CN103667034A - 一种用于土壤烃氧化菌活性检测的培养装置及方法 - Google Patents

一种用于土壤烃氧化菌活性检测的培养装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种用于土壤烃氧化菌活性检测的培养装置及方法。所述培养装置包括检测瓶（1）和可以插入检测瓶（1）的注射针。所述检测瓶（1）为可形成密闭空间的容器或装置，内设有支架（5），支架的下方有水，支架的上面平铺覆盖有载物网（4）；所述检测瓶的密封包括胶塞（3）和带孔外盖（2）的密封。在使用中，通过注射针穿过胶塞，向检测瓶注入或抽取气体。本发明是在常规土壤烃氧化菌活性检测基础上，改进了培养装置，可以增加培养装置内的湿度，又能保证土壤样品的气体通透性，提高了甲烷氧化菌利用甲烷、烃氧化菌消耗烃的效率，保证了活性检测的可靠性。为微生物勘探技术的应用提供了可靠的技术手段。

Description

一种用于土壤烃氧化菌活性检测的培养装置及方法
技术领域
本发明涉及土壤微生物活性检测领域中的一种用于土壤烃氧化菌活性检测的装置，进一步地说，是涉及烃氧化菌活性检测中使用的一种土壤烃氧化菌活性检测的培养装置及方法。
背景技术
近二十年来，随着微生物检测技术的提高及国际、国内对能源需求的增加，微生物油气勘探技术显示出了旺盛的生命力。土壤中气态烃氧化菌的活性是与其数量同等重要的勘探指标，如何提高气态烃氧化菌活性检测的准确性是提高微生物油气勘探技术的关键之一。
目前通用的土壤烃氧化菌活性测定的方法是：称取适量土壤样品加入到经高温灭菌处理的血清瓶中,丁基胶塞密封后向其中注入一定浓度的气态烃,于30℃恒温培养。随后采用气相色谱检测不同培养时间点血清瓶内的气态烃浓度，其最大比消耗速率即为土壤烃氧化菌活性。
但在很多情况下，在烃氧化菌活性测定的试验中轻烃的变化量并不明显。产生这种低氧化速率的原因是由于土样的含水量所引起的。土壤含水量对于土壤中轻烃和氧气的供给和扩散都有很大影响，而底物和氧气则是限制上壤中烃氧化菌和烃氧化活性的重要因子。在含水量适当的条件下，土壤通气状况好，氧的供应充足，烃氧化菌和烃氧化活性高，而当含水量较高时，严重影响上壤中基质的扩散，氧气供应不足，限制了烃氧化菌和烃氧化活性，含水量太低则会使烃氧化菌缺乏生长所必需的水分，导致死亡或进入休眠期。
细菌功能发挥的最低生理含水量为其细胞干物质量的233%~566%，土壤增加含水量可使氧化菌由休眠状态转化为活化状态。对特定土壤测定发现，当含水量<8%时无烃氧化，此值为细胞最低含水量的10万倍，如果烃氧化菌出现生理性缺水，也可能降低烃氧化率。土壤中的水以不同形态存在，可分为吸湿水、毛管水和重力水等。吸湿水是死水无法被利用，合理调节毛管水和重力水成为发挥氧化菌最佳功能的关键。
而现有的活性检测方法缺陷就是无法在土壤的通透性与增加培养装置内的湿度之间取得较好的平衡，如向装置（血清瓶）内加水，土壤中吸湿水含量增加，虽然提高了无机营养盐的输送，却阻碍了气体底物和氧气的传质，培养时间延滞，大大限制了烃氧化微生物活性测定的实际应用。
专利号为RU2008147965-A（Determining hydrocarbon-oxidizing activity ofmicroorganisms for biostability testing of clear petroleum fuels including e.g.gasoline,comprises incubating investigated fuels with an additive in contact withwater-mineral medium）的申请文件中提供了一种测定方法，该方法主要针对主要针对液态石油烃氧化活性测定、采用红外分光光度测定法间接测定活性、主要测定水溶液中的烃氧化活性；该方法不适于测量土壤甲烷氧化菌。
