KR102140508B1 - 헌팅턴병의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산약(Dioscoreae Radix), 산수유(Corni Fructus), 택사(Alismatis Rhizoma), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Moutan Radicis Cortex) 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 헌팅턴병에 의한 운동기능장애의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 신경세포 사멸의 치료 효과가 있고, 항산화 및 항염증 효과가 우수하며, 운동기능장애에 치료 효과가 있으므로, 헌팅턴병의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 신경세포 사멸의 치료 효과가 있고, 항산화 및 항염증 효과가 우수하며, 운동기능장애에 치료 효과가 있으므로, 헌팅턴병의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 헌팅턴병의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산약(Dioscoreae Radix), 산수유(Corni Fructus), 택사(Alismatis Rhizoma), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Moutan Radicis Cortex) 복합 추출물을 포함하는 헌팅턴병의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
헌팅턴 무도병(Huntington's chorea)은 손발이 춤추듯 무의식적으로 움직이는 유전성 신경퇴행성질환을 말한다.
헌팅턴 병의 원인으로는 염색체 4p16.3에 위치하는 헌팅턴(Huntington) 유전자에는 CAG 세 개의 염기가 반복되어 나타나는 특이한 서열이 존재하는데, 정상인은 19회 정도 반복하지만 헌팅턴 무도병 환자에게서는 40회 이상 나타난다. 또한 이러한 반복 횟수는 헌팅턴 무도증이 발병하는 나이와 반비례한다. 소아 헌팅턴병(Juvenile Huntington's disease)의 경우에는 최대 200회 이상의 반복이 나타나는데, 이 때문에 일반 환자에 비해 증상이 조기에 나타난다.
헌팅턴 무도병은 우성유전자에 의해 유전되는데, 유전자를 물려받은 자손에 50%의 영향을 준다. 즉, 부모 중 한명이 헌팅턴 무도병에 걸린 경우는 각각의 아이가 상기 질병을 유전 받게 될 확률은 50%이다. 대부분 30~50대에 주로 발생하게 되지만 이러한 반복이 더 잦아지면 더 젊은 나이에도 발병할 수 있다. 질병 진단 후 수명은 15 내지 18년이며, 증상은 10~30년에 걸쳐 서서히 진행된다. 상기 질병의 특징 및 증상으로는 몸이 뒤틀리는 것 이외에도 환각(hallucination), 심각한 정서 변화, 우울증, 조울증, 경련, 불안전한 보행 및 치매 등과 같은 정신의 퇴보도 함께 이루어진다.
건강 국제기관(NIH)의 부서인, 신경유전질환 및 뇌졸증의 US 국제기관(NINDS)에 따르면, 현재로서는 헌팅턴 무도병을 정지 또는 회복시키는 방법은 존재하지 않는다.
헌팅턴 무도병의 치료제 개발을 위한 시도가 있었으나 현재, 헌팅턴 무도병의 진행을 치료 또는 정지시키기 위해 일반적으로 사용 가능한 약은 없다.
테트라베나진(Tetrabenazine)이 운동장애 관련 질병을 치료하는 약물로써, 예를 들어, 헌팅턴 무도병, 투렛 증후군(Tourette syndrome) 및 틱장애(tic disorders), 항정신병 약물, 지연성 운동 장애 등의 증상 치료제로 사용되고 있다.
그러나 테트라베나진(Tetrabenazine)은 우울증, 자살 충동, 비정상적 행동 변화 등을 포함하는 다양한 부작용을 보이고 있기 때문에 부작용이 문제될 가능성이 낮고, 장기적이고 효과적으로 치료할 수 있는 치료제의 개발이 계속적으로 요구되고 있다.
한편, 육미지황탕은 한의학에서 다양한 신장질환에 빈번히 사용되고 있는 처방으로, 숙지황(Rehrnanninae Rhizorma Preparat), 산약(Dioscorea bataisne Decaisne), 산수유(Cornusofficinalis Sieb), 택사(Alisma canaliculatum), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Paeonia suffruticosa Andrews)의 총 6종의 천연물로 구성된 복합처방이며, 한국에서 가장 빈번히 사용되는 천연물 복합 처방이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 육간의 조정능력에 관여된 진행형 신경퇴행성질환인 헌팅턴병에 효과가 있는 육미지황탕에 관한 연구개발을 수행하여 본 발명을 완성하였다.
