KR102056007B1 - 근원세포 분화 억제 조성물, 이를 이용한 근육 소모성 질환의 치료제 스크리닝 시스템 및 스크리닝 방법 - Google Patents

근원세포 분화 억제 조성물, 이를 이용한 근육 소모성 질환의 치료제 스크리닝 시스템 및 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 조성물은 근원세포의 분화를 억제하여 생체외(in vitro)에서 근육 소모성 질환 모델을 구현할 수 있어, 근육 소모성 질환 치료제의 스크리닝에 활용할 수 있다.
또한, 상기 조성물을 이용하여 분화가 억제된 세포에서 근육형성 및 재생, 근육 사멸 및 퇴화에 연관되어 있다고 알려진 TNF-α, WNT 신호 전달체계의 유전자를 상향 또는 하향조절함을 확인하였는바, 상기 신호 전달 체계를 조절하는 후보물질을 근육 소모성 질환 치료제 개발에 활용할 수 있다.

Description

근원세포 분화 억제 조성물, 이를 이용한 근육 소모성 질환의 치료제 스크리닝 시스템 및 스크리닝 방법{Compositions for inhibiting myogenic differentiation, drug screening system and screening methods for treating muscle wasting}
본 발명은 메타크릴화된 젤라틴과 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트)[poly {sodium-4-styrensulfonate}, PSS]이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔을 포함하는 근원세포(myoblast)의 분화 억제용 조성물, 상기 조성물을 이용하는 근육 소모성 질환의 치료제의 스크리닝 시스템 및 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
근육 소모성 질환은 노화와 함께 진행되는 근감소증(sarcopenia), 단백질 대사의 불균형이나 근육사용 감소에서 유발되는 근위축증(muscle atrophy), 기아, 소모성질환(암 등), 노화와 함께 진행되는 심위축증(acardiotrophy)등이 있다.
근육 소모성 질환의 치료방법으로는 크게 3가지를 들 수가 있다. 첫 번째는 운동이다. 운동은 단기적으로 골격근의 단백질 합성 능력을 증가시키며, 노인들의 근육의 힘이나 운동성을 증가시킨다고 보고되고 있다. 그러나 장기적 치료법으로는 부적절하다. 두 번째는 약물치료로서 테스토스테론(Testosterone) 또는 아나볼릭 스테로이드(anabolic steroid)의 사용이 가능하나 이는 여성에게는 남성화를 유도하며, 남성의 경우 전립선 증상(prostate symptoms) 등 부작용을 나타낸다. 다른 승인된 치료법으로 DHEA(dehydroepiandrosterone) 와 성장 호르몬이 있는데 SARMs(Selective Androgen Receptor Modulators)을 포함하는 부위에서 치료법으로 가능하다는 연구가 보고된 바 있다. 또한 식이요법이 치료법으로 알려져 있지만 영양평가에 의하면 영양실조나, 현대 식습관은 적당한 총체질량(total body mass)을 유지하기 위해 부적절하다.
최근에는 위성 세포를 분리하여 체외에서 분화시킨 후 체내에 도입시키는 줄기세포치료법(stem cell therapy)과 직접 체내의 위성 세포를 활성화하여 근육 분화(myogenesis)를 촉진시켜 근육을 유지하거나 강화시키는 방법이 근감소증과 같은 근육 소모성 질환을 치료할 수 있는 방법으로 대두되고 있다.
또한, 근육 재생 과정에서 위성 세포(satellite cells)는 중요한 요소이며, 이러한 과정은 위성 세포와 이의 환경[줄기 세포 니치(stem cell niche)]간 상호간섭(cross-talk)에 크게 의존한다. 니치에서 중요한 신호 매개체 중 하나는 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 성분으로, 세포의 구조 일체성을 제공하고 위성 세포의 활성화와 정지간 균형을 조절하는 성장 인자와 당단백질 같은 분자를 배치(localizing)하는 데 중요한 역할을 한다.
따라서 근육 소모성 질환을 치료하기 위해 보다 근본적이며 부작용이 없는 치료방법으로 근원세포를 분화하는 방법이 요구되고 있다. 이를 위해 근원세포의 분화를 조절하는 니치 미세환경 요소의 역할을 규명하고 이를 이용하여 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1587227호
본 발명의 하나의 목적은 메타크릴화된 젤라틴과 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트)[poly {sodium-4-styrensulfonate}, PSS]이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔을 포함하는 근원세포(myoblast)의 분화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 소모성 질환의 치료제의 스크리닝 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 메타크릴화된 젤라틴과 폴리 소디움-4-스티렌설포네이트(poly sodium-4-styrensulfonate, PSS)이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔에서 근원세포를 배양하는 단계, 후보물질을 처리하고 근원세포를 분화시키는 단계 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 근원세포의 분화 또는 근관세포(myotube)의 형성을 후보물질이 처리되지 않은 대조구 세포와 비교하는 단계를 포함하는, 근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하나의 양태로 메타크릴화된 젤라틴과 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트)[poly {sodium-4-styrensulfonate}, PSS]이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔을 포함하는 근원세포(myoblast)의 분화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 메타크릴화된 젤라틴과 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트)[poly {sodium-4-styrensulfonate}, PSS]이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔을 포함한다. 상기 메타크릴화된 젤라틴과 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트)[poly {sodium-4-styrensulfonate}, PSS]이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔은 근원세포(myoblast)의 분화를 억제한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “젤라틴”이란 동물의 뼈, 가죽, 힘줄, 연골 등을 구성하는 천연 고분자 단백질인 콜라겐(교원질)을 가수분해하여 얻어지는 유도 단백질이다. 본 발명에서 젤라틴은 A 타입(type) 또는 B 타입(type)일 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 다양한 젤 강도(gel strength), 점도(viscosity)를 가질 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 천연물질로부터 분리 또는 합성될 수 있으며, 그 원료의 종류는 한정되지 않으나, 예를 들면 포유동물 또는 어류 등의 가죽, 뼈 껍질 등으로부터 분리된 콜라겐을 가수분해하여 생산할 수 있다.
상기 메타크릴화 젤라틴은 젤라틴의 일차 아민기를 관능화하는 무수 메타크릴산(Methacrylic anhydride, MA)과 젤라틴을 반응시켜 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 메타크릴화된 젤라틴과 PSS이 공중합된 하이드로겔은 생체기반 고분자이며, 메타크릴화된 젤라틴과 PSS이 가교 결합되어 형성되며, 하이드로겔 제조시 상기 메타크릴화된 젤라틴 또는 PSS 농도를 조절하여 강성 및 전하 밀도, 팽윤비 등의 특성을 조절할 수 있다.
본 발명의 용어 근원세포(myoblast)는 분화되지 않은 상태에 있는 근육 세포이며, 단핵 세포인 위성 세포(satellite cell)가 활성화되면 근원세포로 증식한다.
