CN109316477A - 原花青素类化合物在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱的产品中的用途 - Google Patents
原花青素类化合物在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱的产品中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了原花青素类化合物在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱的产品中的用途，提供了马蔺化合物原花青素类化合物在制备与糖脂代谢紊乱相关疾病药物中的用途，验证了所述原花青素类化合物可抑制脂肪细胞分化，从而用于制备预防或治疗肥胖、II型糖尿病等代谢紊乱疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于植物中药物活性化合物开发领域，特别是涉及马蔺中提取的原花青素类化合物的用途。
背景技术
当机体摄入过多能量而无法消耗时，就以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞内，这种恶性循环下最终会引发一系列的代谢紊乱相关疾病，如肥胖症、糖尿病等。由此可以看出，脂肪细胞在能量储存和能量代谢方面扮演着极为重要的角色，在研究关于肥胖、糖尿病等代谢紊乱相关疾病的预防和治疗中，控制脂肪细胞分化的过程是一条重要和有效的途径。抑制脂肪细胞的分化已成为预防或治疗肥胖、II型糖尿病等代谢紊乱的疾病的靶点。成为脂肪细胞的过程主要包括脂肪细胞形态的改变、生长期阻滞及脂质积累等。因此抑制脂肪细胞分化可从成为脂肪细胞的这些阶段着手进行干预。
马蔺(Iris lactea Pall.var.Chinensis(Fisch.)Koidz)是被子植物门(Angiospermae)鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)的多年生草本宿根植物。目前为止，已经从马蔺的种子中分离得到多种化学成分，包括黄酮类、苯醌类、低聚茋类等。现代药理学对马蔺中的主要活性成分进行了研究，发现马蔺具有多种药理活性，如放射增敏作用、抗辐射作用、增强免疫力、抗生育、抗着床作用等。但是近年来对马蔺的化学成分和药理作用研究多局限于马蔺子甲素的射增敏作用，而对其他化学成分及活性作用研究尚不深入也未见报到。因此，对马蔺中其具有活性的化学成分的开发和药理作用的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供从马蔺中提取得到的原花青素类化合物在制备预防和/或治疗代谢紊乱，特别是糖脂代谢紊乱相关疾病药物中的应用，所述化合物具有抑制脂肪细胞分化的作用。
本发明提供原花青素化合物的用途，所述原花青素类化合物包括以下结构式的化合物中的至少一种，各化合物的结构式和命名如下：
本发明提供的原花青素类化合物在制备预防和/或治疗代谢紊乱的产品中的应用。
所述产品可以是药物、保健品或其他改善胰岛素抵抗的产品。当为药物时，所述药物为预防和/或治疗糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病、代谢综合征中的至少一种的药物。进一步地，所述糖尿病为II型糖尿病。
进一步地，所述代谢紊乱包括糖代谢紊乱和/或脂代谢紊乱。
进一步地，所述药物为脂肪细胞分化抑制剂。
所述脂肪细胞分化抑制剂为抑制脂肪细胞分化的药物。
进一步地，所述药物为降脂药物和/或降糖药物。
所述降脂药物为抑制脂肪细胞胞浆内脂滴的产生及减少甘油三脂含量的药物。
进一步地，所述药物为脂肪细胞G1/S期抑制剂或阻滞剂。
所述脂肪细胞G1/S期抑制剂为阻滞脂肪细胞G1/S期的进程的药物。
进一步地，所述药物为PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、SREBP-1c 拮抗剂、FABP4拮抗剂中的至少一种。
所述PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、SREBP-1c拮抗剂和FABP4 拮抗剂分别为降低脂肪细胞转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、 FABP4的基因表达和蛋白表达水平的药物。