现有技术（油田地表土壤甲烷氧化菌的分离鉴定及活性测定，石油天然气学报，2005年4月第27卷）中提供了一种装置，该装置为密闭装置、可透过软塞向密闭装置内注入气体和液体；但向装置内注水，会显著改变装置底部土壤的气体通透性；培养瓶内气体的湿度不可调节，土壤的湿度由样品本身的含水率决定。这样直接影响了烃氧化微生物活性测定的准确性。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种用于土壤烃氧化菌活性检测的培养装置及方法，该发明在常规活性检测基础上，改变了原有的培养装置，可以向内注水改善培养装置内的湿度，在蒸汽水作用下，提高烃类水溶效率，又不因注水影响土壤样品通透性，从而提高微生物活性检测的灵敏度和准确性，以满足科研和生产的需要。
本发明之一的一种用于土壤烃氧化菌活性检测的培养装置，包括检测瓶1和可以插入检测瓶1的注射针，是这样实现的：
所述检测瓶1为可形成密闭空间的容器或装置，内设有支架5，支架的下方有水，支架的上面平铺覆盖有载物网4；
所述检测瓶的密封包括胶塞3和带孔外盖2的密封。
其中：
所述检测瓶1为带有胶塞3和带孔外盖2的血清瓶；
所述检测瓶1的瓶身上具有与带孔外盖2配套的对接螺旋。
本发明所选的支架材质为能耐高温灭菌且不与检测瓶内环境发生化学反应并具有一定支持能力的材料的材质，如不锈钢、塑料材质等，优选为塑料；
所述载物网4可为本领域常用的能耐高温灭菌、不与土壤及周围环境发生化学反应的材质，可以为网状支撑材料，如不锈钢网、脱脂纱布等，优选脱脂纱布。
另外，
所述的支架5由宽度为1.2~2.2cm，长宽比为30~18:1的塑料膜1条，用塑封机沿长度方向，按照每段长度为宽度的1.8~3.6倍的塑料膜对折焊接，每个焊接段相隔0.4~1.4个宽度的制成；然后，将所述支架卷曲，放入检测瓶1内，待其在内松开后，调整使其平整稳固，再将所述载物网平铺于支架上。
该支架易卷曲，取放灵活，对容器口直径要求很低，在具体实践中使用非常方便。
本发明之二的土壤烃氧化菌活性检测方法，是利用本发明的培养装置按照如下步骤实现的：
1将所述的培养装置灭菌后干燥；
2在无菌环境下取无菌水，沿所述培养装置内壁注入培养装置内，液面低于载物网；
3将待测土壤放置于载物网上，塞上胶塞、拧紧外盖；
4将待测烃类气体用注射针注入检测瓶内；
5定期抽取检测瓶内气体，将气体用于检测。
其中，
所述无菌水的用量可以为0.3~2ml；
所述烃类气体可以选自纯甲烷、乙烷、丙烷、丁烷气体中的至少一种。
定期用色谱测定检测瓶1内烃类的浓度，可以每隔3天测定一次，计算出烃类各组分的消耗率，确定烃氧化菌的活性；
检测瓶1内的湿度可以通过注入检测瓶1内蒸馏水的多少调节，对于给定的检测瓶1，以及给定湿度的土壤，可以通过实验来确定加入的水量；如可以分别加不同体积的测定样品的活性，活性最大对应的水量就是最适宜的加水量。
在具体实施中，
1所述的检测瓶1为50ml的血清瓶及其相应的胶塞3和带孔外盖2；所述的支架5的材质为塑料，制作方法为：裁取宽2cm，长度40cm的塑料条，用塑封机沿长度方向每4厘米对折焊接，每个焊接段相隔1-2厘米，焊接完后沿长度方向卷曲，用镍子夹住，放入培养装置内，待其在内松开后，调整使其平整；所述的载物网4用脱脂纱布制作；
2将以上装置放于高温湿热灭菌器中，在温度为121℃下灭菌30分钟，待压力降低后，放入干燥箱，在60℃干燥60分钟，取出后降到室温；
3在无菌工作台上用一次性注射器抽取经灭菌的蒸馏水2ml，沿容器壁注入容器内，称量10克土壤缓缓装入容器内，放于纱布上；再盖上软塞，拧紧带孔外盖；
4用注射器抽取纯甲烷气体0.5ml和纯丙烷气体0.5m注入检测瓶1内；
5用色谱测定检测瓶1内烃类气体浓度，以后每隔3天测定一次容器内烃类的浓度，计算烃类气体的消耗率，得出烃类氧化菌的活性。
综上，本发明是在常规土壤烃氧化菌活性检测基础上，对活性检测培养装置进行改进，本发明中所用化学装置和化学用品，若特殊说明，均为本领域常规使用的化学装置和化学用品。
早期的活性检测试验，往往由于土壤氧化菌消耗烃类的量过低，使得检测数据出现反转，即后检测的数据大于前面检测的数据，造成活性检测困难。本发明的培养装置及方法，是在常规土壤烃氧化菌活性检测基础上，改进了培养装置。本发明可以增加培养装置内的湿度，又能保证土壤样品的气体通透性，提高了甲烷氧化菌利用甲烷、烃氧化菌消耗烃的效率，保证了活性检测的可靠性。为微生物勘探技术的应用提供了可靠的技术手段，解决了土壤通透性和土壤湿度的矛盾。在一个地区，可以首先进行测试瓶中加水量试验，获得一个最佳的水分条件，再进行其它大量样品的活性检测工作。
