KR102359187B1 - 실리카로 코팅된 산화철 나노비드의 제조방법 및 이의 핵산 분리용 용도 - Google Patents

실리카로 코팅된 산화철 나노비드의 제조방법 및 이의 핵산 분리용 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 실리카 쉘의 두께가 약 10nm이고 직경 약 50-60nm인 Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노비드 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본원에 따른 방법에 의해 제조된 나노비드는 높은 포화자화를 제공하며, 실리카 쉘은 핵산에 높은 결합력을 나타낸다. 아울러, 인비트로 실험결과 세포독성이 없이 생체 적합성을 가져, 다양한 시료로부터 핵산의 분리에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

실리카로 코팅된 산화철 나노비드의 제조방법 및 이의 핵산 분리용 용도 {Method of preparing silica-coated iron oxide nanobeads and its use for separating nucleic acids from sample under magnetic field}
본원은 시료에서 핵산을 분리 또는 정제하는 기술과 관련된 분야이다.
초상자성 산화철 나노 비드는 자기 공명 영상, 암치료의 고열요법, 생물학적 분자의 자성분리 등 다양한 생체 의학 분야에 적용될 수 있기 때문에 생물 의학에서 유망한 나노 물질로 간주된다. 산화철 나노 비드의 높은 포화 자화는 이러한 응용에 필수적이다.
생물학적 시료에서 DNA 및 RNA의 분리는 분자생물학 분야의 실험에서 가장 중요하면서도 필수적인 첫단계이다. 특히 임상의학 분야에서 분리된 핵산은 환자의 감염여부 진단, 유전적 질환의 진단 및 유전전 특징 파악 등 다양한 분야에 사용된다. 기존에 원심분리, 에탄올 침전법 및 크로마토그래피와 같은 핵산을 분리하는 다양한 방법이 개발되었으나, 각 방법 별로 장단점이 존재하였다. 자성을 이용한 분리방법은 기존의 방법과 비교하여 신속하고 간편한 방법이나, 산화철 나노 비드의 포화 자화가 높지 않아 문제가 있었다.
대한민국 등록특허 1646610 (2016년 8월9일 공개)
본원에 높은 포화자화를 갖으며, 핵산에 높은 결합력을 나타내는 자성나노비드를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 다음의 단계를 포함하는, 입자 직경이 50 내지 60nm 이고, 실리카 쉘 두께가 10nm인, Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드의 제조방법을 제공한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 (a) 물 중의 0.025mM의 FeSO4·7H2O와 500mM의 NaOH 수용액을 상온에서 교반하면서 반응시키는 단계; (b) 이어 용액을 4℃에서 정치하여, Fe3O4 나노비드의 침전물이 생성되도록 하는 단계; (c) 상기 침전물 생성 후, 상기 용액 중 상층액을 제거하고, 상기 침전물을 물로 세척한 후, 물에 현탁하여 Fe3O4 나노비드 현탁액을 제조하는 단계; (d) 상기 Fe3O4 나노비드 현탁액을 SiO2 나노비드 용액에 1:3의 부피비로 추가하되, 상기 Fe3O4 나노비드 대 상기 SiO2 나노비드는 1:3의 중량비로 포함되고, 상기 용액을 상온에서 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 초음파 처리된 용액을 4℃에서 정치하여 실리카 코팅된 Fe3O4 나노비드의 침전물이 생성되도록 하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계의 침전물이 생성된 후, 상층액을 제거하고, 상기 침전물을 에탄올 및 물로 세척하여, 실리카 코팅된 Fe3O4 나노비드를 수득하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 SiO2 나노비드 용액은 에탄올, 3차 증류수, 18M NH4OH 및 TEOS TEOS(tetraethoxysilane)를 5: 1: 1.7: 0.6의 부피비로 혼합하여 제조될 수 있다.