成为脂肪细胞的过程主要包括脂肪细胞形态的改变、生长期阻滞及脂质积累等。因此抑制脂肪细胞分化的药物，可以是抑制脂肪细胞胞浆内脂滴的产生及减少甘油三脂含量的药物，也可以是阻滞脂肪细胞 G1/S期的进程的药物，也可以是降低脂肪细胞转录因子PPARγ、 C/EBPα、SREBP-1c、FABP4的基因表达和蛋白表达水平的药物，或者具有以上作用中的两种或三种的药物。
前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞需要一系列复杂精细的转录因子调控。PPARγ是脂肪细胞形成的必不可少的调控因子，在成脂过程的早期高度表达。C/EBPa也就是所谓的CCAAT/增强子结合蛋白α，在脂肪细胞分化的中期阶段大量表达，与PPARγ共同调控下游的转录因子如 SREBP-1c和FABP4等表达。通常SREBP-1c和FABP4在分化过程的末期表达，这些基因主要参与形成和保持脂肪细胞的形态。本发明所述原花青素类化合物能降低脂肪细胞转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、FABP4的基因表达和蛋白表达水平，从而能够有效抑制脂肪细胞分化。
本发明还提供了上述原花青素类化合物在制备脂肪细胞分化抑制剂中的应用。
本发明还提供了以上原花青素类化合物在制备降脂药物和/或降糖药物中的应用。
本发明还提供了上述原花青素类化合物在制备PPARγ拮抗剂、 C/EBPα拮抗剂、SREBP-1c拮抗剂、FABP4拮抗剂中的任意一种中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明中原花青素类化合物能抑制脂肪细胞胞浆内脂滴的产生及减少甘油三脂的含量，可用于制备预防和/或治疗肥胖、糖尿病等糖脂代谢紊乱相关疾病的药物。
(2)本发明中原花青素类化合物能阻滞G1/S期的进程，降低 PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4基因表达水平和蛋白表达水平，能够有效抑制脂肪细胞分化，可用于制备预防和/或治疗肥胖、糖尿病等糖脂代谢紊乱相关疾病的药物。
(3)本发明更加全面挖掘了马蔺的药用价值、拓展了其临床应用，为开发治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的药物的活性成分提供了新的来源和方向。
附图说明
图1是原花青素类对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响；
图2是3T3-L1前脂肪细胞(左)和成熟脂肪细胞(右)(200×)；
图3是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞分化的影响：(a)3T3-L1脂肪细胞脂滴的产生(200×)；(b)TG含量测定；
图4是原花青素类处理后的3T3-L1脂肪细胞细胞周期分布；
图5是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞脂代谢相关蛋白表达影响；
图6是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞转录因子mRNA表达水平的影响：(a)PPARγ，(b)C/EBPα，(c)SREBP-1c，(d)FABP4 mRNA 的表达水平。
具体实施方式
下面通过具体实施例和具体实验对本发明所述应用做进一步说明，对所述原花青素抑制细胞分化的作用进行验证和说明。
一、实验材料和实验准备
1.实验材料、试剂与仪器
受试样品包括6个原花青素类化合物：Catechin(P-1)、Epicatechin (P-2)、Procyanidin B7(P-3)、Procyanidin B6(P-4)、Procyanidin B3 (P-5)、Procyanidin B1(P-6)，均是从马蔺种子中分离纯化制得，经 HPLC检测纯度均在95％以上，其化学结构式如下：
3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞系由中国科学院上海细胞库提供，所使用的实验材料与试剂见表1。
表1材料与试剂
