KR102171753B1 - 신경계 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 우수한, 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 이를 통해 알츠하이머병을 포함한 다양한 신경 염증 관련 및 신경 퇴행 관련의 신경계 질환에 대한 예방, 개선 및 치료 효과를 발휘할 수 있다.
Description
본 발명은 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
미세교세포는 인간 뇌의 10-15%를 차지한다. 미세교세포는 중추신경계(CNS)의 선천적인 면역 세포이며 외인성 독소에 반응하여 숙주 방어에 중요한 역할을 한다. 손상을 입으면, 미세교세포는 죽어가는 세포와 세포 잔해를 탐식한다. 또한, 미세교세포는 일관된 사이토카인 수준을 유지하기 위해 두뇌 항상성을 유지한다. 노화된 두뇌 및 신경 퇴행성 질환의 설치류 모델에서, 미세교세포 활성화는 신경 염증, 시냅스 장애 및 신경 세포 사멸을 일으키며, 신경 염증과 신경 퇴행성 질환과의 연관성을 시사한다. 활성화된 미세교세포는 염증전 사이토카인 수준 및 Aβ 플라크 침착을 현저하게 증가시켜 학습 및 기억 장애를 초래한다. 알츠하이머병(AD)에서 용해성 아밀로이드-β 저중합체와 원섬유는 미세교세포에서 세포 표면 수용체 (예 : 인테그린, CD14 및 Toll 유사 수용체 TLR2와 TLR4)와 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 또한 신경 염증 반응을 유발할 수 있다. 알츠하이머가 유발된 생쥐 모델과 알츠하이머 환자의 대뇌피질 및 해마에서 현저히 증가된 미세교세포의 활성화가 관찰되었고, 뇌와 혈청, 뇌척수액(CSF)에서 염증전 사이토카인의 발현 증가가 관찰되었다. 신경 염증은 또 다른 신경 퇴행성 질환인 파킨슨병(PD)과도 관련되어있다. 예를 들어, 지질다당류(LPS)가 주입된 야생형 C57BL/6J 생쥐는 미세교세포 활성화를 현저하게 유도하여 도파민성 신경 세포 약화 같은 기능 변화를 IL-1 의존적 방법으로 유도하여 PD와 유사한 행동 장애를 일으킨다. 흥미롭게도, 사후 파킨슨병 환자의 뇌, 뇌척수액 및 혈청에서 미세교세포 활성화 및 염증전 사이토카인 수준 (예 : 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨(IL)-1β 및 IL-6) 이 현저하게 증가하며, 이는 파킨슨병의 진행을 예측할 때 이런 표지자의 잠재적인 역할을 암시한다. 비록 신경 염증이 신경 퇴행성 질환에 영향을 미치는 분자 메커니즘이 아직 밝혀지지는 않았지만, 뇌에서 미세교세포와 연관된 신경 염증을 조절하는 것은 신경 퇴행성 질환을 치료하거나 예방하는 치료 전략이 될 수 있다.
육미지황탕은 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사 및 복령의 6가지 한약재가 함유된 전통 한약으로, 아시아에서 당뇨병 치료, 신경 발생 장애, 면역 체계의 기능 장애 등에 널리 사용되고 있다 (비특허문헌 1 및 2, 특허문헌 1). 최근 연구에 따르면 노화 방지를 위해 처방되는 육미지황탕은 산화제와 활성산소의 소거활동을 조절한다는 것이 밝혀졌다 (비특허문헌 2 및 3). 또한 육미지황탕은 노화된 생쥐에서 학습능력과 기억력을 향상시키고 스트레스를 받은 쥐 모델에서 해마의 치아이랑에서 신경 발생을 촉진시킨다 (비특허문헌 4 내지 7). 그러나 상기 육미지황탕이 신경 염증을 변화시킬 수 있는지 여부는 아직 알려져 있지 않았으며, 나아가 이러한 신경 염증성 질환을 포함하는 다양한 신경계 질환에 더욱 효과적인 예방, 개선 및 치료 효과를 갖는 조성물이 요망된다.
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본 발명은 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 우수한, 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구기자(Lycium chinense), 숙지황(Rehmannia glutinosa var. purpurea), 산약(Dioscorea japonica Thunberg), 산수유(Cornus officinalis Sieb. et Zucc), 목단피(Paeonia moutan Sims/P. subfruticosa Makino), 택사(Alisma orientalis(Sam.) Juz.), 복령(Poria cocos Wolf), 녹용(Cervus Nippon, antler), 원지(Polygala tenuifolia) 및 석창포(Acorus gramineus)의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 신경 세포 사멸을 억제하고, 숙신산 탈수소 효소의 활성을 증가시키며, 미세아교세포의 활성을 억제하며, 도파민성 신경세포를 증가시키며, 염증에 의한 신경 손상 회복 효과를 보이는 등 뇌신경세포 보호 효과가 뛰어나므로 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 상기 재료 중 어느 하나 이상의 건조물, 분쇄물, 또는 추출물의 혼합물일 수 있다.
상기 추출물의 제조에 있어서, 상기 재료의 건조물 또는 분쇄물에 물 및 탄소수 1 내지 4의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 용매로 하여 추출한 추출물일 수 있고, 구체적으로는 물, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 용매로 추출한 추출물, 더 구체적으로는 물로 추출한 추출물일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.5 내지 5, 산약 0.1 내지 3, 산수유 0.1 내지 3, 목단피 0.05 내지 2, 택사 0.05 내지 2, 복령 0.05 내지 3, 녹용 0.01 내지 2, 원지 0.01 내지 1.5, 및 석창포 0.01 내지 1.5의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 구체적으로는 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.8 내지 3, 산약 0.3 내지 1, 산수유 0.3 내지 1, 목단피 0.1 내지 1, 택사 0.1 내지 1, 복령 0.3 내지 1, 녹용 0.05 내지 1, 원지 0.05 내지 0.5, 및 석창포 0.05 내지 0.5의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 더 구체적으로는 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 1 내지 1.5, 산약 0.4 내지 0.6, 산수유 0.4 내지 0.6, 목단피 0.2 내지 0.5, 택사 0.2 내지 0.5, 복령 0.4 내지 0.6, 녹용 0.1 내지 0.5, 원지 0.1 내지 0.3, 및 석창포 0.1 내지 0.3의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 50 중량% 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 신경계 질환의 예방 또는 치료에 적용될 수 있으며, 구체적으로 상기 신경계 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 질환, 헌팅턴병, 피크병, 크로이펠츠-야콥병, 전두측두치매, 루이치매, 근육위축가쪽경화증, 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계자가면역질환, 다발성경화증 염증성 및 신경병증성 통증, 우울증, 두부 외상, CNS 저산소증, 뇌 허혈증, 뇌염, 건망증, 외상성 뇌손상, 베르니케 코르사코프 증후군, 해마경화증, 두통, 뇌 노쇠증, 전측두엽 변성, 정상뇌압수두증, 뇌혈관성질환, 뇌신경질환, 기억상실, 경도인지 장애, 인지 결핍 및 주의력 결핍으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 액기스제, 에어로젤 및 주사용액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 경구 투여용 고상 제제로 제형화할 경우, 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되는데, 이러한 고상 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여용 액상 제제로 제형화할 수도 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 이러한 액상 제제에는 통상적으로 사용되는 불활성 희석제 (예를 들면, 정제수, GaIN/LPS, 리퀴드 파라핀) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 비경구, 구체적으로는 복강내 투여를 위한 제제로 제형화될 수도 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제로, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 이용할 수도 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 복합추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료, 껌, 비타민 복합제, 드링크제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물에 포함되는 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 상기 재료 중 어느 하나 이상의 건조물, 분쇄물, 또는 추출물의 혼합물일 수 있고, 상기에서 추출물인 경우 상기 재료의 건조물 또는 분쇄물에 물 및 탄소수 1 내지 4의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 용매로 하여 추출한 추출물일 수 있고, 구체적으로는 물, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 용매로 추출한 추출물, 더 구체적으로는 물로 추출한 추출물일 수 있고, 가장 구체적으로는 열수 추출물일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함되는 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.5 내지 5, 산약 0.1 내지 3, 산수유 0.1 내지 3, 목단피 0.05 내지 2, 택사 0.05 내지 2, 복령 0.05 내지 3, 녹용 0.01 내지 2, 원지 0.01 내지 1.5, 및 석창포 0.01 내지 1.5의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 구체적으로는 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.8 내지 3, 산약 0.3 내지 1, 산수유 0.3 내지 1, 목단피 0.1 내지 1, 택사 0.1 내지 1, 복령 0.3 내지 1, 녹용 0.05 내지 1, 원지 0.05 내지 0.5, 및 석창포 0.05 내지 0.5의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 더 구체적으로는 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 1 내지 1.5, 산약 0.4 내지 0.6, 산수유 0.4 내지 0.6, 목단피 0.2 내지 0.5, 택사 0.2 내지 0.5, 복령 0.4 내지 0.6, 녹용 0.1 내지 0.5, 원지 0.1 내지 0.3, 및 석창포 0.1 내지 0.3의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 신경계 질환의 예방 또는 치료에 적용될 수 있으며, 구체적으로 상기 신경계 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 질환, 헌팅턴병, 피크병, 크로이펠츠-야콥병, 전두측두치매, 루이치매, 근육위축가쪽경화증, 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계자가면역질환, 다발성경화증 염증성 및 신경병증성 통증, 우울증, 두부 외상, CNS 저산소증, 뇌 허혈증, 뇌염, 건망증, 외상성 뇌손상, 베르니케 코르사코프 증후군, 해마경화증, 두통, 뇌 노쇠증, 전측두엽 변성, 정상뇌압수두증, 뇌혈관성질환, 뇌신경질환, 기억상실, 경도인지 장애, 인지 결핍 및 주의력 결핍으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 식품, 구체적으로는 건강기능식품은 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 함량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 혼합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 구체적으로는 5 내지 20 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 구체적으로는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있으나, 이는 당업자에 의해 제품에 맞게 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물 이외에도 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 정제, 캡슐제, 환제, 액제등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 필수 성분으로서 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 구체적으로는 약 5 내지 12 g이다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 제조 방법에 있어, 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 상기 재료 중 어느 하나 이상을 건조, 분쇄 또는 추출하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.