다른 양태에서 본원에 따른 방법으로 제조된 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원의 방법에 따라 제조된 자성 나노비드를 핵산 결합성 담체로 사용하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분리 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법 또는 나노비드를 이용하여 분리가능한 핵산은 DNA, 또는 RNA를 포함한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원의 방법으로 제조된 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 포함하는 핵산 분리용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본원의 방법에 따라 제조된 Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노비드는 실리카 쉘의 두께가 ~10nm이고 직경 50-60nm인 자성입자이다. 본원에 따른 방법에 의해 제조된 나노비드는 산화철 코어가 크게 제조되어 높은 포화자화(= 33.80emu/g)를 제공하며, 실리카 쉘은 핵산에 높은 결합력을 나타낸다. 아울러, 인비트로 실험결과 세포독성이 없이 생체 적합성을 가져, 다양한 시료로부터 핵산의 분리에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노비드의 합성을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노비드의 a. HRTEM 이미지; b. HAADF-STEM 이미지이고, c. Fe; d. O; e. Si 원소 및 f. 모든 원소 (Merge)의 맵핑 이미지이다.
도 3은 bare Fe3O4 나노비드 (아래) 및 Fe3O4@SiO2 코어쉘 나노비드 (위)의 bare Fe3O4 나노비드의 X-Ray 회절 패턴을 나타낸다. 할당 값은 다음과 같다: (hkl) Miller indices: 2θ(hkl) = 18.31°(111), 30.13°(220), 35.37°(311), 37.02°(222), 43.14°(400), 53.39°(422), 56.85°(511), 62.57°(440), 70.82° (620), 73.88°(533), 74.96°(622), 78.93°(444), 86.78°(642), 89.70°(731), 94.48°(800).
도 4는 bare Fe3O4 나노비드 (위) 및 Fe3O4@SiO2 코어쉘 나노비드 (아래)의 bare Fe3O4 나노비드의 FT-IR 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 세로 점선은 각각 Fe-O and Si-O-Si 스트레칭 바이브레이션으로 인한 흡수 피크를 나타낸다.
도 5는 bare Fe3O4 나노비드 및 Fe3O4@SiO2 코어쉘 나노비드의 M-H 커브를 나타낸다.
도 6은 Fe3O4@SiO2 코어쉘 나노비드로 처리된 DU145 및 NCTC1469 세포의 인비트로 세포 생존능을 나타낸다.
도 7은 본원에 따라 제조된 Fe3O4@SiO2 코어쉘 나노비드를 이용하여 분리된 핵산을 이용하여 증폭반응의 일종인 LAMP 반응을 수행한 결과이다: 1: Sample No. 3 without LAMP and 2-7 LAMP 반응 진행 결과 [2: Sample No. 1; 3: Sample No. 2; 4: Sample No. 3; 5: Sample No. 4; 6: Sample No. 5; 7: 대조군 (핵산을 포함하지 않는 LAMP 반응액만 포함)].
도 8은 사이클에 따른 실시간 증폭에서 형광 곡선을 나타낸다 (1 cycle = 30 s): a. A549 비소폐암세포 시료로부터 분리된 핵산, b. 뎅기 바이러스 시료에서 분리된 핵산, 및 c. 대조군(핵산을 포함하지 않는 LAMP 반응액만 포함). RFU = relative fluorescence unit.
본원은 높은 포화자화를 제공하며, 실리카 쉘은 핵산에 높은 결합력을 나타내는 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드의 제조 방법의 개발에 근거한 것이다.
이에 한 양태에서 본원은 입자 직경이 50 내지 60nm 이고, 실리카 쉘 두께가 10nm이며, 33.80emu/g의 포화자화를 나타내는, Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 제공한다.
다른 양태에서 본원은 다음 단계를 포함하는 본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드 제조 방법을 제공한다.
일 구현예에서 상기 방법은 (a) 물 중의 0.025mM의 FeSO4·7H2O와 500mM의 NaOH 수용액을 상온에서 교반하면서 반응시키는 단계; (b) 이어 용액을 4℃에서 정치하여, Fe3O4 나노비드의 침전물이 생성되도록 하는 단계; (c) 상기 침전물 생성 후, 상기 용액 중 상층액을 제거하고, 상기 침전물을 물로 세척한 후, 물에 현탁하여 Fe3O4 나노비드 현탁액을 제조하는 단계; (d) 상기 Fe3O4 나노비드 현탁액을 SiO2 나노비드 용액에 1:3의 부피비로 추가하되, 상기 Fe3O4 나노비드 대 상기 SiO2 나노비드는 1:3의 중량비로 포함되고, 상기 용액을 상온에서 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 초음파 처리된 용액을 4℃에서 정치하여 실리카 코팅된 Fe3O4 나노비드의 침전물이 생성되도록 하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계의 침전물이 생성된 후, 상층액을 제거하고, 상기 침전물을 에탄올 및 물로 세척하여, 실리카 코팅된 Fe3O4 나노비드를 수득하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법에 실리카 코팅을 위해 사용되는 SiO2 나노비드 용액은 본원 실시예에 기재된 것과 같은 Stober 방법으로 제조될 수 있다. 일구현예에서 에탄올, 3차 증류수, 18M NH4OH 및 TEOS(tetraethoxysilane)를 5: 1: 1.7: 0.6의 부피비로 혼합하여 제조된다.
