CN104569135A - 测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置，主要由离心管及空气罩，其上均设有气体收集瓶。在本装置基础上，提出结合¹⁵N标记技术及完全无菌操作，研究无菌环境下土壤氨基酸对植物生长营养贡献的方法。在微生物存在的环境下，结合¹³C、¹⁵N双标记技术，研究微生物存在的环境下测定土壤氨基酸及分子态氨基酸对植物生长营养贡献的方法。本发明装置设计合理，制作简单，应用范围广，可有效地减少微生物的干扰，研究土壤氨基酸对植物生长营养贡献的机理，提出的有菌环境下的测定方法，更加贴近自然环境，研究植物吸收土壤氨基酸的规律，结合以上装置与方法，可以在测定土壤氨基酸对植物营养贡献中应用。

Description

测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置及用途

技术领域

本发明属于有机营养研究领域，尤其涉及一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置及用途。

背景技术

植物有机营养是我国植物营养学研究的重要方向之一，是植物营养研究的拓展和深入。随着同位素质谱仪、核磁共振仪及气相色谱-质谱联用仪的广泛应用，国内外诸多研究业已证实许多植物能够直接吸收利用环境介质中的多种氨基酸、核酸、多肽及小分子蛋白质（崔晓阳.植物对有机氮的利用及其在自然生态系统中的意义.生态学报.2007）。因为土壤中氨基酸种类较多，通量较大，且大多数关于有机营养的研究都集中于氨基酸上，一般将土壤氨基酸作为土壤有机氮的代名词。随着植物有机营养研究的深入，尤其是植物吸收土壤中分子态氨基酸的研究，改变了李比希提出的传统的纯矿质营养观念，导致了对诸多植物营养学、生态学等问题的再认识。

研究土壤氨基酸对植物营养贡献的方法主要有：离体根系短期培养吸收试验；实验室有机氮源无菌培养试验；野外植物对同位素标记（单原子示踪标记及¹³C、¹⁵N双标记技术）有机氮源物质的吸收；植物组织中¹⁵N自然丰度值。离体培养无法避免微生物的矿化作用，且其C、N代谢水平也不同于原位根系，必然会对根系吸收能力造成影响，从而影响有机氮的生物有效性。实验室无菌培养结合¹⁵N标记技术能够为植物直接吸收分子态氨基酸提供坚实的证据，但因其与自然环境的巨大差异，难以评价自然生态系统中氨基酸的营养贡献。¹⁵N单标记的氨基酸加入到土壤后，可以被微生物迅速分解，产生的带有标记¹⁵N的无机氮仍可以被植物根系吸收，从而放大了氨基酸的营养贡献。¹³C、¹⁵N双标记技术是研究微生物存在的环境下有机氮对植物营养贡献较为理想的方法。通过¹³C与¹⁵N的比例，可以确定植物吸收的¹⁵N哪些是以分子态氨基酸的形式吸收的，哪些是以被微生物分解的无机氮形式吸收的，此方法在短期内（2-6h）是研究有机氮对植物营养贡献的方法。随着时间的延长，吸收到植物体内的¹³C会随着呼吸作用而部分排除体外，造成对有机氮营养贡献的低估。

由于上述方法存在的诸多弊端，土壤有机氮构成植物重要氮源的直接证据仍然缺乏。

发明内容

本发明旨在设计一种制作简单，应用范围广的装置，进而提出在无菌环境下，可以有效地减少微生物的干扰的测定方法，研究土壤氨基酸对植物生长营养贡献的机理，在有菌环境下可以更加的贴近自然环境，研究植物吸收土壤氨基酸的规律。结合以上装置与方法，可以深入的研究土壤氨基酸对植物营养贡献的现象与机理。

本发明提供的测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置，由空气罩，进气口，第二过滤器，进水管，第二开关，离心管盖，离心管，第一开关，第一抽气装置，第一气体收集瓶，第三开关，第二抽气装置，第二气体收集瓶，第四开关，第一过滤器，通气出水口、连接管构成，空气罩通过离心管盖与离心管密封连接，采用南大704硅胶密封，离心管盖上设置有三个孔，一个孔连接进水管，另一个孔通过连接管连接第二气体吸收瓶，中间的孔供植物从离心管长出，离心管底部连接一通气出水口，通气出水口依次连接第四开关和第一过滤器，进水管依次连接第二开关及第二过滤器第二气体收集瓶在进气端连接第三开关，在出气端连接第二抽气装置，第二抽气装置可以为低功率抽气泵或者注射器，第二气体收集瓶内放置氢氧化钠溶液，空气罩底部设置进气口，在空气罩上部设置第一开关，并与第一气体收集瓶的进气端连接，第一气体收集瓶的出气端连接第一抽气装置，第一抽气装置为低功率抽气泵，第一气体收集瓶内放置氢氧化钠溶液。

