CN1396271A - 采用基因芯片技术检测耐药基因 - Google Patents

Abstract

本专利涉及检测细菌耐药基因的基因芯片技术，包括固定于基因芯片载体上的寡核苷酸探针的DNA序列、将目标耐药基因进行PCR线性扩增的延伸引物的DNA序列、PCR线性扩增的条件、将PCR产物于芯片上探针杂交的条件。PCR线性扩增的目的是增加目标耐药基因的拷贝数同时将其标记上荧光素等信标。

Description

采用基因芯片技术检测耐药基因

本发明涉及耐药基因芯片的制备以及其检测标本中细菌耐药基因方面的应用。

本发明的目的在于通过使用基因芯片检测细菌的耐药基因，指导抗生素的合理使用。

1.抗生素的使用现状：

正确选用抗生素是抗生素治疗中的一个关键问题。所谓正确选用，包括是否应该使用抗生素、需要选用哪种抗生素及通过什么途径给药等问题。不恰当的给药不仅达不到预期的疗效，而且还会适得其反。

为加强抗生素使用的宏观管理、减少医院感染的发生、阻止或延缓细菌耐药性的产生和发展，各医院都制订了合理使用抗生素的条例。其中合理选用抗生素的原则是：在诊断或高度疑似细菌性感染、决定使用抗生素前，应留取标本做细菌学涂片镜检、细菌培养、分离病原体并做常规药敏试验，作为抗生素选药依据，并根据抗生素的药代动力学特点，结合感染部位及药物浓度分布情况选择抗生素，并参考以下程序：

在实际工作中，绝大多数抗生素是按途径①给药的，在新的抗生素和细菌对各种抗生素的新的耐药性层出不穷的今天，经验用药的可行性和科学性正在逐渐降低；途径②可以将抗生素粗分为β-内酰胺类和非β-内酰胺类给药，但对病原菌的耐药性无法判断，而且不适用于混合感染或有多种细菌定植部位的感染；途径③是目前所能采取的最好方式，但由于所需时间长(最快3天)、难于筛选条件致病菌、药敏试验受实验用抗生素的限制等原因，使其不能在首次诊断时及时提供合理使用抗生素的方案，而是作为对已用抗生素的正误作追溯性评估，同时为调整抗菌药提供方案。若经验用药不对，等到基于途径③的正确给药方案提出时，往往病情已经加重、感染已经蔓延，为增加了下一步治疗的难度。

正是这种传统的抗生素用药方式导致了细菌耐药性的产生和扩散，使人类面临传染病卷土重来的危险。

另外，不合理用药也使全国每年不必要的药费支出高达上百亿元。

因此，迫切需要新的措施，为临床使用抗生素提供及时、准确、合理的指导。2.细菌耐药性研究现状：

人类进入抗生素时代已有近半个多世纪的时间，在这期间，各种新型抗生素的不断问世，极大地促进了医学科学的发展。但与此同时，在抗生素的巨大进化选择压力下，许多病原菌演化出了对抗生素的耐药性。细菌的耐药，使人类面临巨大挑战。从1937年首次观察到淋球菌对磺胺的耐药现象开始，科学家们一直在研究不断出现的细菌对不同抗生素的耐药性，从细胞和分子水平研究细菌的耐药机理。现在已经证实，细菌对每一类抗生素都已产生了耐药性，细菌耐药性从机理上可分为：固有性耐药(细菌本身的生理特性，如不渗透性和溢出机制)、获得性耐药(细菌基因型不变，但耐药性随生长环境而变)和遗传性耐药(通过基因突变或通过获得抗药质粒，细菌获得了新的稳定的耐药特性)。虽然这些耐药性涉及上百种结构和活性各不相同的蛋白质，但近年来已完成对这些蛋白基因序列的测定。固有性耐药：

亲脂性抗生素对G^-菌的MIC要远远大于G⁺菌，这主要是由于G^-菌带有的多种药物溢出泵。

       表1.药物溢出泵类型、分布及功能

溢出泵类型        细菌        基因          抗生素

  EmrB          大肠杆菌      emrB    萘啶酸、thiolactomycin

  ArcB          大肠杆菌      arcAB   Tet、CP、FQ、β-内酰胺类、Nov、

                                      Em、FuA、Rif

  MexB          铜绿假单胞菌  mexAB   Tet、CP、FQ、β-内酰胺类(除羧苄青

                                      霉素外)、Nov、Em、FuA、Rif、TMP、

                                      SMZ

  MexD          铜绿假单胞菌  mexCD   Tet、CP、FQ、TMP、第四代头孢菌

                                      素(除羧苄青霉素外)

  MexF          铜绿假单胞菌  mexEF   CP、TMP、FQ

  MtrD          淋病奈瑟氏球菌 mtrCD  Tet、CP、β-内酰胺类、Em、FuA、

                                      Rif注：CP(chloramphenicol)氯霉素，Em(erythromycin)红霉素，FQ(fluoroquinolones)氟喹诺酮，FuA(fusidic acid)褐霉素，Nov(novobiocin)新生霉素，Rif(rifampicin)利福平，SMZ(sulfamethoxazole)新诺明，Tet(tetracycline)四环素，TMP(trimethoprim)甲氧苄啶。获得性耐药：

细菌由于所处的环境不同而出现耐药性的差异。表现在铜绿假单胞菌时，细菌在体外药敏试验中表现为对氨基糖甙类(妥布霉素)、喹诺酮类(环丙沙星)敏感，但在体内时MIC却提高了6-8倍。这与细菌所处的体内环境和体外实验条件的差异有关。遗传性耐药：

绝大多数的细菌耐药性都是通过遗传途径而获得的并成为稳定性状的。耐药性最初都是由于细菌染色体的基因突变而产生，耐药基因通过同源重组转移到质粒上，即可实现在种属内和种属间的纵向和横向传播。

现在已经知道，大多数的耐药基因都已被整合到了质粒上，因而很容易引起耐药性的扩散。

细菌对各类抗生素的遗传性耐药分述如下：

①β-内酰胺类抗生素：细菌对青霉素类和头孢菌素类抗生素的抗性主要是通过产生β-内酰胺酶而实现的。目前已经鉴定出超过200种β-内酰胺酶，其中超过80％的酶的基因序列已经测出，它们中的绝大多数都有相同的酶活性功能部位，有绝对和相对保守区，因而易于检测。青霉素结合蛋白也是抗性产生的原因之一，但不是主要因素。

  表2.β-内酰胺酶的分类及其所对应的抗生素耐药谱

组别            有关酶类的基因                抗生素1组：               超过33种，包括A1、         主要水解LOR和LOT，对克拉维酸不敏感    AsbAls、AmpCs、TypeA、     部分水解PEN的水解头孢菌素的    P99、BIL-1、FOX-1、LAT-1、β-内酰胺           MIR-1、MOX-1s、CEP-1s、

                S&A、S2等酶2a组：              超过20种，来自G⁺菌，包    主要水解PEN、AMP，部可被克拉维酸抑制    括I、IIIs、MJ-2s、LEN-1s、 分水解CARB、LOR、LOR的水解青霉素的β-   NPS-1s、PCl(A)P，B，C，D、 和NCF内酰胺酶            Exo等2b组：              超过15种，包括CEP-2、      主要水解PEN、AMP、可被克拉维酸抑制    Forml、OHIO-1、SHV-1、     LOR和LOT，其中一些的广谱β-内酰胺酶   TLE-1、ROB-l、LXA-1、      酶还有更宽的耐药谱

                TLE-2、HMS-1、TEM-1、

                TEM-2等2be组：             超过38种，包括TEM-3至      主要水解PEN、AMP、可被克拉维酸抑制    TEM-12、TEM-16、TEM-20     CARB、LOR、LOT、TAX、的超广谱β-内酰胺   至TEM-26、SHV-2至          TAZ和ATM等，个别酶酶                  SHV-6、B1、B2、MJ-2、      还有更宽的耐药谱

                MEN-1、CTX-ase-M-1、K1、

                MJ-1、PER-1、CTX-ase-M-2

                等2br组：             超过9种，包括TEM31至       主要水解PEN、AMP和对克拉维酸不敏感    TEM36、TRC-1等             LOR，个别酶有更宽的耐的广谱β-内酰胺酶                              药谱2c组：              超过15种，包括CARB-5、     主要水解PEN、AMP、可被克拉维酸抑制    AER-1、TypeBs、BRO-1、     CARB，部分水解LOR，的水解羧苄青霉素    BRO-2、PSE-1、PSE-3、      个别酶有更宽的耐药谱的β-内酰胺酶       PSE-4、CARB-3、CARB-4、

                SAR-1等2d组：              超过19种，包括OXA-1至      主要水解PEN、AMP、水解氯唑西林的β-   OXA-12、OXA-A、LCR-1、     CARB、CLOX、OXA、内酰胺酶            M-OXA等                    MET、LOR、LOT、TAX

