CN1928119B - β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测β-内酰胺酶SHV基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。本发明还公开了所述芯片用于检测β-内酰胺酶SHV基因变异的方法。本发明的检测芯片能同时进行多种β-内酰胺酶SHV基因变异的检测，并能及早检出细菌的耐药性以及耐药种类，指导临床合理用药，为控制抗生素滥用提供有效的检测手段。

Description

β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片及其应用
技术领域
本发明涉及细菌耐药基因检测芯片，尤其涉及一种β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片及其应用。
背景技术
自1929年青霉素发明以来，抗生素在防治细菌性疾病方面，抗生素发挥了巨大的作用，极大地提高了人们的生活质量，延长了人们的寿命。但是，由于抗生素的长期大量使用，特别是不规范地滥用抗生素，导致了日益严重的细菌耐药性问题。细菌耐药最主要的机制是产生灭活酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等。β-内酰胺酶能够与β-内酰胺环的羧基共价结合，使其酰胺键水解，灭活青霉素和/或头孢菌素。β-内酰胺酶不仅与高发病率和高死亡率相关，而且治疗产酶菌株感染的可用药物很少，治疗用药的选择与所产的酶的种类有关。已经有产β-内酰胺酶菌株同时耐SMZ、氨基糖苷类、氟喹诺酮的报道。随着引入临床的β-内酰胺类抗生素的数量和种类不断增多，困扰医院的病原菌已经由致病菌转变为平常对宿主不致病的常居菌，其中约60％～70％为革兰氏阴性菌，尤以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌等最常见。β-内酰胺酶种类较为复杂，到目前已发现有三百多种。另一方面，由于超广谱β-内酰胺类抗生素的大量使用，出现了耐受超广谱β-内酰胺类抗生素的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。在过去的几十年中，ESBLs已成为全球急待解决的问题之一。
对β-内酰胺酶的分类方法有多种，目前主要按照分子生物学的分类，根据末端氨基酸序列及编码基因的位点可将β-内酰胺酶分成A、B、C和D四类：SHV属于A类，金属酶属于B类，AmpC酶属于C类，OXA型酶是D类(Paterson DL，Ko WC，VonGottberg A，et al.International prospective study of Klebsiella pneumoniaebacteremia：implications of extended-spectrum beta-lactamase production innosocomial Infections.Ann Intern Med.2004Jan6；140(1)：I143)；其中最有影响的酶是头孢菌素酶、耐酶抑制剂的TEM型和SHV型酶和金属酶。现在已经发现上海市瑞金医院出现了VEB-1、PER-1、CTX-M-3、SHV-12等ESBLs，DHA-1、CMY-4、ACT-1等AmpC酶、VIM-2金属酶和OXA-10、OXA-23D类酶的踪影。
β-内酰胺酶广泛存在于各种细菌中，至今已鉴定出了64种β-内酰胺酶SHV变异体(http://www.lahey.org/studies/)。这些SHV变异体是SHV基因突变所致。已公布的SHV基因突变目前至少有49个。其中L35Q、G238S和E240K这三个突变最为常见，并于绝大多数的SHV型ESBLs相关。突变G238S通常介导非ESBL型SHV转换成ESBL，而突变E240K进一步提高ESBL的酶活性，扩大β-内酰胺类抗生素耐药谱(Hammond DS，Schooneveldt JS，Nimmo GR，Huygens F，Giffard PM.bla(SHV)Genesin Klebsiella pneumoniae：different allele distributions are associated withdifferent promoters within individual isolates.Antimicrob Agents Chemother.2005，49：256-263.)。SHV-10突变自SHV-5，具有耐受抑制剂的表型。在我国流行的ESBL型SHV主要有SHV-2、SHV-5、SHV-12和SHV-27(肖庆忠，苏丹，虹，江洁华，钟南山。广州地区3500株革兰阴性杆菌TEM和shv型超广谱β内酰胺酶基因分型研究。中华检验医学杂志，2005，28：1010-1014；Yu WL，Cheng KC，Chi CJ，Chen HE，Chuang YC，Wu LT.Characterisation and molecular epidemiology ofextended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacter cloacae isolatedfrom a district teaching hospital in Taiwan.Clin Microbiol Infect.2006，12：579-82.)。其中产SHV-12耐药菌株首先在瑞士报道，近年来的研究发现，此耐药菌株在欧亚大陆有较高的流行性。SHV主要见于肺炎克雷伯菌，也见于不动杆菌属和假单胞菌属。ESBLs型SHV流行情况随时间和地域范围而不同，其分布很不一致。