상기 본 발명의 제조 방법에 있어, 추출하는 경우 상기 재료의 건조물 또는 분쇄물에 물 및 탄소수 1 내지 4의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매를 가하여 추출할 수 있고, 구체적으로는 물, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매를 가하여 추출하거나, 더 구체적으로는 물을 용매로 가하여 추출할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 가하는 용매의 양은 상기 추출하고자 하는 재료의 5 내지 15배 중량 또는 부피, 구체적으로 10 내지 12배를 가할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 추출은 진탕 추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출 방법을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한 추출 온도는 40 내지 100 ℃, 추출 시간은 0.5 내지 24시간일 수 있으며, 추출회수는 1 내지 5회일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 추출물은 농축 및 건조될 수 있으며, 상기 농축은 감압농축, 진공 농축일 수 있으며, 구체적으로는 60~80℃에서 brix 20%이상으로 수행될 수 있다. 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조 방법일 수 있고, 구체적으로는 투입온도 170~190℃, 배출온도 95~115℃ 조건의 분무 건조기에서 수행될 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.5 내지 5, 산약 0.1 내지 3, 산수유 0.1 내지 3, 목단피 0.05 내지 2, 택사 0.05 내지 2, 복령 0.05 내지 3, 녹용 0.01 내지 2, 원지 0.01 내지 1.5, 및 석창포 0.01 내지 1.5의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있고, 구체적으로는 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.8 내지 3, 산약 0.3 내지 1, 산수유 0.3 내지 1, 목단피 0.1 내지 1, 택사 0.1 내지 1, 복령 0.3 내지 1, 녹용 0.05 내지 1, 원지 0.05 내지 0.5, 및 석창포 0.05 내지 0.5의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있고, 더 구체적으로는 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 1 내지 1.5, 산약 0.4 내지 0.6, 산수유 0.4 내지 0.6, 목단피 0.2 내지 0.5, 택사 0.2 내지 0.5, 복령 0.4 내지 0.6, 녹용 0.1 내지 0.5, 원지 0.1 내지 0.3, 및 석창포 0.1 내지 0.3의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 상기 재료 각각을 건조, 분쇄 또는 추출하여 혼합하거나, 상기 재료 중 두 개 이상을 혼합하여 건조, 분쇄 또는 추출하여 제조하거나, 또는 상기 재료 중 일부는 추출하고 다른 일부는 건조 후 분쇄하여 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은, 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 포함하는 조성물의 제조방법으로서, 하기의 단계를 포함할 수 있다:
(S1) 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포 중에서 선택된 어느 하나 이상을 혼합하여 추출하는 단계,
(S2) 상기에서 수득한 추출물을 여과하는 단계,
(S3) 상기에서 수득한 여과된 추출물에, 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포 중에서 선택된 어느 하나 이상을 혼합하고 가열하여 혼합물을 제조하는 단계, 및
(S4) 상기에서 수득된 혼합물을 건조하는 단계.
즉, 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 최소한 두 단계의 공정으로 나누어, 일부 재료를 혼합하여 추출한 후, 여과한 후 다시 재료를 혼합하여 가열하고, 건조하는 것이다. 이 경우 (S3) 단계에서 혼합되는 재료는 (S1) 단계에서 혼합되지 않은 나머지 재료들을 모두 포함하고, 또한 (S1) 단계에서 혼합되었던 재료도 부가로 포함될 수 있다.
상기 (S1) 단계에서 혼합되었던 특정 재료를 (S3) 단계에서도 혼합하는 경우에는, 각 재료가 최종적인 혼합물 내에서 존재하는 함량을 고려하여 적정하게 나누어 각 단계별로 혼합할 수 있으며, 일례로 (S1) 에서 혼합되었던 중량 대비 0.1 내지 5배 비율로 혼합할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 (S1) 단계 및 (S3) 단계에서 혼합하는 재료는 건조물 또는 분쇄물일 수 있으며, 일례로 (S1) 단계에서는 혼합 재료들의 건조물을 투입하여 추출 단계를 수행하고, (S2) 단계에서 추출되고 남은 건조물은 제거한 후, (S3) 단계에서는 혼합 재료들의 미세분말을 투입하여 추출할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일례로, 본 발명의 제조 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.
(S1) 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령 및 녹용을 혼합하여 추출하는 단계,
(S2) 상기에서 수득한 추출물을 여과하는 단계,
(S3) 상기에서 수득한 여과된 추출물에, 원지, 석창포 및 복령을 혼합하고 가열하여 혼합물을 제조하는 단계, 및
(S4) 상기에서 수득된 혼합물을 건조하는 단계.
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 50 중량% 포함하여 제조할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 (S4) 단계에 이후에, (S5) 상기에서 수득된 건조된 화합물을 환제 또는 액상 제제로 제형하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 환제 또는 액상 제제로 제형하는 경우 제형화에 통상적으로 필요하거나 맛을 증가시킬 수 있는 성분들을 추가로 투입할 수 있다. 일례로, (S4) 단계에서 얻은 건조된 혼합물에 적당한 수분 또는 에탄올을 첨가하여 환제 형성에 용이하도록 하거나, 또는 이에 물과 올리고당을 혼합하여 맛이 우수한 액상 제제, 특히 짜먹는 스틱형 제제로도 제조할 수 있다.
본 발명은 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하여 신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 개체에 투여하여 신경계 질환을 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 ‘개체’ 란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 상기와 같은 방법으로 제형화된 조성물은 유효량으로 비경구 또는 경구 (경피, 피하, 정맥, 근육, 복강 등)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다.
본 발명의 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 구체적으로는 0.001~10000mg/체중kg/day, 보다 구체적으로는 0.1~1000mg/체중kg/day의 유효량으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 도 있다. 다만, 상기 투여량의 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 신경계 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intracerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명을 통해, 본 발명의 조성물이 신경 염증 반응과 인지 기능에 미치는 시너지 효과를 기대하였다. 이에 본 발명의 조성물이 일차성상세포에서가 아니라 BV2 미세교세포에서 LPS로 유도된 신경 염증 반응을 억제함을 밝혔고, 세포 유형에 따라 신경 염증 반응에 차별적으로 영향을 미칠 수 있음을 제시하였다. 또한 본 발명의 조성물은 LPS로 유도된 신경 염증 반응을 조절하기 위해 TLR4/FAK/NF-κB 신호를 변형시켰다. 또한, LPS가 주입된 야생형 C57BL/6J 생쥐에 본 발명의 조성물을 경구 투여하면 단기 및 장기 기억력이 회복되고, 미세교세포 활성히 현저하게 감소하였다.
종합하면, 상기 결과들은 본 발명의 조성물이 알츠하이머병(AD)를 포함한 항 신경염증제로서의 용도를 시사한다.
본 발명에 따른 조성물은 단기 및 장기 기억을 촉진하고, 미세교세포 활성화를 억제하여 신경계 질환에 대한 우수한 항염증 치료 효과를 발휘하여, 알츠하이머병을 포함한 다양한 신경 염증 관련 및 신경 퇴행 관련의 신경계 질환에 대한 예방, 개선 및 치료 효과를 발휘할 수 있다.