                                           等，个别酶有更宽的耐药

                                           谱2e组：              超过19种，包括CepA、       主要水解LOR和LOT，可被克拉维酸抑制    CblA、CfsA、FormII、FEC-1、部分水解PEN和TAX等的头孢菌素酶        FUR、FPM-1、L2、BlaI等2f组：              超过3种，包括IMI-1、       主要水解PEN、AMP、水解羧苄青霉素的    NMC-A、Sme-1等             LOR、LOT、TAX、ATM、非METβ-内酰胺酶                               IMP等3组：               超过15种，包括CphA/A2、    主要水解PEN、AMP、不被克拉维酸抑制    A2h、II、CcrA、PCM-1、     CARB、CLOX、LOR、的METβ-内酰胺酶    IMP-1、L-1等               LOT、FOX、NCF、TAX、

                                           IMP等。4组：可被克拉维酸   超过7种，主要为SAR-20      主要水解PEN、AMP、部分抑制的青霉素                               CARB、CLOX、OXA，酶                                             部分水解LOR注：PEN，benzylpenicillin青霉素G；AMP，ampicillin氨苄青霉素；CARB，carbenicillin羧苄青霉素；OXA，oxacillin苯唑青霉素；CLOX，cloxacillin氯唑青霉素；LOR，cephaloridine头孢噻啶；LOT，cephalothin头孢噻吩；FOX，cefoxitin头孢西丁；NCF，nitrocefin头孢硝噻吩；TAX，ceftazidime复达欣；ATM，aztreonam氨曲南；IMP，imipenem亚胺培南。②氨基糖甙类抗生素：细菌对氨基糖甙类的抗性包括核糖体结构改变和膜渗透性降低等，但最主要的是借助于酶对抗生素的灭活，如乙酰转移酶、核苷酸转移酶、磷酸转移酶。这些酶的基因分布在转座子上，很容易导致对氨基糖甙的耐药性在不同种类的细菌间快速传播。

        表3.氨基糖甙乙酰化修饰

细菌          基因        分布        抗生素

大肠杆菌        acc(1)        染色体      Apr，Lvdm，Prm，Rsm，(But)，(Neo)

大肠杆菌        acc(3)-Ia     质粒        Gm，Astm，Siso

铜绿假单胞菌    acc(3)-Ib

粘质沙雷氏菌    acc(3)-II     质粒        Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl，2’Ntl，Siso

大肠杆菌

铜绿假单胞菌    acc(3)-III    染色体      Gm，Tob，Dbk，5-epi，Siso，Km，Neo，

                                          Prm，Lvdm

沙门氏菌属      acc(3)-IV     质粒        Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl，2’Ntl，Apr，

                                          Siso

阴沟肠杆菌      acc(3)-VI     质粒        Gm，6’Ntl，Siso，(Tob)，(Ntl)，(Km)，

                                          (5’-epi).

差异柠檬酸杆菌  aac(6’)-I    质粒        Tob，Dbk，Ntl，Amk，2’Ntl，Siso，(Isp)，

粘质沙雷氏菌                  染色体      5-epi

肺炎克雷伯氏菌                转座子

G⁺

阴沟肠杆菌/柠檬

酸杆菌

溶血不动杆菌

不动杆菌属

肠球菌属

铜绿假单胞菌    aac(6’)-II    染色体      Gm，Tob，Dbk，Ntl，2’Ntl，5-epi，

                                           Siso

粪链球菌        aac(6’)-α          质粒        Gm，Tob，Dbk，Ntl，Amk，2’Ntl，

金黄色葡萄球菌  (2”)          转座子      6’Ntl，5-epi，Astm

斯氏普罗威登斯菌 acc(2’-1)    acc(2’-1)  Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl表4.氨基糖甙腺苷酰化修饰

细菌                基因          分布               抗生素

肠杆菌科         ant(2”)-I       质粒           Gm，Tob，Dbk，Siso，Km

阴沟肠杆菌

肠杆菌科         ant(3”)-I       质粒           Sm，Spcm

金黄色葡萄球菌   ant(4”)-I       染色体         Tob，Amk，Isp，Dbk

铜绿假单胞菌     ant(4”)-II      质粒           Tob，Amk，Isp

粪链球菌         ant(6)-I         质粒           Sm

金黄色葡萄球菌   ant(9)-I         转座子         Spcm表5.氨基糖甙磷酸化修饰

细菌                基因            分布               抗生素

粪链球菌         aph(2”)-I       染色体         Gm，Tob，Dbk，Ntl，Amk，

                                                 2’Ntl，6’Ntl，5-epi，Astm

肺炎克雷伯氏菌   aph(3’)-I       转座子         Km，Neo，Prm，Rsm，Lvdm，GmB

                                  质粒

大肠杆菌         aph(3’)-II      转座子         Km，Neo，Prm，Rsm，But，G

                                                 mb(Amk)

金黄色葡萄球菌   aph(3)-III       质粒           Km，Neo，Prm，Lvdm，Rsm，But，

粪链球菌                                         Gmb，AmK，Isp

环状芽孢杆菌     aph(3’)-IV      染色体         Km，Neo，Prm，Rsm，But

弗氏链霉菌       aph(3’)-V       染色体         Neo，Prm，Rsm

S.ribosidificus

青铜小单孢菌

鲍氏不动杆菌     aph(3’)-VI      质粒           Km，Neo，Prm，Rsm，But，GmB，

肺炎克雷伯氏菌                                   Amk，Isp

空肠弯曲杆菌     Aph(3’)-V       质粒           Km，Neo(Amk)

                    II

铜绿假单胞菌     aph(3”)-I       染色体         Sm

灰色链霉菌       aph(6’)-I       转座子         Sm

淡青链霉菌                        染色体

大肠杆菌         aph(4)-I         质粒           HygB

S.hygroscopicus注：Amk，amikacin阿米卡星；Apr，apramycin阿布拉霉素；Astm，Astromicin(fortimicin)阿司米星；But，Butirosin丁胺菌素；Dbk，dibekacin地贝卡星；5-epi，5-episisomicin 5-表紫苏霉素；Gm，gentamicin庆大霉素；GmB，gentamicinB；HygB，hygromycin潮霉素；Isp，isepamicin；Km，kanamycin卡拉霉素；Lvdm，lividomycin里杜霉素；Neo，neomycin；Ntl，netilmicin乙基紫苏霉素；2’Ntl，2’-N-ethylnetilmicin；6’Ntl，6’-N-ethylnetilmicin；Sm，streptomycin；Prm，paromomycin巴龙霉素；Rsm，ribostamycin核糖霉素；Siso，sisomicin紫苏霉素；Spcm，spectinomycin奇霉素；Tob，tobramycin妥布霉素；③酰胺醇类抗生素：细菌对酰胺醇类抗生素的耐药性主要表现在氯霉素上。

很多G⁺和G^-菌都带有氯霉素乙酰转移酶(Cml-acetyltransferases，CAT)，CAT有很多种类，但在它们的基因中，对应于酶活性部位的区域都含有23bp的绝对保守序列，因而易于测出。

还有很多细菌带有异抗生素乙酰转移酶(xemobiotic acetyltransferases，XAT)，其带有相对保守的序列，分布在Mmorganii，S.mancescens，E.aerogenes，E.coli，P.aeruginsa，A.tumefaciens，E.faecium，S.sureus，B.sphaericus等细菌中。XAT导致了对氯霉素的低水平耐药性。④大环内酯类抗生素：ermC基因存在于Bacillus subtilis中，与对大环内酯-林可霉素-链阳性菌素B(macrolide-lincomycin-streptograminB)的耐药性有关。而对红霉素的耐药基因ermBP和ermQ则存在于质粒和染色体上，易于造成对红霉素耐药性的传播。⑤糖肽类抗生素：细菌对糖肽类抗生素的耐药性表现为对万古霉素的耐药性，三个耐药基因vanH，vanA和vanX都有保守序列，其中以vanA为主，vanA可以整和到质粒上。⑥四环素类抗生素：四环素类抗生素的耐药基因tet广泛分布很广，目前常见的病原菌几乎都带有tet基因。⑦喹诺酮类抗生素：细菌主要通过将喹诺酮类抗生素泵出而表现出耐药性。溢出性泵如前所述。⑧甲氧苄啶类抗生素：在G^-菌中发现了17种质粒编码的二氢叶酸还原酶的基因dhfr，它们导致对甲氧苄氨嘧啶的耐药性。在dhfr出现在肠道球菌中10年后，现在在G⁺菌中也发现了dhfr。

综上所述，目前细菌几乎已经对每种抗生素都产生了耐药性，而且很多单个的耐药基因能抗多种不同的抗生素，多数的耐药基因分布于转座子和质粒上，因而造成了耐药性的快速传播。研究发现，在每一种新的抗生素投入临床使用后不久(最短仅数月时间)，细菌就会演化出对这种抗生素的耐药性。

面对如此复杂并不断增加的细菌耐药性，如何才能及时、准确地使用抗生素？传统的药敏试验已经难以回答这一长久困扰医学界的难题。

随着基因工程和生物传感器技术的发展而出现的基因芯片技术，为人们及时准确地查找稀少基因提供了简洁途径。采用基因芯片技术，我们有可能快速准确地直接从标本中检测病原菌的耐药基因，从而准确指导抗生素的正确使用。