본원의 방법에 따라 제조된 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드는 입자 직경이 약 50 내지 60nm 이고, 실리카 쉘 두께가 약 10nm이며, 33.80emu/g의 높은 포화자화를 나타낸다. 또한 보자력(coercivities)과 잔류성(remanences)은 거의 0으로 초상자성 특징을 가진다(본원 도 2 내지 5 등 참조).
본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드는 세포, 조직과 같은 핵산을 포함하는 시료에서 핵산을 순수하게 분리하는데 사용될 수 있는 것으로, 특히 생체 적합성 특징을 갖는 것이 중요하다. 본원의 방법에 따라 제조된 자성 나노입자는 도 6에 나타난 바와 같이, 세포 독성을 나타내지 않아, 생체 적합성을 가진다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 이용한 세포, 및 조직과 같은 핵산을 포함하는 생체 시료 또는 인비트로 반응물에서 핵산을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
실리카로 코팅된 자성입자를 이용한 핵산 분리방법은 카오트로픽(Chaotropic) 시약(R. Boom et al., J. Clin. Microbiol., Vol 28(3), p495-503 (1990))을 이용하여 실리카가 핵산과 결합하게 되고, 외부자력을 이용하여 실리카 코팅된 자성입자를 나머지 용액으로부터 분리해냄으로서 수행된다.
본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 이용한 핵산 분리 방법은 핵산의 분리 정제가 필요한 시료(예를 들면 원핵 또는 진핵 세포 또는 조직과 같은 생체 시료, 또는 특정 반응을 위해 효소 처리된 인비트로 반응물 등을 포함)을 제공하는 단계로, 예를 들면 상기 시료는 세포 등을 파쇄하여 핵산이 포함된 파쇄물 또는 정제가 필요한 인비트로 증폭반응물 또는 합성된 핵산물을 포함하는 것이다. 상기 시료와 본원에 따른 자성 나노비드를 적절한 결합 완충액 중에서 혼합하는 단계로 이에 의해 상기 자성 나노비드에 시료 중의 핵산이 결합되며; 이어 상기 혼합물에 외부 자력을 제공하는 단계로 상기 자력의 제공에 의해 핵산이 결합된 자성 나노비드가 상기 혼합물을 포함하는 용기의 자력이 제공되는 쪽으로 이동하여 모아지고; 이어 혼합물의 자성 나노비드를 제외한 상층액을 제거하는 단계; 상기 외부 자력을 제거한 후, 상기 자성 나노비드 증류수와 같은 세척액을 이용하여 세척하는 단계; 및 상기 세척된 자성 나노비드에 결합된 핵산을 용출하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 이용한 핵산 분리 정제 방법에 사용되는 결합 완충액은 카오트로픽(chaotropic) 시약으로, 예를 들면 구아니딘염, 우레아, 염화물, 요오드화물, 과염소산염, (이소)티오시안산염 등이 포함되며, 구체적인 화합물로는 소디움 퍼크로레이트(Sodium perchlorate), 구아니딘하이드로클로라이드(Guanidine hydrochloride), 구아니딘 이소티오시아네이트(Guanidine isothiocyanate), 포타슘 요오드(Potassium iodide), 포타슘 티오시아네이트(Potassium thiocyanate), 소디움 클로라이드(Sodium chloride), 소디움 이소티오시아네이트(Sodium isothiocyanate), 마그네슘 클로라이드(Magnesium chloride), 소디움 요오드(Sodium iodide) 등을 예로 들 수 있다. 카오트로픽 시약은 1 내지 8 M(mol/L) 농도로 사용된다.
본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 이용한 핵산 분리 정제 방법에 사용되는 용출 완충액으로는 예를 들면 Tris-(hydroxymethyl)amino methane 완충액이 사용될 수 있다.