本发明装置根据需要，可以拆卸部分部件，如做无菌试验，则可将空气罩连同第一气体收集瓶拆除，若做有菌试验，则可不安装第一过滤器及第二过滤器。

本发明的另一个人目的是提供所述装置在测定有菌条件下土壤氨基酸对植物生长营养贡献中的应用。通过以下方法实现(以玉米为例)：

（1）采集所需的土壤样品，自然风干，多次搅拌，使土样均匀；（2）称取5g土壤样品于50ml离心管（普通离心管，非装置中所述离心管）中，加入25ml（V:V=1:5）浓度为0.5M K₂SO₄提取液，25℃恒温震荡1h（120-150r/min），离心（3000-5000r/min），过滤，如此淋洗五次，将五次淋洗的上清液混合起来，测定其中铵态氮、硝态氮、氨基酸的浓度；

（3）向离心管中添加25ml蒸馏水，25℃恒温震荡1h（120-150r/min），离心（3000-5000r/min），倾倒上清液，重复添加蒸馏水、淋洗、震荡、离心步骤；

（4）将步骤（3）（经过7次淋洗）的土壤样品取出，自然晾至含水量在15%左右;

（5）将玉米种子放入清水中浸泡12h，取出后将其播于直径约为60mm的培养皿中，向培养皿中添加少量水，在25℃环境下培养5-7天后，玉米长出1cm左右的嫩芽；

（6）称取含水量约为15%的淋洗过的土壤45g，装于装置的离心管中，选取已发芽的且生长均匀的种子，用镊子夹取一粒放置于离心管中，嫩芽朝上且位于离心管的中心，在种子上覆土5g，添加少量水分后将离心管盖拧紧；

（7）约5天以后，玉米幼苗从离心管中间孔中长出，选取生长一致的幼苗，采用南大704硅胶将中间孔密封起来，硅胶可以起到密封的作用，而又不会限制玉米的生长；

（8）将进水管、第二气体收集瓶的管道插入离心管后，采用南大704硅胶密封，防止漏气；

（9）待玉米长势稳定后，将空气罩连接于离心管盖上，打开第一开关及第一抽气装置，将第二开关、第三开关、第四开关关闭；

（10）通过进水管，采用5ml Eppendorf 移液枪向离心管中添加5-10ml含铵态氮、硝态氮、氨基酸（¹³C、¹⁵N-Gly）的混合液，各氮源的比例与淋洗液中检测到的氮源的比例一致，浓度根据试验目的确定。

上述方法所用的装置可不安装第一过滤器及第二过滤器。

（11）每隔两天，打开第四开关及第三开关，抽取离心管中的气体到第二气体收集瓶中，抽气完成后关闭第四开关及第三开关；

（12）根据土壤干湿情况，在抽取离心管气体后，通过进水管定量添加纯净水；

（13）培养15-35天后，破坏性采样，将地上部与根系分开，地上部用超纯水洗净后放置于冷冻干燥机中冷冻干燥，根系用自来水清洗后，用超声波清洗，然后用0.5mol L^-1CaCl₂清洗吸附于根系表面的氮素，最后用超纯水冲洗干净，用吸水纸擦干净后，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥；

（14）测定土壤样品中的微生物碳氮及丰度；

（15）将干燥后的样品采用微量球磨仪研磨，采用同位素质谱仪测定样品中碳氮丰度；

（16）采用第一气体收集瓶、植株中的碳氮丰度，就可以计算植物氨基酸对玉米生长的营养贡献，

（17）根据微生物含量及第二气体收集瓶的含量及丰度，就可以确定微生物的利用量。

本发明为研究有机氮对植物的营养贡献，设计了一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置。利用本发明装置，采用离心管种植的方法，不仅可以节省¹³C、¹⁵N双标记氨基酸的用量、利于精准控制土壤环境（有无微生物）、拟合根际的生长环境，还可以测定¹³C、¹⁵N双标记氨基酸在土壤中的转化。为克服¹³C、¹⁵N双标记技术存在的问题，采用玻璃或聚乙烯塑料制成密闭空间，可以计量测定植物地上部呼吸所释放的¹³C的量，进而准确评价分子态氨基酸对植物的营养贡献。