本发明的耐药基因芯片是通过将特异性针对细菌耐药基因的核酸分子固定于固相载体表面而制成的。

本发明的基因芯片所采用的固相载体选自任何可用于制备基因芯片的材料，其包括，但不限于，玻璃片、硅片和塑料片。所述的固相载体经不同的化学修饰后，在其表面带有可以固定核酸分子的活性基团。这些基团包括，但不限于，氨基(-NH₂)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巯基(-SH)。

本发明的耐药基因芯片是在所述的固相载体上连接有针对细菌耐药基因的特异性核酸探针，所述的探针可以为单链或双链DNA分子，其核苷酸序列选自耐药基因双链中的任一条链，而且在适当的条件下可以与耐药基因特异性杂交。所述的探针可以通过DNA自动合成或PCR扩增而获得，其长度至少为15个核苷酸，优选至少为20个核苷酸，更优选至少为30个核苷酸，还更优选至少为40个核苷酸，还更优选至少为50个核苷酸，最优选至少为60个核苷酸，还最优选至少为70个核苷酸。所述的核酸探针，在其与载体连接的一端可以选择性地添加一个目的在于增加探针的空间活动性以利于杂交的连接臂，所述的连接臂可以由多聚胸腺嘧啶核苷poly(dT)n(n≥10)、多聚尿嘧啶核苷poly(dU)n(n≥10)或多聚腺嘌呤核苷poly(dA)n(n≥10)构成。

在本发明的耐药基因芯片中，所述的核酸探针或用于制备探针的PCR引物在DNA自动合成时末端(5’端或3’端)被修饰(连接)有活性基团。这些活性基团包括，但不限于，羧基(-COOH)、氨基(-NH₂)和巯基(-SH)。如核酸探针末端被羧基修饰，则羧基与载体表面的氨基反应，形成酰氨键而将该核酸分子以共价键连接到载体上。如核酸探针末端被氨基修饰，则氨基与载体表面的醛基或羧基反应，形成酰氨键而将该核酸分子以共价键连接到载体上。如核酸探针末端被巯基修饰，则巯基与载体表面的巯基反应形成二硫键而将该核酸分子以共价键连接到载体上。

本发明的耐药基因芯片的制备，是利用微排序法按照设计将所述的核酸探针有序地点样到载体上，通过核酸探针末端修饰的活性基团与载体表面相应的活性基团反应，形成共价连接，将探针固定于载体上，从而制成基因芯片。同时，在所制备的基因芯片上，每一种核酸探针都有固定的位置，因此在与样品杂交后，通过对所捕获阳性信号的寻址即可明确其对应的特定核酸探针，从而确定与其对应的耐药基因。

本发明还涉及利用本发明的耐药基因芯片对标本中细菌的耐药基因进行检测，其过程包括样品的标记、与基因芯片的杂交以及杂交信号的检测。

在所述的样品标记过程中，可以利用本领域已知各种核酸标记方法使标本中的目的基因标记上信标分子，所述的方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、体外转录、随机引物标记、缺口平移以及末端转移标记等方法。所述的信标分子可以为荧光素或同位素；所述的荧光素包括，但不限于，Cy3、Cy3.5、Cy5、异硫氰酸荧光素、德克萨斯红；所述的同位素包括，但不限于，32P、。在适当的温度和离子强度的条件下，将所述的标记产物与本发明的耐药基因芯片进行杂交。杂交条件和方法是本领域已知的。杂交后，根据所选用的信标分子采用相应的检测方法对基因芯片进行扫描分析，根据所捕获阳性信号的位置寻址，判断所述标本中细菌耐药基因的种类。在信号采集和分析过程中所需的设备均已经商品化。

本发明的基因芯片采用耐药基因特异性寡核苷酸作为探针，而在细菌耐药基因检测过程中利用基因特异性引物通过对目的基因的线性PCR扩增进行样品的标记。本发明的基因芯片上连接的寡核苷酸探针和在PCR过程中所用扩增引物以及对应的耐药基因均列于表6中。需要说明的是，本发明中所采用的寡核苷酸探针和对应的特异性引物也可以用于对目的基因进行普通的PCR扩增，而扩增后的PCR产物同样可以作为探针用于按照上述方法制备耐药基因芯片，因此利用所述的PCR产物作为探针所制备的耐药基因芯片也在本发明的范围之内。

表6。用于耐药基因检测的探针和引物序列及对应的耐药基因

耐药基因名称	编号	探针序列	引物序列
				氨基糖甙乙酰转移酶(aac(6′)-Ic)	an 01	5′AGCAACAGGGGTGCAGCGAGCTGGCGTCGGATA3′	5′ACTACTCGCTCCGTTTCG3′
氨基糖甙乙酰转移酶(aacA4)	an 02	5′ATGACCTTGCGATGCTCTATGAGTGGCTAAAT3′	5′TCGGGCGTGCTTCTTCTC3′
				氨基糖甙乙酰转移酶	an 03	5′AACCTTTGTTTCGGTCTGCTAATAAATAACTCCT3′	5′TAAGCCTATCCAGCCAAC3′
β-内酰胺酶(ear)	am 01	5′AACAACAGTAGGTTCAGGTTTTCATTCTTCTTCAA3′	5′TTCCACAACTGTCCGTCT3′
				低亲和性青霉素结合蛋白PbP5	am 02	5′TGATACTGGATATGGACAGGGCGAACTTCTA3′	5′TGCTGTTTCGCCGATGAC3′
β-内酰胺酶/ampC	am 03	5′CGCCAGCAGTGTAGGTTGCGAGATGTAATAGTGT3′	5′CGCTAAACAGTGGAATGG3′
				β-内酰胺酶(ampC)5′	am 04	5′ACGCCCGTAAATGTTTTGCTGACCGAACCTAA3′	5′CCGCCTCTTGCTCCACA3′
链球脓菌M蛋白(emm)   emm14.1allele	azt 01	5′CTTTCTGGCGTGCTTCTGATTGTTCTTG3′	5′CTGTTGATTAGGACGGGG3′
				红霉素、竹桃霉素、阿奇霉素、霉素素、米卡霉素B结构抗性蛋白(msrSA)	azt 02	5′GAATCTGGAACAGTTGAAACGAATGGCGAA3′	5′CACTCATACTGTCGGTTGT3′
β-内酰胺酶，bla(SHV-2a)	tax 01	5′ACCCGCCTTGACCGCTGGGAAACGGAACTGA3′	5′GCCTCATTCAGTTCCGTTT3′
				β-内酰胺酶(cfxA)	fox 01	5′TTATGGTCAGCCGACATTTCCTCTTCCG3′	5′GCTTGTCCTGGCGAAAT3′
LAT-2 b-内酰胺酶(bla LAT-2)	fox 02	5′GCGGCCAGTTCAGCATCTCCCAGCCTAATTTGC3′	5′GAAGCCTATGGCGTGAA3′
				SHV型广谱β-内酰	taz 01	5′GCACCCCGCTCGCCAGCT	5′ACGGAACTGAA

胺酶；kp386		CCGGTCTTATCG3′	TGAGGCG3′
				β-内酰胺酶CEF-1前体(blaCEF-1)	taz 02	5′TATCTATCTCAGACAAAACGGCTAAAGCAATCGG3′	5′ATGCCAGAATAGGAGTAGC3′
DNA旋转酶B亚基，GyrB(gyrB)	cip 01	5′GACGCTTACGCACGGCATCCAGCCCTTT3′	5′GTATCAAGGTATTAAAAGGGC3′
				旋转酶A(gyrA)	cip 02	5′GCGAGAATCGTTGGGGATGTTATGGGGA3′	5′CGCAGCAGCACCATCA3′
旋转酶A(gyrA)	cip 03	5′GGTTTATCGGGCGTCATACCTTGTTCATTTA3′	5′CCAGTGAAATGCGTGAATC3′
				DNA旋转酶A亚基(gyrA)	cip 04	5′ACGTTGAGCGGCAGCACTATCTCCATCC3′	5′TCCGTATGGCTCAATGG3′
氯洁霉素抗性决定基(ermFS)	cc 01	5′CAGGGCTGATTTGACAGTTGGCGGTGGC3′	5′CTGGGAGGTTCCATTGTC3′
				rRNA N-6-甲基转移酶(ermM)	e 01	5′TTCGTAACTGCCATTGAAATAGACCATAAA3′	5′AGCAAACCCGTATTCCAC3′
rRNA甲基化酶(ERM-TE)	e 02	5′TCTGGAACATCTGTGGTATGGCGGGTAA3′	5′AAAACTTACCCGCCATAC3′
				rRNA甲基化酶(erm)	e 03	5′AAAACTTACCCGCCATACCACAGATGTTCCAGAT3′	5′TGGCGTGTTTCATTGCTTG3′
红霉素酯酶(ereA2)	e 04	5′TGTCGGCATTGGCGAGGGTGCTCACTTTG3′	5′TCAAGGTGTTGGGTAAATC3′
				红霉素抗性蛋白(ermA)	e 05	5′CCGTCCACCGTCCGTAGTCACCCGTCCGCTT3′	5′CCCGAGGAGCCGTTCCAGTT3′
红霉素诱导的23S核糖体RNA甲基化酶(ermK)	e 06	5′CCAAAAGTGGACTCGGCAATGGTCAGAATAACA3′	5′AATGTTTATGTGATAGAGGC3′
				红霉素甲基转移酶(AA1-253)	e 07	5′CAATGACGCAGGGAGTGGCGGGTAACCGGAAG3′	5′ATCGGACCAGGAAGCG3′
大环内脂-林可酰胺-密柑霉素B抗性	e 08	5′CTAAGACGCAATCTACACTAGGCATGGGATGGAAG3′	5′CGCAAAAAGATTTATGGG3′

