CN105420383B - 一种海洋细菌耐药基因检测芯片及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明目的是提供一种海洋细菌耐药基因检测芯片，可对海水环境细菌中针对5大类抗生素的32种耐药基因进行高通量快速检测。本发明所提供的检测芯片，是在芯片载体上固定有用于检测海洋细菌耐药基因的探针；所述的耐药基因包含有四环素类耐药基因、磺胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、β‑内酰胺类耐药基因、氯霉素类耐药基因。本发明的芯片可用于海水养殖环境细菌耐药谱的快速检测和筛查，也能快速准确地检测出海水养殖动物病原菌携带的相关抗生素耐药基因。

Description

一种海洋细菌耐药基因检测芯片及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种海洋细菌耐药基因检测芯片及其应用。
背景技术
中国是世界上最大的海产品生产和消费国，每年的养殖海产产量达155万吨，占全球养殖产量的80％。但随着海水养殖产业的发展，海水养殖动物经常遭受到一些传染病的危害，其中细菌是引起养殖动物病害发生的主要因素之一。从抗生素应用开始，人们倾向于利用抗生素类药物预防或治疗细菌性传染病，但有研究证明由于大部分的抗生素很难为动物吸收利用，大约有30-75％的抗生素以母体化合物形式随粪尿排出体外。因此直接加到水体用于治疗或预防病害的、未被水产养殖生物吸收的，和随粪便排泄的抗生素可能聚积于水体及底泥沉积物中造成污染。另外，近海养殖环境靠近陆地，工业、城市生活废水中的残留抗生素也直接流入养殖水体或经地下水间接污染养殖水域。在陆源污染和近海水产养殖大量施用抗生素的双重压力下，近海水环境容载了目前人类发现的所有抗生素。由于抗生素的广泛和不合理使用，近海海洋环境中的耐药菌变得司空见惯，多重耐药菌也不断被发现。这些抗生素耐药菌通常携带有一种或多种抗生素耐药基因，耐药基因也可以从非致病性细菌转移到病原菌中或随着食物链的传递转移到人或其他动物体内。作为一个生态和环境问题，这些海水养殖环境中的耐药菌及其携带的耐药基因构成的抗生素耐药基因库，不仅会直接对海水养殖动物和人类生命健康造成危害，而且对海洋生态环境平衡也存在威胁。环境中耐药菌作为潜在的耐药基因库也在近年来被人们加以重视和研究。
在目前发现的抗生素中，四环素类、磺胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类和氟苯尼考类抗生素药物均被水产为养殖允许使用且使用量较多的抗生素药物，海水环境中也存在相当数量的针对这5类抗生素药物的耐药菌。这些耐药菌通常携带有一种或多种具有相同或不同耐药机制的耐药基因，例如介导药物靶位点改变机制基因dfrA1、dfrA12、sul1、sul2，介导抗生素外排机制基因cmle1、cmle3、tetA、tetB、tetC、tetG，介导药物靶位点保护机制基因tetM、tetS、qnrA、qnrS，介导药物活性位点失活的耐药基因cata1、cata2、bla-TEM、bla-SHV、bla-VIM等。目前，研究者已开始针对这些问题开展了一系列的研究以监测环境中耐药菌和耐药基因、揭示可以介导耐药基因转移的可移动片段的分子结构及功能机制。但是这其中的大部分研究只关注感染人类的耐药性病原菌及其耐药基因，对于养殖业中抗生素耐药菌及耐药基因的研究大多侧重于畜禽类及淡水水产养殖环境中针对于一种或多种抗生素药物的耐药基因的定性和定量检出，而针对于海水水产养殖环境中耐药菌及耐药基因的研究较少。由于海洋水产养殖环境中细菌种群结构以及养殖过程中药物使用习惯有别于畜禽类及淡水水产养殖，相关研究并不能反映海水养殖环境耐药基因分布状况。目前对海水养殖区抗性菌及耐药基因的研究方面，Jun等在韩国海水养殖区检测到多种tet基因，Dalsgaard等在泰国海水养殖区检测到氨基糖苷、β-内酰胺磺胺类及四环素类耐药基因。但在中国北方部分海域养殖区仅有检测到cat I,II,III,IV基因和tetA,B,D,E,M基因的报道，如山东胶州湾区域分离菌中定性检测到tet、cat、floR基因，而其他海水养殖区采样点并无其他研究。此外相关研究中细菌耐药性检测主要使用药敏试验，其优点在于方便、简捷、易判定，但只能对少量样品进行一对一检测分析。由于环境中可分离培养细菌仅占环境细菌的1-5％左右，药敏实验无法反映出细菌耐药的来源和传播机制。对于环境中抗生素耐药基因检测的方法还有质粒图谱、PCR-单链构象多态性、质粒指纹图谱、PCR及PCR-限制性片段长度多态性、核酸探针检测、DNA序列测定等，这些研究方法，弥补了药敏试验的不足，但这些技术往往只限制于单一耐药基因的的检测，要对细菌众多的耐药基因进行检测需要做大量的工作，甚至难以实现。
