CN107942036A - 一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法及装置，步骤是：1）将硅胶管装置分别埋入根际和非根际土壤中，土层高于硅胶管顶部；2）在培养盆中加入去离子水，保持淹水；3）淹水后，在培养盆内移栽水稻幼苗；4）水稻分蘖期开始标记13C‑甲烷气体；向每个硅胶管中注射甲烷气体，然后每8个小时注射一次，共标记6天。硅胶塞与硅胶管相连，硅胶管与不锈钢长针头相连组成硅胶管装置。培养盆与两个尼龙网袋相连，其中一个尼龙网袋中与三根硅胶管装置和植物相连，另一个尼龙网袋与一根硅胶管装置相连。在土壤中原位标记甲烷气体，硅胶管内甲烷气体能缓慢的释放到管外，到达土壤中，提高了对甲烷氧化菌的同位素标记效率。

Description

一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法及装置

技术领域

本发明涉及土壤微生物的科学研究领域，更具体涉及一种研究土壤甲烷氧化菌的方法，同时还涉及一种在土壤中原位标记13C-CH₄气体的装置，该装置同样适用于在土壤中标记其他同位素气体（如15N-N₂O）。

背景技术

大气温室气体浓度增加是导致全球变暖的主要原因，甲烷（CH4）是重要的温室气体之一，其百年尺度增温潜势是二氧化碳的25倍（IPCC,2007）。近年来， CH4在大气中的浓度逐年上升，自1750年以来，甲烷的浓度已增幅150%（IPCC, 2014），对全球气候和环境产生了极为严重的威胁。稻田是重要的CH4排放源之一，其每年的CH4排放量占全球人类活动造成的CH4排放总量10% （Nazaries et al., 2013）。稻田甲烷排放是CH4产生过程和CH4消耗过程的净效应，是产甲烷菌和甲烷氧化菌共同作用的结果（Le Mer and Roger, 2001）。土壤中CH4生成是产甲烷菌在严格厌氧条件下作用于有机肥料、动植物残体、土壤腐殖质以及水稻根系分泌物等土壤有机质的结果。而土壤中CH4的消耗是由甲烷氧化菌进行的，约19%~ 83%的甲烷气体被土水界面和根土界面的甲烷氧化菌所氧化（Zhang et al., 2012）。所以利用13C-甲烷气体来标记水稻土中的甲烷氧化菌，进而研究土壤中活性的甲烷氧化菌群落组成结构，具有十分重要的意义。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法。以往对于活性甲烷氧化菌的原位研究是通过在土壤中加入饱和甲烷水溶液，或者甲烷气体经过植物的通气组织到达土壤，进而对土壤甲烷氧化菌进行同位素标记。与以往方法不同的是，本方法可直接在土壤中原位标记甲烷气体，硅胶管内甲烷气体能缓慢的释放到管外，到达土壤中，从而提高对甲烷氧化菌的同位素标记效率。并且可在根际土和非根际土中同时进行同位素气体标记。

本发明的另一个目的是在于提供了一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，该装置制作简单，操作方便。装置中的硅胶管透气不透水，管内的同位素气体能缓慢的作用于土壤微生物。连接硅胶管的不锈钢针头，长度为10厘米，远高于培养盆的水平面，不易进水，能有效防止污染，且同位素标记时更易操作。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法，包括如下步骤：

1）将硅胶管装置分别埋入根际和非根际土壤中，土层高于硅胶管顶部，称取3kg土壤样品，装入培养盆中，培养盆尺寸为16×20cm（直径×高）。盆中设置两个尼龙网根袋，直径7－9厘米的尼龙网根袋中放入三根硅胶管装置，直径5－7厘米的尼龙网根袋中放入一根硅胶管装置，尼龙网根袋中及培养盆中分别装入土壤。

2）在培养盆中加入去离子水，保持淹水状态，约2－4厘米水层，沿培养盆的侧壁加入去离子水，使土壤上方持续保持2－4厘米的水层。

3）淹水一周后，移栽水稻幼苗，淹水一周后，移栽水稻幼苗。水稻品种为中佳早17，幼苗苗龄18－22天。移栽时最好选择阴天，或者在温室大棚的顶部铺上遮阳网，以防止幼苗水分蒸发过快。将幼苗置于水盆中，轻轻洗掉幼苗根部的土壤，选取5株长势相同的幼苗，移栽到7－9厘米的尼龙网根袋中。

4）水稻苗龄45天时（即分蘖期）开始标记13C-甲烷气体；标记时在硅胶管装置上的三通阀上连接2个5ml注射器，其中1个是空的，另1个已吸取了3ml 13C-CH4，将三通阀的开口旋至空的注射器，从硅胶管内吸取3ml气体，然后将三通阀的开口旋至有13C-CH4的注射器，让甲烷气体自然吸入至硅胶管，避免用力推注射器，以防增加硅胶管内压力。然后每8个小时按此步骤注射一次，共标记6天。通过6天的13C-CH4同位素标记，土壤中的甲烷氧化菌以13C-CH4作为能源，通过消耗13C-CH4从而变成13C-甲烷氧化菌，通过后续的稳定同位素技术即分离出这部分13C-甲烷氧化菌。