본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 이용한 핵산 분리 정제 방법은 시료로부터 핵산이 분리됨과 동시에 기타 세포내 단백질과 같은 물질로부터 정제될 수 있다.
본원에 따른 방법에 상기 핵산은 생체 유래 또는 인비트로 반응물의 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로, 전자는 플라스미드 DNA, 유전체 DNA, cDNA, PCR(Polymerase chain reaction) 반응 생성물, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프라이머(primers)를 포함하고, 후자는 mRNA, siRNA, miRNA를 포함한다.
본원은 또한 본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 포함하는 핵산 분리 정제용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
본원에 따른 조성물 또는 키트는 핵산과 실리카 자성나노입자를 결합시키기 위한 카오트로픽 시약, 용출 시약, 및/또는 세척용 시약 및/또는 사용 안내서를 포함할 수있다.
본원의 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 이용하여, 분리된 핵산은 핵산을 이용한 다양한 반응에 사용될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 본원에 따른 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 이용하여 세포에서 DNA를 높은 순도로 분리할 수 있었다.
이어 이러한 분리된 DNA를 핵산 증폭 반응의 일종인 LAMP 반응에 사용한 결과, 주형을 성공적으로 증폭할 수 있었으며, 이는 본원에 따른 자성 나노비드 및 이를 이용한 방법에 의한 우수한 핵산의 분리 정제를 나타내는 것이다(도 7 내지 8 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험재료 및 방법
1. FeSO4·7H2O (≥ 99%), NaOH (> 99.9%), ethanol (≥ 99.5%), NH4OH (≥ 99.99%), 및 테트라에틸 오르쏘실리케이트(tetraethyl orthosilicate) (TEOS) (98%)를 포함한 모든 화합물은 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며, 구매한대로 사용되었다. 에탄올(99% Duksan, South Korea)은 나노비드의 초기 세척(washing)에 사용되었다. 3차 증류수를 최종 세척에 사용하였으며, 수성 나노비드 현탁액 샘플의 제조에 사용하였다.
2. 본원에서 합성된 나노비드의 특징 규명에 사용된 방법
HRTEM 이미지 및 원소 맵핑 이미지(Titan G2 ChemiSTEM CS Probe, FEI)를 측정하여 Fe3O4@SiO2 나노비드 입자의 직경, 형태 및 코어-쉘 구조를 규명하였다. 분말 시료의 결정 구조를 결정하기 위해서 미필터된 CuKα radiation (λ = 0.154184 Å)을 갖는 XRD 패턴 (X’PERT PRO MRD, Philips)을 기록하였다. Fe3O4@ 표면 상의 실리카 코팅을 조사하기 위해 FT-IR 흡광도 스텍트럼(Galaxy 7020A, Mattson Instruments, Inc)을 분석하였다. 자화(M, Magnetization) 대 적용된 장(H, applied field)의 커브(즉 M-H 커브)를 VSM(7407-S, Lake Shore)을 300 K에서 이용하여 측정하고, 본원에 따른 나노비드의 자성 특징을 규명하기 위해 사용하였다. 용액 샘플 중 철(Fe) 농도를 측정하기 위해 ICPAES(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer) (Optima 7300DV& Avio500, Perkin Elmer)를 사용하였다. 본원에 따른 나노비드의 생체적합성은 인간 전립선 암세포(DU145) 및 정상 마우스 간세포(NCTC1469)의 세포 생활도(viability)를 a Luminescent Cell ViabilityAssay (CellTiter-Glo, Promega)를 사용하여 측정하였다.
3. 시료: 암세포, 바이러스 및 박테리아
핵산을 분리하기 위한 5 종류의 시료는 표 4와 같다. 5 종류의 샘플은 다음과 같다: A549 비소폐암세포 (Sample No. 1), 바실러스 세레우스(bacillus cereus) (ATCC® 14579TM) (Sample No. 2) 및 캠필로박터 제주니(campylobacter jejuni) (Sample No. 3)와 같은 박테리아, 및 뎅기 (Sample No. 4) 및 인플루엔자 A (Sample No. 5) 바이러스. 특정 량의 각 샘플을 2.0mL의 마이크로튜브 중에서 200μl의 인간 혈액 또는 90μl의 인산 완충 식염수 또는 90μl의 혈청과 혼합하였다(표 4 참조). 세포, 바이러스 및 박테리아를 파쇄하기 위해, 200μl의 파쇄 완충액 (10 mM Tris-HCl + 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) + 0.5% sodium dodecyl sulfate)을 각 샘플에 추가하였다. 상기 샘플을 10초간 볼텍싱하고 60℃에서 5분간 배양하고, 200μl의 아이소프로필 알코올을 추가하였다.
