayant un fort risque de rechute (R) ou un faible risque de rechute (NR) grâce à l'analyse d'un deuxième panel de gène selon l'invention (10 gènes ayant une séquence nucléotidique choisis parmi les SEQ

ID N°7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55 présentés précédemment dans le tableau 1).

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.

Exemple 1 : Recherche d'un profil d'expression pour le pronostic du cancer du sein

Caractéristiques des échantillons biologiques : L'exemple présenté ci après a été réalisé à partir de 40 échantillons de tumeurs du sein, obtenus auprès du Centre Léon Bérard (CLB) à Lyon, France. Toutes les tumeurs ont été obtenues par un prélèvement chirurgical effectué préalablement à toutes thérapies (hormonot érapie, radiothérapie ou chimiothérapie). On pouvait distinguer des patientes ayant un fort risque de rechute (R) (18 patientes) et des patientes ayant un faible risque de rechute (22 patientes). La rechute n'était pas due à une différence de traitement puisque chaque patiente était soumise à un traitement standard, basée sur la prise d'anthracycline en chimiothérapie, associée a une radiothérapie et une hormonothérapie (traitement au Tamoxifène durant 5 ans). Toutes les patientes présentaient des cellules épithéliales au niveau ganglionnaire et étaient ER +.

Extraction du matériel biologique (ARN totaux) de l'échantillon biologique : les ARN totaux ont été extraits de 40 échantillons tumoraux, par l'utilisation d'un tampon Trizol®. Après l'étape d'homogénisation dans 1 à 1,5 ml de tampon Trizol (Invitrogen, Cergy Pointoise, France), les homogénats ont été traités avec 300 μl de chloroforme pour éliminer les contaminants protéiques et lipidiques. Les ARN ont ensuite été précipités avec 750 μl d' isopropanol, et lavés deux fois dans de l'éthanol 80 % ethanol (vol/vol) et resuspendus dans de l'eau DEPC. Les ARN totaux ont ensuite été purifiés dans des colonnes Qiagen RNeasy columns (Qiagen, Hilden, Germany) selon les instructions du fabriquant, à l'exception de l'élution finale qui a été réalisée dans 200 μl d'eau RNAse free après une minute d'incubation à 65°C. Avant l'étape de transcription inverse, une étape de précipitation supplémentaire a été réalisée par une solution d'acétate d'ammonium (0,5 volumes, 7,5M) et éthanol (2,5 volumes) afin d'accroître la concentration et la purification des ARN totaux. L'intégralité et la qualité des ARN totaux ont été vérifiées par le bioanalyseur AGILENT 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Synthèse d'ADNc, obtention des ARNc et marquage des ARNc et quantification : Afin d'analyser l'expression des gènes cibles selon l'invention, les ADN complémentaires (ADNc) des ARNm contenus dans les ARN totaux tels que purifiés ci dessus, ont été obtenus à partir de 10 μg d'ARN totaux par l'utilisation de 400 unités de l'enzyme de 5 transcription reverse SuperScriptlI (Invitrogen) et 100 pmol d'amorce poly-T contenant le promoteur de la T7 promotor (T7-oligo(dT)24-primcr, Proligo, Paris, France). Les ADNc ainsi obtenus ont ensuite été extraits avec du phénol/chloroforme, et précipités tel que décrit précédemment par de l'acétate d'ammonium et de l'éthanol, et remis en solution dans 24 μl d'eau DEPC. Un volume de 20 μl de cette solution purifiée d'ADNc a

10 fait l'objet ensuite d'une transcription in vitro par l'utilisation d'une ARN polymérase T7 qui reconnaît spécifiquement le promoteur de la T7 polymérase tel que mentionné ci dessus. Cette transcription permet d'obtenir l'ARNc de l'ADNc. Cette transcription a été réalisée par l'utilisation d'un kit Bioarray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY), qui permet non seulement d'obtenir l'ARNc mais

15 également l'incorporation de bases cytidine et uridine biotinylées lors de la synthèse de l'ARNc . Les ARNc purifiés ont ensuite été quantifiés par spectrophotométrie, et la solution d'ARNc a été ajustée à une concentration de 1 μg/μl d'ARNc. L'étape de clivage de ces ARNc a ensuite été réalisée à 94°C pendant 35 min, par l'utilisation d'un tampon de fragmentation