一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，它由硅胶管、硅胶塞、不锈钢长针头、三通阀、植物、尼龙网袋、培养盆组成。其连接关系是：硅胶塞与硅胶管相连，硅胶管与不锈钢长针头相连组成硅胶管装置。培养盆与两个尼龙网袋相连，其中一个尼龙网袋中与三根硅胶管装置和植物相连，另一个尼龙网袋与一根硅胶管装置相连。

硅胶管两端用硅胶塞塞紧，并在两端的外部涂一层704胶（南大704硅橡胶），确保两端密封不透水，晾干后，将不锈钢长针头插入其中一端硅胶塞中，不锈钢针头尺寸为1.6mm×1.32mm（外径×内径），针头外露长度100mm，针头总长度116mm。在插入前，要将针头的针尖用电锯锯掉，以防止扎破硅胶管，影响标记效果。在不锈钢长针头的顶端装有三通阀，在不锈钢长针头与三通阀的接触区域涂抹704胶，防止漏气。进口硅胶管透气不透水，尺寸为14mm×12mm×120mm（外径×内径×长度），也可根据试验需要剪成合适长度。

通过以上技术措施，解决了不能在土壤中直接标记甲烷气体的技术难点。现有技术一般是通过在土壤中加入饱和甲烷水溶液，或者通过植物的通气组织运输甲烷气体到土壤中，从而间接的对土壤微生物进行标记，不能将气体直接作用于土壤微生物，而且其装置设计较复杂。而本方法和装置可直接在土壤中原位标记甲烷气体，并且可在根际土和非根际土中同时进行同位素气体标记。本试验结果表明在硅胶管内注射13C-CH4气体8小时内，管内甲烷浓度减少约60%，说明管内的同位素气体能缓慢的与土壤中气体进行交换，通过每8小时重新注射甲烷气体，保证了硅胶管内气体可持续的作用于土壤微生物。而且与现有标记装置相比，本方法的装置制作简单，造价较低，更易推广。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、硅胶管透气不透水，标记效果更好：

在硅胶管内注射13C-CH4气体8小时后，管内甲烷浓度减少约60%，说明管内的同位素气体能缓慢与土壤中进行气体交换，然后每8小时重新注射甲烷气体，保证了硅胶管内气体可持续的作用于土壤微生物，达到很好的标记效果。

2、能够直接在土壤中原位标记甲烷气体：

以往的原位标记试验一般是用饱和甲烷水溶液或通过植物的通气组织对土壤进行标记，并且只限于根际土壤。而本方法可以在土壤中直接标记甲烷气体，并且可在根际土和非根际土中同时进行同位素标记。

3、使用不锈钢长针头，不易进水，防止污染：

硅胶管装置上的不锈钢针头，长度为10厘米，远高于培养盆的水平面。与短针头相比，不易进水，防止污染，且同位素标记时更易操作。

4、标记装置制作简单，操作方便：

与其他同位素标记装置相比，本方法的装置制作简单，操作方便,而且用于制作装置的硅胶管和不透刚针头造价较低，更易推广。

附图说明

图1为一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法示意图。

图2为图1硅胶管装置的结构示意图。

1-硅胶管、2-硅胶塞、3-不锈钢长针头、4-三通阀、 5-植物、 6-尼龙网袋、 7-培养盆。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例所述的实验为测定中国科学院桃源农业生态试验站施肥制度长期肥料试验田不同施肥处理中甲烷氧化菌群落结构差异。

实施例1：

一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法，其步骤是：

1）将硅胶管装置分别埋入根际和非根际土壤中，土层高于硅胶管顶部，称取3kg土壤样品，装入培养盆中，培养盆尺寸为16×20cm（直径×高）。盆中设置两个尼龙网根袋，直径8厘米的尼龙网根袋中放入三根硅胶管装置，直径6厘米的尼龙网根袋中放入一根硅胶管装置，尼龙网根袋中及培养盆中分别装入土壤。

2）在培养盆中加入去离子水，保持淹水状态，约3厘米水层；沿培养盆的侧壁加入去离子水，使土壤上方持续保持3厘米的水层。

3）淹水一周后，移栽水稻幼苗，淹水一周后，移栽水稻幼苗。水稻品种为中佳早17，幼苗苗龄20天。移栽时最好选择阴天，或者在温室大棚的顶部铺上遮阳网，以防止幼苗水分蒸发过快。将幼苗置于水盆中，轻轻洗掉幼苗根部的土壤，选取5株长势相同的幼苗，移栽到8厘米的尼龙网根袋中。

4）水稻苗龄45天时（即分蘖期），开始标记13C-甲烷气体；标记时在硅胶管装置上的三通阀上连接2个5ml注射器，其中1个是空的，另1个已吸取了3ml 13C-CH4，将三通阀的开口旋至空的注射器，从硅胶管内吸取3ml气体，然后将三通阀的开口旋至有13C-CH4的注射器，让甲烷气体自然吸入至硅胶管，避免用力推注射器，以防增加硅胶管内压力。然后每8个小时按此步骤注射一次，共标记6天。通过6天的13C-CH4同位素标记，土壤中的甲烷氧化菌以13C-CH4作为能源，通过消耗13C-CH4从而变成13C-甲烷氧化菌，通过后续的稳定同位素技术即分离出这部分13C-甲烷氧化菌，从而进行下一步的研究。