4. 샘플로부터 자성을 이용한 핵산 분리
샘플을 포함하는 2mL의 마이크로-튜브를 8구의 마이크로튜브 랙에 넣고, 20μl의 자성 나노비드 용액을 상기 샘플에 추가하고, 10초 동안 볼텍스하였다. 이어 자석을 상기 랙의 뒷면에 1분간 부착하였다. 상기 튜브 중의 용액을 따라 내고, 자석을 상기 랙으로부터 분리하였다. 800ul의 세척 완충액-1 (MagListo-2, Bioneer, USA)을 상기 샘플에 추가하고 10초 동안 볼텍스하였다. 상기 자석을 상기 랙의 뒷면에 다시 1분간 부착하였고, 튜브의 용액을 따라 낸 후, 상기 자석을 탈착하였다. 이러한 완충액-1을 사용한 세척과정을 3회 반복하였다. 동일한 세척과정을 완충액-2(MagListo-2, Bioneer, USA)로 3회 반복하였다. 이 단계에서 샘플의 핵산은 정제된 것으로 간주되었다. 이어 나노비드 표면에 부착된 핵산을 분리해내기 위해, 80μl의 용출 완충액(MagListo-2, Bioneer, USA)을 상기 샘플에 추가하고, 10초간 볼텍스하였다. 상기 랙의 뒷면에 자석을 부착하고, 핵산을 포함하는 용액 샘플을 새로운 마이크로-튜브로 옮겼다.
5. 샘플로부터 분리된 핵산의 분석
샘플로부터 핵산이 성공적으로 분리되었는지 여부의 확인은 다음과 같은 4가지 종류의 실험으로 수행되었다.
먼저, 분리된 핵산의 농도는 UV-visible absorption spectrometer (QIAxpert, Qiagen, Germany)를 이용하여 260nm에서 흡광도(=A260)를 측정하여 결정하였다. 분리된 핵산의 순도는 A260/A230 and A260/A280 비를 측정하여 결정하였으며, A230은 아이소프로필 알콜 및 EDTA와 같은 유기 화합물의 230nm에서의 흡광도이고, A280은 단백질의 280nm에서의 흡광도이다. 분리된 핵산의 흡광도는 A260/A230 및 A260/A280의 수치가 1.9 내지 2.2 사이면 높은 것으로 간주된다.
다음으로, 분리된 핵산은 아가로스 젤에 전기 영동을 수행하여 확인하였다.
또한 분리된 핵산의 LAMP 반응으로 확인하였다. 구체적으로 분리된 핵산의 LAMP 반응(T. Notomi, H. Okayama,H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino, T. Hase, Nucleic Acids Res. 28, e63 (2000))은 분리된 핵산 샘플 2μL를 2X 완충액, Bst DNA 또는 RNA 폴리머라제 및 프라이머를 포함하는 23μL의 LAMP 용액에 첨가하여 수행되었다. LAMP 동안 증폭으로 인해 핵산 농도가 10pg /μL를 초과하면 용액 색상이 보라색에서 파란색으로 변경된다(23. C. Reuter, N. Slesiona, S. Hentschel, O. Aehlig, A. Breitenstein, A. Cs
Figure 112020058398964-pat00001
ki, T. Henkel, W. Fritzsche, Appl. Microbiol. Biotechnol. 104, 405-415 (2020)).
마지막으로 LAMP 반응동안 핵산 증폭은 실시간 핵산 증폭 장비(TP650, Takara, Japan)을 사용하여 실시간 형광 커브 대 사이클(1사이클= 30초)를 기록하여 확인하였다.
도 7의 실험 방법 및 재료는 다음과 같다.
주형은 Bacillus cereus (ATCC® 14579™)에서 추출한 핵산을 사용하였으며, 표적 유전자는 Bacillus cereus EntD이며, 증폭용 프라이머 및 반응 조건은 다음 표와 같다. FIP 및 BIP 프라이머는 각각 1.6uM, F3 및 B3는 각각 0.2uM로 사용하였다. 총 25ul 부피에서 반응을 수행하였다(핵산 2㎕, 2X Reaction buffer 12.5㎕, Bst Polymerase 1㎕, 프라이머 2㎕, 증류수 7.5ul). 63℃에서 30분 후 80℃에 3분 진행하였다.
