KR102208665B1

KR102208665B1 - 산사 추출물을 포함하는 근육 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102208665B1
Application number: KR1020190039450A
Authority: KR
Inventors: 홍금표; 이종록; 박문기; 정대화; 장미희; 최덕호
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2021-01-28
Also published as: KR20200117404A

Abstract

본 발명은 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 산사 추출물은 마이오스타틴의 발현량 감소 또는 젖산의 축적을 억제하는 효과가 우수하여, 이를 근육 질환의 치료제 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있다.　

Description

산사 추출물을 포함하는 근육 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 그의 용도 {COMPOSITION FOR PREVENTING, TREATING OR IMPROVING MUSCULAR FUNCTIONS COMPRISING EXTRACT OF CRATAEGUS PINNATIFIDA AND USE THEREOF}

본 발명은 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

운동 시 유발되는 피로의 주요 원인으로는 체내 저장된 에너지원의 부족, 신경전달 자극장애 및 부산물 축적 등이 대표적인 요인으로 간주되어 왔으며 이러한 요인들이 운동 능력의 제한적 요인으로 작용하여 근 피로를 유도하게 된다. 특히, 부산물 축적 현상은 근육 내 산성화를 유도하여 에너지 대사의 원활한 수행을 방해하는데 대표적인 대사 부산물로 젖산 및 암모니아가 있으며, 그 중에서도 젖산은 운동에 의한 신체 변화의 중요한 변수 중 하나로 운동의 강도와 유형 및 지속 시간에 따라 높은 연관성을 나타내어 젖산이 축적될수록 근 피로도에 기여하게 된다. 또한, 운동의 강도가 증가하면 체내에서는 근육의 분해(glycogenolysis)와 해당작용(glycolysis)이 빨라지고 이에 의해 혈액 내 젖산과 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)의 농도가 증가한다. 젖산탈수소효소는 대부분 조직이나 장기 등에 많이 분포하며 특히 산소의 소모가 많은 근육에 가장 많이 분포하고 있다. 또한, 운동의 강도에 비례하여 젖산탈수소효소의 농도가 증가하며, 젖산은 운동 후 근 통증 및 근 피로를 유발하는 물질로 젖산탈수소효소에 의해 피루브산(pyruvic acid)으로 전환된다. 상기와 같은 부산물 축적은 근 피로에 영향을 주고, 근 피로는 운동 능력의 감소를 유발하기 때문에 근 피로를 방지하여 운동 능력을 향상시키는 것이 운동 기량을 향상시키는 궁극적인 목표에 해당 한다.

또한 골격근 세포는 에너지 생산 및 생체 에너지 조절의 핵심 기관이며 마이오카인(myokine)은 근 수축 시 골격근에서 발현되는 활성 인자들이다. 대표적으로 마이오스타틴(myostatin, Mstn), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6), 아이리신(irisin)등이 있는데, 특히, 마이오스타틴은 형질전환 생장 인자 베타(transforming growth factor beta, TGF- β)군에 속하는 유전자로서 근 세포에 직접적으로 작용하여 근육 생성 및 근 세포 분화를 억제하며, 운동시 마이오스타틴의 발현량이 감소하여 근육의 크기가 증가한다. 여러 선행연구가 운동 강도에 따라 다양한 기전으로 마이오카인의 발현량이 증가 및 감소하며, 고강도 유산소 운동 시 급격히 증가하는 젖산과 마이오카인 발현량이 관련이 있음을 나타내고 있다.

한편, 산사(Crataegus pinnatifida)는 장미과에 속한 산사나무 및 동속식물의 성숙한 과실을 말린 것으로 약리작용으로는 강심, 혈액순환개선 및 혈압강하 등이 있으며, 비위를 따뜻하게 하여 소화를 촉진하고 복통, 구토, 설사, 위산과다,만성 장염 등에 사용한다. 또한 본초강목에 따르면 주치증상으로 어혈과 기결을 없애고 혈행을 돕는다고 하여 혈분에 작용하여 혈의 흐름을 돕고 어혈을 없애 줄 뿐 아니라 폴리페놀 화합물을 다량 함유하여 항산화 활성을 가지고 있다. 그러나, 아직까지 산사 추출물에 대한 근육 질환 예방 또는 치료 효과에 대한 연구나 발명에 대한 보고는 전무한 실정이다.