본 발명에서 사용되는 용어,“근원세포의 분화”란, 단핵인 근원세포(myoblast)가 융합을 통해 다핵의 근관세포(myotube)를 형성하는 과정이다. 근관세포을 형성하는 분화단계의 세포는 Myf5, MyoG, 마이오신 중쇄(Myosin Heavy Chain, MyHC) 마커를 이용하여 구분할 수 있다. 상기 근관세포을 형성하는 분화 초기단계의 세포는 Myf5와 같은 근원성 전사인자(myogenic transcription factor)의 발현이 증가하며, 중기에는 마이오신 G(MyoG)가 증가한다. 분화가 거의 끝나는 후기에는 MyHC의 발현이 증가한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “분화 억제”는 단핵성 근원세포가 다핵성 근관 세포로 융합되는 것을 저해하는 것을 의미한다. 구체적으로 메타크릴화된 젤라틴 또는 조직배양 플레이트에서 배양하여 분화시킨 세포보다, 메타크릴화된 젤라틴과 PSS가 공중합된 하이드로겔에서 배양 및 분화시킨 세포에서 MyHC 양성 핵이 감소하여 분화지수가 감소하거나, 다핵의 근관세포의 형성이 감소하여 융합지수가 감소하는 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서 5%w/v, 10%w/v, 및 15%w/v의 상이한 농도 메타크릴화된 젤라틴(Methacrylated gelatin, GelMA)과 0, 1, 3, 5, 10, 15%w/v의 여섯개의 상이한 농도의 PSS를 사용하여 탄성계수가 상이한 일련의 하이드로겔을 합성하였고, 이들 하이드로겔에서 근원세포인 C2C12세포를 배양하여 강도(rigidity)와 화학 작용기(functional group)가 C2C12 세포 부착과 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 18종의 하이드로겔 중 10%w/v 또는 15%w/v GelMA와 1%w/v PSS를 이용하여 제조한 하이드로겔이 가장 우수한 세포 접착 기질인 것으로 확인하였다.
따라서 상기 하이드로겔은 메타크릴화된 젤라틴 1 내지 30%w/v 및 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트) 0.1 내지 20 %w/v를 포함할 수 있으며, 구체적으로, 메타크릴화된 젤라틴 10 내지 20%w/v, 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트) 0.5 내지 5 %w/v 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 10%w/v, 15%w/v GelMA에서 PSS의 공중합이 C2C12 세포의 분화에 미치는 영향을 확인하고자, GelMA와 PSS가 공중합된 하이드로겔(G10P1, G15P1)과 대조구로 GelMA 하이드로겔(G10, G15)과 폴리스티렌 조직 배양 플레이트(tissue culture plates, TCP)에서 근원세포의 분화를 비교하였다(도 4).
C2C12 세포의 근육 분화를 정량화하기 위해, 분화지수와 융합지수를 분석하였다. 1일과 3일에는 각 기질 중에 유의한 차이는 없었지만, 2일에는 강도(rigidity)가 증가하면서 분화지수가 다소 증가하는 것을 확인하였다.
또한 PSS가 공중합된 하이드로겔에서 분화시킨 3일차 세포에서 대조구의 세포와 비교하여 분화지수가 감소하고, 미오신중사슬(MyHC) 항체인 MF20 양성 영역이 감소함을 확인하여, PSS가 공중합된 하이드로겔이 근원세포의 분화를 감소시킴을 확인하였으며, 근원세포의 융합지수를 분석한 결과, PSS가 공중합된 하이드로겔에서 분화시킨 세포가 대조구 세포보다 다핵화된 근관세포의 형성이 감소함을 확인하였다.
따라서, 메타크릴화된 젤라틴과 PSS가 공중합된 하이드로겔을 근원세포 분화억제용 조성물로 이용할 수 있다.
상기 조성물은 근원세포의 분화 및/또는 근관세포의 형성을 억제하여 생체외(in vitro) 환경에서 근육 소모성 질환의 표현형을 구현할 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 근육 소모성 질환의 치료제 스크리닝을 위해 사용할 수 있다.
상기 근육 소모성 질환은 근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 근육 소모성 질환이란 근력 약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 예를 들어 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy), 또는 심위축증을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 "근력 약화" 란 한 개 또는 그 이상의 근육의 힘이 감소된 상태를 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있다. 또한 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 이학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 근감소증이란, 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미하는 것으로서, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다.
또한 근위축증은 사지의 근육이 거의 좌우대칭적으로 점점 위축되어 가는 것으로서, 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성을 유발하여 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성 진행성 근위축증(Spinal progressive muscular atrophy, SPMA)을 일으킬 수 있다.
근육 퇴행 위축(muscle dystrophy)이란, 점진적인 근위축과 근쇠약이 나타나는 질환으로서, 병리학적으로 근육섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다. 근세포막의 손상으로 근육섬유의 괴사와 퇴행과정을 거쳐 근력저하 및 위축이 발생하게 된다.
본 발명의 심위축증은 심장이 외부적이거나 내부적인 요인에 의해서 위축되어 가는 것으로서, 기아, 소모성질환, 노쇠했을 때 심근섬유가 마르고 가늘어져 지방조직의 감소를 유발하는 심장의 갈색위축 증세를 일으킬 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 다른 양태로 상기 조성물을 포함하는 근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 소모성 질환의 치료제의 스크리닝 시스템을 제공한다.
상기 메타크릴화된 젤라틴과 폴리 소디움-4-스티렌설포네이트(poly sodium-4-styrensulfonate, PSS)이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔 및 근육 소모성 질환은 전술한 바와 같다.
본 발명의 “치료제”는 근육 소모성 질환에 의한 증세를 호전시키거나 이롭게 변경시킬 수 있는 치료용 조성물이다. 근원세포의 분화 또는 근관세포의 형성을 촉진시켜 근육을 유지하거나 강화시킴으로써 근육 소모성 질환에 의한 증세를 호전 또는 이롭게 변경할 수 있다. 따라서 구체적으로 상기 치료제는 근원세포의 분화 또는 근관세포의 형성을 촉진하는 치료용 조성물일 수 있다.
본 발명의 “스크리닝”은 상기 조성물을 이용하여 근원세포의 분화 및/또는 근관세포의 형성을 억제한 근육 소모성 질환의 생체외(in vitro) 모델을 이용하는 것을 특징으로 한다.
상기 생체외 모델에서 후보물질을 처리한 세포에서 근원세포의 분화 및/또는 근관세포의 형성을 후보물질을 처리하지 않은 대조구의 세포와 비교하고, 대조구 세포보다 근원세포의 분화 또는 근관세포의 형성을 촉진하는 경우, 상기 후보물질을 근육 소모성 질환의 치료제로 선택할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "후보물질"은 근원세포의 분화 또는 근관세포의 형성을 촉진하거나, 근원세포의 분화를 유도하는 유전자의 발현을 증가시키거나, 분화를 저해하는 유전자의 발현을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미한다.
본 발명의 후보물질은 합성화합물, 천연화합물, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시예에서 세포배양 기질을 달리하여 세포를 배양 후, 분화배지로 분화시키고 2일차에 세포의 전체 RNA 발현 변화를 분석하였다. 상기 유전자 발현 분석에 사용된 RNA의 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행(GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 이용가능하며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 PSS가 공중합된 하이드로겔에서 배양 후 분화시킨 2일차 세포에서 TNF 신호 경로 유전자 및 Hs3st5, stmn4, Nos2 및 IL-1α 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다. 한편, WNT 신호 경로 유전자, ERK5 신호 경로 유전자 및 IGF1, PIK3R1, mTOR 및 Cav3v 유전자의 발현이 감소함을 확인하였다.