实施例2：

一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，它由硅胶管1、硅胶塞2、不锈钢长针头3、三通阀4、植物5、尼龙网袋6、培养盆7组成。其连接关系是：硅胶塞2与硅胶管1相连，硅胶管1与不锈钢长针头3相连组成硅胶管装置，培养盆7与两个尼龙网袋6相连，其中一个尼龙网袋中与三根硅胶管装置和植物5相连，另一个尼龙网袋与一根硅胶管装置相连。在培养盆7任意内装有硅胶管1、硅胶塞2、不锈钢长针头3、三通阀4、植物5、尼龙网袋6，硅胶管1两端用硅胶塞塞紧，并在两端的外部涂一层704胶（南大704硅橡胶），确保两端密封不透水，晾干后，将不锈钢长针头3插入其中一端硅胶塞中，不锈钢针头3尺寸为1.6mm×1.32mm（外径×内径），针头外露长度100mm，针头总长度116mm。在插入前，要将针头的针尖用电锯锯掉，以防止扎破硅胶管1，影响标记效果。在不锈钢长针头3的顶端装有三通阀4，在不锈钢长针头3与三通阀4的接触区域涂抹704胶，防止漏气。进口硅胶管1透气不透水，尺寸为14mm×12mm×120mm（外径×内径×长度），也可根据试验需要剪成合适长度。本试验装置中的植物为水稻，也可用于其他淹水植物。

该装置中的硅胶管透气不透水，在硅胶管内注射13C-CH4气体8小时后，管内甲烷浓度减少约60%，说明管内的同位素气体能缓慢与土壤中进行气体交换，然后每8小时重新注射甲烷气体，保证了硅胶管内气体可持续的作用于土壤微生物，达到很好的标记效果。这也是在原位标记甲烷氧化菌时，首次直接在土壤中标记甲烷气体，并且利用该装置可在植物根际土壤和非根际土壤中同时进行标记，应用范围更广。

Claims (5)

1.一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法，其步骤是：

1）将硅胶管装置分别埋入根际和非根际土壤中，土层高于硅胶管顶部，称取土壤样品，装入培养盆中，盆中设置两个尼龙网根袋，直径7－9厘米的尼龙网根袋中放入三根硅胶管装置，直径5－7厘米的尼龙网根袋中放入一根硅胶管装置，尼龙网根袋中及培养盆中分别装入土壤；

2）在培养盆中加入去离子水，保持淹水状态，2－4厘米水层，沿培养盆的侧壁加入去离子水，使土壤上方持续保持2－4厘米的水层；

3）淹水一周后，移栽水稻幼苗，幼苗苗龄18－22天，移栽时选择阴天，或者在温室大棚的顶部铺上遮阳网，以减少幼苗的水分蒸发，将幼苗置于水盆中，洗掉幼苗根部的土壤，选取5株长势相同的幼苗，移栽到7－9厘米的尼龙网根袋中；

水稻苗龄45天时开始标记13C-甲烷气体；标记时在硅胶管装置上的三通阀上连接2个5ml注射器，其中1个是空的，另1个已吸取了3ml 13C-CH4，将三通阀的开口旋转至空的注射器，从硅胶管内吸取3ml气体，然后将三通阀的开口旋至有13C-CH4的注射器，让甲烷气体自然吸入至硅胶管，然后每8个小时按此步骤注射一次，共标记6天。

2.权利要求1所述的一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，它包括硅胶管（1）、硅胶塞（2）、不锈钢长针头（3）、植物（5）、尼龙网袋（6）、培养盆（7），其特征在于：硅胶塞（2）与硅胶管（1）相连，硅胶管（1）与不锈钢长针头（3）相连组成硅胶管装置，培养盆（7）与两个尼龙网袋（6）相连，其中一个尼龙网袋中与三根硅胶管装置和植物（5）相连，另一个尼龙网袋与一根硅胶管装置相连。

3.根据权利要求2所述的一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，所述的在培养盆（7）任意内装有硅胶管（1）、硅胶塞（2）、不锈钢长针头（3）、三通阀（4）、植物（5）、尼龙网袋（6），硅胶管（1）两端用硅胶塞塞紧，并在两端的外部涂一层704胶，将不锈钢长针头（3）插入其中一端硅胶塞中，不锈钢针头（3）尺寸为1.6mm×1.32mm，针头外露长度100mm，针头总长度116mm。

4.根据权利要求2所述的一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，所述的在不锈钢长针头（3）的顶端装有三通阀（4），在不锈钢长针头（3）与三通阀（4）的接触区域涂抹704胶。

5.根据权利要求2所述的一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，所述的硅胶管（1）透气不透水，尺寸为14mm×12mm×120mm。