이에 본 발명자들은 산사 추출물이 젖산 축적 억제 효과 및 마이오카인 발현 억제 효과를 확인함으로써, 상기 산사 추출물이 근육 질환 예방 또는 치료 효과에 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

삭제

대한민국 등록특허 제10-1194974호 대한민국 공개특허 제10-2018-0138178호

본 발명의 목적은 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 산사 추출물은 산사를 열수 추출하는 단계, 여과하여 산사 여과액을 수득하는 단계, 상기 산사 여과액을 동결 건조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 근육질환은 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육퇴화, 근경직증, 근디스트로피, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 및 근육감소증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.　

또한, 본 발명은 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료를 위한 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 산사 추출물은 마이오스타틴의 발현량 감소 또는 젖산의 축적을 억제하는 효과가 우수하여, 이를 근육 질환의 예방 또는 치료용도로 유용하게 사용할 수 있다.　

도 1은 본 발명의 산사 추출물을 처리한 세포의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 2은 본 발명의 산사 추출물을 처리한 경우, 세포의 형태를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 산사 추출물을 처리한 경우, 젖산탈수소효소 분석결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 산사 추출물의웨스턴블롯팅 결과를 나타낸 사진이다.　

이하에서 본 발명에 대하여 첨부된 도면에 도시된 실시 예에 따라 구체적으로 설명하기는 하나, 본 발명이 도시된 실시 예만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 및 그 밖에 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.

본 발명은 근육 질환 예방, 치료 및 개선을 위해 사용되는 조성물로 산사 추출물을 포함한다. 이하, 본 발명의 조성물인 산사 및 산사 추출물을 수득하는 방법에 대하여 상세하게 설명한다.

상기 산사 추출물은 일 예로, 산사의 총 부피의 5배 내지 15배(V/W), 바람직하게는 10배(V/W) 부피의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 물을 50~150℃바람직하게는 100℃의 온도에서 1시간~4시간, 바람직하게는 2시간~3시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출, 바람직하게는 열수추출방법으로 수득될 수 있다.

다른 예로, 산사의 총 중량의 5배 내지 15배(V/W), 바람직하게는 10배(V/W) 부피의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 에탄올 또는 70% 에탄올을 실온(20~30℃)에서 36시간~60시간, 바람직하게는 48시간 동안 침지, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 바람직하게는 침지방법으로 수득될 수 있다.

　본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획한 분획물도 포함할 수 있다. 즉, 산사 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 수득된 것뿐만 아니라 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 수득 되는 것도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수득 된 분획, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 수득 된 분획도 본 발명의 산사 추출물에 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 산사 추출물은 감압 증류, 농축, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.　

본 명세서에서 "유효성분으로 포함하는"이란 하기 후술할 산사 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 천연식물재료인 산사로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 산사 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.　

본 발명의 조성물은 상기한 산사 추출물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 제조될 수 있다. 상기한 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 조사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만나톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 칼슘 포스페이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다.　

경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.　

비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제를 포함하며, 비수용성 용제 또는 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함할 수 있다.　

본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여, 산사 추출물을 0.01중량% 내지 99.9중량%로 포함할 수 있으며, 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.　

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여, 예를 들면, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하게 적용될 수 있다. 본 발명의 산사 추출물의 일일 투여량은 약 0.1mg/kg 내지 1000mg/kg일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 근육 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 근육 질환 완화, 예방 또는 치료를 요하는 인간을 포함하는 포유류에 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로서 근육 질환을 완화, 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다.　

본 발명의 조성물은 근육 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품으로 제공될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는, 예를 들어, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액체의 형태일 수 있으며, 이들의 형태는 약학 조성물의 제조방법과 동일하거나, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 제조될 수 있다.　

예를 들면, 산사 추출물이 근육 질환의 예방 및 개선 목적으로 건강기능식품으로 사용될 경우, 상기 추출물의 양은 일반적으로 건강기능식품 총 중량에 대하여, 0.01 내지 99.9중량%으로 가할 수 있다.　

　다른 예로, 산사 추출물이 근육 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 경우, 상기 추출물의 양은 일반적으로 식품 총 중량에 대하여, 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 음료는 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g으로 가할 수 있다.　

본 발명의 음료는 산사 추출물을 필수 성분으로 포함하는 것뿐만 아니라 음료 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 천연 탄수화물 또는 여러 가지 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 및 폴리사카라이드, 예를 들어 텍스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 향미제로는 타우마린, 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 　

상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 10ml당 일반적으로 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다.　

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 도 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 작용 효과를 방해하지 않는 범위 내에서 적절하게 첨가될 수 있다.　