ESBLs流行的严重程度与抗生素使用情况和监测、控制ESBLs的能力和力度有关，如控制的较好的日本大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs的比率就很低，分别<0.1％和<0.3％。早期的ESBLs仅能优先水解头孢他啶或头孢噻肟中的一种，但一些新的ESBLs的水解底物更宽，能同时高效水解上述两种抗生素，如SHV-7。虽然许多三代头孢菌素体外药敏试验表现为敏感，但临床无效。因此加强对ESBLs的监测和控制刻不容缓(Rasusen，B.A.，and K.Bush.Carbapenem-hydrolyzing β-lactamases.Antimicrob.Agents Chemother.1997.41：223-232)。
目前临床医生在处理细菌感染时一般有三种方法：第一种是凭借临床经验直接选用抗生素，并在无效后进行调整用药；第二种是在经验用药前进行细菌涂片及革兰氏染色；第三种处理方法较正规，在用药前进行细菌培养、分离病原体并做常规药敏实验，并在必要时进行血清杀菌实验。
在我国大多数的抗生素是沿用第一种方法给药的，但是随着新抗生素的使用和新的耐药株的不断出现，仅凭经验选用抗生素的方法的可行性和科学性已经日益降低，若经验用药不对后再选用方法三则既耽误病人得到及时合理的治疗，使病情加重，又浪费人力物力；方法二只能将抗生素粗分为β-内酰胺和非β-内酰胺给药，不能判断病原菌是否具有耐药性，且不适用于多重感染；方法三是目前所能采取的最好的给药方式，但由于该方法费时(最快尚需3天)费力，操作程序繁琐，实验结果受多种不定因素影响而存在很大误差，常需重复验证，往往也不能阐明耐药产生的机制，且所作的药敏实验受实验用抗生素的限制，在首次诊断时不能及时提供合理的抗生素使用方案，常常只能对已使用抗生素的正误作追溯性评估，并为调整抗生素提供方案。另外第三种方法本身也存缺陷：有些条件致病菌难于培养出来，对于多重感染也常漏检。针对这一缺点，科研人员研究开发了多种基因水平的检测技术。
目前国内各医院临床常用β-内酰胺酶的检测方法有单纸片法、双纸片协同法、圆环估计法、小片扩散法、琼脂稀释法和抑制剂增强扩散法等等，这些方法在检出正确率、可操作度和检测费用上都有各自的缺陷，并且这些方法大都停留在传统的微生物表型的检测上，未能直接鉴定细菌的染色体DNA或质粒DNA中是否携带有编码β-内酰胺酶的基因，而早期并准确检测出不同类型β-内酰胺酶的基因是对临床合理使用抗生素及防止医院感染的流行或更大范围的流行有重要意义。为此，寻求一种高通量的基因筛检方法尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片，能及早检测细菌是否存在耐药，并确定已知耐药基因的具体类型。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种应用上述芯片检测β-内酰胺酶SHV基因变异的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测细菌SHV基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。
本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度是没有限制的，只要能完成特异性杂交的功能，与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。如果所述探针中可能还有一定程度的错配碱基，则所述探针可以加大长度来抵消错配碱基的不利影响，以提高杂交效率。
本发明检测芯片的探针为DNA，包括：(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：180所示序列；(b)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：180所示序列中每条序列的互补链；(c)与SEQ IDNO：1～SEQID NO：180所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
优选的，本发明检测芯片的探针选自SEQ ID NO：1～SEQID NO：180所示序列。
所述探针序列可包含1～10个错配碱基，较佳地，可包含1～5个错配碱基，更佳地，可包含1～2个错配碱基。
本发明检测芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。
本发明检测芯片可使用任何适当的阴性对照探针，所述阴性对照探针最好能与阳性对照探针有1～5个碱基对的错配。
本发明检测芯片可使用任何合适的阳性对照探针，所述阳性对照探针最好能与目的核苷酸序列、以目的核苷酸序列为模板扩增产生的核苷酸序列或人工合成的核苷酸序列的一部分互补。
本发明检测芯片可使用任何适当的杂交对照探针，所述杂交对照探针最好与人工合成的跟目的基因无关的核苷酸序列互补，也可与一段人工合成的经标记的序列互补或与一段人工合成的经标记的序列有1～10碱基对的错配。
本发明检测芯片可使用任何适当的固定化对照探针，它是芯片表面化学修饰、点样和固定化过程的内部对照，它不与任何核酸序列杂交。固定化对照探针可一端进行化学修饰，另一端带有可检测的标记。
