CN102212467A

CN102212467A - 一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法

Info

Publication number: CN102212467A
Application number: CN2010101428140A
Authority: CN
Inventors: 易绍金; 易东
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2010-04-07
Filing date: 2010-04-07
Publication date: 2011-10-12

Abstract

本发明涉及一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法，其特征在于在常温下按重量百分比分别取氯化钠0.5％、氯化铵0.5％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％，蒸馏水98.75％；将氯化钠、氯化铵、磷酸氢二钾、硫酸镁依次用蒸馏水溶解后加入到容器中混合摇匀，调节其pH值到6.8-7.8，即配制成制取甲烷氧化菌测试瓶所需的培养液；用液体分装器将所配制的培养液按每瓶9.0ml装入西林瓶中，再用注射器向瓶中注入甲烷气体3.0ml，经加盖、封口、高温蒸汽灭菌、冷却后即制成甲烷氧化菌测试瓶。本发明所生产的甲烷氧化菌测试瓶，能够快速准确地测定甲烷氧化菌的菌数、操作简单、能满足油气微生物勘探的实际生产要求。

Description

一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法

技术领域：

本发明涉及一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法，属应用微生物检测方法技术领域。

背景技术：

在科研和生产实际工作中，常常需要对微生物的数量进行测定。如对水体、空气、土壤等环境中的微生物的测定有利于监测和评价其污染程度；对饮用水和工业循环冷却水中的微生物的测定可以评价其是否达标；对油田污水注水中的微生物数量的测定则有助于评价污水注水的水质等。因此，微生物数量的测定对科研和生产实际工作具有十分重要的指导作用和现实意义。

基于石油烃气的垂直运移理论和烃氧化菌的专属性理论的微生物油气勘探技术，是一种新的近地表油气勘探方法。该方法与传统的油气勘探方法相比，具有直接、有效、快速和经济等优势，目前该技术已在众多国家石油公司的油气勘探中得到应用，并取得了良好的应用效果。

在油气微生物勘探过程中，一个关键环节是必须对大量土壤或水样中的气态烃氧化菌指示菌进行测定。

在油气微生物勘探技术中，由于采集的土壤或水样样品较多(一般200米到1000米取一个样品，取样面积达6km²以上)，而样品的保存时间较短(一般用冰箱冷藏，半个月内送到实验室，并立即测量)，必须尽快测定样品中的指示菌。地表微生物油气勘探中最常用的指示菌有甲烷氧化菌(MOB，methane-oxidizing bacteria)、乙烷氧化菌(EOB，ethane-oxidizing bacteria)、丙烷氧化菌(POB，propane-oxidizing bacteria)和丁烷氧化菌(BOB，butane-oxidizing bacteria)4种，因此需要快速准确测量。目前，气态烃氧化菌测试方法主要有两种：一种是平板菌落计数法，另一种是绝迹稀释法。平板菌落计数法是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的；取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数及稀释倍数，计算出培养物中的活菌数；而绝迹稀释法是将待测定的水样逐级注入到试管中进行接种稀释，直到最后一个试管中无菌生长为止，然后根据细菌生长情况和稀释倍数，计算出水样中细菌的数目。这两种方法都有明显的不足，平板菌落计数法测定结果误差较大，方法十分繁杂；绝迹稀释法操作极为繁琐、费时，包括清洗玻璃器皿、培养基的配制和灭菌、分装等一系列复杂过程，且要求无菌操作。而且，这两种方法尤其不适于样品数量很多的大规模工业勘探测量。因此，迫切需要研究出一种简单、准确、针对性强的气态烃氧化菌测定的新工具和新方法，以满足油气微生物勘探的实际生产要求。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法，使所生产的测试瓶能够快速准确地测定甲烷氧化菌的菌数，用于油气微生物勘探中甲烷氧化菌菌数的测定，满足油气微生物勘探的实际生产要求。

本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。

在常温下，按重量百分比分别取氯化钠0.5％、氯化铵0.5％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％，蒸馏水98.75％；将氯化钠、氯化铵、磷酸氢二钾、硫酸镁依次用蒸馏水溶解，加入到容器中混合、充分摇匀，并用0.5mol/L盐酸溶液或10％氢氧化钠溶液调节其pH值到6.8--7.8，即配制成制取甲烷氧化菌测试瓶所需的培养液；将12ml模制西林瓶清洗干净、干燥，用液体分装器将所配制的培养液按每瓶9.0ml装入瓶中，再用5.0ml注射器向瓶中注入市售甲烷气体3.0ml，立即用胶塞加盖、封口；将经加盖、封口的测试瓶用高温蒸汽灭菌锅在121℃、0.105MPa条件下进行高温灭菌18分钟，冷却后即制成甲烷氧化菌测试瓶。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1、本发明所生产的甲烷氧化菌测试瓶，能够快速准确地测定甲烷氧化菌的菌数、生长指示明显、操作简单、可大大提高工作效率。