23S rRNA甲基化酶(ermQ)
				大环内脂2′-磷酸转移酶I(mphA)	e 09	5′GACCGTAGTCACGACCGCCGATACCTCCCAAC3′	5′GCCCAAGCTCATTGACAG3′
Mrx	e 10	5′ACGCGGCACCGAGCACCACGCAAGCGATCAGC3′	5′CGCATTGATCTCGGGTGT3′
				阅读框B mls抗性	e 16	5′AATCGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTAT3′	5′AGTAATGCCAATGAGCG3′
N-6-氨基腺嘌呤-N-甲基转移酶(NMT)	e 11	5′CGGCGGCAACATCCAGGCGTCGCTTCTGCG3′	5′CCTCGGTTCGTTCTTCTTG3′
				红霉素抗性蛋白(msrA)	e 12	5′GAATCTGGAACAGTTGAAACGAATGGCGAA3′	5′CCACTCATACTGTCGGTTGT3′
红霉素抗性甲基化酶(ermTR)	e 13	5′CAATACAGAATCTACATTAGGCTTAGGGTGAA3′	5′AGTCAACGGGTGAATGCT3′
				21kDa MsrB C末端产物(msrB)	e 14	5′GATAATTTCGTTCTTTCCCCACCACTCA3′	5′CTTGAGCGTTCTTGTAATG3′
rRNA甲基转移酶	e 15	5′CAGGGAAAGGTCATTTTACTGCTGAATTGGTA3′	5′GTAAGGTATGCTGCCAAA3′
				UDP-N-乙酰半乳糖苷烯醇丙酮酰转移酶(murA)	fos 01	5′GCCCCGGCACGGATGTCCGAACACCACA3′	5′GATGGCTATCGCTTTGGC3′
磷酸转移酶(fosC)	fos 02	5′CGAAGTCCGCAGCGAGCAACGGGGCGATAT3′	5′CGGGTCTATCCCTTTCA3′
				fosB基因	fos 03	5′GAGATATTTTAGGGGCTGACATTTTAGTTGAA3′	5′TCTTCGTTCAAAGCCAACC3′
fosB基因	fos 04	5′TCAGATAACGATTTTGAAGATTGGTATAACTGGTTG3′	5′CTTCTAAACTTCCTGTATGC3′
				氨基糖甙修饰酶(aph(2″)-Id)	gm 01	5′ACTTAGAAATCGGCCAGGTCCTTAGCT3′	5′TCAATAATCTGCCGAAGC3′
氨基糖甙-(3)-N-乙	gm 02	5′CGCCGTACCTGGCCGCCG	5′CTCCGTCAGCG

酰基转移酶同功酶II    (AAC(3)-II)，(aacC2)		TTCGATCCCG3′	TTTCAG3′
				氨基糖甙腺苷转移酶(aadB，ant(2″)-Ia)	gm 03	5′CCTCCGCGATTTCATACGCTTCGTCTGCCC3′	5′TACTTGACTGCGAACCTG3′
庆大霉素抗性蛋白	gm 04	5′GTGATGGAAATCCCTTCGTGGGCTACCG3′	5′CATCCCGTCTTCACCC3′
				庆大霉素抗性(aadB)	gm 05	5′TGGGCAGACGAAGCGTATGAAATCGCGGAGGC3′	5′GACCTGAAAGCGGCAC3′
庆大霉素抗性(aadB)	gm 06	5′CGCAGCAGGCAGTCGCCCTAAAACAA3′	5′TTTGTTTTAGGGCGACT3′
				抗庆大霉素甲基化酶(grm)	gm 07	5′GCCAGCGGATTGAGGCCACGGCGAGGT3′	5′GATCTTCCGTCACGTGC3′
庆大霉素乙酰转移酶(aacC1)	gm 10	5′CTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGC3′	5′ATCACATAAGCACCAAGC3′
				S-腺苷，甲硫氨酸依赖性甲基化酶(kgmB)	gm 08	5′CGTGACGCTGCTGCTCAAGACCGTGCCC3′	5′CTTCGTCGGGAAACTCAC3′
aacA-aphD氨基糖甙抗性基因	gm 11	5′AAATAATCCAAGAGCAATAAGGGCATACCAAAA3′	5′CACTATCATAACCACTACCG3′
				庆大霉素乙酰转移酶-3-I(AAC(3)-I)	gm 09	5′TCTCGCGGCTTACGTTCTGCCCAGGTTTG3′	5′ATCACATAAGCACCAAGC3′
β-内酰胺酶oxa-23(ari-1)	imi 01	5′AAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAG3′	5′CCTGATAGACTGGGACTGC3′
				β-内酰胺酶ACT-1	imi 02	5′TGCCACGTAGCTGCCAAACCCGCCGGTAGAG3′	5′GAGAAGTGAATCCACCAGC3′
广谱β-内酰胺酶(blaESP)	imi 03	5′TTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGA3′	5′GCTTGAACCTTACCGTCT3′
				卡那霉素抗性多肽	k 01	5′TCCCGTGCGAGCAGATCCATCAGCAGTCCG3′	5′AAGGACGGACTGCTGATG3′

氨基糖甙修饰酶(ant2)	k 02	5′CCTCCGCGATTTCATACGCTTCGTCTGCCC3′	5′TACTTGACTGCGAACCTG3′
				氨基糖甙磷酸转移酶(aphA1-IAB)	k 03	5′GCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACC3′	5′GTATTTCGTCTCGCTCAG3′
卡那霉素核苷酰转移酶(aa1-253)	k 11	5′AAGTGTATCAAACTGCTAAATCGGTAGAAGCCCAA3′	5′AAATGTTGTCGGTCCTTGC3′
				3′-氨基糖甙磷酸转移酶[APH(3；)-I]	k 04	5′CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACAT3′	5′AATGAATAACGGTTTGGT3′
卡那霉素磷酸转移酶(aphA-7)	k 12	5′TCTTCTTGAGGTTGATTTTCGCAAAGCCACTGATA3′	5′TAAACGCACTTCATCAGC3′
				新霉素磷酸转移酶(抗新霉素和卡那霉素)	k 13	5′GCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCG3′	5′GCAGGAGCAAGGTGAGA3′
卡那霉素磷酸转移酶(KM-R)	k 05	5′AGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAAC3′	5′TTCCGACCATCAAGCA3′
				氨基糖甙磷酸转移酶(aph)	k 06	5′TGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTT3′	5′CCGTCAGCCAGTTTAGTC3′
氨基糖甙磷酸转移酶aph(3′)-Id(aphA)	k 14	5′TCGCATCCCATACCTGCTCAGCCGCCCAGCCTTT3′	5′GAATGCCCTTTCAACAG3′
				PP-KAN    蛋白(pp-kan)	k 07	5′GCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACC3′	5′GTAATGGCTGGCCTGTTG3′
S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基化酶(kgmB)	k 15	5′CCGACGTGACGCTGCTGCTCAAGACCGTGCCCT3′	5′TCGTCGGGAAACTCACC3′
				3′5′-氨基糖甙磷酸转移酶(aphA-3)	k 16	5′AATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCT3′	5′AAAGCCCGAAGAGGAACT3′
抗卡那霉素-阿泊拉霉素甲基化酶(KAMC)	k 08	5′CGGAGTTCCTGATCACGCTCAACCTGCACGCCT3′	5′GCGTAGTACGGGGCGAG3′
				抗卡那霉素-阿泊拉	k 09	5′AGCTGCGGTTGCACTCGA	5′CCTGCCCAACC