도 1은 본 발명이 BV2 미세교세포의 세포 생존력 및 형태에 미치는 영향 결과이다. 도 1a는 6시간 처리시 생존력(각 용량별 n=8), 도 1b는 24시간 처리시 생존력(각 용량별 n=16), 도 1c는 세포 모양. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p< 0.001)
도 2는 본 발명이 LPS 매개 전염증성 사이토카인의 mRNA에 미치는 영향 결과이다. 도 2a~2g는 본원발명 250㎍/㎖ 처리 결과(도 2a는 웨스턴 블로팅 결과, 도 2b는 IL-1β, 도 2c는 IL-6, 도 2d는 COX-2, 도 2e는 IL-18, 도 2f는 iNOS, 도 2g는 TNF-α). 도 2h~2n은 본원발명 500㎍/㎖ 처리 결과(도 2h는 웨스턴 블로팅 결과, 도 2i는 IL-1β, 도 2j는 IL-6, 도 2k는 COX-2, 도 2l은 IL-18, 도 2m은 iNOS, 도 2n은 TNF-α), 도 2o 및 2p는 항-CD11b 및 항-IL-1β 항체로 면역 염색한 결과. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p< 0.001)
도 3은 본 발명이 일차성상세포의 염증전 사이토카인 수준에 미치는 영향 및 그 결과를 각 개별 성분과 비교한 결과이다. 도 3a 및 3b는 복령 추출물과 대비, 도 3c 및 3d는 택사 추출물과의 대비, 도 3e 및 3f는 산약 추출물과 대비, 도 3g 및 3h는 녹용 추출물과 대비, 도 3i 및 3j는 목단피 추출물과 대비, 도 3k 및 3l은 산수유 추출물과 대비, 도 3m 및 3n은 본 발명의 구기자 추출물과 대비, 도 3o 및 3p는 본 발명의 숙지황 추출물과 대비. (*p < 0.05, ***p< 0.001)
도 4는 본 발명이 TLR4에 미치는 영향 결과이다. 도 4a 및 4b는 IL-1β에 대한 영향, 도 4c 및 4d는 TLR4의 세포 표면 수준 결과. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p< 0.001)
도 5는 본 발명이 세포신호전달에 미치는 영향 결과이다. 도 5a 및 5b는 FAK 인산화에 대한 영향, 도 5c 및 5d는 IL-1β mRNA에 대한 영향. (***p< 0.001)
도 6은 본 발명이 신경염증에 미치는 영향 결과이다. 도 6a는 웨스턴 블로팅 결과, 도 6b 내지 6d는 각각 세포질에서의 p-IκBα, IκBα, NF-κB 수준, 도 6e 및 6f는 핵내 NF-κB 수준, 도 6g 및 6h는 항-CD11b 및 항-p-NF-κB 항체로 면역 염색한 결과, 도 6i 및 6j는 핵내 NF-κB 수준(FAK 억제제 투여 대비). (*p < 0.05, ***p< 0.001)
도 7은 본 발명이 미세교세포의 이동에 대한 효과를 나타낸 결과이다. 도 7a 및 7b는 세포 이동 측정 결과 (***p< 0.001), 도 7c는 본 발명의 세포 이동 기전 예상도.
도 8은 본 발명이 마우스 인지 기능 및 미세교세포에 대한 효과를 나타낸 결과이다. 도 8a는 Y-미로 검사 결과, 8b는 NOR(the novel object recognition test) 검사 결과, 도 8c는 해마의 Iba-1 항체 면역 염색 영상 결과, 도 8d는 CA1 영역 내 Iba-1 수준, 도 8e는 DG 영역 내 Iba-1 수준, 도 8f는 피질의 Iba-1 항체 면역 염색 영상 결과, 도 8g는 피질 내 Iba-1 수준. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p< 0.001)
도 2는 본 발명이 LPS 매개 전염증성 사이토카인의 mRNA에 미치는 영향 결과이다. 도 2a~2g는 본원발명 250㎍/㎖ 처리 결과(도 2a는 웨스턴 블로팅 결과, 도 2b는 IL-1β, 도 2c는 IL-6, 도 2d는 COX-2, 도 2e는 IL-18, 도 2f는 iNOS, 도 2g는 TNF-α). 도 2h~2n은 본원발명 500㎍/㎖ 처리 결과(도 2h는 웨스턴 블로팅 결과, 도 2i는 IL-1β, 도 2j는 IL-6, 도 2k는 COX-2, 도 2l은 IL-18, 도 2m은 iNOS, 도 2n은 TNF-α), 도 2o 및 2p는 항-CD11b 및 항-IL-1β 항체로 면역 염색한 결과. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p< 0.001)
도 3은 본 발명이 일차성상세포의 염증전 사이토카인 수준에 미치는 영향 및 그 결과를 각 개별 성분과 비교한 결과이다. 도 3a 및 3b는 복령 추출물과 대비, 도 3c 및 3d는 택사 추출물과의 대비, 도 3e 및 3f는 산약 추출물과 대비, 도 3g 및 3h는 녹용 추출물과 대비, 도 3i 및 3j는 목단피 추출물과 대비, 도 3k 및 3l은 산수유 추출물과 대비, 도 3m 및 3n은 본 발명의 구기자 추출물과 대비, 도 3o 및 3p는 본 발명의 숙지황 추출물과 대비. (*p < 0.05, ***p< 0.001)
도 4는 본 발명이 TLR4에 미치는 영향 결과이다. 도 4a 및 4b는 IL-1β에 대한 영향, 도 4c 및 4d는 TLR4의 세포 표면 수준 결과. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p< 0.001)
도 5는 본 발명이 세포신호전달에 미치는 영향 결과이다. 도 5a 및 5b는 FAK 인산화에 대한 영향, 도 5c 및 5d는 IL-1β mRNA에 대한 영향. (***p< 0.001)
도 6은 본 발명이 신경염증에 미치는 영향 결과이다. 도 6a는 웨스턴 블로팅 결과, 도 6b 내지 6d는 각각 세포질에서의 p-IκBα, IκBα, NF-κB 수준, 도 6e 및 6f는 핵내 NF-κB 수준, 도 6g 및 6h는 항-CD11b 및 항-p-NF-κB 항체로 면역 염색한 결과, 도 6i 및 6j는 핵내 NF-κB 수준(FAK 억제제 투여 대비). (*p < 0.05, ***p< 0.001)
도 7은 본 발명이 미세교세포의 이동에 대한 효과를 나타낸 결과이다. 도 7a 및 7b는 세포 이동 측정 결과 (***p< 0.001), 도 7c는 본 발명의 세포 이동 기전 예상도.
도 8은 본 발명이 마우스 인지 기능 및 미세교세포에 대한 효과를 나타낸 결과이다. 도 8a는 Y-미로 검사 결과, 8b는 NOR(the novel object recognition test) 검사 결과, 도 8c는 해마의 Iba-1 항체 면역 염색 영상 결과, 도 8d는 CA1 영역 내 Iba-1 수준, 도 8e는 DG 영역 내 Iba-1 수준, 도 8f는 피질의 Iba-1 항체 면역 염색 영상 결과, 도 8g는 피질 내 Iba-1 수준. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p< 0.001)
이하, 실시예 및 실험예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 본 발명의 준비
본 발명(이하 "ALWPs"로 칭함)에는 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피, 택사, 구기자, 원지, 석창포 및 녹용이 포함된다. ALWPs 조제 방식은 3단계에 걸친 추출 과정을 통해 이루어졌다.
먼저 1단계로 구기자(1000g), 숙지황(1200g), 산약(500g), 산수유(500g), 목단피(360g), 택사(360g), 복령(360g), 및 녹용(240g)에 물 25000cc를 주입하고 120℃에서 12시간 동안 끓였다. 끓이는 중간에 세 시간마다 2000cc씩 물을 추가로 혼합하고, 약재들을 뒤섞어 주었다. 이후 가열된 혼합물을 필터를 통해 걸러 찌꺼기를 제거하였다.
상기 1단계에서 얻은 추출물에 초미세가루로 분말화한 원지(180g), 석창포(180g) 및 복령(90g)을 첨가하고 1시간 동안 끓여(중탕) 농축하면서 화합물을 제조하였다.
상기에서 추출된 화합물을 72시간 동안 공기 건조시키고 환약으로 만들었다. 환약 제조시 에탄올 수용액(소주)를 분무하면서 적당히 수분을 공급하면서 수행하였다.
환약은 4℃에서 저장하고, 추출물은 각 실험 전에 PBS에 녹여 희석하였다. 이후 ALWPs를 구성하는 각각의 한약재를 확인하고 주 표지자의 내용을 확인하기 위해 고성능액체크로마토그래피(UHPLC)를 수행하였다. 또한 ALWPs의 개별 성분이 LPS로 유도된 전염증성 사이토카인 레벨에 미치는 영향을 조사하기 위해 ALWPs의 구성공식을 통해 개별 성분 각각의 용량을 계산하고 추가 실험을 수행하였다.
[실시예 2] 실험의 준비
1) 실험 동물 준비
모든 실험은 한국뇌연구원의 기관생물안전위원회(IBC) (승인번호 2014-479)의 승인을 받았다. 모든 실험은 한국뇌연구원이 승인한 동물 실험 및 지침에 따라 수행되었다. 수컷 야생 C57BL6/J 생쥐(8주, 25-30g)를 무균시설의 22°C의 온도에서 12시간 간격으로 밝은 상태와 어두운 상태에 각각 머물도록 하였다. 물과 음식은 자유롭게 섭취할 수 있었다. 생쥐는 한 우리 당 3-5마리씩 나누었으며, 임의적으로 대조군과 치료군에 배정되었다. 생쥐의 스트레스를 최소화하기 위하여 면으로 된 둥지를 설치하였다. 데이터는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 반자동 방식으로 분석되었으며 결과는 이 실험에 참여하지 않은 독립 연구원에 의해 확인되었다.
2) LPS 신경 염증 모델
야생형 C57BL/6J 생쥐에게 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)를 복강내주사(ip)하여 신경 염증을 일으켰다(Lee, J. W., Lee, Y. K., Yuk, D. Y., Choi, D. Y., Ban, S. B., Oh, K. W., et al. (2008). Neuro-inflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment through enhancement of beta-amyloid generation. J. Neuroinflamm. 5:37. doi: 10.1186/1742-2094-5-37).