发明内容
本发明目的是提供一种海洋细菌耐药基因检测芯片，可对海水环境细菌中针对5大类抗生素的32种耐药基因进行高通量快速检测，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的检测芯片，其特征在于，是在芯片载体上固定有用于检测海洋细菌耐药基因的探针；所述的耐药基因包含有四环素类耐药基因、磺胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、β-内酰胺类耐药基因、氯霉素类耐药基因；
其中用于检测氨基糖苷类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1-6中的任一种或几种；
用于检测四环素类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7-14中的任一种或几种；
用于检测磺胺类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:15-18中的任一种或几种；
用于检测β-内酰胺类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:19-25中的任一种或几种；
用于检测氯霉素类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:26-32中的任一种或几种；
上述探针的5′末端进行了氨基修饰；
作为优选，上述的芯片上还固定有空白和阳性对照，其中阳性对照为5′端进行cy3标记的TTGGATTAGGTATAACAAAAGGACCAGCGGATTCTCCACCTATATCTATA，
上述的芯片载体为醛基芯片载体。
本发明还提供用于扩增核苷酸片段的引物对，引物对扩增的产物用上述芯片进行检测；其中引物对的信息如下：
表1：引物名称、引物序列、扩增片段大小、褪火温度的信息
本发明的芯片用于检测携带有抗生素耐药基因的海水细菌；其方法包括如下的步骤：
1)利用引物对待测样本DNA中的耐药基因进行PCR扩增；
2)将步骤1)的产物进行荧光标记反应；
3)将步骤2)的产物与海洋细菌耐药基因检测芯片进行杂交反应，确定样本所含的耐药基因。
本发明的海洋细菌耐药基因检测芯片是在调查了解海水养殖区抗生素耐药菌耐药类型和耐药基因分布及丰度信息的基础上设计的，涵盖了海水养殖区常见针对大类抗生素的32种耐药基因，且检测速度快，灵敏度和特异性高，该发明对海水养殖环境细菌包括病原菌耐药谱和耐药基因携带情况的快速检测具有显著的实用价值，也为了解和防治海洋环境中耐药细菌提供科学理论依据。
附图说明
图1：芯片微阵列a上探针与检测水样标记样本杂交结果扫描图；
图2：芯片微阵列b上探针与检测水样标记样本杂交结果扫描图；
图3：芯片微阵列a上探针与水样标记样本杂交结果扫描图；
图4：芯片微阵列b上探针与水样标记样本杂交结果扫描图。
具体实施方式
申请人筛选得到常见的耐药及相关基因66个，针对于每个耐药基因的核酸序列保守区设计特异性引物2-3对。用PCR方法对从近海养殖区采集的35个水样进行常见66种耐药基因的扩增检测。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后的PCR产物制备单克隆转化菌后送生物公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)测序。测序结果表明有32种耐药基因可从环境水样中获得扩增，另外34种耐药基因未发现存在于环境海水样中。32种获得正确基因片段的耐药基因其基因名称、引物名称、上下游引物序列、扩增片段大小、褪火温度如表1所示:
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1.探针的设计和筛选
四环素类、磺胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类和氟苯尼考类抗生素药物均为被水产养殖允许使用且使用量较多的抗生素药物，针对这5类抗生素药物的耐药菌通常携带有一种或多种具有相同或不同耐药机制的耐药基因。针对于常见的耐药及相关基因的核酸序列保守区设计特异性引物2-3对。用PCR方法对从近海养殖区采集的35个水样进行常见66种耐药基因的扩增检测。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后的PCR产物制备单克隆转化菌后送生物公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)测序。测序结果表明有32种耐药基因可从环境水样中获得扩增，另外34种耐药基因未发现存在于环境海水样中。