霉素甲基化酶(KAMB)		CCAGGAAGGAC3′	TGCTGT3′
				卡那霉素抗性基因	k 10	5′TGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTT3′	5′CCGTCAGCCAGTTTAGTC3′
青霉素结合蛋白1A(pbp1a)	pen 01	5′TTTGATTGTTGCGTATTATTGTTAGGTTGGT3′	5′CTCACCTGCTCCACAACAAC3′
				青霉素结合蛋白(pbp1a)	pen 02	5′AACGGGTCGTGGTGCTTATCTCCCTTGGCTAC3′	5′AGAAGCCATCACCAACGA3′
青霉素结合蛋白1A(ponA)	pen 03	5′AAGATAGGCTCCACGCCCAGTTCCAIAAGT3′	5′CTCIAATGTCGGAACTCG3′
				青霉素结合蛋白1A(ponA)	pen 18	5′AGATGGCTGCTGCTTACGCTGCCTTTG3′	5′CTCCCATCACTAAAGACG3′
青霉素结合蛋白1A(ponA)	pen 04	5′TCATTCGGCACCAACCAGGCTGTGGAGACC3′	5′AAAGCGGGAGCATAGTCA3′
				低亲和性青霉素结合蛋白PbP5(pbP5)	pen 05	5′CAATAGTTCCGATGCTCGTTTGGTTGCTGA3′	5′CTTTAGGGATTCCGTTGG3′
青霉素结合蛋白5	pen 19	5′TCAGTAATCAAGTGATCCGCAAGAACCGCCATAT3′	5′ATCTTCACGGGCATCAGC3′
				青霉素结合蛋白1B(ponB)	pen 06	5′AAATGACGGTCTTCTGTCGCCAGCAAAGTATCCAC3′	5′GAGCAGCGTCTGTTTGTG3′
β-内酰胺酶(ampC)	pen 07	5′GCCGCCAGCAGTGTAGGTTGCGAGATGTAA3′	5′CGCTAAACAGTGGAATGG3′
				青霉素结合蛋白3r(pbp3r)	pen 20	5′ATTGTAATAGTTCGGGTGCTCGTTTAGTTGCTGA3′	5′TCTTTCTGCTTTAGGGATT3′
青霉素结合蛋白2(penA)	pen 21	5′CGCATCCAGTGCTTTCGCAATGACAAACGGCT3′	5′AGACAGCGAACAGAGGCG3′
				青霉素结合蛋白2(penA)	pen 08	5′CGCCGTAATAGCCGTTGGCAGTCGGTTCGT3′	5′AGTGCGTGAGTTGATGG3′
青霉素结合蛋白2(penA)	pen 22	5′TTTGACGGCTGCGGCGGTCAGTGGCTTGGTCGGG3′	5 ′CTGCCCACGGCTATTACG3′

青霉素结合蛋白2(penA)	pen 23	5′TTGTGCGGCAGACGGCATTTCCTTCATC3′	5′AAGAACAGGGCGACAACC3′
				青霉素结合蛋白2(penA)，only has the3′-half of others	pen 24	5′TGGGCGGCAGCCTGAACATCTTGGGCGTTT3′	5′TTAAGACGGTGTTTTGACGG3′
青霉素结合蛋白4(pbp4)	pen 09	5′CTTTGTTATTCATTAAATCAACGAAATCGCTGGTG3′	5′GGACAATCGCAGACCTAT3′
				青霉素结合蛋白2(pbp2)	pen 10	5′AAACTTGGCTTAAACTACGAAGGCGATATTGGTCC3′	5′GTTTCGCCGTCACGAGTA3′
低分子量青霉素结合蛋白  B(pcbR)	pen 11	5′ATCTCCGTCTTCGTCGGCTTGAGGTTGGTC3′	5′GGACAACGCCGAGTCGCTGA3′
				青霉素钝化蛋白及抗抑制因子(mecR1)	pen 25	5′TTTCGCCATTCGCATTGTCTTCGCCTTTTA3′	5′GCAAATGGATGGTTCGTAGG3′
青霉素结合蛋白2x(pbp2x)	pen 12	5 ′CAGAACTGGTATCGCAACAAACTGTGGATGGCAAG3′	5′GTAGGTCGTTGGGTGGTA3′
				青霉素结合蛋白2b(pbp2b)	pen 13	5 ′CTTCTGCTTCTTCCGCTGGGAGACCGGCTTT3′	5′AGTAGGGAGTGTATCCAGTG3′
青霉素结合蛋白1a(pbp1a)	pen 14	5′GTTACAGCAGTTGAAACGCTTGAAAGGGTCGGA3′	5′GAAATAGCGTTAGCATAGAC3′
				青霉素结合蛋白2b(pbp2b)	pen 15	5′GGAGCCAAGTATTCAGAAGGTGTGTATGCAGTCGC 3′	5′AGACATTGGTTACTGTTCCC3′
青霉素结合蛋白1b(pbp1b)	pen 16	5′GAAGCAATCACCGTCCCGTCCGAATAGGTAATCTC3′	5TTGACAAGGTTCGGGTGC3′
				青霉素结合蛋白1b(pbp1b)	pen 26	5′ACTGATCGTATTCTTCCTGAGTCAGAGCACCCGTA3′	5′CCCCAGAGTCCGATTA3′
青霉素结合蛋白2a(pbp2a)	pen 17	5′TCAGCAACTTGACCGACAACTCCACGAACTCCCC3′	5′CTATTTCCGAGGGCAGAG3′
				链霉素磷酸转移酶(strA)	st 01	5′GCTGATCGGCCTGCGAGCCTGGGGCGGGGAC3′	5′AGGCGTTCCAGCAGCATC3′

链霉素抗性蛋白A(strA)	st 14	5′GGCGTACTCTTGTCCTCGTCCGGTAAGAAGTCG3′	5′GCCGTTGATGTGGTGTCC3′
				链霉素抗性蛋白B(strB)	st 02	5′CCCGTCGGTCTGGTCGGTGAAGTGGGCTTTGGC3′	5′AGTCGTCCGCCATCTGTG3′
链霉素磷酸转移酶(strA)	st 15	5′CCGTCACCACGTCGAAAAACAAAATCACCAG3′	5′TCGCATTCTGACTGGTTG3′
				链霉素和大观霉素抗性氨基糖甙腺苷转移酶(aadA5)	st 03	5′CGTTCCGCTCGTCACCCTTCCAATCCGACTCTGC3′	5′GCCACGACATCCTTTCC3′
链霉素抗性蛋白(aadA2)	st 04	5′CGCCAGGGAAAGCCGAAGCCTCCATAAGGTCAT3′	5′TTTGTTGGTTACTGTGGC3′
				腺苷转移酶(aadA4)	st 05	5′TCAGAGTCGGATTGGAAGGGTGACGAGCGG3′	5′TTAGGAGCAATGAGACCC3′
氨基糖甙磷酸转移酶(aph)	st 16	5′CGGAAGTACCCGCACCACGAGTGGCACGCAG3′	5′CCGAGTCTCCTTCGTTCA3′
				氨基糖甙腺苷转移酶A(aadA2)	st 06	5′AATGACCTTATGGAGGCTTCGGCTTTCCCTGGCG3′	5′GATAACGCCACGGGATG3′
链霉素磷酸转移酶	st 07	5′TCCGGGGCCGGGGACCTTGCACAGATAGCGTG3′	5′AAGCCTCGTCGTCTG3′
				链霉素抗性(strA)	st 08	5′ACATACACCACGTTTCTGCGGGCAAGCCTCTAA3′	5′GGCAACTATCAACCAGC3′
链霉素腺苷化酶(str)	st 09	5′ATTCCCACCTGATTTAGATTATGGTTACAGTTAT3′	5′ACACTCCAAAACTCATTACAGC3′
				aadA基因产物(AA188-236)	st 10	5′TCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAGA3′	5′AGTACGGGCTGATACTGG3′
str	st 11	5′AAAACACCCTTTGCTACATACGTTGAGACACT3′	5′ATTGCTGTAATGAGTTTTGG3′
				氨基糖甙磷酸转移酶(aph(6))	st 12	5 ′CGCCTCAAAGACATCGCCGCCGACATGCTGGA3′	5′CCCAGCCACGCAACAACT3′
氨基糖甙磷酸转移	st 13	5′CTCTGCCTGCCCAACATC	5′GATGAAGCCCG

酶(aphE)		GTCCTCCATCCG3′	ACACCTC3′
				链霉素磷酸转移酶	st 17	5′GCCCTTCGGCGGGTTGAGCCTGATGCCCTGGTC3′	5′CAACACCGTCTGTCTGC3′
磺胺抗性蛋白(sulA)	sul 01	5′ATAGCCCTTCTGATGTAGTTTATCCAGGTCCCGT3′	5′TCTGACCAAGAAAGAAAATC3′
				磺胺抗性基因	sul 02	5′AGTCGGCGTTGGGGCTTCCGCTATTGGTCTCG3′	5′GACGTAGTCAGCGCCATTGC3′
磺胺抗性蛋白(sulII)	sul 03	5′AAACGCAACCGCCTTGTCCTTGATCCCGGCATGG3′	5′AGAGCGAGGTTTCGGGAG3′
				二氢叶酸合成酶(folP)	sul 04	5′AAGTATTTTAGATGTAGGTATTGGTTTTGGAAAGAGT3′	5′AATGCAAATACAAAGTCCC3′
二氢叶酸合成酶(dhps)	sul 05	5′ACATCCAAACCAGAAGTCATCCGTGAGTCAGCGAA3′	5′CAGGTTCGGAAAGGGAGC3′
				二氢叶酸合成酶(dhps)	sul 06	5′GATGTTGTCGGTGAAGTGGCGCGGTATTTGAAAGC3′	5′GTTTCCGCCATCAATTCGGG3′
二氢叶酸合成酶(dhps)	sul 07	5′TCCGCCATCAATTCGGGTAAATGCCGCATCAGT3′	5′GGATGTTGTCGGTGAAGT3′
				PP-SUL	sul-08	5′CATTCCCGTCTCGCTCGACAGTTATCAACCCGC3′	5′TCTGCCTGCCCGTCTTG3′
S1二氢叶酸还原酶(DfrA)	tmp 01	5′TGTCGCTCACGATAAACAAAGAGTCATTGGGTAC3′	5′TTTCCGTGCCATTACAAG3′
				二氢叶酸还原酶(dfr)(抗三甲氧苄二氨嘧啶)	tmp 02	5′TTAGACTTCCTTTCTCTTGCGGTATTGGATGGT3′	5′ATTCATGCTCGGGTGGA3′
抗三甲氧苄二氨嘧啶二氢叶酸还原酶dhfrXVI	tmp 03	5 ′CCCAAATCGAAAGTATGCAGTTGTAACTCGCTCTA3′	5′ATTACACCCTCATCATTCG3′
				二氢叶酸还原酶(抗三甲氧苄二氨嘧啶)(dfr17)	tmp 04	5′CATATTTGCGATTTGGAAGAACACCCATAGAGTC3′	5′TCAATGGCTCCTTGTCGG3′