동물들은 각 실험에 대해 3개의 그룹으로 나누었다: 1그룹은 인산염 완충 식염수(PBS)로 처리하고; 2그룹은 LPS와 PBS로 처리하였다; 3그룹은 LPS와 본 발명 조성물(ALPWs, 200mg/kg)로 처리하였다. ALWPs가 인지 기능에 미치는 영향을 시험하기 위해 8~9 주 된 야생형 생쥐에게 ALWPs(200mg/kg, p.o.) 또는 PBS를 매일 3일 동안 경구 투여하였다. 세 번째 날, PBS 또는 ALWPs 투여 1시간 후 LPS를 250㎍/kg의 양으로 복강 내 주사하였다. LPS의 주사 투여량은 이전의 연구에 근거하여 선택되었다 (Fruhauf, P. K., Ineu, R. P., Tomazi, L., Duarte, T., Mello, C. F., and Rubin, M. A. (2015). Spermine reverses lipopolysaccharide-induced memory deficit in mice. J. Neuroinflamm. 12:3. doi: 10.1186/s12974-014-0220-5, 이하 "Fruhauf et al., 2015"). LPS 주사 1시간 후 Y-미로시험, 그리고 신물질탐색시험(NOR)를 위한 훈련이 순차적으로 수행되었다. NOR시험은 NOR훈련이 끝난 24시간 후에 수행되었다. ALWPs가 인지 기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 Y-미로시험에서는 29 마리, NOR시험에서는 24 마리를 사용하였다. NOR시험에서, 훈련과 시험 중 탐사 시간이 7초 미만인 생쥐는 분석에서 제외하였다 (Taglialatela, G., Hogan, D., Zhang, W. R., and Dineley, K. T. (2009). Intermediateand long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition. Behav. Brain Res. 200, 95-99. doi: 10.1016/j.bbr.2008.12.034; Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., and Hartz, A. M. (2016). A comprehensive behavioral test battery to assess learning and memory in 129S6/Tg2576 mice. PLoS One 11:e0147733. doi: 10.1371/journal.pone.0147733).
3) Y-미로시험
Y-미로시험은 이전에 기술된 바와 같이 즉시작업기억을 평가하기 위해 수행되었다 (Fruhauf et al., 2015). 생쥐를 낮은 붉은 빛 (4-5 lux)하에 서로 120° 각도로 3개의 길(36.5cmХ7cmХ15.5cm)이 있는 Y형 미로에 놓아두었다. 3분 동안 생쥐는 길을 자유롭게 이동하였다. 지나간 길의 수와 그 순서를 기록하고, 비디오 녹화 후 수동으로 분석하였다. 교대비율(%)은 다음 수식을 사용하여 계산되었다.
: 교대비율(%) = 반복횟수/(총 진입횟수-2)Х100.
4) 신물질탐색시험 (NOR/Novel Object Recognition)
NOR은 이전에 설명한 것처럼 장기 기억을 평가하기 위해 수행되었다 (Fruhauf et al., 2015). 훈련 당일, 낮은 붉은 빛 (4-5 lux)하에 두 개의 동일한 물체를 포함하는 실험 장치 (30cmХ30cmХ25cm)에 생쥐를 놓아두었다. 생쥐는 물체를 탐색하기 위해 3분동안 자유롭게 움직였다. 다음날, 테스트를 위해 두개의 물체가 있는 동일한 장치에 생쥐를 5분동안 놓아두었다. 한 물체는 전날에 경험한 것과 동일한 물체였으나, 다른 한 물체는 전날 경험하지 못한 새로운 물체였다. 모든 시험은 비디오 테이프로 기록되었고, 상호 작용 시간은 수동으로 측정되었다. 생쥐가 물체 근처를 지나가거나 물체 위로 올라간 시간은 계산되지 않았다. 오직 생쥐가 물체로 향하는 시간만 측정하였다. 상대 상호작용 시간은 다음 공식에 따라 선호도(%)로 계산되었다.
: 선호도(%) = T새로운/(T친숙한+T새로운)Х100
여기서 T는 대상과의 상호 작용 시간이다.
5) 세포주 및 배양 조건
BV2 세포는 1차 생쥐 미세교세포로부터 유래되었다. BV2 미세교세포(경북대학교 석경호박사 제공)는 5% CO2 배양기 안에서 5% 소태아혈청 (FBS, HyClone) 으로 보충된 고포도당 DMEM (HyClone, Logan, UT, 미국) 에서 유지되었다. BV2 미세교세포의 처리는 항상 무혈청 DMEM에서 수행되었다. 체외에서 사용된 모든 BV2 미세교세포는 미세교세포 표지자로서 항-CD11b 항체로 면역염색을 통해 검증되었다. 또한 건강한 세포가 실험에 사용되었는지 확인하기 위해 10구간 이내의 BV2 미세교세포를 사용하였다. 모든 체외에서의 데이터는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 반자동 방식으로 분석되었으며 결과는 이 실험에 참여하지 않은 독립 연구원에 의해 확인되었다.
6) 일차성상세포 배양
일차성상세포는 1일된 Sprague Dawley 흰쥐의 대뇌 피질에서 배양되었다. 간략하게, 피질을 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신용액(페니실린 5000㎍/㎖, 스트렙토마이신 5㎍/㎖; Corning, NY, 미국)을 함유한 고포도당 DMEM에서 단일 세포로 분쇄하고, 75㎝2 T플라스크(0.5반구/플라스크)에 2주간 담가두었다. 성상세포가 풍부한 배양액을 준비하기 위해, 미세교세포를 120rpm으로 2시간동안 흔들어 분리하였으며, 플라스크에 남아있는 세포는 0.1% 트립신으로 채취하였다. 성상세포는 폴리-D-라이신 (시그마-알드리치) 으로 미리 코팅된 12개의 배양 플레이트 (35 mm)에 두었다.
7) 세포 표면 바이오티닐화
BV2 미세교세포를 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간 처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5시간 처리하였다. 표면 단백질을 4℃에서 부드럽게 흔들어 설포-NHS-SS-바이오틴(Sulfo-NHS-SS-Biotin)으로 표지하였다 (Cat No : 89881, Thermo Scientific, 미국). 30분 후, 세포에 담금질 용액을 첨가하였다. 표지된 세포를 용해 완충액에서 용해시키고, 얼음에서 초음파 처리하여 파괴시키고, 30분 동안 배양하고, 원심 분리 (10,000×g, 10분) 하였다. 원심 분리 후, 용해물을 굳은 NeutrAvidinTM 겔에 넣고 1시간 동안 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 샘플을 DTT가 있는 SDS-PAGE 샘플 완충액에서 1시간동안 배양하였다. 표면 단백질을 TLR4의 N-말단을 인식하는 항체로 면역블로팅하여 분석하였다.
8) 시토졸과 핵 분획
BV2 미세교세포를 시토졸 분리 완충액 (10 mM HEPES pH 8.0, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 300 mM 수크로스, 0.1% NP-40 및 0.5 mM PMSF) 에 용해시키고 5분 동안 10,000 rpm으로 원심 분리하였다. 상청액을 세포질 분리로 수집하였다. 남아있는 알갱이를 핵 분획 완충액 (10mM HEPES pH 8.0, 20% 글리세롤, 100mM KCl, 100mM 염화나트륨, 0.2mM EDTA, 0.5mM DTT 및 0.5mM PMSF) 에 재부유시키고, 15분 동안 얼음 위에서 배양한 후, 10,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 상청액은 핵분리로 수집하였다 (Nam, J. H., Cho, H. J., Kang, H., Lee, J. Y., Jung, M., and Chang, Y. C. (2017). A mercaptoacetamide-based class II histone deacetylase inhibitor suppresses cell migration and invasion in monomorphic malignant human glioma cells by inhibiting FAK/STAT3 signaling. J. Cell. Biochem. 118, 4672-4685. doi: 10.1002/jcb.26133).
9) 역전사 PCR
IL-1β, IL-6, COX-2, iNOS 및 TNF-α mRNA 레벨에 대한 ALWPs의 영향을 조사하기 위해 BV2 또는 일차성상세포를 PBS 또는 ALWPs (250, 500㎍/㎖) 로 30분간 전처리하였고, 5.5시간 동안 PBS 또는 LPS (1㎍/㎖)로 처리하였다. TRIzol (Ambion, 미국) 을 이용하여 RNA를 추출하였다. RT-PCR은 BV2 세포에 대해 다음 프라이머로 수행되었다.
| 구분 | ||
| IL-1b | 정방향 | AGC TGG AGA GTG TGG ATC CC |
| 역방향 | CCT GTC TTG GCC GAG GAC TA | |
| IL-6 | 정방향 | CCA CTT CAC AAG TCG GAG GC |
| 역방향 | GGA GAG CAT TGG AAA TTG GGG T | |
| IL-18 | 정방향 | TTT CTG GAC TCC TGC CTG CT |
| 역방향 | ATC GCA GCC ATT GTT CCT GG | |
| COX-2 | 정방향 | GCC AGC AAA GCC TAG AGC AA |
| 역방향 | GCC TTC TGC AGT CCA GGT TC | |
| iNOS | 정방향 | CCG GCA AAC CCA AGG TCT AC |
| 역방향 | GCA TTT CGC TGT CTC CCC AA | |
| TNF-α | 정방향 | CTA TGG CCC AGA CCC TCA CA |
| 역방향 | TCT TGA CGG CAG AGA GGA GG | |
| GAPDH | 정방향 | CAG GAG CGA GAC CCC ACT AA |
| 역방향 | ATC ACG CCA CAG CTT TCC AG |
일차성상세포의 경우 다음 프라이머를 RT-PCR에 사용하였다.
| 구분 | ||
| COX-2 | 정방향 | TCC AAC TCA AGT TCG ACC CA |
| 역방향 | TCC TCC GAA GGT GCT AGG TT | |
| IL-1b | 정방향 | AAA ATG CCT CGT GCT GTC TG |
| 역방향 | CAG AAT GTG CCA CGG TTT TC | |
| IL-6 | 정방향 | TTG CCT TCT TGG GAC TGA TG |
| 역방향 | TGG AAG TTG GGG TAG GAA GG | |
| iNOS | 정방향 | ATC ATG GAC CAC CAC ACA GC |
| 역방향 | GGT GTT GAA GGC GTA GCT GA | |
| TNF-a | 정방향 | AGC ACA GAA AGC ATG ATC CG |
| 역방향 | CTC CCT CAG GGG TGT CCT TA | |
| GAPDH | 정방향 | GTT ACC AGG GCT GCC TTC TC |
| 역방향 | GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT |
평균 밴드 강도를 측정하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행하였다.