또한, PSS가 분화 중 세포기질과 접착분자에 조절에 매치는 영향을 확인하고자, 1%w/v PSS과 포함된 15%w/v GelMA 하이드로겔(G15P1), PSS가 포함되지 않은 하이드로겔(G15) 및 TCP를 세포배양기질로 근원세포를 배양 및 분화시키고 분화 2일차에 세포의 유전자 발현 변화를 분석한 결과, 세포외기질(ECM)과 세포접착에 연관된 84개 유전자 중 16개(Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8, Thbs1)가 TCP보다 G15P1에서 2배 이상의 발현 감소를 보임을 확인하였으며, 반대로 비트로넥틴(vitronectin, Vtn), CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp, Tnc 등의 유전자의 발현 증가를 확인하였다.
따라서 본 발명의 스크리닝은 후보물질을 처리한 세포에서 TNF 신호 경로 유전자, Hs3st5, stmn4, Nos2, IL-1α, WNT 신호 경로 유전자, ERK5 신호 경로 유전자, IGF1, PIK3R1, mTOR 및 Cav3v 유전자의 발현 수준을 측정하고 후보물질을 처리하지 않은 대조구 세포와 비교하는 것일 수 있으며, 구체적으로 후보물질을 처리한 세포에서 TNF 신호 경로 유전자 및 Hs3st5, stmn4, Nos2, IL-1α 유전자의 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 감소하거나, WNT 신호 경로 유전자, ERK5 신호 경로 유전자, IGF1, PIK3R1, mTOR 및 Cav3v 유전자의 발현 수준이 대조구 세포의 유전자 발현 수준보다 증가하는 경우 상기 후보물질을 치료제로 선택하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 TNF 신호 경로 유전자는 CXCL1, CCL5, CCL2, TNF-α 또는 Vitronectin일수 있으며, 상기 WNT 신호 경로 유전자는 LRP5, AXIN2, LGR4 및 LGR5이며, ERK5 신호 경로 유전자는 klf4, NPNT일 수 있다.
따라서, 상기 스크리닝 시스템은 상기 CXCL1, CCL5, CCL2, TNF-α, Vitronectin, Hs3st5, stmn4, Nos2, IL-1α, LRP5, AXIN2, LGR4, 및 LGR5, klf4, NPNT, IGF1, PIK3R1, mTOR 또는 Cav3v 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
또한, 상기 스크리닝은 후보물질을 처리한 세포와 대조구에서 Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8, Thbs1, CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp 또는 Tnc 유전자의 발현 수준을 더 측정하고, 후보물질을 처리한 세포에서 Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8, Thbs1 유전자의 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 증가하거나, CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp, Tnc 유전자의 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 감소하는 경우 상기 후보물질을 치료제로 선택하는 것일 수 있다.
따라서 상기 스크리닝 시스템은 Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8, Thbs1, CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp 또는 Tnc의 유전자를 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "유전자의 발현 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 qRT-PCR(realtime quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 실시예에서 유전자 발현 수준을 측정하고자, Trizol을 이용하여 RNA를 분리하고, cDNA를 합성하여, 실시간 qRT-PCR(realtime quantitative RT-PCR)로 유전자 수준을 측정하였다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 CXCL1, CCL5, CCL2, TNF-α, Vitronectin, Hs3st5, stmn4, Nos2, IL-1α, LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, klf4, NPNT, IGF1, PIK3R1, mTOR, Cav3v, Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8, Thbs1, CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp 또는 Tnc 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 상기 CXCL1, CCL5, CCL2, TNF-α, Vitronectin, Hs3st5, stmn4, Nos2, IL-1α, LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, klf4, NPNT, IGF1, PIK3R1, mTOR, Cav3v, Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8, Thbs1, CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp 또는 Tnc 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 또 다른 양태로 메타크릴화된 젤라틴과 폴리 소디움-4-스티렌설포네이트(poly sodium-4-styrensulfonate, PSS)이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔에서 근원세포를 배양하는 단계, 후보물질을 처리하고 근원세포를 분화시키는 단계, 상기 후보물질이 처리된 세포에서 근원세포의 분화 또는 근관세포의 형성을 후보물질이 처리되지 않은 대조구 세포와 비교하는 단계를 포함하는, 근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 메타크릴화된 젤라틴과 폴리 소디움-4-스티렌설포네이트(poly sodium-4-styrensulfonate, PSS)이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔, 근력 소모성 질환, 치료제, 후보물질, 스크리닝은 전술한 바와 같다.
전술한 실시예에서, 메타크릴화된 젤라틴과 PSS과 공중합된 하이드로겔에서 배양 후 분화시킨 세포에서 PSS가 함유되지 않은 하이드로겔에서 배양 후 분화시킨 세포보다 TNF 신호 경로 유전자인 CXCL1, CCL5, CCL2, TNF-α, Vitronectin과 Hs3st5, stmn4, Nos2 또는 IL-1α의 발현이 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보물질이 처리된 세포 내에서 CXCL1, CCL5, CCL2, TNF-α, Vitronectin, Hs3st5, stmn4, Nos2 및 IL-1α로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준을 후보물질이 처리되지 않은 대조구 세포와 비교하는 더 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보물질이 처리된 세포에서 상기 CXCL1, CCL5, CCL2, TNF-α, Vitronectin, Hs3st5, stmn4, Nos2, IL-1α유전자의 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 감소하는 경우, 상기 후보물질을 근육 소모성 질환의 치료제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 메타크릴화된 젤라틴과 PSS과 공중합된 하이드로겔에서 배양 후 분화시킨 세포에서 PSS가 함유되지 않은 하이드로겔에서 배양 후 분화시킨 세포보다 ERK5 신호 경로 유전자인 klf4, NPNT와 WNT 신호 경로 유전자인 LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, IGF1, PIK3R1, mTOR, Cav3v의 발현이 감소함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보물질이 처리된 세포 내에서 klf4, NPNT, LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, IGF1, PIK3R1, mTOR 및 Cav3v로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준을 후보물질이 처리되지 않은 대조구 세포와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 후보물질이 처리된 세포에서 상기 klf4, NPNT, LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, IGF1, PIK3R1, mTOR 및 Cav3v로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 증가하는 경우, 상기 후보물질을 근육 소모성 질환의 치료제로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 전술한 실시예에서 메타크릴화된 젤라틴과 PSS과 공중합된 하이드로겔에서 배양 후 분화시킨 세포에서 PSS가 함유되지 않은 하이드로겔에서 배양 후 분화시킨 세포보다 Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8 및 Thbs1 유전자의 발현이 감소함을 확인하였고, 비트로넥틴(vitronectin, Vtn), CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp 및 Tnc 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보물질이 처리된 세포 내에서 Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8, Thbs1, CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp 및 Tnc로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준을 후보물질이 처리되지 않은 대조구 세포와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 후보물질이 처리된 세포에서 상기 Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8 및 Thbs1로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 증가하는 경우, 또는 상기 CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp 및 Tnc로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 감소하는 경우 후보물질을 근육 소모성 질환의 치료제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다
본 발명의 조성물은 근원세포의 분화를 억제하여 생체외(in vitro)에서 근육 소모성 질환 모델을 구현할 수 있어, 근육 소모성 질환 치료제의 스크리닝에 활용할 수 있다.