[표 1]
Figure 112020058398964-pat00002
도 8의 실험 방법 및 재료는 다음과 같다.
주형은 A549(ATCC® CCL-185) 및 뎅기바이러스(NCCP 43248)에서 추출한 핵산을 사용하였으며, 표적 유전자는 A549 세포는 wdr1 gene (RNA 타겟), 뎅기바이러스는 Polyprotein gene (RNA 타겟)이며, 증폭용 프라이머 및 반응 조건은 다음 표와 같다. FIP 및 BIP 프라이머는 각각 1.6uM, F3 및 B3는 각각 0.2uM로 사용하였다. 총 25ul 부피에서 반응을 수행하였다 (핵산 2㎕, 2X Reaction buffer 12.5㎕, Bst Polymerase 1㎕, 프라이머 2㎕, 증류수 7.5ul). 58℃에서 30분 후 80℃에 3분 진행하였다.
[표 2]
Figure 112020058398964-pat00003
[표 3]
Figure 112020058398964-pat00004
실시예 1. Fe 3 O 4 @SiO 2 코어-쉘 나노비드(코어 = Fe 3 O 4 및 쉘= SiO 2 )의 합성
단일 Fe2+ 전구체를 사용하여 Fe3O4 나노비드(도 1 참조)를 제조하였다. 반응식은 다음과 같다:
3Fe2+ (aq) + 8OH- (aq) → 3Fe(OH)2 (s) + 2OH- (aq) → Fe3O4(s) + 4H2O(ℓ)
0.5mmol의 FeSO4·7H2O를 실온에서 대기 조건하에 50mL 비이커에 담긴 20mL의 3차 증류수에 자기 교반하면서 첨가 하였다. 이어 20mL의 3차 증류수에 녹인 10 mmol의 NaOH를 FeSO4·7H2O 용액에 천천히 추가하였고, 상기 용액의 pH는 >8이었다. 상기 반응혼합물을 30분 동안 자기 교반하였고, 400mL의 3차 증류수가 담긴 500mL 비이커로 옮겼다. 상기 프러덕트 용액을 Fe3O4 나노비드가 바닥에 침전될때까지 냉장고(~4℃)에 보관하였다. 이어 Na+, OH-, 및 비반응(unreacted) 전구물질을 포함하는 상부 투명한 용액을 따라냈다. 침전물을 3차 증류수로 3회 세척하였다.
이어 Fe3O4 나노비드를 실리카(즉 SiO2)로 코팅하기 위해, SiO2 나노비드를 St
Figure 112020058398964-pat00005
ber 방법으로 제조하였다(W. St
Figure 112020058398964-pat00006
ber, A. Fink,E. Bohn, J. Colloid Interface Sci. 26,62-69(1968)). TEOS(Tetraethyl orthosilicate)는 물의 추가시 SiO2로 변환된다. 이를 위해, 50mL의 에탄올, 10mL의 3차 증류수, 1.7mL의 18M NH4OH, 및 0.6mL의 TEOS를 500mL 비이커에서 혼합하였다. 상기 혼합 용액을 대기 조건하의 실온에서 1시간 동한 자기 교반하였다. 이어 상기 20ml의 Fe3O4 나노비드 용액을 상기 60ml의 SiO2 나노비드 용액(pH=8~9)에 서서히 추가하였다. 상기 혼합물을 대기 조건하에서 5시간 동안 계속 초음파처리하였다. NH4+, OH-, 및 자유 SiO2 나노비드를 상기 프러덕트 용액으로부터 제거하기 위해, 상기 프러덕트 용액을 400mL의 에탄올로 희석한 후, Fe3O4 나노비드가 비이커 바닥에 침전될때까지 냉장고(~4℃)에 보관하였다. 상층액을 제거하였다. 에탄올을 이용한 세척은 3회 반복되었다. 나노비드에서 에탄올을 제거하기 위해, 3차 증류수를 이용한 동일한 세척과정을 3회 반복하였다. 수득한 나노비드를 두 부분으로 나누었다: 하나는 공기중에서 건조하여 분말을 수득하였으며, 이는 특징 규명 실험을 위한 실험에 사용되었으며, 다른 하나는 3차 증류수로 희석하여 나노비드 용액 시료(> 15 mM Fe)를 제조하였다.
