CN107164392A

CN107164392A - 一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用

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Publication number: CN107164392A
Application number: CN201710561056.8A
Authority: CN
Inventors: 张俊祥; 石伟佳; 张志宏; 孙平; 孙一平; 王保田
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2037-07-11
Also published as: CN107164392B

Abstract

本发明涉及一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用，属于分子生物学中的基因工程领域，增强植物盐胁迫耐性的草莓FvDIV的全长编码区序列如序列表SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明提供草莓耐盐胁迫相关基因FvDIV并用于构建FvDIV基因的植物表达载体，构建的植物表达载体经农杆菌介导法转化拟南芥，获得的转基因植株抗盐胁迫的能力明显提高。本发明为利用基因工程技术，对提高植物的耐盐胁迫能力提供了理论依据与技术手段，具有很大的应用价值。

Description

一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用。

背景技术

草莓多年生草本植物，属于蔷薇科草莓属，浆果类果树(林凤起，1986)。草莓果实为假果，由花托发育而成(雷家军，2006)。草莓果实色泽红嫩诱人，口感柔软多汁，独具风味，具备很高的营养价值及药用价值，素有“水果皇后”之称，广受大众欢迎(万清林，1994)。

植物对非生物逆境(干旱、冷害、高盐碱等)的适应性对于作物的产量和品质有着非常重要的影响，在许多地区是农业发展的瓶颈。由于北方地区草莓的种植是在日光温室中进行的，因而低温和盐碱胁迫一直是困扰设施草莓发展的瓶颈问题，但目前在草莓中还没有真正可用于抗逆遗传改良的基因。

在植物体内，通过转基因技术，过表达或干扰某个基因可以提高植物对环境胁迫的抗性。在烟草中，过表达精氨酸脱羧酶基因，进而提高植物体内多胺水平，增强了烟草对干旱胁迫的抗性(li et al.2017)。有研究报道，在拟南芥过表达GmWRKY20基因，提高了拟南芥中ABA含量，从而提高了拟南芥的抗旱性(luo et al.2013)。另有研究表明，在对模式植物金鱼草的研究中发现DIVARICATA(DIV)RADIALIS(RAD)、DICHOTOMA(DICH)共同参与两侧对称花型发育的分子调控(魏海超等，2012)，但有关DIVARICATA基因在植物耐盐过程中的作用鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用。本发明的技术方案是从二倍体森林草莓‘Ruegen’中分离得到FvDIV基因，构建该基因的植物过表达载体，通过农杆菌介导法，将该基因转化到拟南芥中，以实现FvDIV基因的功能分析。

本发明提供了一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV，该基因的cDNA序列如SEQ NO.1所示；草莓盐胁迫相关基因FvDIV编码的蛋白质，所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；本发明还提供了一种含有草莓盐胁迫基因FvDIV的植物表达载体pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV，将其通过农杆菌介导法转入拟南芥中。

实际上，任何一种将外源基因导入植物体内的表达载体都可以用，本发明优先选用的是的pRI101-GFP-CaMV35S。

本发明的有益效果是：利用现有植物基因工程技术，本发明克隆了草莓耐盐相关基因FvDIV，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐胁迫明显提高。

附图说明

图1：FvDIV基因全长cDNA序列的扩增结果。其中M为DL2000

图2：pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV重组载体验证结果。其中M为DL2000

A：为Kpn1和EcoR1对pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV重组载体双酶切验证结果。

B：为转化了的pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV农杆菌的菌落PCR结果。

图3：pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV测序比对结果。

图4：转基因拟南芥抗性筛选。

图5：为盐胁迫下转基因植株的生长状况。其中，WT为转化的拟南芥，Line8/Line19为两个独立的转基因株系。

图6：FvDIV与其他物种氨基酸序列比对结果

具体实施方式：

实施例1、草莓盐胁迫基因FvDIV的克隆

(1)以二倍体森林草莓‘Ruegen’为试材。

(2)RNA提取：采用改良CTAB法，提取材料中的总RNA之后用反转录试剂盒以RNA为模板反转录得到cDNA第一链。

(3)基因的克隆：以反转录的果实cDNA第一链为模板，利用引物FvDIV-F和FvDIV-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得939bp的目的片段。

FvDIV-F：5＇－AAAGGTACCATGTATAGGGGAATTGAAGTTC－3＇

FvDIV-R：5＇－AAAGAATTCCTGATATTGCATCTCGAAACGC－3＇

其中，引物5＇端的前3个碱基为保护碱基，紧接着的6个碱基是酶切位点，5＇端前9个碱基是构建过表达载体所需，不属于FvDIV的基因序列。

实例2、植物表达载体的构建

(1)利用植物表达载体pRI101-GFP-CaMV35S，选用Kpn1和EcoR1(购自TaKaRa公司)分别对pRI101-GFP-CaMV35S和含有目的基因的PMD18-T(购自TaKaRa公司)进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用T4 DNA连接酶连接过夜后转化大肠杆菌感受态DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司)，鉴定重组子后即可进行双酶切验证。