또한, 상기 조성물을 이용하여 분화가 억제된 세포에서 근육형성 및 재생, 근육 사멸 및 퇴화에 연관되어 있다고 알려진 TNF-α, WNT 신호 전달체계의 유전자를 상향 또는 하향조절함을 확인하였는바, 상기 신호 전달 체계를 조절하는 후보물질을 근육 소모성 질환 치료제 개발에 활용할 수 있다.
도 1은 농도별 GelMA 또는 GelMA-co-PSS 하이드로겔의 FTIR 결과이다
도 2는 (A) 농도별 GelMA 또는 GelMA-co-PSS 하이드로겔의 팽윤비(대조구로서 G5, G10, G15을 사용하였으며, 실험구은 대조구의 각각의 농도에 1% PSS가 공중합되어 만들어졌음) (B) GelMA의 농도에 따른 하이드로겔의 탄성 계수(탄성계수 측정을 위해 각각 5, 7.5, 10, 15% w/v의 GelMA 가 사용됨) 및 (C) 농도별 GelMA 또는 GelMA-co-PSS 하이드로겔의 ZETA 전위를 측정한 결과이다(GelMA 10%(G10), GelMA 15%(G15), GelMA 10%-PSS 1%(G10P1), GelMA 15%-PSS 1%(G15P1)).
도 3은 성장배지에 접종 후 1일, 2일 및 3일차에 하이드로겔 및 TCP 기질에서 배양한 근육근원 세포의 위상차 이미지이다(기준자 = 100㎛).
도 4는 (A) 분화 1일, 2일 및 3일차에 C2C12의 세포면역형광염색 이미지이다. 세포를 고정하고 Desmin(녹색), MyHC(미오신 중사슬, 적색)으로 면역형광염색하였다. 핵은 DAPI로 청색 표지 하였다(기준자 = 50 ㎛)
(B) 세포배양 기질에 따른 분화지수를 측정한 결과이다.
(C) ImageJ를 이용하여 MyHC이 양성인 세포의 면적을 측정한 결과이다.
도 5는 (A) 분화 2일차에 세포를 Desmin 및 MyHC으로 면역형광염색 사진를 확대한 이미지이다(기준자 = 100 ㎛). (B) 분화 1일, 2일 및 3일차에 세포배양 기질에 따른 융합지수를 정량화한 결과이다.
도 6은 근원세포를 G10, G10P1, G15, G15P1, TCP에 접종한 후 각각 1일, 2일, 3일간 분화시킨 세포들의 근육분화 관련 유전자들의 qRT-PCR 분석 결과이다. 구체적으로 근육 특이성 유전자인 (A) 근원성(myogenic) 인자 5 (Myf5) (B) 미오제닌(MyoG) 및 (C) 미오신 중사슬(MyHC)의 상대적인 mRNA 수치를 나타낸다.
도 7은 ERK5 신호 경로 유전자인 Klf4 및 네프로넥틴(NPNT)의 상대적인 mRNA 수치를 나타낸다.
도 8은 TNF 신호 경로 유전자인 IL-6, CCL2(MCP1), CXCL1(KC) 및 CCL5(RANTES)의 상대적인 mRNA 수치를 나타낸다.
도 9는 TNF 신호 경로 유전자인 TNF-α, Vitronectin의 상대적인 mRNA 수치를 나타낸다.
도 10은 WNT 신호 전달 경로 유전자인 LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, RSPO2, Mstn의 상대적인 mRNA 수치를 나타낸 것이다.
도 11은 IGF1/PI3K/Akt/mTOR 신호 전달 경로의 상대적인 mRNA 수치를 나타낸 것이다.
도 12는 Cav3v, Hs3st5, stmn2, stmn4, Nos2, IL-1α의 상대적인 mRNA 수치를 나타낸 것이다.
도 13은 세포배양 기질에 따른 분화 2일차의 세포의 PCR 배열(array) 분석을 통한 유전자 발현 히트맵이다.
도 14는 하이드로겔 기반의 세포배양 기질의 조성을 달리하였을 때, 세포 부착의 정도를 나타낸 위상차 이미지이다. 세포배양기질로 GelMA를 5, 10 또는 15%w/v로 포함하고, PSS를 0, 1, 3, 5, 10 또는 15%w/v로 포함하는 18가지 조성의 하이드로겔을 사용하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<물질 및 방법>
1. 메타크릴화 젤라틴의 합성
60℃의 인산염 완충 식염수(Phosphate buffered saline, PBS) 100 ml에 A형 돼지 피부 젤라틴(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호: G2500) 10g을 지속적으로 교반하면서 용해하였다. 그 후, 무수 메타크릴산(Methacrylic anhydride, Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호: 276685) 8 ml를 2시간 동안 격렬하게 교반하면서 상기 제조된 젤라틴 용액에 첨가하여, 메타크릴화된 젤라틴(Methacrylated gelatin, GelMA)을 합성하였다. 1시간 후, 60℃에서 예열된 PBS를 첨가하고 60℃에서 15분간 정치하였다. 12-14kDa 투석 튜브(Spectrum Laboratories, 카탈로그 번호: 132680)를 통해 매일 2회 탈이온수를 교체하면서, GelMA 용액을 탈이온수(DI)를 이용하여 52℃에서 7일간 투석하였다. 마지막으로, 용액을 여과하고, 동결 건조시킨 후 20℃에서 보관하였다.
2. 하이드로겔 합성
5, 10 또는 15 %w/v의 GelMA와 0, 1, 3, 5, 10 또는 15 %w/v의 소디움-4-비닐벤젠설포네이트(Sodium 4-vinylbenzenesulfonate)를 이용하여 다양한 농도의 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 또는 메타크릴화 젤라틴과 PSS의 공중합체(GelMA-co-PSS)를 포함하는 하이드로겔 합성하였다(표 1).
하이드로겔의 GelMA 및 PSS의 조성
농도 PSS
0%w/v		 PSS
1%w/v		 PSS
3%w/v		 PSS
5%w/v		 PSS 10%w/v PSS 15%w/v
GelMA 5%w/v G5 G5P1 G5P3 G5P5 G5P10 G5P15
GelMA 10%w/v G10 G10P1 G10P3 G10P5 G10P10 G10P15
GelMA 15%w/v G15 G15P1 G15P3 G15P5 G15P10 G15P15
상기 단량체(monomer)를 1×PBS에 용해하고, 10% 과황산 암모늄(Ammonium persulfate, APS) 및 TEMED(N,N’,N’-테트라메틸에틸렌디아민) (산화 환원 개시제/촉진제) 각각 4%v/v 및 3%v/v를 첨가하여 실온에서 Bio-Rad 1 mm 스페이서 유리판에서 중합하였다. 세포 배양 실험을 위해서, 하이드로겔을 24-웰 크기로 만들고, 30분간 70% 에탄올에 상기 하이드로겔을 침지하고 페니실린/스트렙토마이신 50 units/㎖를 함유하는 멸균 PBS로 세척한 후 72시간 동안 5시간마다 완충액을 교체하여 살균하였다. 세포를 접종 전에 모든 하이드로겔은 성장배지인, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 2mM L-글루타민과 50 units/㎖ 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 고(high) 글루코즈 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 밤새 배양하였다.
