CN114324870A - 靶向髓系细胞乳酸转运信号的肺癌生物标志物和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向髓系细胞乳酸转运信号的肺癌生物标志物和检测试剂盒，属于生物医药技术领域。本发明的研究结果首次证明MCT2介导的乳酸转运重新定义了M‑MDSC分化发育方向，从而加速了TME中的肿瘤生长。在髓样细胞中靶向乳酸代谢及转运信号可能是临床上肺癌的潜在治疗选择，同时髓系细胞中乳酸转运信号水平也可作为肺癌的早期诊断和预后的生物标志物。

Description

靶向髓系细胞乳酸转运信号的肺癌生物标志物和检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及靶向髓系细胞乳酸转运信号的肺癌生物标志物和检测试剂盒。

背景技术

肿瘤相关髓系细胞主要由髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)组成，共同调节肿瘤微环境(TME)，在肿瘤进展和患者预后中发挥关键作用。MDSC是未成熟的髓系细胞，在病理状态下大量产生。根据其分子标志物的差异表达，可分为单核样MDSC(M-MDSC)和粒细胞性MDSC(G- MDSC)。这两种MDSC亚群具有不同的表型和功能特征，可抑制免疫应答并促进肿瘤免疫逃逸。而TAM则被分为M1样和M2样两种极化亚型，这取决于 TME中不同的诱导因素和刺激信号。M1样TAM通过释放IFN-γ和介导Th1 反应促进抗肿瘤免疫。相反，M2样TAM通过产生IL-10和触发Th2反应促进肿瘤促进活动。以往的报道认为，M-MDSC可通过不同的机制分化为M2样促肿瘤的TAM。然而最新的研究指出，M-MDSCs在肿瘤微环境中可分化为G- MDSCs。然而，调控这些细胞命运的详细机制尚不清楚。

一些研究表明，肿瘤代谢微环境可以参与调节髓样细胞的发育。在TME中，大量乳酸积累导致M2样TAM极化、加速MDSC分化并抑制杀伤性淋巴细胞的细胞毒性作用。乳酸可以通过多种机制调节免疫细胞发育。乳酸是Gpr81的天然配体和激动剂，活化的Gpr81抑制cAMP的产生，从而抑制TAM的M1 型极化。另有报道证实，肿瘤进展过程中酸性微环境大量累积，其中最主要的有机酸——乳酸——可以通过Gpr132和Gpr65受体信号，阻止TAM的促炎应答。以上报道证实，乳酸对肿瘤微环境的调节和肿瘤进展的缓解起到重要调节作用。

然而，如何围绕肿瘤组织中的乳酸含量和乳酸代谢相关分子表达进行肿瘤进展的评估和预后评价，仍然需要进一步的检测和验证。既往的临床检验方法和诊断技术通过对肿瘤组织中游离乳酸进行定量检测，以此来判断肿瘤进展阶段和微环境酸化程度。或者通过简单地外周血乳酸浓度来对肿瘤预后及复发进行判断和预测。然而，除肿瘤之外的多种组织脏器损伤均可引起高乳酸血症；同时，虽然肿瘤组织中存在大量乳酸堆积，但是无法直接判断这些游离乳酸是否直接影响肿瘤免疫微环境应答和免疫细胞的发育及功能重塑。

因此，仍然需要借助不同样品乳酸含量检测和免疫细胞乳酸代谢及转运相关分子表达进行联合分析，对肿瘤的早期诊断、预后评估进行判断。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供靶向髓系细胞乳酸转运信号的肺癌生物标志物和检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了检测髓系细胞中乳酸的试剂在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。