附图说明

图1是本发明装置结构示意图。

具体实施方式

本发明结合图和实施例作进一步的说明。

实施例1   一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置

本发明提供的测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置，由空气罩1，进气口2，第二过滤器3，进水管4，第二开关5，离心管盖6，离心管7，第一开关8，第一抽气装置9，第一气体收集瓶10，第三开关11，第二抽气装置12，第二气体收集瓶13，第四开关14，第一过滤器15，通气出水口16构成，空气罩1通过离心管盖6与离心管7密封连接，采用南大704硅胶密封，离心管盖6上设置有三个孔，一个孔连接进水管4，另一个孔通过连接管17连接第二气体吸收瓶13，中间的孔供植物从离心管长出，离心管7底部连接一通气出水口16，通气出水口16依次连接第四开关14和第一过滤器15，进水管4依次连接第二开关5及第二过滤器3，第二气体收集瓶13在进气端连接第三开关11，在出气端连接第二抽气装置12，第二抽气装置12可以为低功率抽气泵或者注射器，第二气体收集瓶13内放置氢氧化钠溶液，空气罩1底部设置进气口2，在空气罩1上部设置第一开关8，并与第一气体收集瓶10的进气端连接，第一气体收集瓶10的出气端连接第一抽气装置9，第一抽气装置9为低功率抽气泵，第一气体收集瓶10内放置氢氧化钠溶液。

本发明装置根据需要，可以拆卸部分部件，如做无菌试验，则可将空气罩连同第一气体收集瓶拆除，若做有菌试验，则可不安装第一过滤器及第二过滤器。

实施例2    测定有菌条件下土壤氨基酸对植物生长营养贡献的方法(以玉米为例)

（1）采集所需的土壤样品，自然风干，多次搅拌，使土样均匀；

（2）称取5g土壤样品于50ml离心管（普通离心管，非装置中所述离心管7）中，加入25ml（V:V=1:5）浓度为0.5M K₂SO₄提取液，25℃恒温震荡1h（120-150r/min），离心（3000-5000r/min），过滤，如此淋洗五次，将五次淋洗的上清液混合起来，测定其中铵态氮、硝态氮、氨基酸的浓度；

（3）向离心管中添加25ml蒸馏水,25℃恒温震荡1h（120-150r/min），离心（3000-5000r/min），倾倒上清液，重复添加蒸馏水、淋洗、震荡、离心步骤；

（4）将步骤（3）经过7次淋洗的土壤样品取出，自然晾至含水量在15%左右；

（5）将玉米种子放入清水中浸泡12h，取出后将其播于直径约为60mm的培养皿中，向培养皿中添加少量水，在25℃环境下培养5-7天后，玉米长出1cm左右的嫩芽；

（6）称取含水量约为15%的淋洗过的土壤45g，装于离心管7中，选取已发芽的且生长均匀的种子，用镊子夹取一粒放置于离心管7中，嫩芽朝上且位于离心管7的中心，在种子上覆土5g，添加少量水分后将离心管盖6拧紧；

（7）约5天以后，玉米幼苗从离心管7中间孔中长出，选取生长一致的幼苗，采用南大704硅胶将中间孔密封起来，硅胶可以起到密封的作用，而又不会限制玉米的生长；

（8）将进水管4、第二气体收集瓶13的管道插入离心管7后，采用南大704硅胶密封，防止漏气；

（9）待玉米长势稳定后，将空气罩1连接于离心管盖6上，打开第一开关8及第一抽气装置9，将第二开关5、第三开关11、第四开关14）关闭；

（10）通过进水管4，采用5ml Eppendorf 移液枪向离心管7中添加5-10ml含铵态氮、硝态氮、氨基酸（¹³C、¹⁵N-Gly）的混合液，各氮源的比例与淋洗液中检测到的氮源的比例一致，浓度根据试验目的确定；

上述方法所用的装置可不安装第一过滤器15及第二过滤器3；

（11）每隔两天，打开第四开关14及第三开关11，抽取离心管7中的气体到第二气体收集瓶13中，抽气完成后关闭第四开关14及第三开关11；

（12）根据土壤干湿情况，在抽取离心管气体后，通过进水管4定量添加纯净水；

（13）培养15-35天后，破坏性采样，将地上部与根系分开，地上部用超纯水洗净后放置于冷冻干燥机中冷冻干燥，根系用自来水清洗后，用超声波清洗，然后用0.5mol L^-1CaCl₂清洗吸附于根系表面的氮素，最后用超纯水冲洗干净，用吸水纸擦干净后，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥；