本发明检测芯片所用到的芯片可包含任何一条、部分或全部阳性对照探针、阴性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。这些对照探针可用任何排布方式固定于芯片上，如：可被排布在芯片的四角、中心等进行有规律的排布或随机排布。
所述探针可用多种方法固定于载体上，如点样法(USA Patent No.5288514，USAPatent No.5556752)、光介导法(USA Patent No.5143854，5384261和5561071)、磁珠法(USA Patent No.5541061)等。所述探针可以通过化学或物理的方法，固定于载体上，如通过离子键、共价化合或其它已知的力吸附在载体上，如可用紫外交联仪将所述探针固定于载体上。
所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。
所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2一轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。
所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH2修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH2修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。
所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记选自：荧光素标记、酶标记、放射性元素标记、发光标记、化学标记和荧光共振能量转移标记。
在本发明的另一方面，提供了一种应用上述芯片检测β-内酰胺酶SHV基因变异的方法，包括如下步骤：
(1)在固相载体表面点载SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：180所示序列的探针；
(2)抽提待测样品核酸；
(3)制备待测β-内酰胺酶SHV基因的目的核苷酸序列；
(4)标记步骤(3)的目的核苷酸序列；
(5)在适于与步骤(1)所述的点载在固相载体上的探针进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间；
(6)检测杂交反应的结果。
在本发明的另一方面，还提供了一种应用上述芯片检测β-内酰胺酶SHV基因变异的方法，包括如下步骤：
(1)标记SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：180所示序列的探针；
(2)抽提待测样品核酸；
(3)制备待测β-内酰胺酶SHV基因的目的核苷酸序列；
(4)在固相载体表面点载步骤(3)所述的目的核苷酸序列；
(5)在适于与步骤(4)所述的点载在固相载体上的目的核苷酸序列进行杂交的条件下，加入经标记的探针，并使其反应足够时间；
(6)检测杂交反应的结果。
样本的核酸能用任何合适的方法从样品中被抽提出来。例如，样本核酸能用磁珠从样品中抽提出来，很多生物公司能提供核酸抽提的试剂盒，如Qiagen，Invitron等。也可直接用靶样本中的含核酸的细胞进行扩增。
所述目的核苷酸序列的制备可包括扩增的步骤，扩增得到的单链或双链的DNA或RNA可含有荧光或生物素标记，标记的DNA或RNA可不经纯化直接用于杂交。与本发明中所述芯片杂交的优选靶核苷酸分子是单链核酸分子，双链核酸分子经过变性等处理后也与本发明所述芯片杂交。
目的核苷酸序列可使用任何适当的扩增方法进行富集，如：聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，连接酶链反应(ligase chainreaction，LCR)，滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，链置换扩增(stranddisplacement amplification，SDA)和转录介导的扩增(transcription medicatedamplification，TMA)等。TMA方法最好使用T7启动子。
单链DNA可使用不对称PCR获得。不对称PCR中两条引物可以是任何适当的比例，比如从1:3到1:200。不对称PCR中两条引物可以有相同的或者不同的Tm值，例如两引物的Tm值的差异可以是1℃到20℃。不对称PCR也可以使用三条引物，两条有相同或相近的Tm，另一条相差范围1℃到20℃。引物可以是直链或带有发卡结构。可使用单一或组合的退火温度。例如：不同的退火温度可以相差1℃到20℃。有较低的Tm值的引物可以用于双链的扩增，另一条有较高的Tm值的引物可以在有一定双链后扩增单链DNA。通过这种PCR过程产生的单链目的核苷酸可以不经过纯化直接用于杂交。
单链RNA也可以通过TMA方法得到。含有一个T7启动子的引物使用RNA聚合酶用于扩增。用单链DNA或RNA杂交，避免了用双链所带来的PCR产物的纯化和变性以及杂交信号弱或丢失的问题。