VIII型二氢叶酸还原酶(dhfrVIII)	tmp 05	5′GCGACTGTACGAAGGCGACACCTACGTTGATC3′	5′GCCATTCTGCTCGTAGTC3′
				Ib型二氢叶酸还原酶(dhfrIb)	tmp 06	5′AAACGGCGTGATTGGTTGCGGTCCAGACATAC3′	5′CGCCCATAGATTCAAACG3′
VIII型二氢叶酸还原酶(dhfrVII)	tmp 07	5′TGCAACGTCAGAAAATGGCGTAATCGGTAATGG3′	5′TGGAAGAACACCCATAGAG3′
				二氢叶酸还原酶(dfr2a)(抗三甲氧苄二氨嘧啶)	tmp 08	5′GCCGCCTGGCAAGGTCAGATTGTCGGGTGGTA3′	5′TACTGAGCCTGGGTGAGC3′
二氢叶酸还原酶	tmp 09	5′CTGGGTGGGATTCGGACTCGACCGCATAGCC3′	5′GTCGTCGGTTGGTATTGC3′
				二氢叶酸还原酶	tmp 10	5′TCGGATGCCAAAGCGATAGCGTGCGACAGCG3′	5′GCAAGCCTCTACCGAACC3′
二氢叶酸还原酶(dhfrIX)	tmp 11	5′GTAGTCAGTAAAACAGTACCACCCACCCAGAACA3′	5′TACGCACTCTTCCCACCA3′
				二氢叶酸还原酶(dfrXIII)	tmp 12	5 ′CCTTTGAGGGTGACGCCTTCTTCCCAGTGCTTA3′	5′CTTGAATGGTTTCGGATG3′
二氢叶酸还原酶(folH)	tmp 13	5′TTCAAAGGTTTTACGCCCCATAATGACAGGTT3′	5′GTTTCGTCAGAACACCACT3′
				二氢叶酸还原酶DHFR L1(dfrD)	tmp 14	5′ATGGAATGTCGTTATCCTTGCCGATTACTCTTT3′	5′ATTGTTGCGATGGATAAG3′
S1 DHFR	tmp 15	5′TGTCGCTCACGATAAACAAAGAGTCATTGGGTAC3′	5′AATCATTTGGTAAGTGCC3′
				I型3′-氨基糖甙磷酸转移酶(aphA1)	tob 1	5′CAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAA3′	5′CGATAGATTGTCGCACCT3′
FirA	rif 1	5′TGCCCGTAACCGTCACTTTGTCGCATTTTCCAT3′	5′TTGGCGACAATACGGC3′
				RNA聚合酶β亚基(点突变)	rif 2	5′ACAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAATTGGCT3′	5′GGAGTTCTTCGGCACCAG3′
利福平抗性(firA)	rif 3	5′CTATTCTAGCGTTTCTGCC	5′TGAAATCCGCTA

		GATATTTACTCCTC3′	TTGTTG3′
				RNA聚合酶β亚基(rpoB)	rif 4	5′TTCAACACGACCTCTGTGCTTAGCTGTAATAGCCG3′	5′TTTCAGCAGCGACAGCA3′
RNA聚合酶β亚基(rpoB)	rif 5	5′AGAAAGGAATACATGCTGTCGCAACGGCAACTACC3′	5′TGGGACGTCACCAAGGGG3′
				膜结构蛋白(ptr)	rif 6	5′CGGAGTCCAAGAACCCGCAGGGCGACAGGC3′	5′TGGTTACGGAAGAAGTGC3′
甲苯异恶唑青霉素酶(oxa9)	oxs 1	5′GCCCACGAACCAGCCCTGCGGACGACTTTCATTT3′	5′GGCGTATGCCACAATCCC3′
				ABC转运因子TetB(tetB)	oxs 2	5′ACCTGGCCGATGCCTGTGAGCCGGATGAAC3′	5′GTCCGCTTCGCCTTGAT3′
ABC转运因子TetA(tetA)	oxs 3	5 ′CGTGAGCATCAAGCCGTTCGCCTTCGCCGTTTC3′	5′GGATGTCGCTGGCTTGG3′
				甲苯异恶唑青霉素水解酶(oxa2)	oxs 4	5′ATCGTAACGAGCTGCCCTTTCGGGTAGAACATC3′	5′CTTCCCAGCCCGTCTTTG3′
DNA旋转酶(gyrB)	na 1	5 ′CCGCAAAGGGCTGATGGACGGCTTGGGACTG3′	5′TGCGGTGGTAGCGTAGTTT3′
				C类β-内酰胺酶(ampC)	fep 1	5′AGCCGCTCAAGCTGGACCATACCTGGATTA3′	5′CGCCTCTTCCGCTTTCG3′
β-内酰胺酶(bla)	zox 1	5′GTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA3′	5′TCGTATTGCCTTTGAGCC3′
				β-内酰胺酶SHV-13(bla)	ctr 1	5′TCATTCAGTTCCGTTTCCCAGCGGTCAAGGCG3′	5′TGACGGTCGGCGAACTCT3′
β-内酰胺酶(cumA)	roxh 1	5′AATCCGACTTAGTTGCTTACAGCCCTATTACAGAA3′	5′TTGAGTGACTTTGGCTGGA3′
				β-内酰胺酶(blaB)	roxh 2	5′ATCGCAAAGCGTTCTTCACCACGGTATGTTATT3′	5′CCAATGCTATGGGCTGAC3′
β-内酰胺酶(blaIRT-14)	ca 1	5′GAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGC3′	5′TTCTGCTATGTGGTGCGG3′
				延长因子G(EF-G)	fa 1	5′GCAGCAGATGTGATAGTA	5′ATGGACTGGAT

(fus)		ATACCACGGTCTTGTTC3′	GGAGCAA3′
				酯酶(fusH)	fa 2	5′GCGACCCTGGGCGGCAAGACCCTCGGCAT3′	5′GTGGTGACGGGTTCGGC3′
阅读框	fa 3	5′TCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGG3′	5′ATAACCAGACCGTTCAGC3′
				普那霉素抗性蛋白(VgaB)	pri 1	5′GGATAAAATAGGTATTGTAGGTAAGAATGGAGTTGGC3′	5′ATCTTGAAATCCCTCTGC3′
抗抑制因子的β-内酰胺酶TEM-77(blaTEM-77)	amc 1	5′AATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGC3′	5′GCACGAGTGGGTTACATC3′
				连接酶(vanE)	va 1	5′CGTTTCCCAACACGGCACAGCCAACTTCA3′	5′GACGCCGCCATTGAAACA3′
D-α-D-α肽酶(vanXst)	va 2	5′CGTGATGGAGTCCTGCGGTTTCAAGGCGTA3′	5′TCGGCGAGCGTGTAGTG3′
				D-乳酸脱氢酶(vanH)	va 3	5′GCTCATCAGTCCGCATACCGCCTATTACAC3′	5′TACTACTTCCCGCTTTCG3′
D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶(ddlN)	va 4	5′GAGCCGTACTACATCGGGATCACCCAGAGC3′	5′TCGCCGTTCTCCCAGTC3′
				D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽酶(vanx)	va 5	5′GGACCTGACGCTCTACCGCCTGGACACC3′	5′CACCACTCGCACTCGTAG3′
万古霉素抗性蛋白vanx)	va 6	5′TCGCATTGTAGGGACATACGAGTTGGCTGA3′	5′AACCGTCCCATAGAAGCA3′
				D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶	va 7	5′CGCTTGCGGCTCATCATTGCCCAGAACGCTCAC3′	5′TTGAAGCAGGCGATTGAG3′
VanS(vanSb)；VanY(vanYb)	va 8	5′CTGGCTGGATTTACCGCTCACATCAACA3′	5′CTACGATTTGTGGCTGGT3′
				D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶(vanD)	va 9	5′ACTGGGAAACGGAAATGATCTCATGGCTGGCG3′	5′TAAGGCGGCTGGAACTCG3′
D-α-D-α连接酶	va 10	5′GCGGACGACCGAATAGG	5′CGGCATCCCCT