Clinical Neuropharmacology, 2002, Vol.25, no.6, p. 300-302
본 발명의 목적은 숙지황(Rehrnanninae Rhizorma Preparat), 산약(Dioscorea bataisne Decaisne), 산수유(Cornusofficinalis Sieb), 택사(Alisma canaliculatum), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Paeonia suffruticosa Andrews)의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 헌팅턴병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 다른 목적은 본 발명의 숙지황(Rehrnanninae Rhizorma Preparat), 산약(Dioscorea bataisne Decaisne), 산수유(Cornusofficinalis Sieb), 택사(Alisma canaliculatum), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Paeonia suffruticosa Andrews)의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 헌팅턴병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 숙지황(Rehrnanninae Rhizorma Preparat), 산약(Dioscorea bataisne Decaisne), 산수유(Cornusofficinalis Sieb), 택사(Alisma canaliculatum), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Paeonia suffruticosa Andrews)의 복합 추출물인 육미지황탕의 효과에 대하여 연구하던 중, 상기 복합 추출물이 신경세포사멸을 방지하고, 항산화 작용 및 항염증작용을 나타내며, 운동기능장애의 완화에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 숙지황(Rehrnanninae Rhizorma Preparat), 산약(Dioscorea bataisne Decaisne), 산수유(Cornusofficinalis Sieb), 택사(Alisma canaliculatum), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Paeonia suffruticosa Andrews)의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 헌팅턴병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 운동기능장애의 예방에 현저한 효과를 보이며 줄무늬체 신경세포사멸의 억제 효과가 뛰어나므로 헌팅턴병에 의한 운동기능장애의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 헌팅턴병의 예방 또는 치료는 헌팅턴병에 의한 운동기능장애의 예방 또는 치료일 수 있다.
또한 본 발명의 더 바람직한 일 실시양태에서, 헌팅턴병은 헌팅턴 무도병(huntington's chorea)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 무도병은 신체의 각 부의 근육에 불수의적으로 불규칙한 운동이 발생하는 질환을 의미한다.
본 발명에서, 상기 숙지황(Rehrnanninae Rhizorma Preparat), 산약(Dioscorea bataisne Decaisne), 산수유(Cornusofficinalis Sieb), 택사(Alisma canaliculatum), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Paeonia suffruticosa Andrews)의 복합 추출물은 한방에서 사용되는 육미지황탕에 해당할 수 있다.
본 발명의 복합 추출물의 제조에 있어서, 추출은 환류 추출, 진탕 추출, Soxhlet 추출, 열수 추출 또는 초음파 추출 방법을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 추출온도는 40 내지 100 ℃인 것이 바람직하다. 또한, 추출시간은 1 내지 8시간, 바람직하게는 1 내지 4시간 일 수 있으며, 추출회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하다.
본 발명의 복합 추출물의 추출에 사용되는 추출용매는 물, 알코올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 메틸 아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출된 것일 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 더 바람직하게는 증류수 일 수 있다.
본 발명에서, 상기 추출과정을 거친 추출액 또는 이를 분획한 분획물은 이후, 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매가 제거될 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 예를 들어, 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있고, 상기 건조는 예를 들어, 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조법으로 수행할 수 있다. 상기 건조된 추출물은 분말형태로 사용하거나 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이드, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필레글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 무도병의 운동기능장애 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 숙지황(Rehrnanninae Rhizorma Preparat), 산약(Dioscorea bataisne Decaisne), 산수유(Cornusofficinalis Sieb), 택사(Alisma canaliculatum), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Paeonia suffruticosa Andrews)의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 헌팅턴병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 복합 추출물은 앞서 기술한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 운동기능장애의 예방에 현저한 효과를 보이며 줄무늬체 신경세포사멸의 억제 효과가 뛰어나므로 헌팅턴병에 의한의 운동기능장애의 예방 또는 개선에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 헌팅턴병은 헌팅턴 무도병(huntington's chorea)일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 숙지황(Rehrnanninae Rhizorma Preparat), 산약(Dioscorea bataisne Decaisne), 산수유(Cornusofficinalis Sieb), 택사(Alisma canaliculatum), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Paeonia suffruticosa Andrews)의 복합 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서, 복합 추출물의 함량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 복합 추출물은 식품의 총중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%로 첨가할 수 있다.