20 (40 mM de Tris acétate, pH 8,1, 100 M d'acétate de potassium, 30 mM d'acétate de magnésium) afin de provoquer l'hydrolyse des ARNc et obtenir des fragments de 35 à 200 bp. Le succès d'une telle fragmentation a été vérifié par une électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%. Mise en évidence d'un profil d'expression des gènes dans les tumeurs de cancer du sein,

25 permettant de discriminer les patientes R et NR L'expression d'environ 10 000 gènes a été analysée et comparée entre des patientes ayant un fort risque de rechute (R) et des patientes ayant un faible risque de rechute (NR). Pour cela, 10 μg d'ARNc fragmentés issus de chaque échantillon ont été ajoutés à un tampon d'hybridation (Affymetrix) et 200 μl de cette solution ont été mis en contact pendant 16 h à

30 45°C sur une puce d'expression (Human Génome U95Av2 GcncChip® (Affymetrix), qui comporte 12 625 groupes de sondes représentant environ 10 000 gènes selon le protocole d' Affymetrix tel que décrit sur le site internet d' Affymetrix (voir notamment à l'adresse suivante http://www.affymctrix.com/support/downloads/manuals/exprcssion_s2_manual.pdf).

Afin d'enregistrer les meilleures performances d'hybridation et de lavage, des ARN qualifiés de « contrôle » biotinylés (bioB, bioC, bioD et cre) et des oligonucléotides (oligo

B2) ont également été inclus dans le tampon d'hybridation. Après l'étape d'hybridation, les

ARNc biotinylés et hybrides sur la puce, ont été révélés par l'utilisation d'une solution de stteptavidme-phycoerythrine et le signal a été amplifié par l'utilisation d'anticorps anti- streptavidine. L'hybridation a été réalisée dans une étuve d'hybridation « GeneChip Hybridisation oven » (Affymetrix), et le protocole Euk GE-WS2 du protocole d' Affymetrix a été suivi. Les étapes de lavage et de révélation ont été réalisées sur une station «Fluidics Station 400 » (Affymetrix). Chaque puce U95Av2 a ensuite été analysée sur un scanner Agilent G2500A GeneArray Scanner à une résolution de 3 microns afin de repérer les zones hybridées sur la puce. Ce scanner permet la détection du signal émis par les molécules fluorescentes après excitation par un laser argon en utilisant la technique du microscope à épifluorescence. On obtient ainsi pour chaque position, un signal proportionnel à la quantité de ARNc fixés. Le signal a ensuite été analysé par le logiciel Microarray Suite 5.0 software (MAS5.0, Affymetrix). Afin de prévenir les variations obtenues par l'utilisation de différentes puces, il a été réalisé une approche de normalisation utilisant le logiciel «Affy », qui permet d'harmoniser la distribution moyenne des données brutes obtenues pour chaque puce. Les résultats obtenus sur une puce peuvent alors être comparés aux résultats obtenus sur une autre puce. Le logiciel MAS5.0 permettait aussi d'inclure un algorithme statistique pour considérer si un gène était exprimé ou non. Chaque gène représenté sur la puce U95Av2 était couvert par 16 à 20 couples de sondes de 25 oligonucléotides. Par couple de sondes, on entend une première sonde qui s'hybridait parfaitement (on parle alors de sondes PM ou perfect match) avec un des ARNc issus d'un gène cible, et une deuxième sonde, identique à la première sonde à l'exception d'un mésappariement (on parle alors de sonde MM ou mismatched) au centre de la sonde. Chaque sonde MM servait à estimer le bruit de fond correspondant à une hybridation entre deux fragments nucléotidiques de séquence non complémentaire. (Affymetrix technical note "Statistical Algorithme Référence Guide" ; Lipshutz, et al (1999) Nat. Genêt. 1 Suppl., 20-24). Les 40 échantillons restants montraient une moyenne de 49,8 % de gènes exprimés. L'analyse des données d'expression a été réalisée par des algorithmes génétiques (Li et al 2001, Bioinformatics, 17 : 1131-1142 ; Ooi et al, 2003, Bioinformatics, 19 : 37-44). 5 A partir des 12625 groupes de sondes, représentant environ 10 000 gènes, de la puce, les inventeurs ont sélectionné les gènes pertinents qui étaient corrélés à un fort risque de rechute. Pour cela, une première étape a consisté à exclure les gènes présentant un niveau d'expression comparable entre tous les groupes de patientes (Li et al, 2001 ,