1)探针设计：针对32种获得正确基因片段的耐药基因，使用AlleleID 7.0软件设计探针序列，探针要求设计在高可变区、长度在30-50mer左右、解链温度(Tm)在60℃左右、GC含量为40％-60％、在5’端使用氨基修饰。使用NCBI在线BLAST工具检测所设计探针的特异性，以避免非特异性杂交。引物和探针均交由上海生工生物工程股份有限公司合成。
2)探针点制：商业合成的寡核苷酸探针稀释至适当浓度：用1×TE缓冲液将合成的探针稀释至终浓度为100ng/μL，将用1×TE缓冲液稀释的终浓度为100ng/μL的探针与点样液等体积混合，使其终浓度达到50ng/μL，点制于醛基芯片载体上。点样环境条件为室温20℃，湿度60％-70％。在点制之后需要在37℃湿盒内水合杂交12-18小时。水合后使用双蒸水清洗3次，每次2分钟，洗脱去未连接的、连接不紧密的探针。使用0.2％NaBH4封闭：使芯片完全浸没，静置5分钟后，150rpm震荡5分钟，再静置5分钟；最后用双蒸水清洗3次，每次2分钟。离心去除芯片表面水迹，离心参数：2000rpm，2分钟。
3)探针的筛选：取每个探针对应的PCR产物用PCR产物纯化试剂盒将产物纯化后进行荧光标记。将杂交液与荧光标记产物按照1:1的比例混合，加入10μM阳性质控1μL，95℃变性3min，置于冰上冷激3min。在筛选芯片的点样区加入杂交混合液，置于60℃湿盒中杂交2h。使用洗液Ⅰ(1×SSC、0.2％SDS)、Ⅱ(0.2×SSC)、Ⅲ(0.1×SSC)各清洗15min，离心甩干。使用GenePix Pro 4000B微阵列扫描仪进行扫描，扫描波长为532nm，饱和荧光信号值为65535。使用GenePix Pro 6.0软件对扫描图像进行分析，检测阵列中各点的荧光信号强度和信噪比(Signal noise rate,SNR)。
根据各探针的荧光信号强度和信噪比，筛选获得了32个探针序列，这32个探针SNR≥1.5，且专一性探针和目的靶基因杂交点杂交斑点清晰，杂交斑点背景干净(图1，图2)。各探针样点信号强度中位值≥1500，靶基因与非目的探针杂交点SNR值均小于0.1，且信号采集点信号强度中位值≤200(表3)，目的靶基因和特异性探针杂交点以及目的靶基因非特异性杂交点之间无论SNR值还是信号强度中位值之间都有比较大的差异。
表2：探针和靶基因杂交特异性判读结果表
实施例2.海洋细菌耐药基因检测芯片的构建
选择实施例1中筛选出来的32种探针进行海洋细菌耐药基因检测芯片的构建。
1)商业合成的寡核苷酸探针稀释至适当浓度：用1×TE缓冲液将合成的探针稀释至终浓度为100ng/μL，将用1×TE缓冲液稀释的终浓度为100ng/μL的探针与点样液等体积混合，使其终浓度达到50ng/μL，点制于醛基芯片载体上。点样环境条件为室温20℃，湿度60％-70％。
(2)探针与芯片水合交联：在点制之后需要在37℃湿盒内水合杂交12-18小时。
(3)水合后芯片处理：使用双蒸水清洗3次，每次2分钟，洗脱去未连接的、连接不紧密的探针。使用0.2％NaBH4封闭：使芯片完全浸没，静置5分钟后，150rpm震荡5分钟，再静置5分钟；最后用双蒸水清洗3次，每次2分钟。离心去除芯片表面水迹，离心参数：2000rpm，2分钟。4℃避光保存备用。
表3：芯片探针阵列对应的靶标耐药基因(阵列a，阵列b)
阵列a；每个阵列10行11列，每行2种基因样点，每种样点5个重复，最后一列为阳性质控点。
阵列b；每个阵列10行11列，每行2种基因样点，每种样点5个重复，最后一列为阳性质控点。
实施例3：使用海洋细菌耐药基因检测芯片检测海参池水环境中耐药基因
1)养殖环境水样
A使用无菌处理的容器取待测水样1L，低温避光，尽快运输到实验室。
B使用灭菌的0.22μm微孔滤膜过滤水样，过滤后的滤膜用铝箔包好后放置于-80℃储存。
2)模板DNA制备
提取滤膜上总菌宏基因组DNA作为PCR模板(可采用水体细菌基因组试剂盒E.Z.N.A.D5525-01处理滤膜，按操作步骤提取水样细菌全基因组DNA)使用琼脂糖凝胶电泳检测提取情况，使用分光光度计检测提取样品DNA浓度。
3)PCR反应体系
注：也可以将反应液和ddH2O水按照样品数量配合成混合液(Mix)后再分别加到PCR管中。
4)PCR反应条件
①PCR反应程序如下：
程序结束后，将离心管取出，按照模板将多种离心管中的反应液合并在一起。用PCR产物纯化试剂盒将产物纯化。
5)荧光标记PCR产物
①取各模板纯化的PCR产物5μL于无菌的0.2mL离心管中，作为模板；
②向每个样品管加入100μM Cy3标记的随机引物3μL无菌水11μL，瞬时离心；
③将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性5min后立即放置冰上3min；
④冷却后再在PCR管中加入5×klneow buffer 2.5μL，klneow酶1μL，dNTP 2.5μL.震荡混匀，瞬时离心。
