CN102154441A - 一种甲烷氧化菌的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲烷氧化菌的定量检测方法，包括采样；用PBS溶液对样品进行振摇洗菌；根据样品数量设计和选择带特定孔数的双层微孔滤膜板；菌体抽滤过膜固定、荧光染色和结果分析。根据微孔滤膜板上样品的荧光强度，定量计算土壤或沉积物样品中甲烷氧化菌的数量，为微生物油气勘探与微生物油气藏表征提供技术支持。

Description

一种甲烷氧化菌的定量检测方法

技术领域

本发明涉及微生物定量检测的技术领域，特别涉及一种甲烷氧化菌高通量定量检测方法。

背景技术

甲烷氧化菌是专性烃氧化菌菌群中的一员，是具有高度专一的、以甲烷为唯一碳源的细菌群体。甲烷氧化菌的存活依赖于持续性的甲烷供给。故表层土壤或沉积物中甲烷氧化菌异常的产生往往与深部甲烷的持续微渗漏有关，而甲烷氧化菌异常是微生物油气勘探与微生物油气藏表征的重要指标。

甲烷氧化菌异常的确定需要对甲烷氧化菌的数量进行高通量计数。甲烷氧化菌计数的常规方法是活菌培养法，即取一定量的样品，在室外对样品进行低温保存或干燥保存；在室内对甲烷氧化菌进行活菌培养，再对甲烷氧化菌的数量进行定量计数分析。

然而，活菌培养法存在明显的缺陷：

(1) 化学法是根据样品中甲烷氧化菌在一定时间内对甲烷的消耗量来间接推算甲烷氧化菌的含量。因样品会对甲烷进行吸附，故影响了对甲烷消耗量测定的精度；且测定甲烷消耗量耗时耗力，工作量巨大，无法适应高通量分析的要求。

(2) 活菌培养法是先采集一定量的样品，经低温保存或干燥保存，再在室内对样品中的甲烷氧化菌进行活菌培养和计数分析。由于甲烷氧化菌培养需要甲烷的持续供给，样品需经低温或干燥处理，且室内培养条件与原来样品中甲烷氧化菌所处的生存条件发生了很大的变化，故样品中大部分甲烷氧化菌不能被培养存活，这会人为造成较大的计数误差。此外，若要对大量样品通过室内培养来对活菌进行计数，实验工作量很大，无法实现对大量样品进行快速定量检测。

(3) 分子生物学法相对于化学法和培养法而言，准确性好，工作量也大大降低，但基因组提取和荧光定量PCR测定费用较高，需要有专门的技术人员和大型仪器设备作为支撑，且平均每人每天仅可处理15个左右的样品，这极大地限制了该方法的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能对土壤和/或沉积物等样品中甲烷氧化菌进行准确、高通量、定量检测的新方法。

为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种甲烷氧化菌的检测方法，包括如下步骤：

1、根据土壤和/或沉积物的特征、土壤和/或沉积物中生物种群特征及人类活动情况，确定特定的采样深度和采样量。研究表明，采样深度为从10 cm至200 cm；采样量为从20 g至2000 g。

2、采用PBS溶液对样品进行振摇法洗菌；根据样品类型，称取50-100 g样品置于三角烧瓶中，按1:4(质量/体积比，g/mL)加入PBS溶液后，将三角烧瓶置于摇床上，200 rpm振摇30 min后，若样品存在澄清度不佳，则需在加入终浓度为5%质量的NaCl后，再沉淀15 min；此时菌体均洗脱到PBS上清溶液中。

3、设计和选择合适的微孔滤膜板。微孔滤膜板的选择原则是：能与荧光显微镜配套使用，便于观察和后续分析；能截留甲烷氧化菌和透过甲烷单加氧酶(pMMO)单克隆抗体。本发明采用双层96孔或384孔滤膜板上(上层滤膜板孔径为5 μm，下层滤膜板孔径为0.2 μm)进行试验分析；结果表明，两者阳性对照的菌体截留率为99.5-99.8%，不同浓度间的线性关系R² ≥ 0.9999，无显著性差异，误差在可接受范围之内。在孔板大小不变的情况下，每板孔数越多，能容纳的样品数越多，分析结果也就越准确，但会增加样品抽滤过膜时间。另外，微孔滤膜板需要特定的抽滤装置，故本发明根据样品数量进行孔板设计，设计孔数为96 ~ 384孔。上述微孔滤膜板和配套的抽滤装置可委托专业公司生产。

4、菌体抽滤过膜采用双层96孔或384孔滤膜板；上层滤膜板用于去除颗粒状杂质，下层滤膜板用于截留甲烷氧化菌等微生物，所有细菌等微生物均截留在下层滤膜上；将截留住的甲烷氧化菌全部固定于96孔或384孔滤膜板上。