3. 겔의 특성 분석
3.1. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)
동결건조된 하이드로겔(48-웰 크기)의 화학 조성을 C1000 Thermal Cycler을 사용하여 푸리에 변환 적외선 분광 분석하였다.
3.2. 팽윤비
하이드로겔의 팽윤비를 확인하기 위해서 합성된 하이드로겔 샘플을 PBS으로 24 시간 세척하여 평형 팽윤 상태에 도달시키고, 미반응물을 제거하였다. 그 후, 샘플을 용기에 충진하고 티슈 페이퍼로 부드럽게 닦아서 샘플 표면의 액체 초과분을 제거하고 습식중량을 측정하였다. 그 후, 샘플을 건조하여 중량을 측정하여 팽윤비를 하기 식에 따라 계산하였다.
Figure 112018059602678-pat00001
3.3. 기계적 측정
레오미터(Kinexus Pro, Malvern, UK)를 사용하여 하이드로겔의 강도(압축 탄성률)을 측정하였다. 세 개의 샘플의 평균을 이용하여 실험군마다 기계적 특성을 평가하였고, 결과는 평균과 표준 편차로 나타내었다.
강도 측정을 위한 하이드로겔은 전술한 하이드로겔의 합성방법과 동일하게 제조하였고, PSS는 0%w/v로 포함하며, GelMA의 농도는 5, 7.5, 10 또는 15%w/v로 제조하였다.
3.4. 제타 전위 측정
제타 전위를 측정하기 위해서, 하이드로겔의 프리-겔(pre-gel) 용액을 PH 7.4로 조정하였다. 레이저 도플러 속도계(Zetasizer Nano ZS90, Malvern, U.K.)를 사용하여 제조된 샘플의 제타 전위를 측정하였다. 모든 측정은 3회 반복하였다.
4. 세포 배양
C2C12세포(근원세포)는 10% 소태아혈청(FBS) 및 50 U/㎖ 페니실린/스트렙토 마이신을 첨가한 DMEM 배지(성장배지)에 5k cells/㎠의 밀도로 접종하였다. 세포를 5% CO2, 37℃에서 배양 하였다. 세포가 90% 내지 100% 밀집도(confluency)에 이르렀을 때, 성장배지를 분화배지(2% 말 혈청을 함유한 DMEM 배지)로 교체하여 분화를 유도하였다. 실험에 사용된 모든 세포는 10 계대 이하였으며, 배지는 격일로 교체하였다.
5. 면역조직화학(Immunohistochemisty, IHC)
세포를 실온에서 10분간 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)에 고정시킨 후, 0.1%v/v Triton X-100 및 3%w/v 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)를 함유한 PBS로 각각 1시간 동안 실온에서 차단/투과하였다. 세포를 1%w/v BSA를 함유하는 PBS로 희석한 토끼 항-Desmin(1:200, Abcam, 카탈로그 번호: ab8592) 및 마우스 항-MyHC(MF-20) (1:200, Developmental Studies Hybridoma Bank)에 대한 일차 항체로 4℃에서 밤새 배양한 후 PBS로 3회 세척한 후, 이차 항체인 항-토끼 Alexa 488(1:200) 및 항-마우스 Alexa 546(1:200; Life Technologies)로 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 핵을 Hoechst 33342(2 mg/㎖, Life Technologies)로 실온에서 10분간 염색하였다. 형광 사진을 Nikon Eclipse Ti-U 현미경으로 촬영하고 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 얻었다.
실험군마다 3개 이상의 임의의 필드(random fields of view)를 분석하였다. 융합지수(fusion index)를 계산하기 위해 MyHC을 양성으로 발현하는 근원세포를 총 네 개의 군, 즉, 1, 2-6, 7-14 및 15 이상의 핵을 함유하는 MyHC 양성 근관세포로 구별하였다. 그 후, 군마다 계수한 핵의 수를 MyHC 양성 세포의 총 핵수로 나누었다. 분화지수(differentiation index)는 MyHC을 양성으로 발현하는 근관세포의 핵의 수를 임의의 필드에 존재하는 총 핵 수로 나누어 계산하였다.
시점마다 세 개의 임의의 필드(random fields of view)에서 기질(substrate)마다 적어도 1000개의 핵을 계수하였다.
6. RNA 분리 및 cDNA 합성
전체 RNA는 트리졸(Trizol, Invitrogen사)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 추출하였다. 역전사는 gDNA 리무버(Toyobo, FSQ-301)를 포함하는 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix로 수행하였다. cDNA 합성을 위해 0.5㎍의 RNA를 10㎕ 반응에서 주형으로 사용하고 qPCR에는 DEPC 수(diethyl pyrocarbonate water)로 5배 희석된 cDNA를 사용하였다.
7. 정량 PCR 및 프라이머
정량 실시간 PCR은 StemOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 SYBR® 그린 실시간 PCR 마스터 믹스(Toyobo, QPK-201)를 사용하여 수행하였다.
PCR 반응액은 아래와 같이 제조하였다
사이버 그린 (Syber green): 5 ㎕
정방향 프라이머: 0.4 ㎕
역방향 프라이머: 0.4 ㎕
DEPC수: 2 ㎕
cDNA: 2 ㎕
사이클링은 아래의 조건으로 수행하였다.
예비 변성 (pre-denaturation): 95℃, 1 분
변성 (Denaturation): 95℃, 15 초
어닐링 (Annealing): 60℃, 15 초
연장 (Extension): 72℃, 45 초
유전자 발현은 0일차 B2M(housekeeping)으로 표준화하였다
PCR 분석에 사용한 프라이머는 표 2과 같다.