본 발명에서, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 음료, 껌, 비타민 복합제, 드링크제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 건강기능음료일 수 있으며, 상기 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트릴톨 등의 당알콜이다. 또한, 상술한 것 이외의 향미제(사카린, 아스파르탐 등)을 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 신경세포 사멸 억제에 효과가 있고, 항산화 및 항염증 효과가 우수하며, 운동기능장애에 치료 효과가 있으므로, 헌팅턴병의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델 유도 및 본 발명의 복합 추출물의 투여를 나타낸 것이다.
도 2는 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 운동기능장애에 대한 본 발명의 복합 추출물의 예방 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 운동기능장애에 대한 본 발명의 복합 추출물의 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 신경세포사멸에 대한 본 발명의 복합 추출물의 보호 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 신경세포사멸에 대한 본 발명의 복합 추출물의 항염증 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 본 발명의 복합 추출물의 NF-kB와 MAPKs 신호기전의 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 본 발명의 복합 추출물의 항산화 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 운동기능장애에 대한 본 발명의 복합 추출물의 예방 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 운동기능장애에 대한 본 발명의 복합 추출물의 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 신경세포사멸에 대한 본 발명의 복합 추출물의 보호 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 신경세포사멸에 대한 본 발명의 복합 추출물의 항염증 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 본 발명의 복합 추출물의 NF-kB와 MAPKs 신호기전의 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 3-NPA에 의한 헌팅턴병 동물모델에서 본 발명의 복합 추출물의 항산화 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
실시예
1. 복합 추출물의 제조
숙지황, 산약, 산수유, 택사, 백복령 및 목단피를 4:2:2:1.5:1.5:1.5의 비율로 하여 총 250 g을 사용하였다. 약제를 환류추출기에 증류수 2.5 L와 함께 넣고, 1.5시간 동안 방치한 다음에 가열하여 탕액이 끓기 시작하는 시점부터 1.5시간 동안 더 가열하였다. 추출액을 여과지로 감압하여 여과한 후, 여과액을 진공감압농축기를 사용하여 농축액을 만든 다음 동결건조기를 이용하여 분말시료로 조제하였다.
실시예
2. 3-
NPA를
이용한
헌팅턴병
동물모델 유도
본 발명의 복합 추출물의 헌팅턴병에 대한 알아보기 위하여 3-NPA를 투여하여 헌팅턴병 동물모델을 제조하였다. 출생 후 8-9주령의 수컷 C57BL/6 생쥐((주) 나라바이오텍, 평택)를 준비하여 일주일동안 안정시킨 다음에, 정상대조군(3-NPA와 본 발명의 복합 추출물 대신 생리식염수 투여한 군), 3-NPA 투여군(3-NPS를 12시간 간격으로 4회 복강 투여한 군(1-2회는 60 mg/kg, 2-3회는 80 mg/kg 투여)), 본 발명의 복합 추출물 투여군(3-NPA를 투여하기 1시간 전 구강 투여한 군(8.75, 17.5,35 mg/kg)), 본 발명의 복합 추출물 단독투여군(3-NPA 대신 생리식염수와 본 발명의 복합 추출물 (35 mg/kg 투여한 군)으로 나누었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 복합 추출물의 투여시점에 따라 전투여(Pre-treatment; 3-NPA를 처음으로 투여하기 5일 전부터 매일 1회씩 투여), 동시투여(Co-treatment; 3-NPA를 처음으로 투여하기 1시간 전부터 매일 1회씩 투여), 온셋투여(Onset-treatment; 3-NPA에 의해 신경학적인 행동변화가 나타나기 시작하는 시점인 3차 투여 1시간 전부터 매일 1회씩 투여) 및 진행투여(Progression-treatment; 3-NPA에 의해 신경학적인 행동변화가 뚜렷한 3차 투여 1시간 전부터 매일 1회씩 부여) 4가지로 나누었다.