10 Bioinformatics, 17 : 1131-1142). Les gènes non exprimés chez l'ensemble des patientes ont été exclus (logiciel MAS5.0). Certains gènes ont également été exclus si la médiane d'expression des 2 groupes (patientes R et patientes NR) était inférieur à 300 ou si le rapport des médianes d'expression entre les patientes R et NR était compris entre 0,7 et 1,3. L'expression des 1404 gènes restants a ensuite été analysée (algorithme GA, Ooi et al,

15 2003, Bioinformatics, 19 : 37-44). Cette analyse a permis de mettre en évidence 57 gènes pertinents selon l'invention (SEQ ID N°l à 57). Une analyse complémentaire (test t) a également permis de mettre en évidence 11 gènes supplémentaires qui s'avéraient également très pertinents (SEQ ID N°58 à 68). L'augmentation ou la diminution d'expression de chacun de ces gènes, observée chez les 0 patientes R par rapport aux patientes NR est indiquée dans le tableau 2.

Tableau 2 - liste des 68 gènes exprimés différentiellement dans les cancers du sein des patients R et NR

Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de 57 gènes de séquence nucléotidique choisi parmi les SEQ ID N°l à 57 du tableau 2 pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 1, qui présente la classification des patientes NR et R selon leur profil d'expression. 85% des patientes étaient correctement classifiées. Ceci confirme que l'analyse de l'expression de ces 57 gènes est un bon outil pour discriminer les patientes ayant un fort risque de rechute des patientes ayant un faible risque de rechute.

Validation par RT-PCR quantitative Afin de confirmer ces résultats à l'aide d'une autre technique de biologie moléculaire, l'expression des ARNm des gènes de SEQ ID 1 ; 5 ; 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 16 ; 18 ; 22 ; 24 ; 28 ; 35 ; 41 ; 45 ; 48 ; 53 ; 55 ; 58 ; 66 a également été analysée par RT-PCR quantitative. Brièvement, une réaction de transcription inverse (RT) a été réalisée dans un volume final de 20 μl. L'ARN total (1 μg) a été mélangé avec 1 μl de polyT à 50 μM et 1 μl de dNTP mix (ThermoScript™ RT-PCR system, Invitrogen), puis incubé 5 min à 65°C. Après refroidissement dans la glace, la solution a été mélangée avec 4 μl de 5x cDNA synthesis buffer, 1 μl de RNAse out (40 U/μl), 1 μl d'eau traitée au DEPC et 1 μl de Thermoscript RT (15 U/μl), tous ces produits étant issus du ThermoScript™ RT-PCR System (Invitrogcn). La transcription inverse a été effectuée pendant 1 h à 50°C puis stoppée par une incubation de 5 min à 85°C. Pour finir, chaque solution de cDNA a été diluée au 1/10 dans de l'eau DEPC. Pour chacun des gènes d'intérêt, un standard a été préparé par une amplification PCR (polymerase chain reaction) conduite jusqu'à saturation. Les amplicons obtenus ont été purifiés (PCR purification kit, Qiagen Ltd) et la présence d'un amplicon unique a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose et marquage au bromure d'éthidium. Les amorces nécessaires a l'amplification des gènes cibles de SEQ D N° 24 ; 41 ; 53 ; 55, ainsi que les amores nécessaires à l'amplification du gène «de ménage » Peptidylpropyl isomerase B (PPIB) codant pour la cyclophilin B ont été obtenus chez Search-LC (Heidelberg, Allemagne). Les amplicons amplifiés étaient les suivants : • gène cible de SEQ ID N°24: séquence 220-544 du gène de référence NM_152758 • gène cible de SEQ ID N°41 : séquence 998- 1199 du gène de référence XM_496907 • gène cible de SEQ ID N°53: séquence 488-707 du gène de référence NM_014015 • gène cible de SEQ ID N°55: séquence 103-262 du gène de référence AF060511 • gène de ménage PPIB : séquence 105-338 du gène de référence M60857 Pour les autres gènes cibles, les amorces utilisées sont présentées dans le tableau 3 ci dessous.

Tableau 3 - liste des amorces utilisées pour analyser l'expression des gènes cibles par PCR quantitative.