优选地，所述检测乳酸的试剂为检测乳酸浓度的试剂。

优选地，所述检测乳酸的试剂为检测外周髓源性抑制细胞中乳酸转运体浓度的试剂。

进一步优选地，所述检测乳酸的试剂为检测外周G-MDSC或M-MDSC中的MCT1和MCT2表达水平的试剂。

本发明还公开了乳酸转运抑制剂在制备抗肺癌的药物中的应用。

优选地，所述乳酸转运抑制剂为AR-C155858。

进一步优选地，AR-C155858能够阻断乳酸转运体MCT2，通过减少G- MDSC生成和促进巨噬细胞成熟显著抑制肿瘤生长。

本发明还公开了一种诊断肺癌的试剂盒，包括检测乳酸浓度或检测外周髓源性抑制细胞中乳酸转运体表达的试剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的研究结果表明肿瘤来源的乳酸会通过乳酸转运体MCT2被髓系细胞摄取，参与髓系细胞发育，进而调节肺腺癌进展。当给予外源性乳酸刺激后，诱导M-MDSCs向G-MDSCs发育，而非向M1样成熟巨噬细胞的分化。使用 AR-C155858阻断乳酸转运体MCT2功能可通过减少G-MDSC生成和促进巨噬细胞成熟显著抑制肿瘤生长。最重要的是，本发明通过实验在临床肺癌样本中，观察到MCT2调控乳酸转运信号介导的髓样细胞的发育与肺癌患者预后显著性相关。外源性乳酸促进肺腺癌患者外周血中的M-MDSCs分化为G-MDSCs，通过阻断MCT2信号完全恢复。本发明的研究结果首次证明MCT2介导的乳酸转运重新定义了M-MDSC分化发育方向，从而加速了TME中的肿瘤生长。在髓样细胞中靶向乳酸代谢及转运信号可能是临床上肺癌的潜在治疗选择，同时髓系细胞中乳酸转运信号水平也可作为肺癌的早期诊断和预后的生物标志物。

附图说明

图1为监测肿瘤生长结果图；

图2为肿瘤进展过程中，免疫细胞亚群发育图，其中，A为MDSC亚群发育检测；B为TAM亚群发育检测；

图3为TAM极化标志物表达图，其中，A为M1 markers；B为M2 markers；

图4为不同髓系细胞标记物的表达与肺癌患者生存率之间的相关性结果图；

图5为TCGA公共数据库中TAM成熟相关分子标志物与肺癌预后相关性图；

图6为肿瘤相关髓系细胞乳酸转运相关检测图，其中，A为肿瘤相关MDSC 亚群中细胞内乳酸浓度测量；B为TAM亚群中细胞内乳酸浓度测量；C为肿瘤相关MDSC亚群中乳酸转运体表达检测；D为TAM亚群中乳酸转运体表达检测；

图7为肿瘤微环境中的乳酸对髓系细胞的发育影响结果图；其中，A为 MDSC亚群的分选图；B为乳酸对MDSC亚群增殖水平的影响；C为乳酸对 MDSC亚群增殖水平调控的统计；D为乳酸对MDSC亚群凋亡水平的影响；E 为乳酸对MDSC亚群凋亡水平调控的统计；

图8为M-MDSC分化来源的G-MDSC鉴定图，其中，A为分离M-MDSCs 培养诱导分化流程示意图；B和C为M-MDSC分化的非MDSC亚群的鉴定； D为M-MDSC分化亚群ROS释放的检测；E为M-MDSC分化亚群NO浓度的检测；F为M-MDSC分化亚群对T淋巴细胞抑制作用；G为M-MDSC分化亚群形态学鉴定；H和I为M-MDSC分化亚群生物标志物检测；

图9为FACS评估M-MDSCs的分化能力结果图，其中，A为总髓系细胞细胞群展示；B为MDSC亚群数量和比例展示；C为MDSC亚群数量和比例统计；D为总巨噬细胞数量和比例展示；E为巨噬细胞亚群数量和比例展示；F为巨噬细胞亚群数量和比例统计；

图10为MCT2基因敲低影响乳酸对骨髓细胞发育的结果图，其中，A为 MCT2敲低效率的mRNA水平检测；B和C为MCT2敲低效率的蛋白水平检测；D和E为敲低MCT2对乳酸调控巨噬细胞极化分子表达挽救的检测和统计；F和G为敲低MCT2对乳酸调控MDSC分化挽救的检测；H为敲低MCT2 对乳酸调控MDSC分化挽救的统计；

图11为L-乳酸与对髓系细胞分化的调节高度依赖其结构特异性；其中，A 为不同手性构象的乳酸对MDSC亚群分化的检测；B为不同手性构象的乳酸对巨噬细胞亚群分化的检测；C为不同手性构象的乳酸对MDSC及巨噬细胞亚群分化比例的统计；D为不同手性构象的乳酸对巨噬细胞极化的检测；

图12为AR-155858在体外不影响LLC细胞的增殖或凋亡；其中，A为AR- 155858处理后，LLC细胞凋亡的检测；B为AR-155858处理后，LLC细胞增殖的检测；C为AR-155858处理后，LLC细胞周期的检测；