실시예
3. 3-
NPA에
의한
헌팅턴병
모델에서
운동기능장애에 대한 예방 및
치료 효과 확인
3-NPA에 의한 운동기능장애에 대한 본 발명의 복합 추출물의 예방 효과를 확인하였다. 상기 실시예 2에서 제조된 동물 모델을 이용하여 전투여군과 3-NPA군의 24시간 후에 신경학적 행동, 체중변화, 생존율 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 3-NPA군에 비하여 전투여군에서 운동기능장애의 정도는 농도 의존적으로 감소하였고, 체중은 3-NPA군에서 정상군에 비하여 감소하였으나 본 발명의 복합 추출물 투여군에서 유의하게 증가하지는 않았다. 생존율은 3-NPA군에서는 50%였으나 본 발명의 복합 추출물 8.75, 17.5 및 35.0 mg/kg 전투여군에서 50%, 70% 및 80%였다. 이러한 결과로 본 발명의 복합 추출물의 전투여는 3-NPA에 의한 운동기능장애를 예방할 수 있다는 것을 확인하였다.
또한 운동기능장애에 대한 본 발명의 복합 추출물 (30.0 mg/kg)의 투여시기별 효능을 확인하기 위하여 상기 실시예 2에서 제조된 동물 모델의 전투여, 동시투여, 온셋투여 및 진행투여를 실시하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 운동기능장애 정도는 3-NPA군에 비하여 본 발명의 복합 추출물의 전투여, 동시투여 및 온셋투여에서 완화되었고 생존율은 3-NPA군에 비하여 전투여군에서 유의하게 증가하였다.
실시예
4. 3-
NPA에
의한
헌팅턴병
모델에서
신경세포사멸에 대한 본 발명의
복합 추출물의 보호 효능 확인
3-NPA에 의한 운동기능장애에 대한 유의한 효과가 이를 담당하는 뇌의 부위인 줄무늬체(striatum; 선조체)의 신경세포사멸의 보호 효과와 관련이 있는지를 확인하였다.
조직은 3-NPA를 마지막으로 투여한 후 24시간 후에 줄무늬체를 포함하는 동결절단 표본을 사용하여 cresyl violet 염색을 실시하였다.
조직은 3-NPA를 마지막(4차)으로 투여하고 24시간 후에 관류고정하여 뇌를 적출하여 4% 파라포름알데하이드(PFA, paraformaldehyde)에 담가 4℃에서 하루 정도 고정시킨 다음 30% 수크로스(sucrose)로 바꾸어 4 ℃에서 3일 이상 기간 동안 보관하여 동결손상을 방지하였다. 동결절편기를 이용하여 뇌를 30 ㎛ 두께로 잘라 동결 절편을 제작하여 cresyl violet 염색과 신경세포의 마커인 NeuN (Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 미세아교세포의 마커인 Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1, WAKO, 일본)에 대한 항체를 이용하여 형광염색을 시행하여 세포손상 정도를 확인하였다.
형광염색은 절편을 블로킹 솔루션[200 ㎍ 소혈청알부민(BSA, Bovin serum albumin, sigma, 미국), 500 ㎕ FBS (Fetal bovine serum, Gibco, 독일), 500 ㎕ NFS (Normal goat serum, Vector, 미국) 및 10 ㎕ Triton X-100 (sigma, 미국)을 PBX에 넣어 10ML을 만듦]을 넣은 플레이트에 담가 1시간 반응시켰다. 그 다음 PBX로 수세한 후 1차 항체[Noun (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, 미국), Mba-1 (1:1,000, WALKS, 일본)]를 블로킹 솔루션에 희석한 용액으로 교체하고 12시간 반응시켰다. 그 다음 PBX로 수세한 후 2차 항체(Vector, 미국)를 PBX에 1:200으로 희석한 용액으로 교체하고 1시간 반응한 후 PBX로 수세하였다. 마지막으로 마운팅한 후 컨포칼(confocal) 장비로 세포사멸 및 미세아교세포의 활성화 정도를 확인하였다.