⑤将离心后的样品管放入PCR仪设37℃1h，之后70℃10min，程序结束后，将样品置于冰上，然后进行下一步芯片杂交。
6)杂交
①配制杂交体系
将杂交液在50℃融化，取15μL杂交液和15μL标记产物等比例混合混匀离心，95℃变性3min，立即放置冰上，备用。
②杂交
A打开芯片杂交盒，将杂交盒平放桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约100μL无菌水，以防止杂交过程中杂交液大量挥发。
B将芯片正面朝上(标签朝上)放入杂交盒内两个定位销之间。
放上芯片盖片(有凸台的一面朝向芯片)，上端先接触芯片，再缓缓盖下。
C样品管瞬时离心，用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入30μL变性后的杂交样品，样品会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凹台和芯片表面之间形成一道液膜。(注意：不要震动盖片或芯片，以免破坏液膜。)
D将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中。扣上盖板后，分别将两个金属夹卡进两侧。(注意：动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域；金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性)
E将杂交盒放入水浴锅，于60-65℃杂交2h
③芯片清洗
预先于42℃预热三种洗脱液，使用洗脱液Ⅰ(1×SSC、0.2％SDS)、Ⅱ(0.2×SSC)、Ⅲ(0.1×SSC)各清洗芯片10min，离心甩干。洗脱后的芯片在避光、密封、室温条件下可保存较长时间。
④扫描芯片
清洗后用微阵列扫描仪检测，设置扫描波长为532nm，饱和荧光信号值为65535。(参考芯片分析通用标准，选取样点总信号强度与样点背景总信号强度的比值(信噪比,SNP)来表示每个样点的杂交结果，SNP≥1.5为基因阳性判断标准，并结合信号强度中位值来比较各输出数据之间关系。)根据芯片扫描结果，数据输出结果见表5，从表4微阵列中查找出探针对应的靶标耐药基因，根据数据输出结果判定SNP≥1.5的耐药基因有aph33ia、ant2ia、tetM、dfra1、dfra15、bla-OXA1、bla-OXA10、bla-CTX、tetB、tetC、tetS、sul1、sul2、cata1、cmle1共15种，判断为阳性的耐药基因扫描图(图3、图4)色斑明亮、背景清晰，无交叉性反应，色斑判定结果与数据输出结果判定一致，可识性良好。
表4：水样中耐药基因基因芯片检测数据输出结果

Claims (5)

1.一种基因检测芯片，其特征在于，所述的基因检测芯片是在芯片载体上固定有用于检测海洋细菌耐药基因的探针；所述的耐药基因包含有四环素类耐药基因、磺胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、β-内酰胺类耐药基因、氯霉素类耐药基因；
其中用于检测氨基糖苷类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1-6；
用于检测四环素类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7-14；
用于检测磺胺类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:15-18；
用于检测β-内酰胺类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:19-25；
用于检测氯霉素类耐药基因的探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:26-32；
所述的探针的5′端进行了氨基修饰。
2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的芯片载体上固定有空白对照和阳性对照。
3.如权利要求2所述的芯片，其特征在于，所述的阳性对照为5′端进行cy3标记的核酸探针，核酸探针的序列为TTGGATTAGGTATAACAAAAGGACCAGCGGATTCTCCACCTATATCTATA。
4.如权利要求1或2所述的芯片，其特征在于，所述的芯片载体为醛基芯片载体。
5.用于扩增核苷酸片段的引物对，所述的引物对扩增的产物用于权利要求1所述的芯片的检测；其中引物对的信息如下：
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