　본 발명에서 정의되는 근육 질환은 근육 소모 또는 근육 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생될 수 있으며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행 등을 포함할 수 있다. 이와 관련된 질환의 예로는 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육퇴화, 근무력증, 악액질 및 근육감소증 등이 있을 수 있다. 또한, 본 발명에서 근은 심줄, 근육, 건을 포괄적으로 지칭하고, 근 기능은 근육의 수축에 의해 힘을 발휘하는 능력을 의미하며, 근육이 저항을 이겨내기 위하여 최대한으로 수축력을 발휘할 수 있는 능력인 근력, 근육이 주어진 중량에 대해 얼마나 오랫동안 또는 얼마나 여러 번 수축과 이완을 반복할 수 있는지를 나타내는 능력인 근 지구력, 단시간 내에 강한 힘을 발휘할 수 있는 능력인 순발력을 포함할 수 있다. 이러한 근 기능은 근육량에 비례하며, 근 기능 치료라 함은 근 기능을 향상시키는 것을 말할 수 있다.　

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

실시예 1: 산사 추출물 제조 및 특성 확인

1.1 산사 추출물의 제조

산사는 대원약업사(Daegu, Korea)에서 제공받아 20g을 열수 추출한 후 300mm filter paper(Toyo Roshi Kaisha Ltd, Tokyo, Japan)로 여과 후 동결건조 하여 산사 추출물(Crataegus pinnatifida extract, CPE)을 얻었다. 이 때 추출물의 수율은 34.5%였다.

1.2 산사 추출물의 항산화 효과 및 페놀 화합물 함량 확인

본 발명의 산사 추출물의 항산화능을 확인하기 위해, 항산화 물질과 반응하여 음이온 라디칼이 소거되는 DPPH와 양이온 라디칼이 소거되는 ABTS를 이용하였다. DPPH 및 ABTS의 라디칼 소거능을 이용한 항산화 실험의 경우 각각 Blois 방법(Blois MS 1958) 및 Re 방법(Re et al 1999)을 응용하여 측정하였다. DPPH의 경우 0.15 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액을 시료와 암반응 시킨 후 흡광도를 측정하였고, ABTS의 경우 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 12시간 동안 암소에서 반응시켜 얻은 ABTS 용액을 시료와 암반응 시킨 후 흡광도를 측정하였다.

또한, 폴리페놀 함량 측정 실험의 경우 Folin-Denis 방법(Folin & Denis 1912)을 일부 변형하여 측정하였다. 실험에 사용한 시료인 CPE의 농도는 1 mg/ml으로 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 타닌산(Tannic acid)을 사용하였고, 자외선 분광 광도계(UV spectrophotometer (TECAN, Switzerland))를 이용하여 흡광도를 측정한 다음, 라디칼 소거(%)와 함량(ug/ml)로 나타내었다 이의 결과를 표 1에 나타내었다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, DPPH의 경우, 양성대조군인 아스코르브산(ascorbic acid)의 항산화능 45.75 %와 비교하여 47.80 %로 항산화 활성이 있음을 확인하였다.

또한, ABTS의 경우, 양성대조군인 아스코르브산(ascorbic acid)에 비해 75.30%로 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 총 페놀 함량은 타닌산(Tannic acid)을 표준물질로 하여 표준 곡선을 기준으로 실험한 결과 CPE는 247.96 ug Tannin/g로 높은 폴리페놀 함량을 가지는 것을 확인하였다.

(1 mg/ml)	DPPH 소거활성 (%)	ABTS 소거활성 (%)	총 페놀 화합물 함량 (ug Tannin/g)
CPE	47.80±1.02	75.30±0.04	247.96±2.11

1.3 산사 추출물의 세포 독성 확인

American Type Culture Collection (ATCC; CRL-1772, Manassas, VA, USA)에서 구입한 골격근 세포주인 C2C12는 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였고, 분화 전 세포 증식기에는 열처리한 10% FBS (fetal bovine serum)과 100 units/mL 페니실린(penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 혼합한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 사용하여 T-75 Flask에 60% 에 도달하도록 1 : 4 비율로 3~4일간 계대 배양하였다. 계대 후 myoblast가 90% confluence에 도달하면 FBS를 2% Horse serum (HS)으로 변경하여 6일간 배양액을 교체하며 분화를 유도하였다. 이후 실험 목적에 따라 최대 24시간으로 약물을 처치하였다.