cresyl violet은 절편을 슬라이드에 올려 건조시킨 후 cresyl violet 염색용액에 5분간 담가 신경세포의 핵을 염색시킨 다음 70%, 80%, 95% 및 100% 에탄올에 순서대로 1분간 담그고 마지막으로 자일렌(xylene)에 3분간 담근 후 커버 그라스를 덮었다. 이 후 세포손상 정도를 측정하기 위해서 NIH Image J 프로그램을 이용하여 정량하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 3-NPA군에서 줄무늬체의 신경세포사멸(염색되지 않은 부분)은 유의하게 증가하였으나 본 발명의 복합 추출물을 전투여한 군에서는 농도 의존적으로 신경세포의 사멸정도가 감소하였고(도 4A-E), 신경세포사멸이 관찰된 생쥐는 3-NPA군에서 60%였고 본 발명의 복합 추출물 8.75, 17.5 및 35.0 mg/kg 전투여군에서 각 각 60%, 42.8% 및 37.5%였으며(도 4P), 줄무늬체의 신경세포사멸 부위의 면적은 3-NPA군에서 전제 줄무늬 면적의 80.3 ± 3.4%였고 본 발명의 복합 추출물 8.75, 17.5 및 35.0 mg/kg의 전투여군에서 74.8 ± 4.3%, 61.5 ± 3.7% 및 48.5 ± 3.7%였다. 신경세포의 마커인 NeuN에 대한 면역형광염색의 정도(도 4F-J)와 단백질 발현 정도(도4 R, S) 및 줄무늬체 신경세포의 마커인 β-lll-tubulin에 대한 단백질 발현 정도(도 4R, T)는 cresy violet의 결과와 일치하였다. 또한, 퇴화된 신경세포의 마커인 Fluoro Jade C에 대한 형광반응정도(도 4K-O)와 아포토시스가 일어난 세포의 마커인 cleaved caspase-3(도 4R, U)의 단백질 발현의 정도도 cresy violet의 결과와 일치하였다.
실시예
5. 3-
NPA에
의한
헌팅턴병
모델에서
신경세포사멸에 대한 본 발명의
복합 추출물의 항염증 효과 확인
3-NPA에 의한 신경세포사멸과 관련한 신경염증반응에 대한 본 발명의 복합 추출물의 억제 효능을 확인하였다. 3-NPA를 마지막으로 투여한 후 24시간 후에 줄무늬체를 취하여 미세아교세포(microglia)의 마커인 lba-1에 대한 면역염색과 웨스턴블롯법으로 분석하였다. 또한, 활성화된 미세아교세포는 염증매개인자를 발현하므로 이들의 발현정도를 실시간 PCR법과 웨스턴블롯법으로 분석하였다.
면역염색은 실시예 4에 기재한 동일한 방법에 따라 수행하였고, 실시간 PCR 분석은 조직에 3-NPA를 마지막으로 투여하고 12시간 후에 쥐의 경추를 탈골하고 뇌를 적출한 후 선조체(striatum)만 따로 적출하여 동결 보관하였다. 조직은 트리졸(Trizol, Invitrogen, 미국) 1 ml을 넣고 분쇄기로 조직을 갈고 원심분리하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 RT-PCR kit(Invitrogen, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 cDNA 4 ul와 하기 표 1에 기재된 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 iNOS와 COX-2 그리고 항산화기작인 Keap1/Nrf2 기작과 관련한 Keap1, Nrf2, HO-1, GCLs 및 NQO1 프라이머(Bionics, 미국)를 각각 1 ul와 2x SYBR GREEN(Applied Biosystems, 미국) 5 ul를 이용하여 실시간 PCR 장비 (Applied Biosystems 7500)를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용한 primer에 대한 정보는 표1과 같다.