图13为乳酸转运体抑制剂AR-155858对小鼠肿瘤生长的影响图，其中，A 和B为AR-155858处理后，小鼠皮下肿瘤生长大小检测和统计；C为肿瘤中 MDSC亚群数量和比例的检测；D为肿瘤中TAM亚群数量和比例的检测；E为肿瘤中T细胞亚群数量和比例的检测；F、G、H和I为肿瘤中免疫细胞亚群数量的统计；J为肿瘤血管新生的检测和统计；K为肿瘤相关髓系细胞中乳酸浓度的检测；L为在TAM中对巨噬细胞成熟相关分子的检测；M和N为在TAM中对巨噬细胞极化分子的检测；

图14为MCT2+CD68+细胞在正常组织和邻近组织中的分布图，其中，A 为免疫荧光染色结果；B为MCT2+CD68+巨噬细胞的百分比趋势；

图15为健康献血者、良性肿块患者和肺腺癌患者的外周血中分离出的血清中乳酸含量结果图；其中，A为肺腺癌患者外周血清乳酸浓度显著增加；B为 MCT1表达水平；C为MCT2表达水平；D为MCT4表达水平；

图16为流式细胞仪分析健康献血者和肺腺癌患者外周血中MDSC亚群的表型结果图；其中，A显示肺腺癌患者外周血中G-MDCSs和M-MDSCs的百分比均显著增加；B为MCT1/2抑制剂(AR)处理完全逆转结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明的下述实验所涉及的分子生物学及细胞生物学试剂如下表1所示：

表1

本发明所使用的抗体及信息如下表2所示：

表2

1、乳酸代谢参与肿瘤相关的髓样细胞发育

通过建立小鼠皮下肺癌模型，监测肿瘤生长，结果参见图1。在肿瘤进展过程中，利用流式细胞术检测肿瘤相关髓系细胞亚群发育的变化。与肿瘤生长2 周相比，生长3周时肿瘤中浸润的髓系细胞(CD11b+)和髓系来源的免疫抑制性细胞(MDSC)的显著增加，其中G-MDSCs和M-MDSCs均表现为数量上升。在TAM分化过程中，TAM会失去Ly6C表达并获得MHCII表达，这是成熟TAM的标志。因此，TAM被分为三个亚群：(1)Ly6C+MHCII-的TAM前体(pre-TAM)；(2)Ly6C-MHCII-的未成熟TAM(imm-TAM)；(3)Ly6C-MHCII+ 的成熟TAM(ma-TAM)。实验结果发现随肿瘤进展，pre-TAM的数量逐渐减少 (如图2中A-B所示)。

此外，本发明还测定了不同TAM亚群中的极化标记物水平。正如预期的那样，在肿瘤进展过程中数量显著减少的ma-TAM表现为M1样极化，而imm- TAM和pre-TAM展现出M2样极化表型，如图3所示。

进一步，本发明基于TCGA数据库评估了不同髓系细胞标记物的表达与肺癌患者生存率之间的相关性。CD15(G-MDSC标志物)和CD14(M-MDSC标志物)的表达与肺癌患者的生存时间呈负相关，结果参见图4。尽管TAM标志物CD68的表达与患者预后无相关性，但巨噬细胞成熟标志物的高表达，包括 CD11c、CIITA(MHCII的激活因子)和HLA-DR/DP/DQ(MHCII的亚型)，与肺腺癌患者的更长生存期相对应，表明成熟的TAM与肺腺癌患者的良好预后相关，如图5所示。

肿瘤的恶性增殖往往导致肿瘤微环境中大量乳酸的积累，这会导致过量 MDSC的产生和TAM的M2样极化。因此，本实验检测了不同髓系亚群的细胞内乳酸浓度，并观察到在肿瘤生长过程中所有亚群的乳酸浓度增加。值得注意的是，在G-MDSCs中观察到的乳酸积累量多于M-MDSCs，并且ma-TAMs 中的乳酸浓度低于pre-和imm-TAMs(如图6中A和B结果所示)。此外，乳酸转运蛋白(MCT家族)在不同的髓系细胞亚群中表现出不同的表达谱。负责乳酸输入的MCT2在G-MDSCs中的表达水平高于M-MDSCs(如图6中C所示)，并且在TAM成熟期间其表达水平降低(如图6中D所示)。