Analyse de l'expression des ARNm par PCR en temps réel

Les ARNm des gènes cibles ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel. Les réactions PCR ont été effectuées à l'aide du Fast-Start™ DNA Mastcr SYBR Green I rcal- time PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Chaque PCR a été effectuée dans un volume final de 20 μl contenant 1 μl de LC-Fast Start Reaction Mix SYBR Green I, 1 μl de LC-Fast Start DNA Master SYBR Green I/Enzymc (incluant la Taq DNA polymerase, le tampon de réaction et un mélange de deoxynucleotides triphosphate), du MgCfc (3 mM concentration finale), les amorces sens et anti-sens (0.5 μM concentration finale), et 10 μl de solution de cDNA. Après une étape de dénaturation de 10 min à 95°C, l'amplification a été effectuée à l'aide de 40 cycles d'un protocole de "touch-down" PCR (10 s à 95°C, 10 s d'hybridation à 68-58°C, suivi d'une extension de 16 s à 72°C). A la fin de chaque cycle, la fluorescence émise par le SYBR Green a été mesurée.

Pour confirmer la spécificité de l'amplification, les produits PCR ont systématiquement fait l'objet d'une analyse de courbe de fusion (LightCycler™ - Roche). Pour cela, les produits PCR ont été traités par une température croissante de 58 à 98°C avec une augmentation de 0,l°C/s. Pour chaque produit PCR, un seul pic a été obtenu lors de l'analyse de la courbe, caractérisé par une température de fusion spécifique. La quantité d'ARNm cible relative à la quantité d'ARNm du gène de ménage PPIB a été analysée par la technique de quantification relative avec le LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). La "Second Derivative Maximum Method" du logiciel LightCycler™ (Roche) a été utilisée pour déterminer automatiquement le Crossing Point (Cp) pour chaque échantillon. La valeur du Cp a été définie comme le nombre de cycles pour lequel la fluorescence était significativement différente du bruit de fond.

Cinq dilutions en séries au 1/10 ont été réalisées en quadruplicatc avec chaque standard afin de générer une courbe d'étalonnage exprimant le Cp en fonction du logarithme du nombre de copies. Les dilutions de standard ont été optimisées afin que la courbe d'étalonnage couvre le niveau d'expression attendu pour le gène cible et le gène de ménage. Les courbes standards relatives décrivant l'efficacité de PCR pour le gène cible et le gène de ménage ont été générées et utilisées pour réaliser une quantification avec le LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). La corrélation des résultats obtenus d'une part avec la biopuce et d'autre part avec la technique en RT-PCR quantitative a été établie grâce au test de corrélation de Pearson. Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci dessous.

Ces résultats montraient une bonne corrélation (représentée par une étoile * lorsque p < 0,05) des résultats obtenus sur puce et par RT PCR, puisque plus de 70 % des gènes testés étaient corrélés entre les deux techniques confirmant la pertinence des gènes sélectionnés. Les inventeurs ont également mis en évidence un panel de gènes plus restreint, permettant également de discriminer les patients R et NR.

Tableau 5 - liste des 10 gènes exprimés différentiellement dans les cancers du sein des patients R et NR

Les résultats sont présentés dans la figure 2, qui présente la classification des patientes NR et R selon leur profil d'expression. 92,5 % des patientes étaient correctement classifiées. Ceci confirme que l'analyse de l'expression de ces 10 gènes est un bon outil pour discriminer les patientes ayant un fort risque de rechute des patientes ayant un faible risque de rechute.

L'utilisation de panel de gènes restreint est particulièrement adapté pour obtenir un outil de pronostic. En effet, l'analyse de l'expression d'une dizaine de gènes re nécessite pas la fabrication à façon de puce à ADN, et peut être mise en œuvre directement par des techniques de PCR ou de NASBA, ou puce de basse densité, ce qui présente un atout économique important et une mise en œuvre simplifiée.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour le pronostic du cancer du sein chez un patient atteint d'un cancer du sein caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 68, c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles.

2. Procédé pour le pronostic du cancer du sein selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon tissulaire.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques.

4. « "Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le au moins un réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation

5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la au moins une sonde d'hybridation est immobilisée sur un support.

6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le support est une biopuce.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 57 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 57 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 57 desdits gènes cibles.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 10 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 10 desdits gènes cibles

9. Support comprenant au moins une sonde d'hybridation spécifique d'au moins un gène cible présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 68.

10. Support comprenant au moins 68 sondes d'hybridation choisis parmi les sondes spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 68.

11. Support comprenant au moins 57 sondes d'hybridation choisis parmi les sondes spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 57 .

12. Support comprenant au moins 10 sondes d'hybridation choisis parmi les sondes spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55.

13. Utilisation d'un support selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 pour le pronostic d'un cancer du sein.

14. Kit de pronostic d'un cancer du sein comprenant un support selon l'une quelconque des revendications 9 à 12.