[표 1]
웨스턴블롯 분석법은 조직에 3-NPA를 마지막으로 투여하고 24시간 후에 생쥐의 경추를 탈골하고 뇌를 적출한 후 선조체(striatum)만 따로 적출하여 동결 보관하였다. 조직은 단백질 용해 완충액(protein lysis buffer; 10 mM 트리스, 0.5 mM EDTA, 0.25 M 수크로스) 200 ul를 넣고 분쇄기를 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 소혈청알부민을 사용한 Bradford (Bio-rad, 미국) 방법을 이용하여 각 개체의 단백질을 정량한 뒤 단백질 30 ㎍은 10% SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리하여 PVDF(polyvinylidene difluoride)멤브레인(membrane, Gendepot, 영국)으로 이동시켰다. PVDF 멤브레인은 5% 탈지유(skimmed milk, BD, 미국)에서 1시간 동안 블로킹시켰다. TBST로 씻은 후 1차 항체[NeuN (1:1000, Santacruz), β-III-tubulin (1:500, sigma), cleaved caspase-3 (1:500, Cell Signaling Technology, 미국), Iba-1 (1:1,000, 일본), iNOS (inducible nitric oxide synthases, 1:200, Santa Cruz Biotechnology), COX-2 (cyclooxygenase-2, 1:500, BD Biosciences, 미국), Nrf2 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), HO-1 (heme oxygenase-1, 1:200, Enzo Life Sciences, Farmingdale, 미국), p-JNK/p-ERK/p-p38 (1:1,000; Cell Signaling Technology), NF-κB/p65, p-IκBα (1:1,000; Santa Cruz Biotechnology)]를 3% 탈지유에 희석시켜 4℃에서 하루 동안 반응시킨 후 TBST로 10분씩 3회 씻고 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응 후 TBST에 씻은 뒤 ECL system(Santacruz, 미국)로 밴드를 확인하였다. 단백질의 확인 및 정량 분석은 이미지 장비 ChemiDoc XRS+(Bio-Rad)를 이용하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, lba-1의 형광면역반응의 정도(도 5A-D)와 단백질발현의 정도(도 5E, F)는 3-NPA군에서 증가하였으나 본 발명의 복합 추출물 (35.0 mg/kg) 전투여군에서 감소하였다. 또한, TNF-a, IL-6, IL-1β, iNOS 및 COX-2의 mRNA의 발현정도는 3-NPA군에서 증가하였으나 본 발명의 복합 추출물 (35.0 mg/kg) 전투여군에서 감소하였으며(도 5G-K), iNOS와 COX-2의 단백질발현 정도는 3-NPA군에서 증가하였으나 본 발명의 복합 추출물 (35.0 mg/kg) 전투여군에서 감소하였다(도 5M-N).
또한, 이러한 항염증작용에 관여하는 신호기전을 웨스턴블롯분석으로 분석하였다. 웨스턴블롯분석은 상기 기재한 동일한 방법에 따라 수행하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, NF-kB/65, p-lkBa, p-JNK, P-ERK 및 p-p38의 단백질 발현 정도는 3-NPA군에서 증가하였으나, 본 발명의 복합 추출물 (35.0 mg/kg) 전투여군에서 감소하였다).
실시예
6. 3-
NPA에
의한
헌팅턴병
모델에서
신경세포사멸에 대한 본 발명의
복합 추출물의 항산화 효과 확인
3-NPA에 의한 신경세포사멸에 대한 본 발명의 복합 추출물의 신경보호효능에 대한 분자기전으로 항산화 효과를 확인하였다. 3-NPA를 마지막으로 투여한 후 12시간 후 줄무늬체를 취하여 Nrf2 기전과 간련한 분자에 대한 실시간 PCR 분석을 시행하였다. 또한, 3-NPA를 마지막으로 투여한 후 24시간 후에 줄무늬체를 취하여 Nrf2와 HO-1에 대한 웨스턴블롯분석으로 분석하였다. 웨스턴블롯분석과 실시간 PCR 분석은 실시예 5에 기재한 동일한 방법에 따라 수행하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, Kea1의 mRNA의 발현은 3-NPA군에서 증가하였으나 본 발명의 복합 추출물 (35.0 mg/kg) 전투여군에서 감소하였다. 반면에, Nrf2, HO-1, GCLs 및 NQO-1의 mRNA의 발현정도는 3-NPA군에서 증가하였으며 본 발명의 복합 추출물 (35.0 mg/kg) 전투여군에서 더 증가하였다(도 7A-E). 또한 Nrf2와 HO-1의 단백질발현의 정도는 3-NPA군에서 증가하였으나 본 발명의 복합 추출물 (35.0 mg/kg) 전투여군에서 더 증가하였다(도 7F-H).