		TGAGCGACTTG3′	ACGTCGG3′
				万古霉素抗性蛋白(vanC-3)	va 11	5 ′CGGTGTTGAGATCGGTTGCGGTATTTTGG3′	5′AGCACCGACAGTCAAAGA3′
D-Ala：D-Lac连接酶(vanB)	va 12	5′GCCAAAGGACGAACCTGACCGTGCCG3′	5′ATGGACAAATCACTGGC3′
				万古霉素抗性蛋白(vanB)	va 13	5′TCCTGATGGATGCGGAAGATACCGTGGCTC3′	5′TTGATTGTCGGCGAAGTG3′
VANA连接酶(vanA)	va 14	5 ′CAATACCGCACAACCGACCTCACAGCCCGAAAC3′	5′TTCAGGCTCATCCTTCGG3′
				VanR	va 16	5′CCCGAGCAATTAACTCCAGTGGGCGAAAGG3′	5′CGGGAAAGATACAGAGGT3′
万古霉素组氨酸蛋白激酶(vanS)	va 17	5′GACAATGCTCGTTCTTCCGATACGGGTGG3′	5′CAACCAAGTCTGGCATCG3′
				万古霉素抗性蛋白(vanH)	va 18	5′TACCTTGCCACGGTCGCTGTCCAACCTGAA3′	5′GCCTCTATTCTTCTTGCG3′
D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶相关蛋白(vanC)	va 19	5′TTTGTTCATACATAATGCGGAGGCAGCGAC3′	5′GAAGTATGGCGAGGATGG3′
				D-特异D-2-羟酸脱氢酶(ddh)	va 20	5′ACACGGCGTTCAATATCTGGGAAGCGACGCACTA3′	5′TCTGTTTCTATCGCCCTAC3′
D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶相关蛋白	va 21	5′CTTGCCTATGCGGTCGTCAGGAACGCGGGAATC3′	5′GACGGTCCAGAAGTTCGG3′
				四环素抗性蛋白(tetC)	tet 1	5′CCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATG3′	5′GCTTGTTTCGGCGTGGGT3′
四环素抗性决定簇(tetV)	tet 2	5′CGCCCGCCCAGCCCGCCTCCGAGCACCAT3′	5′GTCCCAGCACGACGAGCACGAA3′
				四环素抗性蛋白(tetAJ)	tet 3	5′GCTAATGATAACCGTGTTGCGTTCTCCCC3′	5′AAGTTCGTTTCGCTTGGC3′
药物泵出蛋白(TetA)	tet 4	5′GACTGGCGGCGGCGACATCGGGTTCCTC3′	5′CAAGGTAATCAAGCAGGGTA3′

四环素抗性蛋白(tetR)	tet 5	5′GCTGGTTTCGAGCGGCTGCGTTCATCTACAAC3′	5′TGTTGTAGATGAACGCAGCC3′
				四环素抗性蛋白(TetG)	tet 6	5′CACATGCGATCTTCCAAGCGTTTGTTACCG3′	5′GAACACCATCCATCCCTGC3′
革兰氏阳性四环素泵出样蛋白(bct1)	tet 7	5′CTGGAGCAACTAATTTCGCCACCGCAATCATAC3′	5′GATTTTCGCAAGGTTAGTG3′
				四环素抗性蛋白(tet)	tet 8	5′TCGATCCAATAAGACCAAATGCTTTACCCC3′	5′CTCGTAATGGTTGTAGTTGC3′
四环素抗性蛋白(TetW)	tet 9	5′GCAAAGCGGAAACAACCTCCAACTGCACCCG3′	5′CTGGACGCTCTTACGCAACT3′
				tet基因	tet 10	5′CGACAACCATCACAAGAGCTGGGAATGCGG3′	5′AGCCCGATTTATTCAAGG3′
TetBSR	tet11	5′AACCGCCTACAATCGCAATACCCGTTCCCTCTG3′	5′ATCAGAGGGAACGGGTATTG3′
				TetQ蛋白	tet 12	5′TGGATCAGCAATGTTCAATATCGGTATCAATGAGT3′	5′TTTTATGTCCTTTGGGGTCA3′
TetO	tet 13	5′GCTCTATGGACAACCCGACAGAAGCCCAGAAAGG3′	5′GGAGGCAGAAATAAAAGAGC3′
				四环素抗性蛋白(tetA(p))	tet 14	5′CCAATAAATGCTCCTATCTGCCCTGCTTGTGCTCCC3′	5′GTAGCACAGATTGTATGGGG5′
四环素抗性蛋白(tetB(p))	tet 15	5′AGGTTGCCCTCATAGTTTCTAAATCCCATACCGCTT3′	5′CAGCCAGCACTCCAGCAGAT3′
				四环素抗性蛋白(tetA)	tet 16	5′GTTGTTATAGAAGCCGCATAGATCGCCGTGAAG3′	5′GGCAGGTGGATGAGGAAC3′
四环素抗性蛋白(tetA)	tet 17	5′TAGAAGCCGCATAGATCGCCGTGAAGAGGA3′	5′CAGGCAGGTGGATGAGGA3′
				E类tetA	tet 18	5′TCGCATAGGTCGTCGCCCTGTATTGTTACTTTCA3′	5′ACAACACCACACTACGCTG3′
四环素抗性决定簇tet(U)(orf1)	tet 19	5′CTGTCACATCCAACCCCAAAAGCCACGTATCCAAT3′	5′GCTGAGCCTTCTAATTGGTC3′

(ORF2)	tet 36	5′TTTTCGTCCAATAAGCTATGGTATCATTCAGTTTTCC3′	5′TAACCGTATTTCTAACAGCG3′
				四环素抗性蛋白(tetM)	tet 20	5′TGTGTGACGAACTTTACCGAATCTGAACAATGGG3′	5′TTTCCGCAAAGTTCAGAC3′
四环素抗性蛋白(tetM)	tet 21	5′GCGTTGAGAAGCTGAGGTGGTATCGGCAA3′	5′CCCAGTGCTGTTGTTGTC3′
				TetT(tetT)	tet 22	5′CATCTAACACTTTCAGAGTTCGCTCAACTTCGGCTA3′	5′CGGGCGTCTACAGTTTCA3′
四环素抗性(TetS)	tet 23	5′GTCATTCTCATTGGTGAAATTCCAGCCCGT3′	5′TGAATACAACGGGCTGGAA3′
				tet	tet 24	5′TACAACGGGCTGGAATTTCACCAATGAGAATGACC3′	5′AGATTTCCGAATGCTTGCG3′
H类抗四环素泵出蛋白	tet 25	5′ACAACTTCTATCGGTATGTCTTTGGCGGTTCTGG3′	5′CTGGTAAGATGACCCAAACG3′
				pp-tetA	tet 26	5′CAGCAGCGCCCGGCGGAAACTCATTGCA3′	5′CTGGGAATAGAACAGCCGACAC3′
tetA(G)＝TetA	tet 27	5′CGGCGGTGGCAGAATAGAGTGCTGTGAA3′	5′TCCCGATTCTGTTGCTGC3′
				四环素抗性(tetK)	tet 28	5′ATAACTGTTTTAGTAAAAGATAATCCGCCCATAACAA3′	5′TGTAAATGTAGCGACAATAGGT3′
四环素抗性决定簇(tetB)	tet 29	5′CGATAGTTAGCAACGCAGCGATAAAGAAGGGGCAA3′	5′TGGTTCGGTTGGTTAGGG3′
				四环素抗性蛋白(tet)	tet 30	5′TATTAGTTTGAGCTGTCTTGGTTCATTGATTGCTTTT3′	5′CCACCATAATCAGTGAAGGGA3′
杀菌抗性蛋白(qacA)	tet 31	5′CATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTCGA3′	5′GATGTTACAGCCTCGTTTGC3′
				四环素抗性蛋白(tetL)	tet 32	5′TTAGCGTATTAAATGAAATGGTTTTGAACGTCTC3′	5′CAGTTTGTACTCGCAGGTGGT3′
四环素抗性蛋白	tet 33	5′CCGAATGCCCGCCAACTC	5′GGACCGACCGC