5、荧光染色：用经FITC标记的甲烷氧化菌跨膜蛋白pMMO的单克隆抗体对pMMO的膜外结构域进行特异性结合；加入的标记单克隆抗体分子个数需超过孔板滤膜上固定的甲烷氧化菌数量的3倍以上。抗体特异性结合后，将孔板加PBST溶液进行抽滤，重复3-5次，将滤膜上尚未结合的单克隆抗体完全除去。

6、用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1) pMMO是甲烷氧化菌的特征性酶，具有特异性，与甲烷氧化菌具有定量对应关系，故该方法定量准确。

(2) 利用抗原与抗体之间存在的特异性反应，该反应的速率快且特异性好，无交叉污染和假阴性等情形出现。

(3) pMMO是一种跨膜蛋白，通过其膜外结构域与相应荧光标记的单抗结合，然后对荧光强度进行测定，得到样品中甲烷氧化菌的数量。该方法可在体外进行，无需对甲烷氧化菌进行培养，不仅大大减小了实验误差，使甲烷氧化菌的计数精度更高，而且能显著提高测定效率。本发明发现，通过对pMMO单克隆抗体进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记后，再读取样品的荧光强度，最后根据荧光强度定量检测样品中甲烷氧化菌的数量；通过与标准品进行对比分析，该方法的误差小于0.15%。

(4) 采用384孔微孔滤膜板一次性可对上百个样品进行分析，大大降低了试验工作量，轻松实现对土壤或沉积物等样品进行高通量定量检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

1、采集稻田土壤50 g，采样深度为50 cm。

2、将样品放入500 mL小口三角烧瓶中，然后加入200 mL PBS溶液，将小口三角烧瓶放置于摇床上，200 rpm振摇30 min后，让其自然沉淀15 min。

3、采用上层孔径为5 μm，下层孔径为0.2 μm的双层96孔滤膜板对上清进行抽滤；取5个已知不同浓度的甲烷氧化菌作为阳性对照，每个浓度做3个平行试验；设置一个阴性对照，做3个平行试验。

4、取掉上层微孔滤膜板，并向下层滤膜板每孔加入100 μL 100 mg/mL经FITC标记的pMMO单克隆抗体，37°C保湿40 min。

5、向下层滤膜板各孔加入100 μL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST溶液并进行抽滤；重复3-4次，直至完全去除尚未结合FITC标记的单抗为止。

6、应用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析，根据标准品和土壤样品中的荧光强度的相对值，对样品中的甲烷氧化菌进行定量测定。

实施例2：

1、采集水塘底泥50 g，采样深度为30 cm。

2、将样品放入500 mL小口三角烧瓶中，然后加入200 mL PBS溶液，将小口三角烧瓶放置于摇床上，200 rpm振摇30 min后，加入12.5 g的NaCl，让其自然沉淀15 min。

3、采用上层孔径为5 μm，下层孔径为0.2 μm的双层96孔滤膜板对上清进行抽滤；取5个已知不同浓度的甲烷氧化菌作为阳性对照，每个浓度做3个平行试验；设置1个阴性对照，做3个平行试验。

4、取掉上层微孔滤膜板，并向下层滤膜板每孔加入100 μL 100 mg/mL经FITC标记的pMMO单克隆抗体，37°C保湿 40 min。

5、向下层滤膜板各孔加入100 μL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST溶液并进行抽滤；重复3-4次，直至完全去除尚未结合FITC标记的单抗为止。

6、应用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析，根据标准品和土壤样品中的荧光强度的相对值，对样品中的甲烷氧化菌进行定量测定。

实施例3：

1、采集稻田土壤50 g，采样深度为50 cm。

2、将样品放入500 mL小口三角烧瓶中，然后加入200 mL PBS溶液，将小口三角烧瓶放置于摇床上，200 rpm振摇30 min后，让其自然沉淀15 min。

3、采用上层孔径为5 μm，下层孔径为0.2 μm的双层384孔滤膜板对上清进行抽滤；取5个已知不同浓度的甲烷氧化菌作为阳性对照，每个浓度做3个平行试验；设置1个阴性对照，做3个平行试验。

4、取掉上层微孔滤膜板，并向下层滤膜板每孔加入100 μL 100 mg/mL经FITC标记的pMMO单克隆抗体，37°C保湿40 min。

5、向下层滤膜板各孔加入100 μL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST溶液并进行抽滤；重复4-5次，直至完全去除尚未结合FITC标记的单抗为止。

6、应用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析，根据标准品和土壤样品中的荧光强度的相对值，对样品中的甲烷氧化菌进行定量测定。

实施例4：

1、采集水塘底泥50 g，采样深度为30 cm。

2、将样品放入500 mL小口三角烧瓶中，然后加入200 mL PBS溶液，将小口三角烧瓶放置于摇床上，200 rpm振摇30 min后，加入12.5 g的NaCl，让其自然沉淀15 min。