2、乳酸促进M-MDSCs向G-MDSCs分化

为了确定肿瘤微环境中的乳酸是否会影响髓系细胞的发育，首先对髓样细胞进行分类，包括M-MDSCs和G-MDSCs(图7中A所示)，并在有/无乳酸的情况下培养。结果显示，乳酸并不影响这些细胞的增殖和凋亡(图7中B-E的结果)。一般认为，M-MDSCs在生理或病理条件下可分化为巨噬细胞或树突状细胞(DC)。先前的研究表明，当与肿瘤外植体上清液孵育时，M-MDSCs也会分化为G-MDSCs。因此，本发明分离M-MDSCs，然后将其与GM-CSF/IL-6一起培养以诱导分化，流程图如图8中A所示，方法如下：

1)选取8-10周龄成年C57/B6小鼠，实施脱颈处死后，浸泡于75％酒精 5min进行消毒；

2)在超净台中将消毒后小鼠固定，小心剪开小鼠后肢皮肤，并钝性分离肌肉组织，暴露股骨和胫骨，小心取出；

3)用剪刀和镊子仔细剥离小鼠后肢骨附着的肌肉组织，并用剪刀将长骨两端剪开，使骨髓腔暴露；

4)用5mL注射器吸取无菌RPMI-1640培养液后，从骨髓腔暴露的一端扎入，缓慢推动注射液，使腔内骨髓细胞被培养液从另一端轻轻冲出，将包含骨髓细胞的培养液转移至无菌15ml离心管中；

5)每根长骨用培养液冲洗两遍，待所有骨髓细胞收集完全后，1200rpm低温离心5min；

6)离心后，弃去上清液，用红细胞裂解液将细胞团进行重悬，4℃静置5min，裂红完成后，加入双倍体积的RPMI-1640充分混合后，1200rpm低温离心5min；

7)弃去上清液，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞团块，接种于10cm培养皿中进行差速贴壁，以去除成纤维细胞、内皮细胞以及成熟的骨髓定居巨噬细胞；

8)6-12小时后，收获悬浮细胞并进行计数，按1×10⁶细胞/ml接种于所需培养器皿中，同时在培养液中加入终浓度为25ng/ml的GM-CSF和25ng/ml的 IL-6，使骨髓单个核细胞向髓系细胞分化，4天后诱导成功，利用流式细胞术对 CD11b+Gr1+、CD11b+Ly6G+Ly6C-和CD11b+Ly6G-Ly6C+细胞群进行鉴定。

BMDM培养方法如下：

小鼠分离骨髓细胞方法同前所述，单个核贴壁6-12小时后，收获悬浮细胞并进行计数，按2×10⁶细胞/ml接种于所需培养器皿中，同时在培养液中加入终浓度为20ng/mL的M-CSF，使骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞，第4天进行换液，弃去悬浮细胞同时加入新鲜培养基和M-CSF，第7天时BMDM诱导成熟，利用流式细胞术对BMDM纯度进行鉴定，并进行下一步功能学实验。

FASC结果表明M-MDSC分化后形成显著的三个细胞群，其中主要亚群包括M-MDSC样细胞(即M→M)、G-MDSC样细胞(即M→G)和成熟的巨噬细胞(Ly6C-Ly6G-)(图8中B和图9中A-C所示)。随后，通过一系列实验对 M-MDSC分化而来的G-MDSC样细胞(M→G)进行鉴定，包括ROS和NO生成分析(图8中D-E所示)、T细胞抑制反应(图8中F所示)、形态学分析(图 8中G所示)和功能标记物检测(针对G-MDSCs的NOX2、S100A8和G-CSF；针对M-MDSCs的iNOS、IL-4R和TGF)(图8中H-I所示)，证实该群细胞确实为典型的G-MDSC。

在确认细胞群体的身份信息后，分选出M-MDSC后，与PBS、乳酸或乳酸加MCT1/2抑制剂(AR-155858)培养，然后使用FACS评估M-MDSCs的分化能力。乳酸诱导G-MDSC分化(图9中A-C所示)，但抑制巨噬细胞分化，尤其是成熟巨噬细胞分化(图9中D-F所示)。正如预期的那样，乳酸转运抑制剂 AR-155858治疗后，完全逆转了乳酸对髓系细胞分化的影响。