2、培养液中的甲烷是唯一碳源，只适合甲烷氧化菌生长，所培养出的微生物只是甲烷氧化菌，测试工作不会受其他细菌的干扰。

具体实施方式：

在常温下(以配制1L培养液为例，以此类推)，按重量百分比分别称取氯化钠5.0g、氯化铵5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.5g；將氯化钠、氯化铵、磷酸氢二钾、硫酸镁依次用蒸馏水溶解，并加入到1L容量瓶中混合、再用蒸馏水定容到1L刻度线，充分摇匀，测定其酸碱度并用0.5mol/L盐酸溶液或10％氢氧化钠溶液调节其pH值到6.8--7.8，即配制成制取甲烷氧化菌测试瓶所需的培养液。

将12ml模制西林瓶清洗干净、干燥，用液体分装器将所配制的培养液按每瓶9.0ml装入瓶中，再用5.0ml注射器向瓶中注入市售甲烷气体3.0ml，立即用A-13型药用胶塞加盖、用普通抗生素玻璃瓶铝盖经专用封口器封口；最后将经加盖、封口的测试瓶用高温蒸汽灭菌锅在121℃、0.105MPa条件下进行高温灭菌18分钟，冷却后即制成甲烷氧化菌测试瓶。

采用甲烷氧化菌测试瓶测定待测水样中的甲烷氧化菌的菌数时，系采用绝迹稀释法原理，将待测水样用无菌注射器逐级注入测试瓶中稀释培养，直到最后一个测试瓶无菌生长为止，可根据稀释的倍数计算出待测水样中甲烷氧化菌的数目。

可采用以下的方法和步骤：

(1)准备数支相同的1ml医用注射器，用蒸馏水清洗干净后高温灭菌(高压蒸汽灭菌锅121℃、0.105MPa下灭菌15分钟)，冷却备用；

(2)根据待测水样中甲烷氧化菌的大致多少，将数个上述所制成的甲烷氧化菌测试瓶排成一组，并依次编上序号1、2、3、4……；

(3)用上述灭菌后的无菌注射器取1.0mL待测水样并注入到1号甲烷氧化菌测试瓶内，充分震荡10秒；

(4)另取一支无菌注射器从摇匀后的1号甲烷氧化菌测试瓶内取出1.0mL液体注入到2号甲烷氧化菌测试瓶内，充分震荡10秒；

(5)再另取一支无菌注射器从摇匀后的2号甲烷氧化菌测试瓶内取出1.0mL液体注入到3号甲烷氧化菌测试瓶内，充分震荡10秒；

(6)依次重复上述操作程序，一直到最后一瓶为止；

(7)把上述加入待测水样后的一组甲烷氧化菌测试瓶放在30℃(或现场温度)的培养箱内培养，经过14天后观察测试瓶内的变化，判断细菌的生长情况；

(8)判断标准：无菌存在的甲烷氧化菌测试瓶内的培养液无变化，而有菌存在的甲烷氧化菌测试瓶内的培养液变浑变浊，且培养液表面有甲烷氧化菌菌膜出现；因此，甲烷氧化菌测试瓶中的培养液变浑变浊，且培养液表面有甲烷氧化菌菌膜出现的，表示有甲烷氧化菌生长；

(9)根据甲烷氧化菌测试瓶内指示细菌生长的情况和有菌生长的测试瓶的瓶数，查表1可计算出待测水样中的甲烷氧化菌菌数。

表1单瓶细菌最大可能值

有菌生长测试瓶数	菌数/个mL^-1
		12345	1-1010-100100-10001000-1000010000-100000

Claims

1.一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法，其特征在于在瓶中加入由氯化钠、氯化铵、磷酸氢二钾、硫酸镁和蒸馏水等制成的培养液和甲烷气体，经加盖、封口、高温蒸汽灭菌制成。

2.根据权利要求1所述的一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法，其特征在于在常温下按重量百分比分别取氯化钠0.5％、氯化铵0.5％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％，蒸馏水98.75％；将氯化钠、氯化铵、磷酸氢二钾、硫酸镁依次用蒸馏水溶解，加入到容器中混合、充分摇匀，并用0.5mol/L盐酸溶液或10％氢氧化钠溶液调节其pH值到6.8--7.8，即配制成制取甲烷氧化菌测试瓶所需的培养液。

3.根据权利要求2所述的一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法，其特征在于将12ml模制西林瓶清洗干净、干燥，用液体分装器将所配制的培养液按每瓶9.0ml装入瓶中，再用5.0ml注射器向瓶中注入市售甲烷气体3.0ml，然后立即用胶塞加盖、封口。

4.根据权利要求3所述的一种甲烷氧化菌测试瓶的生产方法，其特征在于将经加盖、封口的测试瓶用高温蒸汽灭菌锅在121℃、0.105MPa条件下进行高温灭菌18分钟，冷却后即制成甲烷氧化菌测试瓶。