서열번호 프라이머 이름 서열
1 B2M 정반향 프라이머 ACCGGCCTGTATGCTATCCAG
2 B2M 역방향 프라이머 AATGTGAGGCGGGTGGAACTG
3 Myf5 정방향 프라이머 CTG CTG TTC TTT CGG GAC CA
4 Myf5 역방향 프라이머 TAT TAC AGC CTG CCG GGA CA
5 MyoG 정방향 프라이머 CCTACAGACGCCCACAATC
6 MyoG 역방향 프라이머 CCCAGGCTGACAGACAATC
7 MyHC 정방향 프라이머 ACGCCATCAGGCTCAAGAAGAAGA
8 MyHC 역방향 프라이머 TGAGTGTCCTTGAGGATGCCTTGT
9 Klf4 정방향 프라이머 GCCAACTACCCTCCTTTCCTG
10 Klf4 역방향 프라이머 TCTTTGGCTTGGGCTCCTC
11 NPNT 정방향 프라이머 GGCCAAACAAGTGCAAATGTC
12 NPNT 역방향 프라이머 GGTGGAAGGACTCATCTTGGTT
13 CCL5 정방향 프라이머 GCTGCTTTGCCTACCTCTCC
14 CCL5 역방향 프라이머 TCGAGTGACAAACACGACTGC
15 CXCL1 정방향 프라이머 CTGGGATTCACCTCAAGAACATC
16 CXCL1 역방향 프라이머 CAGGGTCAAGGCAAGCCTC
17 MCP1 정방향 프라이머 TCT CAC TGA AGC CAG CTC TCT
18 MCP1 역방향 프라이머 CAG GCC CAG AAG CAT GAC A
19 Hs3st5 정방향 프라이머 CCTCCTGTATCTAGTTGCCAGA
20 Hs3st5 역방향 프라이머 CCAATGATAATGGCTTTGGGGA
21 Stmn4 정방향 프라이머 ATGGAAGTCATCGAGCTGAACA
22 Stmn4 역방향 프라이머 GGGAGGCATTAAACTCAGGCA
23 Nos2 정방향 프라이머 GCAGGTCTTTGACGCTCGGA
24 Nos2 역방향 프라이머 ATGGCCGACCTGATGTTGCC
25 IL-1α정방향 프라이머 CGAAGACTACAGTTCTGCCATT
26 IL-1α역방향 프라이머 GACGTTTCAGAGGTTCTCAGAG
27 IFG1 정방향 프라이머 CTGGACCAGAGACCCTTTGC
28 IFG1 역방향 프라이머 GGACGGGGACTTCTGAGTCTT
29 PIK3R1 정방향 프라이머 ACACCACGGTTTGGACTATGG
30 PIK3R1 역방향 프라이머 GGCTACAGTAGTGGGCTTGG
31 mTOR 정방향 프라이머 ACCGGCACACATTTGAAGAAG
32 mTOR 역방향 프라이머 CTCGTTGAGGATCAGCAAGG
33 Cav3v정방향 프라이머 GGATCTGGAAGCTCGGATCAT
34 Cav3v역방향 프라이머 TCCGCAATCACGTCTTCAAAAT
35 CCL2 정방향 프라이머 TCT CAC TGA AGC CAG CTC TCT
36 CCL2 역방향 프라이머 CAG GCC CAG AAG CAT GAC A
37 TNF-α정방향 프라이머 ACG GCA TGG ATC TCA AAG AC
38 TNF-α역방향 프라이머 GTG GGT GAG GAG CAC GTA GT
39 Vitronectin정방향 프라이머 CCCCTGAGGCCCTTTTTCATA
40 Vitronectin역방향 프라이머 CAAAGCTCGTCACACTGACA
41 LRP5 정방향 프라이머 GAAAGCACAATGGGTCCTCCA
42 LRP5 역방향 프라이머 CTGACGCCTGTTCCACTTCT
43 AXIN2 정방향 프라이머 TGACTCTCCTTCCAGATCCCA
44 AXIN2 역방향 프라이머 TGCCCACACTAGGCTGACA
45 LGR4 정방향 프라이머 AGTCCTAACCCTCCAGAACAATCAG
46 LGR4 역방향 프라이머 GGTAATATGGTTGGCATCTAAGCG
47 LGR5정방향 프라이머 AGCCTTCAATCCCTGCGCCTAG
48 LGR5역방향 프라이머 GACAGGGACGTCTGTGAGAGCATTG
49 RSPO2정방향 프라이머 ATAGAGGCCGCTGCTTTG
50 RSPO2역방향 프라이머 TGCCGTGTTCTGGTTTCC
51 MSTN정방향 프라이머 AGTGGATCTAAATGAGGGCAGT
52 MSTN역방향 프라이머 GTTTCCAGGCGCAGCTTAC
53 RPS6KB1정방향 프라이머 AGACACAGCGTGCTTTTACTT
54 RPS6KB1역방향 프라이머 GTGTGCGTGACTGTTCCATCA
8. RNA 시퀀싱(RNAseq)을 통한 전사체(transcriptome) 분석
제조 회사의 지침에 따라 Trizol(Invitrogen)을 사용하여 분화 이틀 후 세포로부터 전체 세포 RNA를 추출하였다. 그 후, 전체 세포 RNA 시퀸싱(RNAseq)은 마크로젠에서 수행하였다.
9. 기능 분석(Functional annotation)
분화 2일째에 RPKM(Reads per kilobase million) 비율을 기준으로 발현 변화가 1.8배 높은 G15P1 및 조직 배양 플레이트(Tissue culture plate, TCP) 기질에서 배양한 세포에서 동정된 유전자를 상이하게 발현되는 유전자를 기능상 분류하기 위해 신중하게 선택하였다. G15P1에서 상향 조절되는 유전자는 TCP에서 상향 조절되는 것으로 간주하였으며, TCP에서 상향 조절된 유전자는 G15P1에서 하향 조절되는 것으로 간주하였다. 상향 조절된 유전자는 DAVID 데이터베이스에 의해 유전자 온톨로지(gene ontology, GO)와 KEGG 경로에 대하여 분석하고, 분석결과를 기준으로 분류하였다.
10. 마우스 세포외 기질 & 접착 분자 PCR 배열
Trizol에 의해 RNA를 분리한 후에 분리된 RNA의 0.5㎍을 Qiagen RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401) 반응 분석을 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 그 후, cDNA를 Mouse Extracellular Matrix 및 Adhesion Molecules RT2Profile PCR Array(PAMM-0013, SABiosciences)에 적용하였다. StemOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 RT2 SYBR Green/ROX qPCR 마스터 믹스를 사용하여 증폭하였다. 유전자 발현율은 ΔΔCt 방법과 PCR 배열 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
11. 통계 분석
GraphPad Prism(version 5.00) 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. p 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 별표는 통계적 유의성의 상이한 정도를 나타낸다. 동일한 시점에서 다양한 군을 비교하기 위해서 Tukey-Kramer post-hoc 테스트를 이용하여 일방 분산 분석(ANOVA)을 수행하였다. Bonferroni post-hoc test를 이용한 양방 ANOVA를 사용하여 다양한 시점에서 여러 군을 비교하였다. 모든 데이터는 세 개 이상의 반복 실험값의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타내었다.
<결과>
1. 하이드로겔의 구성과 특성 분석
GelMA는 무수 메타크릴산(MA)와 젤라틴의 일차 아민기를 관능화하는 무수 메타크릴산(MA)과 젤라틴의 직접 반응으로 합성하였다. 하이드로겔에 헤파린 모사 부분을 도입하기 위해, 술포네이트기를 함유하는 PSS를 GelMA와 공중합하였다(도식 1).
아래 반응식은 GelMA계 하이드로겔의 제조 반응식이다. 구체적으로 젤라틴 리신기를 메타크릴레이트 펜던트기로 치환하는 젤라틴과 메타크릴산 무수물의 반응, GelMA 및 소디움 4-비닐 벤젠술포네이트(PSS)의 가교 결합에 의해 만들어진 하이드로겔 구조의 형성을 나타낸 것이다.
도식 1
Figure 112018059602678-pat00002
제조한 하이드로겔의 화학적 조성을 규명하기 위해 동결건조된 하이드로겔의 FTIR 분석을 수행하였다. 도 1은 10, 15% GelMA 및 10, 15% GelMA-co-PSS 하이드로겔의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다. GelMA 및 GelMA-co-PSS의 스펙트럼은 3296 cm-1 (아미드 (II)의 N-H 신축을 나타냄) 및 2938 cm-1 (C-H 신축을 나타냄)에서 유사하게 나타났으나, GelMA-co-PSS의 스펙트럼에서만 1100 cm-1에서 SO3을 나타내는 피크를 확인하였다.