（14）测定土壤样品中的微生物碳氮及丰度；

（15）将干燥后的样品采用微量球磨仪研磨，采用同位素质谱仪测定样品中碳氮丰度；

（16）采用第一气体收集瓶、植株中的碳氮丰度，就可以计算植物氨基酸对玉米生长的营养贡献，

（17）根据微生物及第二气体收集瓶13的碳氮含量及丰度，就可以确定微生物的利用量。

实施例3    测定无菌条件下土壤氨基酸对植物生长营养贡献的方法（以玉米为例）

（1）采集所需的土壤，自然风干，多次搅拌，使土样均匀；

（2）称取5g土壤样品于50ml离心管（非装置中所述离心管7）中，加入25ml（V:V=1:5）浓度为0.5M K₂SO₄提取液,25℃恒温震荡1h（120-150r/min），离心（3000-5000r/min），过滤，如此淋洗五次，将五次淋洗的上清液混合起来，测定其中铵态氮、硝态氮、氨基酸的浓度；

（3）向离心管中添加25ml蒸馏水，25℃恒温震荡1h（120-150r/min），离心（3000-5000r/min），倾倒上清液,再次添加蒸馏水、震荡、离心，弃去上清液；

（4）将步骤（3）经过7次淋洗的土壤样品取出，自然晾至含水量在15%左右，放置于121℃灭菌锅中灭菌30min，取出后搅拌，重复灭菌，搅拌，共三次;

（5）将玉米种子放入清水中浸泡12h，采用70%酒精灭菌1 min-无菌水冲3次-10%过氧化氢灭菌5 min-无菌水冲5次- 0.1% HgC1₂ 灭菌5 min-无菌水冲6次的组合灭菌方法，取出后将其播于已高温高压灭菌的直径约为60mm的培养皿中，向培养皿中添加少量无菌水水，置于白天温度25C，夜间温度22C，光照强度为6000lux的植培台上发芽，在25℃环境下5-7天后，玉米长出1cm左右的嫩芽；

（6）称取含水量约为15%的淋洗且灭菌过的土壤45g，装于上述离心管7中，该离心管采用高温高压的方法灭菌，选取已发芽的且生长均匀的种子，用镊子夹取一粒放置于离心管中，嫩芽朝上且位于离心管的中心，在种子上覆土5g，添加少量水分后将离心管盖6拧紧于离心管中；

（7）约5天以后，玉米幼苗从离心管7中间孔中长出，选取生长一致的幼苗，采用南大704硅胶将中间孔密封起来；

（8）将进水管4、第二气体收集瓶13的管道插入离心管盖6后，采用南大704硅胶密封，防止漏气；

（9）待玉米长势稳定后，通过进水管，采用5ml Eppendorf 移液枪向离心管中添加5-10ml含铵态氮、硝态氮、氨基酸（¹⁵N-Gly）的混合液，混合氮源采用过0.22μm滤膜的方式灭菌，各氮源的比例与淋洗液中检测到的氮源的比例一致；

（10）根据土壤干湿情况，在抽取离心管气体后，通过进水管4定量添加纯净水；

为保持土壤的含氧量，可将第四开关14打开；

（11）培养15-35天后，破坏性采样，将地上部与根系分开，地上部用超纯水洗净后放置于冷冻干燥机中冷冻干燥，根系用自来水清洗后，用超声波清洗，然后用0.5mol L^-1CaCl₂清洗吸附于根系表面的氮素，最后用超纯水冲洗干净，用吸水纸擦干净后，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥；

（12）将干燥后的样品采用微量球磨仪研磨，采用同位素质谱仪测定样品中碳氮丰度；

（13）测定无菌条件下土壤氨基酸对植物生长营养贡献的方法，则可将空气罩1连同第一气体收集瓶12拆除，也可将第二气体收集瓶13拆除。

Claims (6)