3、采用上层孔径为5 μm，下层孔径为0.2 μm的双层384孔滤膜板对上清进行抽滤；取5个已知不同浓度的甲烷氧化菌作为阳性对照，每个浓度做3个平行试验；设置1个阴性对照，做3个平行试验。

4、取掉上层微孔滤膜板，并向下层滤膜板每孔加入100 μL 100 mg/mL经FITC标记的pMMO单克隆抗体，37°C保湿 40 min。

5、向下层滤膜板各孔加入100 μL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST溶液并进行抽滤；重复4-5次，直至完全去除尚未结合FITC标记的单抗为止。

6、应用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析，根据标准品和土壤样品中的荧光强度的相对值，对样品中的甲烷氧化菌进行定量测定。

实施例5：

1、采集海洋表层沉积物50 g，采样深度为30 cm。

2、将样品放入500 mL小口三角烧瓶中，然后加入200 mL PBS溶液，将小口三角烧瓶放置于摇床上，200 rpm振摇30 min后，加入12.5 g的NaCl，让其自然沉淀15 min。

3、采用上层孔径为5 μm，下层孔径为0.2 μm的双层384孔滤膜板对上清进行抽滤；取5个已知的不同浓度甲烷氧化菌作为阳性对照，每个浓度做3个平行试验；设置1个阴性对照，做3个平行试验。

4、取掉上层微孔滤膜板，并向下层滤膜板每孔加入100 μL 100 mg/mL经FITC标记的pMMO单克隆抗体，37°C保湿 40 min。

5、向下层滤膜板各孔加入100 μL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST溶液并进行抽滤，重复4-5次，直至完全去除尚未结合FITC标记的单抗为止。

6、应用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析，根据标准品和土壤样品中的荧光强度的相对值，对样品中的甲烷氧化菌进行定量测定。

实施例6：

1、采集荒漠区土壤100 g，采样深度为50 cm。

2、将样品放入1000 mL小口三角烧瓶中，然后加入400 mL PBS溶液，将小口三角烧瓶放置于摇床上，200 rpm振摇30 min后，让其自然沉淀15 min。

3、采用上层孔径为5 μm，下层孔径为0.2 μm的双层384孔滤膜板对上清进行抽滤；取5个已知的不同浓度甲烷氧化菌作为阳性对照，每个浓度做3个平行试验；设置1个阴性对照，做3个平行试验。

4、取掉上层微孔滤膜板，并向下层滤膜板每孔加入100 μL 100 mg/mL经FITC标记的pMMO单克隆抗体，37 °C保湿 40 min。

5、向下层滤膜板各孔加入100 μL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST溶液并进行抽滤，重复4-5次，直至完全去除尚未结合FITC标记的单抗为止。

6、应用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析，根据标准品和土壤样品中的荧光强度的相对值，对样品中的甲烷氧化菌进行定量测定。

实施例7：

1、采集盐碱地土壤100 g，采样深度为30 cm。

2、将样品放入1000 mL小口三角烧瓶中，然后加入400 mL PBS溶液，将小口三角烧瓶放置于摇床上，200 rpm振摇30 min后，让其自然沉淀15 min。

3、采用上层孔径为5 μm，下层孔径为0.2 μm的双层384孔滤膜板对上清进行抽滤；取5个已知的不同浓度甲烷氧化菌作为阳性对照，每个浓度做3个平行试验；设置1个阴性对照，做3个平行试验。

4、取掉上层微孔滤膜板，并向下层滤膜板每孔加入100 μL 100 mg/mL经FITC标记的pMMO单克隆抗体，37°C保湿 40 min。

5、向下层滤膜板各孔加入100 μL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST溶液并进行抽滤，重复4-5次，直至完全去除尚未结合FITC标记的单抗为止。

6、应用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析，根据标准品和土壤样品中的荧光强度的相对值，对样品中的甲烷氧化菌进行定量测定。

Claims (1)

1.一种甲烷氧化菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采样，对土壤的采样深度为10 ~ 200 cm；采样量为20~2000 g；

（2）采用PBS溶液对样品进行振摇法洗菌，将菌体洗脱到PBS上清溶液中；

（3）采用双层96孔或384孔滤膜板，上层滤膜板孔径为5 μm，下层滤膜板孔径为0.2 μm，上层滤膜板用于去除颗粒状杂质，下层滤膜板用于截留甲烷氧化菌，甲烷氧化菌被截留在下层滤膜上；将截留住的甲烷氧化菌固定于96孔或384孔滤膜板上；

（4）取掉上层微孔滤膜板，并向下层滤膜板加入经FITC标记的pMMO单克隆抗体，加入的标记单克隆抗体分子个数需超过孔板滤膜上固定的甲烷氧化菌数量的3倍以上；抗体特异性结合后，将孔板加PBST溶液进行抽滤，重复3-5次，将滤膜上尚未结合的单克隆抗体完全除去；

（5）用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析。