도 2A는 GelMA 및 GelMA-co-PSS 하이드로겔의 팽윤비를 측정한 결과이다. GelMA의 함량이 5%에서 15%로 증가할수록 수분흡수력이 낮아져 팽윤비가 감소하였으나, 1% PSS는 하이드로겔의 팽윤비의 변화에 영향을 주지 않았다.
도 2B는 하이드로겔 탄성계수를 측정한 결과로, GelMA의 농도가 5%에서 15%(5, 7.5, 10, 15%w/v)로 증가할수록 강도(압축 탄성률)이 증가함을 확인하였다.
제타 전위는 표면 전하에 필요한 유용한 지표로, 본 발명에서 하이드로겔이 음전하로 하전된 중합체 사슬로 인해 음으로 하전된 표면을 가질 것으로 예상하였다. PSS가 GelMA와 하이드로겔 표면전하에 미치는 영향을 확인하고자, GelMA 하이드로겔(G10, G15)과 동일한 GelMA 농도에 1%w/v PSS가 공중합된 GelMA-co-PSS 하이드로겔(G10P1, G15P1)의 제타 전위 ζ를 측정하고, 그 결과는 도 2C에 나타내었다. 모든 하이드로겔은 생리학적 pH에서 음의 제타 전위를 나타내었다. G10과 G15의 하이드로겔의 제타 전위는 각각 -2.32mV와 -2.12mV로 거의 유사하였고, G10P1 및 G15P1의 하이드로겔 모두 제타 전위가 -3.9mV 와 -3.07mV 측정되어, PSS가 공중합된 하이드로겔에서 제타 전위가 감소되는 것을 확인하였다. 이는 PSS에 포함된 음전하의 술포네이트기로 설명될 수 있다.
2. C2C12 세포의 부착 및 증식
5%, 10%, 및 15 %w/v의 상이한 농도의 GelMA와 0, 1, 3, 5, 10, 15%w/v의 여섯 개의 상이한 농도의 PSS를 사용하여 탄성계수 상이한 18가지의 하이드로겔을 합성하였다. 이들 하이드로겔에서 C2C12세포를 배양하여 강도(rigidity)와 화학 작용기(functional group)가 C2C12 세포 부착과 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 18종의 하이드로겔 중 10% 또는 15% GelMA와 1% PSS를 이용하여 제조한 GelMA-co-PSS 하이드로겔이 가장 우수한 세포 접착 기질인 것으로 확인되었으며, 따라서 이후의 발명은 이러한 네 종류의 하이드로겔(G10, G15, G10P1, G15P1)을 사용하였다(도 14).
도 3은 두 종류의 GelMA(G10, G15) 하이드로겔, 두 종류의 GelMA-co-PSS(G10P1, G15P1) 하이드로겔, 조직 배양 플레이트(tissue culture palate, TCP)를 포함하여 총 다섯 종류의 기질(substrates)에서 성장배지로 1일, 2일 및 3일 동안 배양한 C2C12 세포의 위상차 이미지이다.
C2C12 세포는 상기 다섯 종류의 기질(TCP, G10, G15, G10P1, G15P1 하이드로겔)에 배양하였을 때, 모두 정상적인 부착(adhesion)과 시간에 따른 증식(proliferation)이 가능함을 확인하였다.
3. 근원세포의 분화 평가
다음으로, 10%, 15% GelMA에서 PSS의 공중합이 C2C12 세포의 분화에 미치는 영향을 확인하고자, GelMA-co-PSS 하이드로겔(G10P1, G15P1)과 대조구인 GelMA 하이드로겔(G10, G15) 및 폴리스티렌 조직 배양 플레이트(tissue culture plates, TCP)에서 근원세포의 분화를 비교하였다(도 4).
C2C12 세포의 근육 분화를 정량화하기 위해, 분화지수와 융합지수를 분석하였다. 분화 1일차과 3일차에는 각 기질 중에서 PSS가 포함되지 않은 그룹 간(TCP, G10, G15) 유의한 차이는 없었지만, PSS가 포함된 G10P1과 G15P1에서는 분화지수와 융합지수가 현저히 감소하였다. 분화 2일차에는 강도(rigidity)가 증가하면서 분화지수가 다소 증가하는 것을 확인하였다(G10<G15<TCP).
분화 1일차에는 GelMA 10%w/v를 사용한 G10와 G10P1간 차이가 없으나, 분화 2일차와 3일차에서는 G10P1의 분화지수가 G10보다 상당히 낮음을 확인하였다. 그리고, GelMA 15%w/v의 G15과 G15P1을 비교하였을 때, G15P1은 분화 1일차부터 3일차까지 모든 시간대에서 G15에 비해 분화지수가 매우 감소함을 확인하였다.
또한, 미오신중사슬(MyHC) 항체인 MF20 양성 영역을 측정한 결과, 역시 분화도와 유사한 결과 확인하여 GelMA-co-PSS 하이드로겔(G10P1, G15P1)이 근원세포의 분화를 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 4 B 및 C).
4. 헤파린 모사 모티프의 근육 세포 융합에서의 역할 분석
분화 1일차에 모든 그룹의 세포는 단핵이거나 초기 근관세포 단계에서 2개 내지 6개의 핵을 가졌다. 강도(rigidity)가 상이한 그룹(GelMA 10%w/v, GelMA 15%w/v, TCP) 중에서 근육 세포의 융합이 유의하게 변하는 것을 발견하지는 못했지만, 세포배양기질에 PSS를 도입한 G10P1과 G15P1 하이드로겔 세포배양기질에서는 근원세포가 융합하여 다핵화된 근관세포를 형성하는 과정을 억제함을 확인하였다(도 5A, B).
분화 2일차에 한 개의 근관세포가 포함하고 있는 핵의 갯수를 각각 1개, 2-6개, 7-14개 및 15개 이상으로 나누어 그 비율을 분석한 결과, G15에서 배양한 근육세포는 단핵 세포(1개)가 15%, 2 내지 6개의 핵을 함유하는 초기 근관세포(early myotube)가 35%임을 확인하였다. 나머지 50%는 7 내지 14개 또는 15개 이상의 핵을 포함하고 있는 성숙한 근관세포로 확인되었다. 반면에 GelMA 15%에 PSS를 도입한 G15P1의 경우 형성된 근관세포의 41%는 단핵(1개)을 포함하는 근원세포였으며, 2 내지 6개의 핵을 포함하는 초기 근관세포의 빈도는 45%를 차지하였다. 그리고 7 내지 14개 또는 15개 이상 의 핵을 포함한 성숙한 근관세포의 비율은 14% 정도로 G15에 비해 현저히 낮은 융합지수를 나타내었다.
G15는 분화 2일차에 약 40%의 빈도로 15개 이상의 핵을 포함하는 근관 세포를 형성하였으나, G15P1은 15개 이상의 핵을 포함하는 근관 세포를 G15보다 현저히 낮은 3%로 형성하였다.
또한 분화 3일차에 G15P1과 G15의 15개 이상의 핵을 포함하는 성숙한 근관세포는 각 6%와 80%로 나타났다. 즉, PSS의 도입이 근원세포의 융합능력을 현저하게 억제함을 확인하였다.