10) 액체 크로마토그래피
역상 UHPLC는 4차 용매 관리 펌프, 시료 관리자(sample manager)-TN 및 광 다이오드 어레이 (photodiode array, PDA) 검출기로 구성된 Waters ACQUITYUHPLC H-Class 시스템 (Milford, MA, 미국)에서 수행되었다. UHPLC 데이터 분석을 위해 Empower 3 Pro 소프트웨어 (Milford, MA, 미국)를 사용하였다. 크로마토그래피 분리는 30℃에서 Perkin Elmer C18 역상 칼럼(Brownlee SPP 100mm×1.0mm ID, 1.7㎛) 으로 수행하였고, 283nm 5-HMF (5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, 시그마 알드리치) 231nm 파에오니플로린(paeoniflorin, MFDS, 오송, 대한민국)에서 240 nm 모로니사이드 (morroniside, ChemFaces, Wuhan, 중국)에서 237nm 로가닌 (MFDS)에서 관찰하였다. 아세토니트릴(용매A) 및 0.1% 포름산 DW (용매B)로 이루어진 용매시스템은 2%(용매A):98%(용매B)부터 100%(용매A):0%(용매B)까지 18분 동안 0.4㎖/분의 속도로 처리하였다. 표준 저장액은 10㎍/㎖의 최종 농도를 얻기 위해 100% 메탄올에 녹여 준비하였다. 9000rpm으로 초원심분리하고 주사기 필터 (0.2㎍, WhatmanTM, Maidstone, 영국)에 여과한 후, 4㎖의 샘플을 6회 주사하였다.
11) MTT 분석
세포 생존력은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT) 분석을 사용하여 평가하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 심고 FBS가 없는 상태에서 6시간 또는 24시간 동안 다양한 농도의 ALWPs (50-250㎍/㎖) 로 처리하였다. 세포는 0.5㎍/㎖의 MTT를 처리하고 5% CO2의 배양기에서 37℃로 3시간 동안 배양하였다. 배지를 폐기한 후, 포르마잔 염료를 용해시키기 위해 디메틸술폭시드(DMSO)를 첨가하였고, 580nm에서 흡광도를 측정하였다.
12) 면역 세포 화학
세포를 12-웰 플레이트 (Eppendorf, Hamburg, Germany) 의 커버 슬립 위에 웰당 세포 2만개의 밀도로 위치하도록 하였다. 혈청이 없는 고포도당 DMEM (HyClone) 으로 배양액을 교환하고 24시간 후, 세포를 ALWPs (250㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간 전처리하였고, 이후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5시간동안 처리하였다. 그 후 세포를 냉메탄올에서 8분간 고정하고, PBS로 3회 세척하고, GDB 완충액 [0.1 % 젤라틴, 0.3 % 트리톤 X-100, 16 mM 인산나트륨 (pH 7.4), 450mM 염화나트륨]에서 밤새 4℃로 다음 일차 항체 중 하나와 항온 배양하였다: 항-CD11b (M1/70, Cat No: ab8878, 1:200, Abcam), 항-IL-1b (Cat No: sc-7884, 1:200, Santa Cruz Biotechnology), 또는 p-NF-kB (Ser536, Cat No: 3033L, 1:100, Cell Signaling Technology). 다음날, 세포를 PBS로 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안하기 다음 2차 항체와 함께 배양하였다: Alexa Fluor 488 및 Alexa Fluor 555 (1:200, Molecular Probes, OR, 미국). 세포를 DAPI 함유 용액 (Vector Laboratories, CA, 미국)에 고정하고 공촛점 현미경 (Nikon, 일본)을 사용하여 단일 평면에서 이미지를 획득하였으며 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
13) 면역 형광 분석
ALWPs가 미세교세포 활성화에 미치는 영향을 조사하기 위해 3개월 된 야생형 C57BL/6J 생쥐에 ALWPs (200mg/kg, p.o.) 또는 PBS를 3일간 매일 경구 투여하였다. 3번째 날, LPS (10㎎/㎏) 를 복강내 주입하였다. 3시간 후, 생쥐에게 4% 파라포름알데히드 (PFA)를 뿌리고 고정하였고, 뇌조직을 급속 냉동하고 저온유지장치에서 해부하였다 (35㎛ 두께). 각 뇌 절편은 면역 형광 염색을 진행하였다. 절편을 PBS로 세척하고, 토끼의 항-Iba-1 (1:500, Wako, 일본)과 함께 배양하여 미세교세포를 검출하였다. 일차 항체를 0.5% 소혈청 알부민 (BSA) 으로 세척하고 밤새 4℃에서 배양하였다. 다음날, 조직을 0.5% BSA로 세척하고 실온에서 1시간 동안 Alexa Fluor 555-접합된 항-래빗 IgG (1:500, Molecular Probes) 와 함께 배양하였다. 그 뒤에 조직을 젤라틴 코팅 된 커버 글래스에 장착하고 DAPI 함유 고정 용액 (Vector Laboratories) 으로 덮었다. 염색된 조직을 공촛점 현미경 (TI-RCP, Nikon) 을 사용하여 영상화하였다. 면역 형광 분석을 위해 9마리의 생쥐를 사용하였다.
14) 웨스턴 블로팅
프로테아제와 포스파타아제 억제제 타블렛 (Roche, Basel, Switzerland) 을 포함하는 IPH 용해 완충액 (50 mM Tris-Cl, 150 mM 염화나트륨, 1 % NP-40, 0.5M EDTA, 1 mM PMSF, 0.1M DTT) 을 사용하여 세포를 용해시켰다. 같은 양의 단백질 (10 또는 20㎍) 을 5분 동안 끓인 sample loading buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, 미국) 와 혼합하고 Mini protein Tetra cell 시스템을 사용하여 SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질을 전기 영동 이동 시스템 (Bio-Rad) 을 사용하여 polyvinylidene difluoride membranes (PVDF, Millipore, Temecula, CA, 미국) 으로 옮겼다. 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 분유 또는 5% BSA로 블로킹한 후, 막을 다음의 특정 일차 항체 혹은 2차 항체와 함께 배양하였다. 일차항체: 마우스 b-actin (1:5000), 마우스 항-p-IkBa (1:1000), 래빗 항-IkBa (1:1000), 래빗 항-NF-kB (P65, 1:1000), 마우스 항-PCNA (1:1000), 래빗 항-FAK (1:1000), 래빗 항-p-FAK (Tyr397, 1:1000), 래빗 항-ERK (1:1000), 래빗 항-p-ERK (Thr202/Tyr204, 1:1000), 래빗 항-JNK (1:1000), 래빗 항-p-JNK (Thr183/Tyr185, 1:1000), 래빗 항-P38 (1:1000), 래빗 항-p-P38 (1:1000), 래빗 항-TLR4 (1:1000), 및 래빗 항-TLR4 (1:1000), 2차 항체: HRP-접합된 항-래빗 또는 마우스, 1:10,000). 마지막으로, 막은 향상된 화학 발광 검출 시약 (ATTO, 일본) 을 사용하여 개발되었다 (Song, X., Shukla, S., Lee, G., Park, S., and Kim, M. (2016). Detection of Cronobacter genus in powdered infant formula by enzyme-linked immunosorbent assay using anti-Cronobacter antibody. Front. Microbiol. 7:1124. doi: 10.3389/fmicb.2016.01124). 이미지는 Fusion 소프트웨어 또는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
15) 세포 이동 분석 (상처 치료 분석)
상처 치료 분석은 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Nam, J. H., Cho, H. J., Kang, H., Lee, J. Y., Jung, M., and Chang, Y. C. (2017). A mercaptoacetamide-based class II histone deacetylase inhibitor suppresses cell migration and invasion in monomorphic malignant human glioma cells by inhibiting FAK/STAT3 signaling. J. Cell. Biochem. 118, 4672-4685. doi: 10.1002/jcb.26133). BV2 미세교세포를 12-웰 플레이트에 심고, 세포가 80-90% 융합될 때까지 배양하였다. 세포를 세포 스크래쳐 (SPL, 경기도, 대한민국) 로 긁어 상처를 만들었다. 이미지는 즉시 또는 24시간 후에 촬영하였다.