[표 4] Samples, characterizations, and UV-absorbance results
Figure 112020058398964-pat00007
실시예 2. 본원에서 합성된 나노비드의 특징 규명
2-1. HRTEM 분석 결과
도 2a에 도시 된 바와 같이, Fe3O4@SiO2 나노비드는 입자 직경이 50 내지 60nm 인 거의 구형의 형태를 가졌으며, 명암 대비를 갖는 실리카 쉘 및 Fe3O4 코어를 갖는 코어-쉘 구조를 나타냈다. 쉘 두께는 대략 10nm인 것으로 나타났다. 본원에 따른 방법에서는 단일 전구체 Fe2+를 합성에 사용하여 Fe3O4 나노 비드의 입자의 직경을 크게 제조하였다. HAADF-STEM (high-angle annular dark field-scanning transmission electron microscopy) 이미지는 도 2 b에 기재되어 있다. HAADF-STEM 이미지 상의 원소(Fe, O, 및 Si) 맵핑은 도 2c 내지 도 2f에 기재되어 있다. 원소 맵핑 결과 Fe은 코어(도 2c)에 분포되어 있고, O는 코어 및 쉘 모두(도 2d)에 분포되어 있었으며, Si는 주로 쉘(도 2e)에 분포되어 있는 것으로 나타났다. 겹쳐진(merged) 이미지는 코어-쉘 구조를 명확하게 보여주고 있다(도 2f).
2-2. XRD 분석결과
도 3은 bare Fe3O4 나노비드 (하단) 및 Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노 비드 (상단)의 XRD 패턴을 보여준다. 베어 Fe3O4 나노비드의 XRD 패턴에 나타난 모든 피크는 입방 Fe3O4에 해당하는 (hkl) 밀러 지수로 할당 될 수 있다. Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노 비드는 비정질 SiO2 코팅으로 인해 감소된 피크 강도를 나타냈다. Fe3O4 나노비드의 추정된 셀 상수는 8.37 ± 0.05 Å이며, 이는 보고된 값과 일치하는 것이다 (T. Tegafaw, W. Xu, S. H. Lee, K. S. Chae, Y. Chang, G. H. Lee, Int. J. Mod. Phys. B 31, 1750014 (2017)).
2-3. FT-IR 분석
Fe3O4 나노비드 표면의 SiO2 코팅을 조사하기 위해 베어 Fe3O4 나노비드 (상단) 및 Fe3O4@SiO2 코어-쉘 (하단)의 FT-IR 흡수 스펙트럼을 조사하였다(도 4). 베어 Fe3O4 및 Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노 비드의 FT-IR 흡수 스펙트럼에서 550 cm-1에서의 특징적인 흡수 피크는 Fe-O 스트레칭 진동으로 인한 것이었다(T. Tegafaw, W. Xu, S. H. Lee, K. S. Chae, Y. Chang, G. H. Lee, Int. J. Mod. Phys. B 31, 1750014 (2017)). Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노 비드의 FT-IR 흡수 스펙트럼에서 1090 cm-1에서의 피크는 Si-O-Si 스트레치 진동으로 인한 것이었다(S. Musi
Figure 112020058398964-pat00008
, N. Filipovi
Figure 112020058398964-pat00009
-Vincekovi
Figure 112020058398964-pat00010
, L. Sekovani
Figure 112020058398964-pat00011
, Braz. J. Chem. Eng. 28, 89-94 (2011)). 이러한 결과는 Fe3O4 나노 비드의 표면이 SiO2로 성공적으로 코팅되었음을 나타내는 것이다.
2-4. VSM 분석 결과
베어 Fe3O4 및 Fe3O4@SiO2 코어-쉘 나노 비드의 자기 특성은 300 K에서 M-H 곡선을 기록함으로써 결정되었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 보자력(coercivities)과 잔류성(remanences)은 거의 0으로, 이는 본원에서 합성된 나노 비드가 주로 초상자성임을 나타낸다. 베어 Fe3O4 나노 비드의 포화 자화(Ms)는 78.5 emu/g로 나타났으며, 이는 비자성 SiO2 코팅으로 인해 Fe3O4@SiO2 나노 비드의 33.80 emu/g 보다 높은 값으로 이 수치는 자기 분리에 강력할만큼 충분히 높은 것이다.