本发明的突出特点是：在将待测土壤样品装入培养装置前，可以向容器内加入适量无菌水，而将土壤样品至于容器内载物网上，再塞上胶塞，拧紧外盖。可以保证培养装置内形成所需的湿度，又不会因土壤直接吸水而影响通透性，以甲烷氧化菌为例，将提高甲烷氧化菌利用甲烷的效率，对于烃氧化菌亦是同理，使得检测灵敏度增加，检测数据可靠。
本发明可用于通过培养法检测以特定气体作为底物的微生物菌群活性，适用于地质微生物领域，可应用于地质调查，地质勘探等。本发明与传统的活性测定方法相比，烃氧化菌活性分辨率显著提高，尤其适合大规模工业化测试，应用前景乐观。
附图说明
附图1为本发明装置的使用示意图。
其中1为测试瓶、2为带孔外盖、3为胶塞、4为载物网、5为支架。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。
实施例1
如图1所示，用于土壤烃氧化菌活性检测的培养装置包括检测瓶1和可以插入检测瓶1的注射针。这里的检测瓶为带有胶塞和带孔外盖的血清瓶。所用的材料均可以高温灭菌。
实施步骤：
（1）测试瓶取50ml的血清瓶及其相应的胶塞和带孔外盖，支架用耐高温蒸煮的塑料膜加工，制作方法为：裁取宽2cm，长度40cm的塑料膜一条，用塑封机沿长度方向每4厘米对折焊接，每个焊接段相隔1-2厘米，焊接完后沿长度方向卷曲，用镍子夹住，放入血清瓶内，待其在内松开后，调整使其平整。载物网可用脱脂纱布制作，方法是剪取边长为6厘米的纱布一块，平放于支架上。所述血清瓶制备两个，备用。
（2）将上述两个血清瓶放于高温湿热灭菌器中，在温度为121℃下灭菌30分钟，待压力降低后，放入干燥箱，60℃干燥60分钟。取出后降到室温。
（3）两个血清瓶灭菌干燥后，在无菌工作台上用一次性注射器（或已灭菌枪头移液枪）在一个瓶中注入0.5ml蒸馏水，另一瓶中注入1ml蒸馏水；所述培养瓶即血清瓶分别命名为装置1、装置2；取一份待测土壤，混匀，称取10g土壤两份，分别装入两个培养瓶中，放于纱布上。盖上软塞，拧上封盖螺旋。
（4）每个培养装置中注入纯甲烷气体0.5ml及纯丁烷气体0.5ml。
（5）用色谱测定容器内烃类气体浓度，以后每隔3天测定一次容器内烃类的浓度，计算消耗率，结果见表1。
其中，消耗率的计算公式为：
根据单位培养时间内土壤消耗甲烷的数量来计算气体氧化速率(R2>0.95)，计算公式为:
V = 1 W &CenterDot; d ( C 0 - C ) dt - - - ( 1 )
其中V为氧化速率，单位是μLL-1HC g-1d-1;t为培养的时间，单位是d；C0和C(μL HCL-1)分别为0时和t时甲烷的碳浓度；W为培养瓶中土壤重量，单位为g。根据气体反应动力学方程式：
V = V max C K m + C - - - ( 2 )
V和Vmax分别为烃氧化的速率和最大反应速率，单位是μL/L HC g-1d-1;Km和C分别为半饱和常数与烃初始浓度，单位均为μL HC L-1。
方程（2）可变形为： 1 V = K m V max &CenterDot; 1 C + 1 V max - - - ( 3 )
根据方差（3），以
Figure BDA00002086933400074
为因变量，
Figure BDA00002086933400075
为自变量，进行线性回归，
Figure BDA00002086933400076
和
Figure BDA00002086933400077
分别为直线的斜率和截距，再进一步计算出Vmax和Km。通过LSR方法来比较不同土壤气态烃氧化的差异（P<0.05），利用Matlab因子分析烃氧化的主要影响因子，并进行线性回归。
表1实验测试结果
如表中所示，检测瓶中加入不同水分，对土壤氧化菌的活性是不同的，在本例中，检测瓶中加入0.5ml的水，为最佳的测试条件。在对甲烷的检测结果中可看到，随着测试时间的推移，甲烷、丁烷的浓度呈逐步降低的趋势；
其中，实施例表格中，加水量为1ml的“丁烷”检测实验中，72h、144h的数据依次为0.31、0.32，后面数据比前位数据略高3%，数值偏差在色谱的误差限内，不影响活性的计算。