16) 통계 분석
모든 데이터는 두 그룹간의 비교에 대한 Welch's correction과 양쪽꼬리검정 혹은 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 이용한 다중 비교를 위한 단방향 ANOVA를 사용하여 분석하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***<0.0001 로 유의성이 설정된 Tukey's 다중 비교 테스트로 사후비교분석 완료하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다.
[실험예 1] BV2 미세교세포의 세포 생존력과 형태에 대한 효과
ALWPs가 세포 생존 능력에 미치는 영향을 평가하기 위하여, BV2 미세교세포를 PBS 또는 ALWPs(50, 250, 500, 750 또는 1000㎍/㎖)로 6시간 처리한 후 MTT 분석을 실시하였다. ALWPs는 500㎍/㎖까지 농도에서 세포 독성을 일으키지 않았지만, ALWPs 농도가 750㎍/㎖ 이상일 때 세포 생존율이 감소하였다.(도 1A)
ALWPs가 더 긴 치료 시간 동안 세포 생존 능력에 영향을 주는지 여부를 확인하였다. BV2 미세교세포를 PBS 또는 ALWPs(50, 250, 500, 750 또는 1000㎍/㎖)로 24시간 처리한 후 MTT 분석을 실시하였다. ALWPs는 최대 용량에서 BV2 미세교세포 생존율을 약간 감소시켰다. 750, 1000㎍/㎖에서 각각 17.5 및 19.8 %의 감소하였다.(도 1B) 이러한 결과를 바탕으로 후속 실험을 위한 최적 ALWPs 농도로 250, 500㎍/㎖를 선택하였다.
ALWPs가 세포 형태에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, BV2 미세교세포를 PBS 또는 ALWPs(500㎍/㎖)로 30분간 처리한 후 LPS(1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5시간 처리하였다. 이어서, 세포를 고정시키고 미세교세포 표지자로서 항-CD11b 항체로 면역 염색시켰다.
실험 결과, 대조군(CON)과 비교하여 LPS 처리한 세포는 세포체에서 연장되는 길고 얇은 섬유 모양의 구조를 나타내었다(도 1C, 중간). 그러나 ALWPs 처리한 후 LPS 처리한 세포는 LPS 처리한 세포와 비교하여 더 짧은 가지와 더 둥근 세포 모양을 나타내었다(도 1C 하단).
[실험예 2] 본 발명의 전염증성 사이토카인에 대한 효과
본 발명의 ALWPs가 LPS 매개 전염증성 사이토카인 레벨을 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다. BV2 미세교세포를 ALWPs (250㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간 전처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5시간 처리하였다. 총 RNA를 분리하고, 전염증성 사이토카인의 mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하였다. 놀랍게도 250㎍/㎖ ALWPs는 BV2 미세교세포에서 LPS 매개 전염증성 사이토카인 레벨을 변화시키지 않았다(도 2a-2g).
나아가, 더 높은 농도의 ALWPs가 LPS 매개 전염증성 반응을 변화시킬 수 있는지 여부를 확인하였다. BV2 미세교세포를 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간 전처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5시간 처리하였다. 총 RNA를 분리하고, 전염증성 사이토카인의 mRNA 수준을 RT-PCR로 검사하였다. 흥미롭게도, ALWPs 처리한 후 LPS 처리하면 LPS 매개 BV2 미세교세포에서 IL-1β의 mRNA 수준을 유의하게 감소시켰지만 다른 전염증성 사이토카인의 mRNA 수준은 감소시키지 못하였다(도 2h-2n).
상기 결과를 더 확인하기 위해, BV2 미세교세포를 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간 전처리한 후, LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5시간 동안 처리하였다. 면역 염색은 항-CD11b 및 항-IL-1β 항체로 수행하였다.
위에서 설명한 결과와 일치하여 LPS 단독으로 처리하면 대조군에 비해 IL-1β 수치가 유의하게 증가하였지만, ALWPs 처리한 후 LPS 처리한 경우는 LPS 처리만한 경우와 비교하여 IL-1β 수치를 유의하게 감소시켰다(도 2o, 2p). 즉, ALWPs는 BV2 미세교세포의 LPS 매개 IL-1β 레벨을 감소시킨다. 이는 ALWPs가 BV2 미세교세포에서 LPS로 유도된 염증전 사이토카인 수준에 선택적으로 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
[실험예 3] 각 개별 성분별 전염증성 사이토카인에 대한 효과
ALWPs의 개별 성분이 ALWPs와 LPS 처리 또는 LPS 단독 처리한 경우와 비교하여 전염증성 사이토카인 IL-1β 수준을 변화시킬 수 있는지 확인하기 위해, BV2 미세교세포를 복령 추출물 또는 ALWPs (500㎍/㎖)로 30분간 전처리한 후 5.5시간 동안 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 처리하였다. 총 RNA를 분리하고 IL-1β의 mRNA 수준을 RT-PCR로 검사하였다. 동일한 방법으로 택사 추출물, 산약 추출물, 녹용 추출물, 목단피 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 숙지황 추출물로 BV2 미세교세포를 처리하였다.
실험 결과, 상기 결과들과 일치하여 ALWPs는 LPS와 비교하여 LPS로 유도된 염증전 사이토카인 IL-1β mRNA 수준을 차단하였다. 또한, ALPSs의 개별 성분으로 전처리한 후 LPS 처리한 결과 LPS 단독 처리한 경우와 비교하여 IL-1β mRNA의 수준을 크게 변화시키지 않는다는 것을 확인하였다(도 3a-3p). 이는 ALWPs에서 10가지 구성 약재의 조합이 신경 염증 반응에 부가/시너지 효과를 가질 수 있음을 시사한다.
[실험예 4] 일차성상세포에서의 전염증성 사이토카인에 대한 효과
ALWPs가 일차성상세포의 염증전 사이토카인 수준을 조절할 수 있는지 조사하기 위해, 일차성상세포를 먼저 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간 처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5, 11.5, 또는 23.5시간 동안 처리하였다. 특정 처리 기간 후, 총 RNA가 세포로부터 분리되었고, 염증전 사이토카인 mRNA 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였다. 실험 결과, ALWPs 치료가 일차성상세포의 모든 시점에서 LPS 매개 염증전 사이토카인 수준을 변화시키지 않는 것을 발견하였다.
나아가, ALWPs가 염증전 사이토카인 수준에 용량에 따라 각기 다른 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 일차성상세포를 ALWPs (500, 750, 1000㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간 처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5시간 처리하였다. 총 RNA를 분리하기 위해 세포를 채취하여 염증전 사이토카인 수준을 RT-PCR로 측정하였다.
이를 통해 ALWPs의 복용량이 일차성상세포에서 LPS 매개 염증전 사이토카인 수준을 조절하지 않음을 확인하였다. 이는 ALWPs가 LPS로 유도된 염증전 반응을 세포 유형마다 차별적으로 조절할 수 있음을 시사한다.
[실험예 5] TLR4에 대한 효과
ALWPs 존재 하에서 TLR4가 LPS로 유도된 IL-1β mRNA 수준을 변화시킬 수 있는지 여부를 확인하였다. BV2 미세교세포를 TAK-242 (TLR4 억제제, 500nM) 30분, ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS 30분, 그리고 마지막으로 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5시간 처리하였다. 총 RNA를 분리하고 IL-1β mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하였다.
실험 결과, 상기 결과들과 일치하여, ALWPs 처리한 후 LPS 처리한 경우는 LPS 단독 처리한 경우에 비해 IL-1β mRNA 수준을 감소시켰다(도 4a,4b). 또한, TAK-242, ALWPs 및 LPS 처리한 경우, TAK-242 및 LPS 처리한 경우와 비교하여 IL-1β mRNA 수준이 감소하지 않았다(도 4a,4b). 이는 ALWPs가 TLR4를 변화시켜 LPS로 유발된 염증전 사이토카인 수준에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
나아가, ALWPs가 TLR4의 세포 표면 수준을 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 BV2 미세교세포를 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간 처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5.5시간 처리하였다. TLR4의 N-말단을 인식하는 TLR4 항체로 세포 표면 바이오티닐화를 수행하였다. LPS 처리는 TLR4의 세포 표면 수준을 유의하게 증가시켰다.(도 4c,4d) 또한, ALWPs 처리한 후 LPS 처리한 경우는 LPS 단독 처리한 경우에 비해 TLR4의 세포 표면 수준을 현저히 감소시켰다(도 4c,4d). 이는 ALWPs가 TLR4의 세포 표면 수준을 억제함으로써 세포 표면의 LPS와 TLR4 사이의 상호 작용을 감소시켜 염증 반응을 조절함을 시사한다.