(1)受试化合物的配制
分别称取适量的单体化合物P-1、P-2、P-3、P-4、P-5和P-6用DMSO 溶液配制成100mM的母液，于-20℃保存，使用时按实验需求进行稀释。
(2)MTT溶液配制
称取25.0mg MTT粉末，用5mL PBS充分溶解，配制成浓度为5 mg/mL，分装后避光，于-20℃保存。
(3)IBMX(×100，50mM)溶液的配制
称取115.0mg IBMX，溶于940μL去离子水，再加入60μL 1M KOH溶液，022μm滤膜过滤除菌，分装后，-20℃保存。用时稀释100 倍，即每毫升培养液中加入10μL IBMX母液，使用时的终浓度为0.5 mM。
(4)Dex(×1000，1000μM)溶液的配制
称取3.9mg Dex，溶于10mL 98％甲醇中，分装后甲醇中，分装后-20℃保存。用时稀释1000倍，即每毫升培养液中加入1μL Dex母液，使用时的终浓度为1μM。
(5)胰岛素溶液的配制
购买的人工合成胰岛素浓度为1.4mg/mL，4℃保存，使配制时的终浓度为10μg/mL。
(6)油红O染色的配制
油红O母液的配制：称取0.60g油红O粉末加入到100mL异丙醇中，充分搅拌均匀后，用滤纸过滤，避光，4℃保存。
油红O工作液配制：取上述已配制的油红O母液和去离子水以3：2的比例充分混匀后过滤使用。
(7)4％中性甲醛溶液的配制
称取无水磷酸氢二钠0.65g，磷酸二氢钠0.40g，量取40％甲醛10 mL，混合溶解而成。
(8)10％(W/V)过硫酸铵(APS)溶液
称取0.1g过硫酸铵，加入1.0mL超纯水，溶解后，-20℃避光保存，现用现取(可一次性配5mL，用200μL管分装)。
(9)10％SDS溶液的配制
称取10g SDS，加入，加入100mL超纯水，50℃水浴溶解，室温保存。如出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
(10)SDSSDS-PAGE电泳液(5×)的配制
称取15.1gTris，94.0gGlycine，5.0gSDS，加超纯水溶解定容至100 mL，室温保存。使用时可将5×的电泳液稀释为1×电泳液，重复使用 2～3次，室温保存。
(11)转膜液(10×)的配制
称取15.15g Tris，72.0g甘氨酸用时稀释为1×转膜液，方法：量取10×转膜液50mL，加甲醇100mL，用超纯水补至500mL，即10×转膜液∶甲醇∶水＝1∶2∶7，可重复使用3-5次，4℃冰箱保存。
(12)TBS(10×)的配制
称取12.12g Tris，40.03g NaCl，加超纯水溶解，HCl调PH＝7.6(加 HCl大约3.5mL)，定容至500mL，4℃冰箱保存。
(13)75％DEPC乙醇的配制
用DEPC水稀释无水乙醇至75％，4℃冰箱存放。
(14)5％脱脂牛奶的配制
称取1.5g脱脂牛奶，加入30mLTBST，超声充分溶解后，置于4℃冰箱保存。
本发明所使用的实验仪器与设备见表2。
表2仪器与设备
2.实验方法
本发明使用统计学软件SPSS17.0进行实验数据的分析和整理，统计结果用平均值±标准值表示，两组间均数的比较采用独立样本 t检验，*表示P＜0.5说明具有统计学意义，**表示P＜0.01说明其差异具有极显著统计学意义。
3T3-L1前脂肪细胞培养技术：
(1)3T3-L1前脂肪细胞的体外培养
将3T3-L1前脂肪细胞用含10％FBS及1％青链霉素混合液的DMEM 高糖培养基在37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养。
(2)3T3-L1前脂肪细胞的传代
当步骤(1)中体外培养的前脂肪细胞细胞融合度达到80％以上时，按照常规方法对细胞进行1∶5的比例传代。
(3)3T3-L1前脂肪细胞的计数
用血球计数板进行细胞计数，血球计数板每块计数板由2块H形凹槽，形成高0.10mm的计数池，计数板中有9个大方格，细胞计数的区域为四角的4个大方格。根据实验要求调整细胞计数密度，记录4个大方格的细胞总数，最后下列公式计算细胞个数：细胞个数＝4个格中的细胞总数4×104×稀释倍数。根据实验需要，调整细胞密度。
(4)3T3-L1前脂肪细胞的冻存
选取对数生长期的细胞，快速消化细胞，加入提前配制的细胞冻存液，分装到无菌的细胞冻存管中。在4℃放置10min，-20℃放置1h，-80℃放置过夜后，于液氮罐中保存。