只要用于杂交的目的核苷酸序列的长度足够以产生特异性杂交，所述目的核苷酸序列长度在上下游方向上并无限制。合适的目的核苷酸序列长度从30到200碱基对长度。杂交用的靶核苷酸序列过长或过短，会影响杂交效率，并使得杂交在探针上的靶核苷酸序列易于被洗脱下来，导致荧光信号过弱或丢失。较长的DNA片段，可用DNase I进行片段化处理，或者在反应体系中加入适当比例的脱氧尿嘧啶，然后PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，片段化DNA片段。至于RNA，处理方法较为简单，直接用高盐和高温处理即可。
在本发明的一个实施例中，目的核苷酸序列的制备采用PCR扩增方法。
所述探针和目的核苷酸序列之间的杂交可同源，也可非同源。
所述探针或目的核苷酸序列都适合用于标记。探针在合成引入标记，目的核苷酸序列可以在扩增中引入标记，或者扩增后用合适的方法引入标记。
合适的标记包括荧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素或有特殊结合配体的配基。
本发明方法的杂交可以在任何杂交液中进行，如含有SSPE和表面活性剂的杂交液。杂交液可以含有任何浓度的SSPE，例如1～10×SSPE。也可以使用任何适当的表面活性剂，如Triton-100，SDS，SLS(十二烷基肌氨酸钠)，CTAB(六烷基三甲基溴化铵)等。杂交液中也可有任何浓度的表面活性剂，如0.01～1％(w/w)。所述的杂交可在任何适当的温度下进行，如25℃～65℃，所述杂交时间为5分钟～18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。
所述杂交结果在检测前的洗涤可使用任何适当的洗涤液，该洗涤液可含有0～3％(w/w)的表面活性剂，洗涤可持续适当的时间，如1～30分钟。可以用室温的洗涤液进行洗涤，或预热后洗涤，如42℃。可用不同的洗涤液先后进行洗涤。
所述探针和目的核苷酸序列之间的杂交可以采用任何己???知的方法进行检测。根据标记的不同，可以选用合适的检测方法，例如荧光标记的探针或目的核苷酸序列可以用激光扫描仪或荧光仪检测，放射性元素标记的探针或目的核苷酸序列可以用放射自显影检测。
总体杂交特异性可以用任何适当的标准来确定，例如可按中国专利CN1566366A描述的方法来确定。
芯片的阳性信号可以用任何适当的标准来确定，例如可按中国专利CN1566366A描述的方法来确定，或以杂交信号大于平均背景噪音与3倍标准差之和的方法来确定。
本发明也可用于目的基因的拷贝数检测。结合于芯片探针上的目的核苷酸序列的数量能够被检测，并且与目的基因的拷贝数相关。根据含有已知拷贝数的对照基因的核苷酸序列的数量可以对目的基因的拷贝数进行定量。荧光能用光电倍增管CCD或激光扫描探测。
本发明的β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片及其应用，与传统检测方法相比，能同时进行多种β-内酰胺酶基因变异的检测，早期检出临床上常见细菌的耐药性以及耐药的种类，有效地提高抗生素使用的针对性，不仅避免了繁琐而费时的病原微生物培养，而且无需机体免疫应答反应，能及早诊断，待测样品用量小，且便于临床操作、灵敏度高。本发明的检测芯片能指导临床合理用药，并为控制日益严重的抗生素滥用提供有效的检测手段。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1中PCR扩增产物的电泳检测结果图；
图2是本发明实施例1中PCR产物片段化后的电泳检测结果图；
图3是本发明实施例1的检测芯片杂交结果图。
具体实施方式
实施例1反向杂交
1.基因芯片的制备
(1)探针溶解
每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10mM。将浓度为10mM的探针与浓度为200mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。
(2)点样
将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid100型号的点样仪，在湿度：65—75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样的格式为1×3，每个矩阵为8×18，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。
2.全长SHV基因扩增和标记
用引物SHV-F(5’-CTCAAGGATGTATTGTGGTTATGCGT-3’，SEQ ID NO：181)和SHV-R(5’-GGGTTAGCGTTGCCAGTGCTCGAT-3’，SEQ ID NO：182)扩增全长SHV基因。PCR扩增用100μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dATP、dGTP和dTTP；0.15mM dCTP和Cy3-dCTP；10mM Tris-HCl；50mM KCl；2mM MgCl2；20％Q solution(Qiagen)；0.2μM SHV-F和SHV-R；100ng基因组DNA；3U Ex Taq酶(Takara)。循环参数：94℃变性5min；94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测扩增结果，如图1所示，PCR产物的大小为884bp。
3.PCR产物纯化和片段化
PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。纯化的PCR经测定浓度后，用DNase I进行片段化。30μl片段化的反应体系包括：1×DNase I缓冲液，200ng/μl纯化PCR产物，DNase I(0.0012U/μg)。反应条件为37℃温浴5min，然后95℃15min。片段化后的产物跑1.5％琼脂糖凝胶，电泳检测结果如图2所示。
4.杂交、洗涤和结果检测
荧光标记的PCR产物95℃变性10min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应体系包括：15μl荧光素标记的PCR产物，1.2μl20×SSPE，0.2μl1％Triton，0.9μl10×Denhandts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH2O。
反应条件为50℃温浴2小时，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH2O洗涤10秒。离心甩干。
甩干的芯片用GenePix4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图3所示，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以得到目的基因的基因型。
实施例2正向杂交
1.全长SHV基因扩增和芯片制备
用引物SHV-F(5’-CTCAAGGATGTATTGTGGTTATGCGT-3’，SEQ ID NO：181)和SHV-R(5’-GGGTTAGCGTTGCCAGTGCTCGAT-3’，SEQ ID NO：182)扩增全长SHV基因。PCR扩增用100μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP，10mM Tris-HCl，50mM KCl，2mM MgCl2，20％Q solution(Qiagen)，0.01μM SHV-F，0.2μM SHV-R，100ng基因组DNA，3U Ex Taq酶(Takara)。循环参数：94℃变性5min；94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。将纯化的PCR产物浓度调整至400ng/μlmM。
将浓度为400ng/μl的探针与100％的DMSO于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心。将25mM的PCR产物通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid100型号的点样仪，在湿度：65—75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样完毕放置半小时后，将芯片放于饱和食盐水盒中，37℃水化过夜，次日取出，600mJ交联，交联完毕之芯片即可使用。
2.芯片杂交
杂交反应体系包括：2nM荧光标记的寡核苷酸探针，1.2μl20×SSPE，0.2μl1％Triton，0.9μl10×Denhandts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH2O。反应条件为50℃温浴2小时，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH2O洗涤10秒。洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。
序列表
<110>上海生物芯片有限公司
<120>β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片及其应用
<130>NP-10785
<160>182
<170>PatentIn version3.3
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<223>引物
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Claims (4)

1.一种β-内酰胺酶SHV基因变异检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测β-内酰胺酶SHV基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交，其特征在于，所述探针为DNA，包括：
(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：180所示序列；或
(b)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：180所示序列中每条序列的互补链。
2.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述探针选自：(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：180所示序列。
3.如权利要求1或2所述的检测芯片，其特征在于，所述探针设有连接臂，且所述探针被修饰。
4.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
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