此外，使用siRNA抑制BMDM中的MCT2表达，或使用针对MCT2的慢病毒shRNA抑制M-MDSC中的MCT2表达。这些结果表明，MCT2基因敲除也挽救了乳酸对骨髓细胞发育的影响(图10)。重要的是，D-乳酸与L-乳酸(在本发明中使用)化学式完全一致，仅表现为手性差异。然而D-乳酸确并不能调节M-MDSC分化和巨噬细胞成熟(图11)，这说明L-乳酸与对髓系细胞分化的调节高度依赖其结构特异性。综上可以充分说明，在TME中，乳酸促进M- MDSC向G-MDSC而不是ma-Mφs分化。

3、乳酸转运抑制剂改善肿瘤微环境并抑制肿瘤进展

在本研究中，乳酸转运抑制AR-C155858在体外不影响LLC细胞的增殖或凋亡(图12)。然而将AR-C155858注射到LLC荷瘤小鼠体内可显著降低肿瘤生长(如图13中A-B所示)。流式细胞术对免疫微环境的分析表明，AR-155858 处理的小鼠的总MDSC和G-MDSC数量减少。尽管总TAM的数量没有变化，但在AR-C155858治疗的荷瘤小鼠中，ma-TAM显著增加，而imm-TAM显著减少。此外，AR-C155858给药显著增强T细胞浸润(图13中C-I所示)。AR-155858还可降低CD31+血管密度(图13中J所示)。同时，AR-C155858通过抑制MCT1/2减少CD11b+髓系细胞的乳酸摄取(图13中K)，逆转了TAM中成熟标记物的表达，包括CD11c和Vcam1(图13中L)，并且促进M2样TAM 转换为M1样TAM(图13中M-N)。

4、乳酸转运体MCT2对M-MDSC分化的调控在临床肺癌活检中得到验证

已证实MCT2介导的乳酸转运可以在小鼠肺癌进展过程中调节M-MDSC 分化和免疫微环境应答。因此，本发明的实验在临床肺癌活检中进一步检查了髓系细胞中乳酸转运信号的表达。参见图14，免疫荧光染色显示MCT2+CD68+ 细胞在正常组织和邻近组织中呈散在分布，但在肿瘤中显著性增加(如图14中 A-B所示)。此外，随着肿瘤病理分级的增加，MCT2+CD68+巨噬细胞的百分比均呈现增加趋,。

其次，从健康献血者、良性肿块患者和肺腺癌患者的外周血中分离血清，检测血清乳酸含量，结果如图15所示，发现肺腺癌患者外周血清乳酸浓度显著增加(图15中A)。另外，上述人群分别利用物理方法分离G-MDSCs和M- MDSCs细胞，检测乳酸浓度和乳酸代谢相关基因的表达情况。结果提示，与健康供体和良性肿块患者相比，肺腺癌患者外周G-MDSC或M-MDSC中的MCT1 和MCT2表达水平均显著增加(图15中B-D)。总的来说，这些结果表明乳酸代谢可能参与肿瘤患者中髓样细胞分化。

最后，使用流式细胞仪分析了健康献血者和肺腺癌患者外周血中MDSC亚群的表型。结果如图16所示，肺腺癌患者外周血中G-MDCSs和M-MDSCs的百分比均显著增加(图16中A)。通过从肺腺癌患者的外周血中分离M-MDSC (CD11b+HLA-DR-CD14+CD15-)，然后将这些细胞暴露于不同的治疗处理以进行后续的细胞表型分析。乳酸处理明显促进M-MDSC向G-MDSC分化，但 MCT1/2抑制剂(AR-C155858)处理完全逆转了这种效应(图16中B)。

因此，这些临床数据表明MCT2介导的乳酸调控与肺癌进展相关，并在肺癌进展过程中调节M-MDSC分化。对乳酸浓度和外周MDSC样品中乳酸转运体的表达检测，可以作为肺腺癌早期诊断、预后的生物标志物。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (8)

1.检测髓系细胞中乳酸的试剂在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测乳酸的试剂为检测乳酸浓度的试剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测乳酸的试剂为检测外周髓源性抑制细胞中乳酸转运体浓度的试剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测乳酸的试剂为检测外周G-MDSC或M-MDSC中的MCT1和MCT2表达水平的试剂。

5.乳酸转运抑制剂在制备抗肺癌的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述乳酸转运抑制剂为AR-C155858。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，AR-C155858能够阻断乳酸转运体MCT2，通过减少G-MDSC生成和促进巨噬细胞成熟显著抑制肿瘤生长。

8.一种诊断肺癌的试剂盒，其特征在于，包括检测乳酸浓度或检测外周髓源性抑制细胞中乳酸转运体表达的试剂。

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