(2)选取双酶切验证正确的重组质粒，送金唯智生物科技有限公司测序。之后转化农杆菌GV3101感受态细胞，得到的含有重组质粒的农杆菌用于转化拟南芥。

实例3、转基因功能验证—拟南芥转化筛选及耐盐表型分析

3.1拟南芥转化

当拟南芥(哥伦比亚生态型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导侧花序的生成，转化前将材料浇透水。挑选含有目的基因FvDIV的农杆菌GV3101阳性克隆。接种于含有Kan(卡那霉素)50mg/L和Rif(利福平)25mg/L的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h，取1ml培养好的菌液，加入50ml液体YEP液体培养基，放置于28℃，200rpm振荡培养，使OD600＝0.8左右。

将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，5min离心收集菌种，再用同等体积的MS重悬液(1/2MS+5％Sucrose，pH5.7)重悬农杆菌，并加入表面活性剂Silwet，使其终浓度达到0.03％(300μl/L)。一个月后收获了T0代种子在含有30mg/L的卡纳霉素的培养基上筛选出阳性植株(见图4)，以便收获T2代种子，用于盐胁迫实验。

3.2拟南芥阳性株系耐盐表型分析

在1/2MS培养基上播种的WT和转基因拟南芥种子生长5d后(约2片子叶)，挑选生长状况一直的植株转移到含有75mM的NaCl的1/2MS的培养基上，生长12天之后测定主根长度(见图5)。测定结果如表1所示。

表1野生型和转基因植株在0mM和75mM NaCL 1/2MS培养基上主根长

由表1可知，在相同的培养条件和培养基上，12天之后，在不含NaCL的1/2MS培养基上，野生型拟南芥(WT)的根长与转基因株系(Line8和Line19)拟南芥根长没有明显差别。在含有75mM NaCL的1/2MS培养基上，转基因株系的主根明显长于野生型，且转基因植株的生长状态也优于野生型，叶片颜色较野生型绿。这说明，草莓FvDIV能够提高植物的抗盐胁迫能力。以上植株的培养条件均在温度23-25℃，光照1800～2200lx，光照时间为16h/d。

SEQ ID NO:1

ATGTATAGGGGAATTGAAGTTCTATCTCCAGCCTCTTATATTCAAAACTCAAATTGGTTATTCCAAGAAAGCAAAGGAGCCGAGTGGACCGCAGAGGAGAACAAGCGATTTGAGAATGCTCTTGCTCTTTATGATAAGGACACCCCTGATCGATGGCAAAAGGTGGCTTATTTGATCCCTGGAAAGACCGTTGGCGATGTGATCAAGCAGTACAAGGAGTTGGAGGAAGATGTGAGTGATATTGAGGCTGGTCTTATCCCAATTCCTGGGTATTCTAATAATAATTCTTTCACATTGGAGTGGGTTGATGATCAAGGCTTCGATGGATTGAAGCAATATTATAGTGTTGGTGGGAATGGTGGCAAGAGAGGCTCGTCGACTCGGCCGTCTGAGCAGGAAAGAAAGAAAGGTGTGCCATGGACTGAAGAAGAGCACAGGCAATTTCTGATGGGACTTAAAAAGTATGGTAAAGGTGACTGGAGAAATATCTCAAGAAATTTTGTGACCACTAGGACACCAACTCAAGTAGCCAGTCATGCTCAAAAGTACTATATCAGGCAACTCACAGGAGGCAAAGACAAGAGAAGGTCTAGCATCCACGACATCACAACCGTTAATGTGTCAGATACCAAATCTGGATCAGTAGGGAGTAGCCAGAGTACTACTAGAAGCTCAACGTCACAAGATCATGAGTCTGCAGTTGTGGTTCAGTCACAGCAACATCCAAAGATGAGTAATAAGCAGCAATTTGACTGGAAAGTGTCGAATGAGGGACCGCAGATGGTCTTCAATTCGATGAATGGGAATGCGATCATTGGACCTTTCATCGGCATTTCTTCACCTGTACCTAAGCTTGAGGAGCAAGATTTCTTCAGTGGCAGTACCTTTCATGGATCTCAGTTTGATCATCACAATGCGCGTTTCGAGATGCAATATCAGTGA

SEQ ID NO:2

MYRGIEVLSPASYIQNSNWLFQESKGAEWTAEENKRFENALALYDKDTPDRWQKVAYLIPGKTVGDVIKQYKELEEDVSDIEAGLIPIPGYSNNNSFTLEWVDDQGFDGLKQYYSVGGNGGKRGSSTRPSEQERKKGVPWTEEEHRQFLMGLKKYGKGDWRNISRNFVTTRTPTQVASHAQKYYIRQLTGGKDKRRSSIHDITTVNVSDTKSGSVGSSQSTTRSSTSQDHESAVVVQSQQHPKMSNKQQFDWKVSNEGPQMVFNSMNGNAIIGPFIGISSPVPKLEEQDFFSGSTFHGSQFDHHNARFEMQYQ