이 후, 세포 생존율을 측정하기 위해 C2C12 세포를 24 well plate에 1×10⁵ cells/well 농도로 0.5 mL/well로 분주한 뒤 24시간 동안 배양하였고, 최종농도 (0, 10, 30, 100, 300 μg/mL)의 CPE를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이 후 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (0.5 mg/mL)를 500 μL씩 각 well에 처리하고 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켜, 환원된 formazan이 떨어져 나가지 않도록 배지를 제거하고 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 처리하여 용해시킨 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이의 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 산사 추출물의 농도에 상관없이 세포독성은 나타나지 않음을 확인하였다.

실시예 2: 본 발명의 산사 추출물의 근육분화 억제 효과 관찰

실시예 1.3과 같은 방법으로 배양된 C2C12 세포를 6일간 분화를 유도한 후 CPE를 10, 30, 100 μg/mL의 농도로 24시간 동안 약물을 처리하여 현미경(macroscope)으로 세포의 형태학적 현상을 확인하였다. 이의 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 농도가 높아질수록 근육분화가 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 3: 본 발명의 산사 추출물의 젖산탈수소효소 생성 억제 효과 확인

C2C12 세포에 6일간 분화를 유도한 후, 산사추출물을 10, 30, 100 μg/mL의 농도별로 처리한 후 단시간 내 4 mM의 l-lactic acid를 처리하여 젖산 축적을 유도하였다.

보다 구체적으로, 젖산탈수소효소를 측정하기 위하여, 200 mM Tris (pH.8) buffer와 50 mM Li-Lactate reagent 및 NAD/PMS/INT 솔루션을 각각 플레이트에 넣고 마지막으로 세포 용해물(cell lysates)를 넣은 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 산사 추출물은 농도 의존적으로 젖산탈수소효소 생성이 억제됨을 확인하였다.

실시예 4: 본 발명의 산사 추출물의 Mstn의 발현 억제 효과 확인

본 발명의 산사 추출물의 마이오카인(myokine) 중에 하나인 마이오스타틴(myostatin, Mstn)의 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1.3의 방법으로 배양한 C2C12 세포(10, 30, and 100 ㎍/mL의 산사 추출물을 24시간 간격으로 6일동안 처리한 후, 4 mM의 l-latic acid를 처리 함)를 PBS (phosphate buffered saline)로 세척하여, radio-immunoprecipitation buffer와 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo, Rockford, IL, USA)을 용해 완충액(lysis buffer)으로 용해하여 4 ℃에서 15,000 × g로 30분 동안 원심분리 후, 상층액을 취하여 전체 세포 용해물(whole cell lysates)으로 사용하였다.

상기 세포 용해물의 단백질 함량은 BCA protein assay (Thermo, Rockford, 1L, USA)에 따라 정량하였고, 기전확인을 위해 정량한 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동한 후 막에 단백질을 전이하여 1차 항체와 2차 항체를 반응시켰다. 항체와 반응시킨 막에 ECL detection reagent (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 감광하였다. 상기 면역블롯팅을 위하여, 항-GDF8 myostatin antibody (Mstn)는 Abcam (Cambridge, USA)에서 구입하였고, horseradish per-oxidase-conjugated goat anti-mouse IgG는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 anti-β-actin 항체 등 다른 시약들은 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다. 상기 면역블롯팅 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 단시간 내 젖산 축적 유도 시 대조군에 비해 마이오스타틴 발현량이 감소함을 확인할 수 있었으며, CPE에 4 mM의 l-lactic acid를 처치한 군에서는 CPE를 단독으로 처리한 군에 비해서는 마이오스타틴 발현량이 감소하였으나 4 mM l-lactic acid 단독군에 비해 증가함을 확인하였다.

Claims

산사(Crataegus pinnatifida) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 근육 질환은 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육퇴화, 근경직증, 근디스트로피, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 및 근육감소증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 산사 추출물은 산사를 열수 추출하는 단계; 여과하여 산사 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 산사 여과액을 동결 건조하는 단계를 포함하여 제조된 것인 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 산사 추출물은 마이오스타틴의 발현량을 감소시키며, 젖산의 축적을 억제하는 것을 특징으로 하는, 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
상기 근육 질환은 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육퇴화, 근경직증, 근디스트로피, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 및 근육감소증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 근육 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물로서,
상기 근육 질환은 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육퇴화, 근경직증, 근디스트로피, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 및 근육감소증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 근육 질환 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
제6항에 있어서,　상기 피부 외용제는 크림, 연고, 젤 및 첩부제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 형태인 근육 질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.