모든 결과는 SPSS 21 버전을 이용하여 분석하였으며, 실험결과는 mean ± standard deviation(평균±표준편차)의 값으로 표시하였다. 통계적 유의성 검증은 ANOVA (일원배치 분산분석)를 이용하여 분석 후 Tukey post hoc로 사후분석 하였고, 유의확률(p-value) 값은 p<0.05 및 p<0.01 미만인 경우에만 인정하였다.
<110> UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION GROUP OF KYUNG HEE UNIVERSITY
<120> A composition for preventing or treating huntington's disease
<130> P16-116-KHU
<160> 22
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer of COX-2
<400> 1
cagtatcaga accgcattgc c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer of COX-2
<400> 2
gagcaagtcc gtgttcaagg a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer of GAPDH
<400> 3
aggtcatccc agagctgaac g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer of GAPDH
<400> 4
caccctgttg ctgtagccgt at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer of GCLs
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer of GCLs
<400> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer of HO-1
<400> 7
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer of HO-1
<400> 8
cctggagcag gacatggc 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer of IL-1 beta
<400> 9
ttgtggctgt ggagaagctg t 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
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tccatccagt tgccttcttg g 21
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<220>
<223> Antisense primer of IL-6
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ccacgatttc ccagagaaca tg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer of iNOS
<400> 13
ggcaaaccca aggtctacgt t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer of iNOS
<400> 14
tcgctcaagt tcagcttggt 20
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<220>
<223> sense primer of Keap1
<400> 15
gatcggctgc actgaactg 19
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
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ggactcgcag cgtacgtt 18
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer of NQO1
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cattctgaaa ggctggtttg a 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer of NQO1
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ctagctttga tctggttgtc ag 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> sense primer of Nrf2
<400> 19
tctcctcgct ggaaaaagaa 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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aatgtgctgg ctgtgcttta 20
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<211> 21
<212> DNA
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<223> sense primer of TNF-alpha
<400> 21
agcaaaccac caagtggagg a 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer of TNF-alpha
<400> 22
gctggcacca ctagttggtt gt 22
Claims (7)
- 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산약(Dioscoreae Radix), 산수유(Corni Fructus), 택사(Alismatis Rhizoma), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Moutan Radicis Cortex) 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 헌팅턴병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 헌팅턴병은 줄무늬체(striatum)에서 신경세포사멸 증가, 미세아교세포 (microglia) 활성화, 염증매개인자의 발현 증가 및 운동기능장애로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 나타내는 것인, 헌팅턴병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 헌팅턴병의 예방 또는 치료는 헌팅턴병에 의한 운동기능장애의 예방 또는 치료인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 헌팅턴병은 헌팅턴 무도병인 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 C1-C4 알코올을 추출용매로 하여 추출된 것인 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 물을 추출용매로 하여 추출된 것인 약학적 조성물.
- 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산약(Dioscoreae Radix), 산수유(Corni Fructus), 택사(Alismatis Rhizoma), 백복령(Poriacocos Wolf) 및 목단피(Moutan Radicis Cortex) 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 헌팅턴병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
상기 헌팅턴병은 줄무늬체(striatum)에서 신경세포사멸 증가, 미세아교세포 (microglia) 활성화, 염증매개인자의 발현 증가 및 운동기능장애로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 나타내는 것인, 헌팅턴병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물. - 제6항에 있어서, 상기 헌팅턴병은 헌팅턴 무도병인 건강기능식품 조성물.
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-
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