SEQUENCE LISTING

<110> 沈阳农业大学

<120> 一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用

<130> 2017.7.11

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgtataggg gaattgaagt tctatctcca gcctcttata ttcaaaactc aaattggtta 60

ttccaagaaa gcaaaggagc cgagtggacc gcagaggaga acaagcgatt tgagaatgct 120

cttgctcttt atgataagga cacccctgat cgatggcaaa aggtggctta tttgatccct 180

ggaaagaccg ttggcgatgt gatcaagcag tacaaggagt tggaggaaga tgtgagtgat 240

attgaggctg gtcttatccc aattcctggg tattctaata ataattcttt cacattggag 300

tgggttgatg atcaaggctt cgatggattg aagcaatatt atagtgttgg tgggaatggt 360

ggcaagagag gctcgtcgac tcggccgtct gagcaggaaa gaaagaaagg tgtgccatgg 420

actgaagaag agcacaggca atttctgatg ggacttaaaa agtatggtaa aggtgactgg 480

agaaatatct caagaaattt tgtgaccact aggacaccaa ctcaagtagc cagtcatgct 540

caaaagtact atatcaggca actcacagga ggcaaagaca agagaaggtc tagcatccac 600

gacatcacaa ccgttaatgt gtcagatacc aaatctggat cagtagggag tagccagagt 660

actactagaa gctcaacgtc acaagatcat gagtctgcag ttgtggttca gtcacagcaa 720

catccaaaga tgagtaataa gcagcaattt gactggaaag tgtcgaatga gggaccgcag 780

atggtcttca attcgatgaa tgggaatgcg atcattggac ctttcatcgg catttcttca 840

cctgtaccta agcttgagga gcaagatttc ttcagtggca gtacctttca tggatctcag 900

tttgatcatc acaatgcgcg tttcgagatg caatatcagt ga 942

<210> 2

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Tyr Arg Gly Ile Glu Val Leu Ser Pro Ala Ser Tyr Ile Gln Asn

1 5 10 15

Ser Asn Trp Leu Phe Gln Glu Ser Lys Gly Ala Glu Trp Thr Ala Glu

20 25 30

Glu Asn Lys Arg Phe Glu Asn Ala Leu Ala Leu Tyr Asp Lys Asp Thr

35 40 45

Pro Asp Arg Trp Gln Lys Val Ala Tyr Leu Ile Pro Gly Lys Thr Val

50 55 60

Gly Asp Val Ile Lys Gln Tyr Lys Glu Leu Glu Glu Asp Val Ser Asp

65 70 75 80

Ile Glu Ala Gly Leu Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Ser Asn Asn Asn Ser

85 90 95

Phe Thr Leu Glu Trp Val Asp Asp Gln Gly Phe Asp Gly Leu Lys Gln

100 105 110

Tyr Tyr Ser Val Gly Gly Asn Gly Gly Lys Arg Gly Ser Ser Thr Arg

115 120 125

Pro Ser Glu Gln Glu Arg Lys Lys Gly Val Pro Trp Thr Glu Glu Glu

130 135 140

His Arg Gln Phe Leu Met Gly Leu Lys Lys Tyr Gly Lys Gly Asp Trp

145 150 155 160

Arg Asn Ile Ser Arg Asn Phe Val Thr Thr Arg Thr Pro Thr Gln Val

165 170 175

Ala Ser His Ala Gln Lys Tyr Tyr Ile Arg Gln Leu Thr Gly Gly Lys

180 185 190

Asp Lys Arg Arg Ser Ser Ile His Asp Ile Thr Thr Val Asn Val Ser

195 200 205

Asp Thr Lys Ser Gly Ser Val Gly Ser Ser Gln Ser Thr Thr Arg Ser

210 215 220

Ser Thr Ser Gln Asp His Glu Ser Ala Val Val Val Gln Ser Gln Gln

225 230 235 240

His Pro Lys Met Ser Asn Lys Gln Gln Phe Asp Trp Lys Val Ser Asn

245 250 255

Glu Gly Pro Gln Met Val Phe Asn Ser Met Asn Gly Asn Ala Ile Ile

260 265 270

Gly Pro Phe Ile Gly Ile Ser Ser Pro Val Pro Lys Leu Glu Glu Gln

275 280 285

Asp Phe Phe Ser Gly Ser Thr Phe His Gly Ser Gln Phe Asp His His

290 295 300

Asn Ala Arg Phe Glu Met Gln Tyr Gln

305 310

Claims

1.一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV，其特征在于：该基因的cDNA核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.根据权利要求1所述的草莓盐胁迫相关基因FvDIV编码的蛋白质，其特征在于；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种用于扩增权利要求1所述的草莓盐胁迫相关基因FvDIV的引物，其特征在于，包含：

FvDIV-F：5＇－AAAGGTACCATGTATAGGGGAATTGAAGTTC－3＇

FvDIV-R：5＇－AAAGAATTCCTGATATTGCATCTCGAAACGC－3＇

4.一种含有权利要求1所述的草莓盐胁迫相关基因FvDIV的植物过表达载体，其特征在于：载体为pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV。

5.根据权利要求1所述的草莓盐胁迫相关基因FvDIV在提高植物耐盐胁迫中应用。

6.权利要求4所述的草莓的表达载体pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV在提高植物耐盐胁迫中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：采用农杆菌介导法，将基因转化到拟南芥。