(5)3T3-L1前脂肪细胞的复苏
从液氮罐中快速取出冻存的细胞株，迅速置于37℃水浴中融化，待细胞完全融合后，快速地将细胞转移培养液中进行培养，至细胞贴壁后 (一般6h)，更换新鲜培养液。
二、3T3-L1前脂肪细胞活力的测定
将3T3-L1前脂肪细胞接种至96孔培养板，每孔的铺板密度为1×104个细胞，用含10％FBS的高糖DMEM培养液培养24h至细胞完全长满到80％左右；将96孔板放入培养箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养24h，加入受试单体化合物。每个受试单体化合物分别设6 组浓度梯度(0、0.1μM、1μM、10μM、50μM及100μM，每个浓度设置 4个重复，药物浓度处理细胞48h后，采用酶标仪在490nm处读取吸收值。按下列公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(药物组OD/空白组OD)×100％
通过MTT法检测本发明6个原花青素类单体化合物对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响。从图1可以看出，6个原花青素类单体化合物对 3T3-L1前脂肪细胞的相对存活率的影响没有呈现出明显的浓度依赖关系，各浓度处理后细胞的相对存活率均在80％以上，对细胞的影响较小，受试化合物对细胞的毒性较弱，对于后续有关3T3-L1前脂肪细胞的活性试验，选用10μM作为处理浓度。
三、3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化
采用“鸡尾酒法”对3T3-L1前脂肪细胞进行诱导：将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板上，铺板密度5×104个/mL，用含10％FBS的高糖 DMEM培养液培养至细胞完全长满到80％左右时，进行2天的接触抑制。随后进行诱导分化，加诱导液I诱导2天，随后用诱导液II诱导2天，再用完全培养液继续培养4天，在诱导的第8天，观察细胞内可见85％以上的细胞呈现出成熟脂肪细胞形态，即通过显微镜发现细胞内具有大小不一的脂滴。诱导液I：0.5mMIBMX+0.1μM Dex+10μg/mL Insulin，诱导液II：10μg/mL Insulin。
3T3-L1前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，胞浆中未见脂滴，如图2左图所示的3T3-L1前脂肪细胞。当细胞完全融合处于生长停滞期，加入诱导I和诱导液II各培养2天后，细胞开始由前脂肪细胞向成熟细胞转变，细胞形态由梭型开始逐渐转变为圆形，并且胞体变大，胞浆内逐渐出现脂滴。随着培养时间的增加，胞浆的脂滴显著增多。直到第8 天，胞浆内90％的前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，呈“戎环”样的结构，为典型的3T3-L成熟脂肪细胞，如图2右图所示。
四、3T3-L1细胞脂滴积累和TG含量测定
将无菌盖玻片置于24孔板中，加入1mL DMEM，置于培养箱中温浴30min后。吸走培养基，将细胞以5×104个/mL接种于玻片上，每孔中加1mL细胞悬液，用针头按压玻片排除下面的气泡，置于培养箱中培养，待细胞完全汇合2天后进行诱导分化。诱导分化过程同实施例3，在诱导的第0天和第2天加受试化合物进行处理。诱导结束后，进行固定并加入提前配制的油红O工作液染于细胞表面，避光静置60min。用 70％乙醇洗涤细胞，取出多余的染料双蒸水洗涤3～4次，置于显微镜下观察并拍照。
将3T3-L1脂肪细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞完全长满至80％左右时进行诱导分化，诱导过程同实施例4，在诱导的第0天和第2天分别加受试单体化合物进行处理。在诱导的第8天进行TG含量的测定，其具体方法如下：(1)细胞收集：在诱导的第8天，将细胞培养液吸走，PBS洗两次后用胰蛋白酶消化液消化脂肪细胞2min 使其成为单个细胞，并加入PBS 3mL吹打均匀，快速转移至离心管中，在1000rpm/min的条件下离心6min，弃上清，留细胞沉淀。(2)细胞破碎：加入0.3mL的匀浆介质进行匀浆，冰浴条件下进行超声破碎(功率：300W，3～5s/次，间隔30s，重复3～5次)，制备好的匀浆液不离心直接测定。(3)在96孔板中每孔加入2.5μL待测样品，空白孔中加入 2.5μL蒸馏水，标准孔中加入2.5μL标准品，然后每孔中加入250μL工作液，510hm波长条件下用酶标仪测定各孔吸光值。借助BCA法测定待测样品中蛋白浓度，进行校正。