[실험예 6] 세포신호전달에 대한 효과
ALWPs가 LPS로 자극된 염증전 반응을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해, ALWPs가 MAP 키나아제 시그널ㄹ링 캐스케이드, 하방 LPS-유도된 시그널링 경로를 조절하는지 확인하였다 (Kaminska et al., 2009; Dang et al., 2014; Guo et al., 2016). 이를 위해 BV2 미세교세포를 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 5시간 처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 45 분간 처리하였다. 이후 항-p-ERK, 항-ERK 항체로 웨스턴 블로팅을 수행하였다. ALWPs는 LPS로 자극된 BV2 미세교세포에서 p-ERK 또는 총 ERK 수준을 변화시키지 않았다. ALWPs가 P38 및 JNK 신호전달을 포함하는 다른 MAP 키나아제 신호전달경로를 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다. ALWPs는 LPS로 유도된 BV2 미세교세포에서 P38/JNK의 인산화 상태 및 총 수준을 변경시키지 않았다.
ALWPs가 염증에 관련된 잠재적 표적으로써 focal adhesion kinase (FAK) 의 인산화를 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다 (Zeisel et al., 2005; Wong et al., 2011; Choi et al., 2015; Lian et al., 2015). 이를 위해 BV2 미세교세포를 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 5시간 동안 전처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 45분간 처리하였다. 이후 항-p-FAK, 항-FAK로 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 실험 결과, LPS 단독 처리한 세포는 대조군에 비해 FAK의 인산화를 증가시켰으며, ALWPs는 BV2 미세교세포에서 LPS 처리한 군에 비해 FAK 인산화를 현저히 감소시켰다.(도 5A,B)
ALWPs가 LPS로 유도된 IL-1β mRNA 수준에 영향을 미쳐 FAK 신호를 변화시키는지를 조사하기 위해, BV2 미세교세포를 PF-573228 (FAK 억제제, 5㎛) 또는 운반체 (1% DMSO)로 30분간, ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 30분간, 마지막으로 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5시간 동안 처리하였다. 총 RNA를 분리하고 IL-1β mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하였다. PF-573228, ALWPs 및 LPS 처리한 경우는 PF-573228와 LPS 단독 처리한 경우에 비해 LPS로 유도된 IL-1β mRNA 수준이 감소하지 않았다(도 5C,D). 이는 ALWPs가 LPS로 자극된 염증전 반응을 조절하기 위해 FAK 신호를 조절함을 시사한다.
[실험예 7] 신경염증에 대한 효과
NF-κB는 신경 염증에 있어서 중요한 역할을 한다 (Lawrence, 2009 ; Cao et al., 2010 ; Tilstra et al., 2011 ; Yao et al., 2013a). 미세교세포에서의 NF-κB는 바이러스 및 LPS와 같은 세균의 독소에 의해 활성화된다. 예를 들어, 만성 염증 환자에서 NF-κB의 활성화는 자가 면역/염증성 질환인 알츠하이머, 파킨슨병 및 골다공증의 중요한 요인으로 밝혀졌다 (Vallabhapurapu and Karin, 2009). 따라서 ALWPs가 NF-κB 세포 내 국소화를 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 BV2 미세교세포를 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 5시간 동안 전처리하고 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 45 분간 처리한 다음 세포 이하로 분화 (핵과 세포질)를 실시하였다.
실험 결과, LPS에 의한 ALWPs의 전처리가 LPS 처리에 비해 세포질에서 p-IκBα, IκBα 또는 NF-κB 수준을 변화시키지 않는다는 것을 확인하였다(도 6A-D) . 핵 구획에서 LPS는 대조군 치료에 비해 NF-κB 수준을 증가시켰다(도 6E, F). LPS에 의한 ALWPs의 전 처리는 BV2 미세교세포에서 LPS 단독 처리에 비해 LPS로 유도 된 핵 NF-κB 수준을 감소시켰다(도 6E, F).
상기 결과를 더 확인하기 위해 BV2 미세교세포를 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 5시간 동안 전처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 45 분간 처리하였다. 이어서 항-CD11b 및 항-p-NF-κB 항체로 면역 세포 화학을 수행하였다.
실험 결과, LPS 단독으로는 핵 p-NF-κB 수준이 유의하게 증가하는 반면, ALWPs는 BV2 미세교세포에서 LPS로 유도된 핵 p-NF-κB 수준을 유의하게 감소시켰다(도 6G, H). 이는 ALWPs가 BV2 미세교세포에서 LPS로 유도된 NF-κB 핵 전좌를 조절한다는 것을 시사한다.
또한, ALWPs가 LPS 유도된 핵 p-NF-κB 수준을 변경하기 위해 FAK 신호를 조절하는지 여부를 확인하였다. BV2 미세교세포를 3분 동안 FAK 억제제 PF-573228 (5㎛)로 전처리한 후 ALWPs (500㎍/㎖) 또는 PBS로 30 분간 처리한 후 LPS (1㎍/㎖) 또는 PBS로 5시간 처리하였다. 이어서, 항 CD11b 및 항-p-NF-κB 항체로 면역 세포 화학 법을 수행하였다.
실험 결과, PF-573228, ALWPs 및 LPS 처리는 PF-573228 및 LPS 또는 ALWPs 및 LPS 처리에 비해 LPS 자극된 핵 p-NF-κB 수준을 더욱 감소시켰다(도 6I, J). 이는 ALWPs가 FAK 신호를 변경하여 신경 염증 반응을 조절하기 위해 핵 p-NF-κB 신호 전달에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
[실험예 8] 미세교세포의 이동에 대한 효과
여러 연구에서 미세교세포의 이동이 신경 염증 반응과 관련되어 있음을 보여 준다. 이에 ALWPs가 미세교세포의 이동을 조절할 수 있는지 알아보기 위해 BV2 미세교세포를 PBS 또는 ALWPs (500㎍/㎖)로 1시간 동안 전처리한 후 LPS (0.1㎍/㎖) 또는 PBS를 24시간 동안 처리하였다.
실험 결과, LPS 단독으로 대조군 치료에 비해 BV2 미세교세포 이동이 유의하게 증가한다는 것을 발견하였다(도 7A, B). 또한, LPS 처리에 의한 ALWPs의 전처리는 LPS 처리와 비교하여 BV2 미세교세포 이동을 유의하게 억제하였다(도 7A, B). 이는 ALWPs가 LPS 매개 BV2 미세교세포 이동을 억제할 수 있음을 시사한다(도 7C).
[실험예 9] 마우스 인지 기능 및 미세교세포에 대한 효과
여러 연구에서 미세교세포의 활성화가 알츠하이머 병 및 다른 신경계 질환의 원인임을 보여주었다 (Wee Yong, 2010 ; Hirsch et al., 2012 ; Asai et al., 2015 ; Heneka et al., 2015). 또한, 강화된 신경 염증은 기억 손상을 초래할 수 있으며 결국 신경 퇴행성 질환을 유발할 수 있다 (Fang 외, 2010; Tweedie 등, 2012; Kempuraj et al., 2016). 이에 ALWPs가 생체 내에서 인지 기능을 조절할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 야생형 C57BL/6J 마우스에게 ALWPs (200 mg/kg) 또는 PBS를 매일 3일 동안 경구투여 하였다. PBS나 ALWPs 치료 후 마지막 날에 LPS (250㎍/kg)를 복강 내 주사하여 Y-미로(Y-maze) 검사를 시행하였다. 또한 LPS 주입 1시간 후 NOR(the novel object recognition test)훈련을 실시하였고 24시간 후 NOR 검사를 실시하였다. 실험 결과, LPS가 주입된 야생형 마우스는 PBS-주입 된 야생형 마우스와 비교하여 단기 및 장기 기억을 상당히 감소시켰다(도 8A, B). LPS 단독 주입과 비교하여 ALWPs 전처리와 LPS 주입은 단시간 및 장기간의 기억을 보존했으며(도 8A, B), 이는 ALWPs가 LPS 주입 야생형 마우스의 학습 및 기억에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다.
또한, ALWPs가 생체 내에서 미세교세포 활성화를 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다. 야생형 C57BL/6J 마우스에게 ALWPs (200 mg/kg) 또는 PBS를 매일 3일 동안 경구 투여하였다. 마지막 날 PBS 또는 ALWPs 처리한 후, LPS (10㎍/kg)를 복강 내 주입하였다. 3시간 후에 면역 조직 화학 염색은 활성화 된 미세교세포의 마커인 항-Iba-1 항체로 전도되었다. LPS가 주사된 야생형 마우스는 PBS가 주입된 야생형 마우스와 비교하여 해마(도 8C-E) 및 피질(도 8F, G)에서 미세교세포 활성 증가를 현저히 나타내었다. 그러나 ALWPs의 전처리는 LPS가 주입된 야생형 C57BL/6J 마우스에서 해마와 피질의 미세교세포 활성화가 현저히 감소되었다(도 8C-E).
이 결과들은 ALWPs가 LPS가 주입된 야생형 C57BL/6J 마우스에서 미세교세포의 활성화를 억제할 뿐만 아니라 장단기 기억 장애를 치료할 수 있음을 시사한다.
[실험 결과의 종합]
본 연구에서는 ALWPs가 인지 기능과 신경 염증 반응에 미치는 새로운 효과를 조사 하였다. 특히 ALWPs가 BV2 미세교세포에서 LPS-유도된 IL-1β 수치를 억제하였으나 일차성상세포에서는 그렇지 못하다는 것을 확인하였다. ALWPs는 또한 LPS-유도된 IL-1β 수준을 감소시키기 위해 TLR4/FAK 신호를 조절하였다. 또한, ALWPs는 전사 인자 NF-κB의 핵 위치를 조절함으로써 신경 염증 반응을 완화시킨다. 더욱이 LPS 주입 야생형 C57BL/6J 마우스에 대한 ALWPs의 경구 투여가 단기 및 장기 기억을 보존하고 미세교세포 활성화를 감소시키는 것을 확인하였다.