2-5. 인비트로 세포독성
Fe3O4@SiO2 코어 쉘 나노비드는 DU145 및 NCTC1469 세포에서 최대 200μM Fe의 매우 낮은 세포 독성을 나타냈다(도 6). 이는 본원 방법에 따라 제조된 나노비드의 우수한 생체 적합성을 나타낸다.
2-6. 분리된 핵산의 분석 결과
Fe3O4 @ SiO2 코어-쉘 나노비드를 이용한 성공적인 핵산 분리는 하기 기재된 바와 같이 다양한 실험(표 4)를 통해 확인되었다.
시험된 모든 샘플에서 LAMP 동안 용액 색상이 보라색에서 파란색으로 변하였다(도 7). 이는 모든 샘플에서 핵산이 성공적으로 증폭되었음을 나타낸다. 따라서 이어 선별된 샘플에 대해서만 추가의 실험을 수행하였다.
분리된 핵산의 농도는 A260의 UV- 흡광도 측정으로부터 샘플 번호 1, 2 및 4에 대해 결정되었다. 3가지 샘플 모두에 대해 농도를 알 수 있었다(표 4). A260 / A230 비율은 세 샘플 모두에 대해 높았으며 분리된 핵산에서 유기 분자에 의한 오염이 거의 없음을 나타냈다. 그러나 A260 / A280 비율은 샘플 번호 1에 대해서만 높았으며, 이는 분리된 핵산이 샘플 번호 2와 4에 대해 단백질에 의해 다소 오염되었으나 그러나 핵산을 검출하는데는 아무런 문제가 없는 정도이다.
LAMP 동안 샘플 번호 1 및 4에 대한 실시간 형광 곡선을 기록함으로써 핵산 분리를 확인 하였다. 형광 신호는 두 샘플 모두에서 관찰되었으며(도 8), 핵산을 함유하지 않은 대조 용액에서는 형광이 관찰되지 않았다.
상기 모든 결과는 모든 샘플로부터 Fe3O4 @ SiO2 코어-쉘 나노 비드에 의한 성공적인 핵산 분리를 나타내는 것이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (7)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 입자 직경이 50 내지 60nm 이고, 실리카 쉘 두께가 10nm인, Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드의 제조방법:
    (a) 물 중의 0.025mM의 FeSO4·7H2O와 500mM의 NaOH 수용액을 상온에서 교반하면서 반응시키는 단계;
    (b) 이어 용액을 4℃에서 정치하여, Fe3O4 나노비드의 침전물이 생성되도록 하는 단계;
    (c) 상기 침전물 생성 후, 상기 용액 중 상층액을 제거하고, 상기 침전물을 물로 세척한 후, 물에 현탁하여 Fe3O4 나노비드 현탁액을 제조하는 단계;
    (d) 상기 Fe3O4 나노비드 현탁액을 SiO2 나노비드 용액에 1:3의 부피비로 추가하되, 상기 Fe3O4 나노비드 대 상기 SiO2 나노비드는 1:3의 중량비로 포함되고, 상기 용액을 상온에서 초음파 처리하는 단계로, 상기 SiO2 나노비드 용액은 에탄올, 3차 증류수, 18M NH4OH 및 TEOS TEOS(tetraethoxysilane)를 5: 1: 1.7: 0.6의 부피비로 혼합하여 제조되는 것인, 단계;
    (e) 상기 초음파 처리된 용액을 4℃에서 정치하여 실리카 코팅된 Fe3O4 나노비드의 침전물이 생성되도록 하는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계의 침전물이 생성된 후, 상층액을 제거하고, 상기 침전물을 에탄올 및 물로 세척하여, 실리카 코팅된 Fe3O4 나노비드를 수득하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 따른 방법으로 제조된 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드.
  4. 제 3 항에 따른 자성 나노비드를 핵산 결합성 담체로 사용하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분리 방법.
  5. 제 4 항에 있어서
    상기 핵산은 DNA, 또는 RNA인, 핵산 분리 방법.
  6. 제 1 항에 따른 방법으로 제조된 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 포함하는 핵산 분리용 조성물.
  7. 제 1 항에 따른 방법으로 제조된 Fe3O4 코어를 갖는 실리카 코팅된 자성 나노비드를 포함하는 핵산 분리용 키트.
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