TG含量＝(OD样品-OD空白)/(OD校样-OD空白)×校准品浓度 (mM)/待测样品蛋白浓度(gprot/L)
如图3(a)所示，undiff组内没有出现任何脂滴，细胞形态和前脂肪细胞基本相似为梭形，细胞分化程度极低。而diff组内出现大量的脂滴，分化程度极高，95％以上细胞都分化为成熟脂肪细胞。原花青素的 6个化合物处理后，都能减少3T3-L1细胞内脂滴的积累，表现出抑制脂肪细胞分化的作用。其中化合物P-5和P-6表现出强烈的抑制分化的作用，其余四个化合物的抑制细胞分化作用相比化合物P-5和P-6较弱。 TG含量测定结果如图3(b)所示，undiff组中TG含量极低，其数值小于0.2mmol/gprot；diff组中TG含量显著高于药物处理组；说明经本发明6个原花青素化合物处理后，都能减少3T3-L1细胞内脂滴的积累，表现胞内TG含量较diff组低。其中化合物P-5和P-6处理后，脂肪细胞胞内TG含量显著降低。其脂滴积累(油红O染色)的结果与TG含量测定的结果趋势基本一致。
五、细胞周期测定
将3T3-L细胞以5×104个/孔密度接种于6孔板中，待完全汇合2天后进行诱导分化，诱导过程同实施例3，在诱导的第0天和第2天加受试化合物进行处理。在诱导的第4天收集细胞进行周期的测定，其具体方法如下：(1)细胞样品的准备：在诱导的第4天，将细胞培养液吸走，PBS洗两次，用胰蛋白酶消化液消化2min成单细胞，加入提前预冷的 PBS吹打均匀，吸至离心管中，1000rpm/min，离心3min，弃上清，留细胞沉淀，用PBS洗1～2遍，弃上清，留细胞沉淀；(2)细胞固定：每管中加入1mL提前冰浴预冷的70％乙醇，4℃固定12h；(3)染色：每管细胞样品中加入500μL提前配制的碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min；(4)流式检测。
如图4所示，3T3-L1脂肪细胞细胞经过本发明10μM原花青素类单体化合物处理后，FCM法检测undiff组发现G1期细胞周期严重阻滞及 S期细胞减少。而diff组中G1期所占的比例明显升高，S期细胞活跃 DNA合成加快。原花青素的6个单体化合物能不同程度的阻滞G1/S期的进程，这跟抑制细胞分化的作用有关。
六、3T3-L1脂肪细胞代谢相关蛋白表达的检测
将3T3-L1细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，待细胞完全长满至 80％左右时进行诱导分化，诱导过程同实施例3，在诱导的第0天和第2 天分别加入受试单体化合物进行处理。在诱导的第8天收集细胞，提取胞浆蛋白，其具体方法如下：
(a)细胞总蛋白的抽提：细胞经药物处理结束后，收集细胞并抽提总蛋白，最后将提取的总蛋白置于-80℃保存。
(b)BCA法测定蛋白质含量
取出冻存的蛋白样品，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书的要求，将蛋白标准品用PBS缓冲液稀释为0.5mg/mL，按50∶1的比例将试剂A：试剂B混匀配制成工作液。按表3所示将标准品和PBS加入96孔板中，每孔20μL，每个浓度设3个复孔，用来绘制标准曲线。蛋白样品1μL 加到96孔板中，加PBS补到20μL。每孔加入200μLBCA工作液充分混匀，上述样品在微孔板孵育振荡器37℃振荡孵育30min，于酶标仪562nm 处测光度值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。测定完蛋白浓度后，计算30μg蛋白样品中加入SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀，沸水中煮沸10min，使蛋白完全变性。蛋白上样前，样品离心混匀后使用。
表3 BCA法蛋白定量表
(1)SDS-PAGE电泳