1.一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置，其特征在于，由空气罩（1），进气口（2），第二过滤器（3），进水管（4），第二开关（5），离心管盖（6），离心管（7），第一开关（8），第一抽气装置（9），第一气体收集瓶（10），第三开关（11），第二抽气装置（12），第二气体收集瓶（13），第四开关（14），第一过滤器（15），通气出水口（16）、连接管（17）构成，空气罩（1）通过离心管盖（6）与离心管（7）密封连接，采用南大704硅胶密封，离心管盖（6）上设置有三个孔，一个孔连接进水管（4），另一个孔通过连接管（17）连接第二气体吸收瓶（13），中间的孔供植物从离心管长出，离心管（7）底部连接一通气出水口（16），通气出水口（16）依次连接第四开关（14）和第一过滤器（15），进水管（4）依次连接第二开关（5）及第二过滤器（3），第二气体收集瓶（13）在进气端连接第三开关（11），在出气端连接第二抽气装置（12），第二抽气装置（12）为低功率抽气泵，第二气体收集瓶（13）内放置氢氧化钠溶液，空气罩（1）底部设置进气口（2），在空气罩（1）上部设置第一开关（8），并与第一气体收集瓶（10）的进气端连接，第一气体收集瓶（10）的出气端连接第一抽气装置（9），第一抽气装置（9）为低功率抽气泵，第一气体收集瓶（10）内放置氢氧化钠溶液。

2.根据权利要求1所述的一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置，其特征在于，所述装置中空气罩（1）连同第一气体收集瓶（10）可拆卸。

3.根据权利要求1所述的一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置，其特征在于，所述装置中第一过滤器（15）及第二过滤器（3）可拆卸。

4.根据权利要求1所述的一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置，其特征在于，第二抽气装置（12）选用注射器。

5.根据权利要求1所述的一种测定土壤氨基酸对植物生长营养贡献的装置在测定有菌条件下土壤氨基酸对植物生长营养贡献中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：

（a）采集所需的土壤样品，自然风干，多次搅拌，使土样均匀；

（b）取土壤样品于50ml普通离心管中，加入0.5M K₂SO₄提取液，25℃恒温震荡1h，离心，过滤，如此淋洗五次，将五次淋洗的上清液混合，测定其中铵态氮、硝态氮、氨基酸的浓度；

（c）向步骤（b）普通离心管中添加25ml蒸馏水，25℃恒温震荡1h，离心，倾倒上清液，重复添加蒸馏水、淋洗、震荡、离心步骤；

（d）将步骤（c）的土壤样品取出，自然晾至含水量在15%；

（e）将玉米种子放入清水中浸泡12h，取出后将其播于直径约为60mm的培养皿中，向培养皿中添加少量水，在25℃环境下培养5-7天后，玉米长出嫩芽；

（f）取步骤（d）的土壤，装于装置中的离心管（7）中，选取步骤（e）中已发芽的种子，用镊子夹取一粒放置于离心管（7）中，嫩芽朝上且位于离心管的中心，在种子上覆土，添加少量水分后将离心管盖（6）拧紧；

（g）5天以后，玉米幼苗从离心管（7）中间孔中长出，选取生长一致的幼苗，采用南大704硅胶将中间孔密封；

（h）将进水管（4）、第二气体收集瓶（13）的管道插入离心管（7）后，采用南大704硅胶密封，防止漏气；

（i）待玉米长势稳定后，将空气罩（1）连接于离心管盖（6）上，打开第一开关（8）及第一抽气装置（9），将第二开关（5）、第三开关（11）、第四开关（14）关闭；

（j）通过进水管（4），采用5ml Eppendorf 移液枪向离心管（7）中添加5-10ml含铵态氮、硝态氮及¹³C,¹⁵N双标记的Gly，各氮源的比例与淋洗液中检测到的氮源的比例一致，浓度根据试验目的确定；

（k）每隔两天，打开第四开关（14）及第三开关（11），抽取离心管（7）中的气体到第二气体收集瓶（13）中，抽气完成后关闭第四开关（14）及第三开关（11）；

（l）在抽取离心管气体后，通过进水管（4）添加纯净水；

（m）培养15-35天后，破坏性采样，将地上部与根系分开，地上部用超纯水洗净后放置于冷冻干燥机中冷冻干燥，根系用自来水清洗后，用超声波清洗，然后用0.5mol L^-1CaCl₂清洗吸附于根系表面的氮素，最后用超纯水冲洗干净，用吸水纸擦干净后，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥；

（n）测定土壤样品中的微生物碳氮及丰度；

（o）将干燥后的样品采用微量球磨仪研磨，采用同位素质谱仪测定样品中碳氮丰度；

（p）采用第一气体收集瓶（10）、植株中的碳氮丰度，计算植物氨基酸对玉米生长的营养贡献，

（q）根据微生物含量及第二气体收集瓶（13）的含量及丰度，确定微生物的利用量。