早期的活性检测试验，往往由于土壤氧化菌消耗烃类的量过低，使得检测数据出现反转，即后检测的数据大于前面检测的数据，造成活性检测困难。本装置解决了土壤通透性和土壤湿度的矛盾，提高了土壤氧化菌氧化烃类的效率，保证了检测可靠性。在一个地区，可以首先进行测试瓶中加水量试验，获得一个最佳的水分条件，再进行其它大量样品的活性检测工作。

Claims (9)

1.一种用于土壤烃氧化菌活性检测的培养装置，包括检测瓶（1）和可以插入检测瓶（1）的注射针，其特征在于：
所述检测瓶（1）为可形成密闭空间的容器或装置，内设有支架（5），支架的下方有水，支架的上面平铺覆盖有载物网（4）；
所述检测瓶的密封包括胶塞（3）和带孔外盖（2）的密封。
2.如权利要求1所述的培养装置，其特征在于：
所述检测瓶（1）为带有胶塞（3）和带孔外盖（2）的血清瓶；
所述检测瓶（1）的瓶身上具有与带孔外盖（2）配套的对接螺旋。
3.如权利要求1所述的培养装置，其特征在于：
所述支架（5）的材质包括不锈钢或塑料；
所述载物网（4）的材质包括不锈钢网或脱脂纱布。
4.如权利要求3所述的培养装置，其特征在于：
所述支架（5）的材质为塑料；
所述载物网（4）的材质为脱脂纱布。
5.如权利要求1~4之一所述的培养装置，其特征在于：
所述的支架（5）由宽度为1.2~2.2cm，长宽比为（30~18）:1的塑料膜1条，用塑封机沿长度方向，按照每段长度为宽度的1.8~3.6倍的塑料膜对折焊接，每个焊接段相隔0.4~1.4个宽度的制成；然后，将所述支架卷曲，放入检测瓶（1）内，待其在内松开后，调整使其平整稳固，再将所述载物网平铺于支架上。
6.一种利用权利要求1~5之一所述培养装置的土壤烃氧化菌活性检测方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
（1）将所述的培养装置灭菌后干燥；
（2）在无菌环境下取无菌水，沿所述培养装置内壁注入培养装置内，液面低于载物网；
（3）将待测土壤放置于载物网上，塞上胶塞、拧紧带孔外盖；
（4）将待测烃类气体用注射针注入检测瓶内；
（5）定期抽取检测瓶内气体，将气体用于检测。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：
所述无菌水的用量为0.3~2ml；
所述烃类气体选自纯甲烷、乙烷、丙烷、丁烷气体中的至少一种。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：
定期用色谱测定检测瓶（1）内烃类的浓度，每隔3天测定一次，计算出烃类各组分的消耗率，确定烃氧化菌的活性；
检测瓶（1）内的湿度通过注入检测瓶（1）内蒸馏水的多少调节，对于给定的检测瓶（1），以及给定湿度的土壤，通过实验来确定加入的水量；如分别加不同体积的测定样品的活性，活性最大对应的水量就是最适宜的加水量。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：
（1）所述的检测瓶（1）为50mL的血清瓶及其相应的胶塞和带孔外盖（2）；所述的支架（5）的材质为塑料，制作方法为：裁取宽2cm，长度40cm的塑料条，用塑封机沿长度方向每4厘米对折焊接，每个焊接段相隔1-2厘米，焊接完后沿长度方向卷曲，用镍子夹住，放入培养装置内，待其在内松开后，调整使其平整；所述的载物网（4）用脱脂纱布制作；
（2）将以上装置放于高温湿热灭菌器中，在温度为121℃下灭菌30分钟，待压力降低后，放入干燥箱，在60℃干燥60分钟，取出后降到室温；
（3）在无菌工作台上用一次性注射器抽取经灭菌的蒸馏水2ml，沿检测瓶壁注入容器内，称量10克土壤缓缓装入容器内，放于纱布上；再塞上胶塞，拧紧带孔外盖；
（4）用注射器抽取纯甲烷气体0.5ml和纯丙烷气体0.5ml注入检测瓶（1）内；
（5）用色谱测定检测瓶（1）内烃类气体浓度，以后每隔3天测定一次检测瓶内烃类的浓度，计算烃类气体的消耗率，得出烃类氧化菌的活性。
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