根据目的蛋白的分子量按照表4选择合适的分离胶浓度，根据表5 配胶说明，配置合适的溶液体系，最后按照表6配制上层5％的浓缩胶，配胶后按常规方法进行电泳，电泳条件：S1阶段，80V，30min；S2阶段，120V，2h，直至缓冲液中溴酚蓝跑到分离胶最下端时结束电泳。
表4不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围
表5配制不同体积10％SDS-PAGE分离胶所需各成分体积
表6配制不同体积5％SDS-PAGE浓缩胶所需各成分体积
(2)转膜：待到蛋白电泳结束后立即进行转膜。
(3)封闭：转膜结束后，将PVDF膜快速从转膜板中用镊子轻轻拿出，放于TBST缓冲液中漂洗5min，随后立刻用含5％脱脂奶粉的TBST 室温摇床1h进行封闭。
(4)一抗孵育：封闭结束后，将PVDF膜放入稀释好的一抗溶液中，在4℃条件下置于水平摇床上慢摇进行过夜孵育。
(5)二抗孵育：一抗孵育结束并完成洗膜后，将PVDF膜置于含有HRP标记的鼠二抗或兔二抗溶液中室温摇床孵育1h。
(6)显影：所有抗体孵育结束后，采用ECL法检测，按1∶1比例配制显影液，将混合好的ECL加在PVDF膜上进行发光，并用凝胶成像系统进行拍照。
本实验通过Western blotting研究在蛋白水平上本发明原花青素类化合物对3T3-L1脂肪细胞脂代谢相关蛋白表达的影响。如图5所示，在 undiff的3T3-L1前脂肪细胞中，PPARγ、SREBP-1c和FABP4都近乎没有表达，C/EBPα处于本底的低表达水平。而diff组的脂肪细胞中，PPARγ、 FABP4和C/EBPα都有较高的表达水平。原花青素类中各个单体化合物对其脂肪细胞分化过程进行药物干预后，发现本发明原花青素类都能不同程度降低PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4蛋白表达水平，其中对SREBP-1c蛋白表达水平的影响程度较弱。化合物P-5和P-6能明显降低PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4蛋白表达水平，其次是化合P-3和P-4能较强降低脂代谢相关蛋白的表达水平，抑制脂肪细胞分化。
七、3T3-L1脂肪细胞转录因子mRNA表达的检测
将3T3-L1脂肪细胞以5×104个/孔密度接种于6孔板中，待细胞完全长满至80％左右时，进行诱导分化，诱导过程同实施例3，在诱导的第0天和第2天加马蔺受试化合物进行处理。在诱导的第8天收集细胞提取总RNA，其具体方法如下：
(1)Trizol法提取细胞总RNA
细胞经药物处理结束后，收集细胞并用Trizol法提取细胞总RNA，最后将提取的总RNA立即保存于-80℃超低温冰箱或立即用于逆转录。
(2)RNA检测与定量
a.RNA浓度和纯度测定
采用酶标仪进行RNA母液浓度测定，若数值过大可适当稀释成合适的浓度，再次测定RNA浓度。根据最后的测定浓度计算出1000ngRNA 所需的RNA母液的体积。然后用稀释的样品进行琼脂糖电泳，检测RNA 否降解或者掺有杂质。
b.琼脂糖电泳鉴RNA完整性
具体方法如下：1.1％琼脂糖凝胶的配置；2.微波炉加热30s，室温放置不烫手时，加入2μLlmg/mL溴化乙锭充分在锥形瓶内混匀。3.插好梳子立即倒入凝胶，待其凝结；4.上样：1μL母液+5μL Loading buffer (6×)，在第一甬道加2μL RNA marker；5.电泳：100V电泳45min； 6.显影：在UV2/UV1下，调节聚焦和散焦情况下观察条带情况。凝胶条带：最上方的为28S，中间的为18S，最下方的为5S。未降解的情况下亮度比较应该是28S∶18S＝2∶1。
(3)逆转录
a.以总RNA为模板，合成cDNA第一条链。取经过稀释后的RNA 样品进行逆转录，反应体系如下：
b.在72℃条件下3min热变性。
c.取10μL第一产物，再按照下表配制反应体系：
d.在70℃条件下逆转15min，得到的cDNA产物于-20℃保存。
(4)实时荧光定量PCR
a.目的基因的引物序列如下表所示：
b.配制PCR扩增反应体系，如下表所示：
c.将上述反应液放入荧光定量PCR仪中进行扩增，PCR反应条件如下表所示：
每个循环结束后采集荧光信号，最后绘制溶解曲线以确定反应产物有无引物二聚体及非特异性扩增。在实时荧光定量PCR中，Ct值被认为与扩增基因的初始浓度紧密相关。