흥미롭게도, ALWPs가 BV2 미세교 세포에서 LPS-자극된 IL-1β 수준에 영향을 주었지만, 일차성상세포에서 LPS-유발성의 염증전 사이토카인 수준의 변화는 보이지 않았다는 것을 확인하였다. 상기 결과는 ALWPs가 LPS에 의해 유발 된 염증전 사이토카인 IL-1β 수치를 조절하고 세포 유형에 따라 다른 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 이를 통해 본 발명의 ALWPs가 인지 기능뿐만 아니라 신경 염증을 조절하기 위해 IL-1β 수치를 감소시킨다고 예상한다.
ALWPs는 TLR4 신호를 변조하여 LPS 유도된 IL-1β 수준을 조절하였다. ALWPs가 TLR4 억제제가 없을 때 LPS 유도된 IL-1β 수준을 감소시키는 것을 관찰했기 때문에 ALWPs가 LPS와 TLR4 사이 또는 LPS와 LPS와의 상호 작용하는 알려지지 않은 수용체 사이의 결합을 방해할 수 있다. 또한, ALWPs가 TLR4의 세포 표면 수준을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, ALWPs는 세포 표면에서 LPS와 TLR4 사이의 상호 작용을 억제하여 신경 염증 반응에 영향을 미친다는 것을 의미한다.
예상외로, ALWPs가 LPS 유도 MAPK 신호 전달 경로를 변경시키지 않는다는 것을 확인하고, LPS 처리는 쥐 대식 세포 및 인간 활막 세포에서 FAK의 자가 인산화(Tyr397)를 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, FAK 인산화에 대한 ALWPs의 영향을 조사한 경과 ALWPs가 LPS-자극 BV2 미세교세포에서 p-FAK(Tyr 397)를 감소시키는 것을 확인하였다(도 5). 또한, FAK 억제제, ALWPs 및 LPS로 처리한 결과, FAK 억제제 및 LPS 처리에 비해 LPS-유도된 IL-1β 수준은 감소하지 않았다. 이는 ALWPs가 FAK 인산화 (Tyr 397)를 억제하여 LPS-유도 IL-1β 수준을 조절함을 시사한다.
ALWPs가 LPS 자극 BV2 미세교 세포의 핵에서 p-NF-κB와 전좌를 하향 조절한다는 것을 확인하였다. 이는 ALWPs는 NF-κB 및 IL-1β의 수준을 조절하고 항염증 반응의 새로운 메커니즘을 제공하는데 중요한 역할을 한다는 것을 시사하며, 각 성분이 아니라 ALWPs로 구성되었을 때 LPS로 자극된 염증 전 사이토카인 IL-1β 수준을 유의하게 감소시켰다.
미세교 세포 이동에 대한 ALWPs의 효과를 조사하였고, ALWPs가 LPS-유도 BV2 미세교 세포 이동을 유의하게 억제한다는 것을 발견하였다(도 7).
염증 전 사이토카인 IL-1β 수준에 대한 ALWPs의 각 구성 요소의 영향을 조사하여 각각의 요소가 아니라 ALWPs가 BV2 미세교 세포에서 LPS 매개 IL-1β mRNA 수준을 감소시키는 것을 확인하였다. ALWPs의 각 구성 요소가 세포 수준에서 긍정적인 효과를 나타내는 것으로 알려져 있지만, ALWPs에서 10가지 성분의 조합을 통해 신경 염증을 줄이기 위한 시너지가 있음을 확인하였다.
본 발명의 ALWPs가 항염증 효과를 가지고 있음을 확인하고 야생형 마우스에서 LPS-유도된 단기 및 장기 기억 장애를 완화시킴을 확인하였다.
결론적으로, ALWPs가 LPS-유도 BV2 미세교세포에서 항염증 TLR4/FAK 신호 전달 계통의 조절 인자이고, LPS에 의한 ALWPs 처리는 전사 인자 NF-κB의 세포 내 위치를 변화시킨다. 또한, ALWPs는 단기 및 장기 기억을 촉진하고 미세교세포 활성화를 억제한다. 종합적으로 말하자면, 이러한 결과들은 ALWPs가 알츠하이머병을 포함한 신경 염증 관련 질환에 대한 잠재적인 항염증 치료제가 될 수 있음을 시사한다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (10)
- 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 유효성분으로 포함하되,
상기 혼합물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.5 내지 5, 산약 0.1 내지 3, 산수유 0.1 내지 3, 목단피 0.05 내지 2, 택사 0.05 내지 2, 복령 0.05 내지 3, 녹용 0.01 내지 2, 원지 0.01 내지 1.5, 및 석창포 0.01 내지 1.5의 중량비로 혼합되고,
상기 혼합물은 (S1) 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령 및 녹용을 혼합하여 추출하는 단계, (S2) 상기에서 수득한 추출물을 여과하는 단계, (S3) 상기에서 수득한 여과된 추출물에, 원지, 석창포 및 복령을 혼합하고 가열하여 혼합물을 제조하는 단계, 및 (S4) 상기에서 수득된 혼합물을 건조하는 단계를 포함하는 방법을 통해 제조된 것을 특징으로 하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 물 및 탄소수 1 내지 4의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 용매로 하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 신경계 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 질환, 헌팅턴병, 피크병, 크로이펠츠-야콥병, 전두측두치매, 루이치매, 근육위축가쪽경화증, 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계자가면역질환, 다발성경화증 염증성 및 신경병증성 통증, 우울증, 두부 외상, CNS 저산소증, 뇌 허혈증, 뇌염, 건망증, 외상성 뇌손상, 베르니케 코르사코프 증후군, 해마경화증, 두통, 뇌 노쇠증, 전측두엽 변성, 정상뇌압수두증, 뇌혈관성질환, 뇌신경질환, 기억상실, 경도인지 장애, 인지 결핍 및 주의력 결핍으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물을 유효성분으로 포함하되,
상기 혼합물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.5 내지 5, 산약 0.1 내지 3, 산수유 0.1 내지 3, 목단피 0.05 내지 2, 택사 0.05 내지 2, 복령 0.05 내지 3, 녹용 0.01 내지 2, 원지 0.01 내지 1.5, 및 석창포 0.01 내지 1.5의 중량비로 혼합되고,
상기 혼합물은 (S1) 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령 및 녹용을 혼합하여 추출하는 단계, (S2) 상기에서 수득한 추출물을 여과하는 단계, (S3) 상기에서 수득한 여과된 추출물에, 원지, 석창포 및 복령을 혼합하고 가열하여 혼합물을 제조하는 단계, 및 (S4) 상기에서 수득된 혼합물을 건조하는 단계를 포함하는 방법을 통해 제조된 것을 특징으로 하는 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물. - 제5항에 있어서, 상기 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령, 녹용, 원지 및 석창포의 혼합물은 물 및 탄소수 1 내지 4의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 용매로 하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 제5항에 있어서, 상기 신경계 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 질환, 헌팅턴병, 피크병, 크로이펠츠-야콥병, 전두측두치매, 루이치매, 근육위축가쪽경화증, 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계자가면역질환, 다발성경화증 염증성 및 신경병증성 통증, 우울증, 두부 외상, CNS 저산소증, 뇌 허혈증, 뇌염, 건망증, 외상성 뇌손상, 베르니케 코르사코프 증후군, 해마경화증, 두통, 뇌 노쇠증, 전측두엽 변성, 정상뇌압수두증, 뇌혈관성질환, 뇌신경질환, 기억상실, 경도인지 장애, 인지 결핍 및 주의력 결핍으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- (S1) 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령 및 녹용을 혼합하여 추출하는 단계, (S2) 상기에서 수득한 추출물을 여과하는 단계, (S3) 상기에서 수득한 여과된 추출물에, 원지, 석창포 및 복령을 혼합하고 가열하여 혼합물을 제조하는 단계, 및 (S4) 상기에서 수득된 혼합물을 건조하는 단계를 포함하고,
상기 혼합물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.5 내지 5, 산약 0.1 내지 3, 산수유 0.1 내지 3, 목단피 0.05 내지 2, 택사 0.05 내지 2, 복령 0.05 내지 3, 녹용 0.01 내지 2, 원지 0.01 내지 1.5, 및 석창포 0.01 내지 1.5의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법. - (S1) 구기자, 숙지황, 산약, 산수유, 목단피, 택사, 복령 및 녹용을 혼합하여 추출하는 단계, (S2) 상기에서 수득한 추출물을 여과하는 단계, (S3) 상기에서 수득한 여과된 추출물에, 원지, 석창포 및 복령을 혼합하고 가열하여 혼합물을 제조하는 단계, 및 (S4) 상기에서 수득된 혼합물을 건조하는 단계를 포함하고,
상기 혼합물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.5 내지 5, 산약 0.1 내지 3, 산수유 0.1 내지 3, 목단피 0.05 내지 2, 택사 0.05 내지 2, 복령 0.05 내지 3, 녹용 0.01 내지 2, 원지 0.01 내지 1.5, 및 석창포 0.01 내지 1.5의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제조 방법.
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