		CCGTGCCAGG3′	TGAAGG3′
				D类tetA	tet 34	5′TCCGCCCGAGATACAACATCCACAGCACAT3′	5′GCCGTTTGTCATTGCG3′
四环素抗性决定簇(tet347)	tet 35	5′CGGCAAGCTCATCGCGTCCTCGGGCCGGTTCA3′	5′GAGGTGATGACGGTCTGGGACA3′
				拓扑异构酶IV(parC)	CIP-05	5′TGGCGGCGGAAGACCAACCACTCAGTCAGGAT3′	5′TGATGAGCCACCTGTTCG3′
A类β-内酰胺酶(bla IBC-1)	TAZ-03	5′CCTGCCACGGAGCGGTTTCTAGCATCGGG3′	5′GTGTTGTCGCCCATCTCC3′
				青霉素结合蛋白(pcbR)	LAC-01	5′GACGCATTCCGACAACTATGGCGATGACCCG5 3′	5′GGTGTAACCCCAATAGCC3′
D类β-内酰胺酶(OXA-18)	LAC-02	5′TCGCAGCAGAAGCCGACCGATCCGACCAT3′	5′CTGCGAATACCAGACGAT3′
				林可霉素抗性蛋白(lmrB)	LIN-01	5′AGCCATAATGCTGACCGCAACCGCTGTTCCGATA3′	5′AAATGTCACGACCACTTCA3′
林可霉素抗性蛋白(lmrB)	LIN-02	5′GAGATCCATCAGTGCTTTGTCTTGCTTGCCGAGTT3′	5′CGCCATCGCACTCCTCAT3′
				林可霉素抗性基因(linAn2)	LIN-03	5′TAAATCGTAGCCCGAATGGAATACTTGTTGCC3′	5′GCGGACGGCACTTCCAAAC3′
林可霉素抗性蛋白(lmrA)	LIN-04	5′GGGATTGCGTGCGGTCGTCTCGTCCTTCTTG3′	5′AAGGCGTTGAGCGTCTGGC3′
				林可霉素抗性蛋白(lmrB)	LIN-05	5′CGTCAAGGTCGTCGGCGAGGACATTCTGC3′	5′TGTGCGGAACGGTCGGAAGC3′
林可霉素抗性蛋白(lmrC)	LIN-06	5′ATCCATCAGTGCTTTGTCTTGCTTGCCGAGTT3′	5′CGCCATCGCACTCCTCAT3′
				林可霉素抗性甲基化酶(lmrB)	LIN-07	5′AAGGCGAACCTCGGCACCCGCTTGAGCACC3′	5′TCACGGCGGAGTCCTGGC3′
林可霉素抗性甲基化酶(lrm)	LIN-08	5′GCCGACATCGTCGACTGGTGCCTGACCG3′	5′CGGTGCGTTTGCGGGCGTA3′
				6′-N-乙酰基转移酶	NET-0	5′GACTCTTCCGCCATCGCT	5′AGCGACCGACT

(AAC(6′)-II)

1

CTGGGCAGGTAGTGTTC3′

CTTGATG3′

本发明通过以下实施例对本发明的基因芯片的制备、检测方法及其应用进行描述。需说明的是，下述实施例只是用来说明而非限制本发明，本领域技术人员所熟知的其他用于通过基因芯片对细菌耐药基因进行检测的技术均在本发明的范围内。

实施例1耐药基因特异性寡核苷酸和扩增引物的合成

利用DNA自动合成仪(PE)按照表6中所列的寡核苷酸序列合成相应的寡核苷酸探针和扩增引物。在合成耐药基因特异性寡核苷酸探针过程中，于每条探针序列的5’端均添加20个额外的胸腺嘧啶核苷(poly(dT)₂₀)，并对所合成寡核苷酸探针的5’端进行氨基修饰。

通过聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳对合成的所有寡核苷酸进行纯化。所述的纯化方法是本领域技术人员已知的。

实施例2细菌耐药基因检测基因芯片的制备

将合成的耐药基因特异性寡核苷酸探针分别溶于适当体积的无菌去离子水中，使各探针的终浓度均为60μM。从所有寡核苷酸探针溶液中各吸取5μl分别置于不同的微量离心管内，并向每个微量离心管中分别加入5μl的二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，美国)。将两种溶液充分混匀后，各取5μl置于386孔板的相应孔中。以醛基修饰的玻片(CSS-100 Silylated Slides，CEL Associates，Inc.，休斯敦，美国)作为固相载体，制备细菌耐药基因检测基因芯片。

利用GSI Flexys基因芯片点样仪(Genomic Solution，美国)将各寡核苷酸探针样品均按照3×3的矩形点阵点到玻片上相应的位置处，这样不同位置上的寡核苷酸探针矩阵便对应于相应的耐药基因。室温下将点制的基因芯片避光放置至少24小时。

实施例3标本中细菌耐药基因的PCR线性扩增和扩增产物的荧光素标记

利用耐药基因特异性引物通过线性PCR扩增对标本中细菌的耐药基因进行扩增，并在扩增过程中向扩增产物中掺入荧光素，以便随后通过激光共聚焦扫描仪进行检测。

将所有的耐药基因特异性引物溶于适当体积的无菌去离子水中，调整体积，使全部引物合并后各引物的终浓度均为10μM。按照本领域技术人员已知的线性扩增方法，以标本DNA为模板利用该引物混合物对标本中相应的细菌耐药基因进行扩增。简言之，在50μl PCR反应体系中的成分如下：1×Taq酶反应缓冲液、2.0mM MgCl₂、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP、2μM引物、2μg模板DNA。将所述的PCR混合物在95℃变性5分钟后加入Taq酶1u，随后以94℃30秒，50℃30秒，72℃120秒的循环参数进行50个循环，最后于72℃反应5分钟。利用Microcon 30(MilliporeCorporation，美国)按照制造商的使用说明对PCR反应产物进行纯化，具体操作如下：将PCR产物加入到Microcon 30样品池中，并用去离子水补足体积至500μl；将其置于一微量离心管中，室温下以12,000×g离心10分钟；将样品池取出，加入10μl去离子水，并将其倒置放于一微量离心管中，室温下以12,000×g离心2分钟。将纯化的PCR产物用于进行与基因芯片的杂交。

实施例4随机引物6聚体对标本中细菌耐药基因荧光素标记

利用随机引物6聚体和大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段(TaKaRa公司，大连，中国)按照本领域技术人员已知的方法对标本中细菌耐药基因进行荧光素标记。具体如下：配置反应体系，使得在50μl终体积中含有1×大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段反应缓冲液、15μg的随机引物6聚体、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP以及2μg模板DNA。将上述混合物在99℃变性2分钟后立即置于冰浴上，随后加入50个单位的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，并于37℃温育2小时。反应结束后，利用Microcon 30(Millipore Corporation，美国)按照前面所述的方法对反应产物进行纯化。

实施例5耐药基因PCR扩增产物与基因芯片的杂交和检测

按照本领域已知的方法对耐药基因芯片进行杂交前的预处理，具体操作如下：将基因芯片经60mJ的紫外线交联后，用0.2％SDS室温洗涤2次，各2分钟；随后用H₂O室温洗涤2次，各2分钟；将基因芯片置于Na₂BH₄(1.3gNa₂BH₄溶于375ml PBS中，并加入125ml无水乙醇)溶液中室温洗涤10分钟；用0.2％SDS室温洗涤2次，各1分钟；用H₂O分别于室温和95℃各洗涤1分钟后干燥待用。将纯化的PCR产物或随机引物标记产物与杂交缓冲液(12×SSC，0.2％SDS)等体积混合，99℃变性5分钟后立即置于冰浴中冷却。将所述的杂交液滴加在基因芯片一侧的边缘，小心盖上盖玻片，使杂交液均匀分布在基因芯片和盖玻片之间，随后将其置于湿盒中，于70℃杂交1小时。杂交后，取出基因芯片，并立即投入到2×SSC+0.2％SDS溶液中，轻轻移去盖玻片，洗涤5分钟，随后用1×SSC+0.1％SDS液继续洗涤5分钟，继而在0.05×SSC中洗涤5分钟，取出后自然凉干。利用GeneTAC 2000基因芯片扫描仪(Genomic Solution Inc.，美国)，在532nm的激发光波长下进行扫描并自动曝光。分析扫描结果，并对荧光信号进行寻址，并与特异性寡核苷酸探针相对应，确定标本中细菌耐药基因的表达状况。

Claims (7)

1.耐药基因芯片，其用于对标本中细菌的耐药基因进行检测，是通过将针对细菌各种耐药基因的特异性寡核苷酸固定于固相载体上制成的。

2.权利要求1的基因芯片，其以玻璃片、硅片、塑料片或者其它可以用于制备基因芯片的材料作为固相载体，所述的固相载体表面经化学修饰而带有活性基团。

3.权利要求2的活性基团，其可以选自氨基(-NH₂)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巯基(-SH)。

4.具有表6中所列核苷酸序列的寡核苷酸，其用于耐药基因芯片的制备和细菌耐药基因的检测，所述的核苷酸序列中探针序列和引物序列分别属于所述耐药基因的互补链之一。

5.权利要求4的寡核苷酸，其中探针序列可直接用于制备基因芯片，在所述探针末端(5’端或3’端)修饰(连接)有活性基团，所述的活性基团选自羧基(-COOH)、氨基(-NH₂)和巯基(-SH)。

6.权利要求4的寡核苷酸，其中探针序列可与引物序列联合用于相关耐药基因DNA序列的PCR扩增，所获的PCR产物也可用于制备基因芯片。

7.权利要求4的寡核苷酸，其中引物序列通过对目的基因的线性PCR扩增而将信标分子标记到扩增产物上，所述的扩增产物通过与基因芯片上的探针杂交而被检测。