(5)相对定量分析
目的基因的表达采用比较Ct值，用内参基因β-actin来校正差异，变化的倍数量为计算公式为：其中ΔΔCt＝(Ct 目的基因-Ct内参基因)药物处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因) Control。
脂肪细胞分化过程中受一系列转录因子的调控如PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4，这些因子主要参与形成和保持成熟脂肪细胞的形态与功能。本发明通过实时荧光定量PCR的方法检测了本发明原花青素类化合物对3T3-L1脂肪细胞细胞转录因子mRNA表达水平的影响。
结果如图6所示，undiff组细胞未经诱导液诱导分化，一直保持前脂肪细胞状态，因此细胞内PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4这四个转录因子mRNA表达水平极低，尤其PPARγ在mRNA水平上未表达，表达量近乎为零。而diff组细胞经过正常诱导分化后，分化为成熟的脂肪细胞，在其分化过程中转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4 高度表达。6个原花青素单体化合物对其脂肪细胞分化过程进行药物干预后，发现原花青素都能不同程度降低PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和 FABP4基因表达水平，其中对FABP4基因表达水平的影响程度小于其他三个基因的表达。化合物P-5和P-6处理组具有显著降低PPARγ、 C/EBPα、SREBP-lc mRNA表达的作用。
综上所述，本发明原花青素类的化合物都能抑制胞浆内脂滴的产生及减少甘油三脂的含量，还能不同程度的阻滞G1/S期的进程，都能不同程度降低PPARγ、C/EBPa、SREBP-1c和FABP4基因表达水平和蛋白表达水平，具有抑制脂肪细胞分化的作用，可在制备预防和/或治疗代谢紊乱相关疾病药物中应用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.原花青素类化合物在制备预防和/或治疗代谢紊乱的产品中的应用；所述原花青素类化合物包括以下结构的化合物：
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述代谢紊乱包括糖代谢紊乱和/或脂代谢紊乱。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述产品为药物，所述药物包括预防和/或治疗肥胖、糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病、代谢综合征相关疾病的药物中的至少一种。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述药物为脂肪细胞分化抑制剂。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述应用，其特征在于，所述药物降脂药物和/或降糖药物。
6.根据权利要求1-4中任一权利要求所述应用，其特征在于，所述药物为脂肪细胞G1/S期进程抑制剂或阻滞剂。
7.根据权利要求1-4中任一权利要求所述应用，特征在于，所述药物为PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、SREBP-1c拮抗剂、FABP4拮抗剂中的至少一种。
8.原花青素类化合物作为脂肪细胞分化抑制剂的应用，所述原花青素类化合物包括以下结构的化合物：
9.原花青素类化合物在制备抑制脂肪细胞分化的药物中的应用，所述原花青素类化合物包括以下结构的化合物：
10.原花青素类化合物作为PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、SREBP-1c拮抗剂、FABP4拮抗剂中的任意一种中的应用，所述原花青素类化合物包括以下结构的化合物：
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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