5. 근원성 마커 발현 확인
PSS의 근육분화와 세포융합 억제 효과를 확인한 후에, PSS가 근원세포의 분화를 조절하는 Myf5, Myog, MyHC와 같은 근육 조절 유전자의 발현에 미치는 영향을 도 6에서 확인하였다. 분화 유도 3일간 qRT-PCR로 이들 유전자의 발현정도를 측정하였다. 대조군인 G15과 TCP에서 분화 3일차와 1일차를 비교하였을 때, Myf5 발현이 각각 54% 와 66%가 감소하는 것을 관찰하였다. 그러나, 이러한 Myf5 발현 감소는 G15P1에서는 30%에 불과하였다(도 6A). MyoG 유전자 발현에 있어서도, G15P1의 MyoG 발현 정도는 대조군인 G15보다 하루 늦는 것이 관찰되었다. G15P1의 분화 2일차, 3일차의 MyoG 발현 정도는 G15의 분화 1일차, 2일차의 발현 정도와 거의 동일하였다(도 6B). 마찬가지로, PSS을 G15에 도입하게 되면 후기 근원성 마커인 MyHC의 발현이 저해되었는데, 이는 분화 2일차 및 3일차에 두드러지게 나타났다(도 6C).
6. 신호 전달 유전자 발현 분석
6-1. ERK5 신호 전달 유전자 발현 분석
ERK5 신호 전달 경로를 억제하면 C2C12 세포주에서 근원세포의 융합을 저해할 수 있다고 보고 되었다. ERK5는 Klf 전사 인자를 통해 근원세포의 융합을 조절한다. 직접적인 Klf 전사 표적 중 하나는 근육 세포 융합에 중요한 역할을 하는 네프로펙틴(nephronectin)이다.
따라서 세포배양 기질 변화에 따른 ERK5 신호 전달 경로 유전자의 발현 변화를 분석하였다. qPCR에 수행하여 분화 2일차에 G15, G15P1 및 TCP에서 분화된 세포에서 Klf4와 네프로넥틴의 mRNA 수준을 분석하였다(도 7). 흥미롭게도, G15P1에서 Klf4 및 네프로넥틴 모두 발현 정도가 감소하는 것을 발견하였다.
6-2. TNF 신호 전달 유전자 발현 분석
세포배양 기질 변화의 따른 TNF 신호 전달 경로 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해 IL-6, CCL2, CXCL1, CCL5, TNF-a 및 Vitronectin의 발현 변화를 분석하였다.
구체적으로 qPCR을 수행하여 분화 2일차에 G15P1, G15 및 TCP에서 분화된 세포에서 IL-6, CCL2, CXCL1, CCL5, TNF-a 및 Vitronectin의 mRNA 수준을 분석하였다. 그 결과, G15P1에서 상기 IL-6, CCL2, CXCL1, CCL5, TNF-a 및 Vitronectin 유전자 모두 증가함을 확인하였다(도 8 및 도 9).
6-3. WNT 신호 전달 유전자 발현 분석
세포배양 기질 변화에 따른 WNT 신호 전달 경로 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해 LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, RSPO2, Mstn 유전자의 발현 변화를 분석하였다.
qPCR을 수행하여 분화 2일차에 G15P1, G15 및 TCP에서 분화된 세포에서 상기 LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, RSPO2, Mstn의 mRNA 수준을 분석하였다. 분석결과, G15P1에서 LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, RSPO2의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 10).
6-4. IGF1/PI3K/Akt/mTOR 신호 전달 유전자 발현 분석
상기에서 확인한 신호경로 유전자 이외의 IGF1/PI3K/Akt/mTOR 신호 전달 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해 IGF1, PIK3R, mTOR, Rps6kb1 유전자의 발현 변화를 분석하였다.
qPCR을 수행하여 분화 2일차에 G15P1, G15 및 TCP에서 분화된 세포에서 상기 IGF1, PIK3R, mTOR, Rps6kb1의 mRNA 수준을 분석하였다. 분석결과, G15P1에서 IGF1, PIK3R, mTOR의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 11)
6-5. 그 외 주요 유전자의 발현 분석
상기에서 확인한 신호경로 유전자 이외의 중요한 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해 Cav3c, Hs3st5, stmn2, stmn4, Nos2, IL-1α의 발현 변화를 분석하였다.
qPCR을 수행하여 분화 2일차에 G15P1, G15 및 TCP에서 분화된 세포에서 상기 Cav3c, Hs3st5, stmn2, stmn4, Nos2, IL-1α의 mRNA 수준을 분석하였다. 분석결과, G15P1에서 Cav3c의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, Hs3st5, stmn2, stmn4, Nos2, IL-1α의 발현이 증가함을 확인하였다(도 12).
7. 헤파린 모사 모티프에 따른 유전자 발현 조절 분석
다음으로 헤파린 모사 모티프(PSS)를 함유하는 기질이 세포의 유전자 발현 변화에 미치는 영향을 확인하고자, PSS를 함유하는 기질에서 성장한 세포와 대조군인 TCP에서 성장하는 세포에서의 RNA 시퀀싱을 수행하여 전체 유전자의 발현을 비교 분석하였다. RNA-SEQ 데이터에서 상향조절 유전자로는 G15P1에서 1.8 배 이상 유도된 유전자를, 하향조절 유전자로는 TCP에서 1.8배 이상 유도된 유전자를 기준으로 선별하였다.
그 결과로서 얻은 후보 유전자의 온톨로지(ontology)를 DAVID 데이터베이스를 사용하여 분석하였다. RNA-SEQ 데이터는 TNF-α 신호 경로 유전자가 PSS 존재 하에 고도로 발현되는 것을 확인하였다(표 3). 그러나, Wnt 신호 및 TGF 베타 신호 관련 유전자는 G15P1에서 감소됨을 확인하였다(표 4).
상향 조절된 유전자는 Hippo 및 TNF 신호 전달 경로 및 염증과 밀접한 관련이 있음을 확인하였고, 하향 조절된 유전자는 Wnt 신호 전달 경로와 밀접한 관련이 있음을 확인하였다.
G15P1에서 상향 조절된 유전자의 KEGG 관련 경로.
용어 계수 % P값 농축 배수 (Fold Enrichment)
히포(Hippo) 신호 전달 경로 34 1.833873 1.86E-08 2.966344959
칼슘 신호 전달 경로 36 1.941748 1.55E-07 2.634812287
전신 홍반성 루프스 43 2.591923 1.46E-14 3.840529409
알코올 중독 42 2.531646 3.86E-09 2.729844413
이식편 대 숙주 질환 15 0.904159 2.18E-05 3.787284144
동종 이식 거부 14 0.843882 2.22E-04 3.282312925
바이러스성 심근염 17 1.024714 2.40E-04 2.825282012
식포 28 1.687764 2.71E-04 2.112753147
세포 접착 분자(CAMs) 26 1.567209 4.92E-04 2.107163853
제 I형 당뇨병 14 0.843882 6.40E-04 2.964669739
시토크롬 P450에 의한 생체 이물의 대사 14 0.843882 8.79E-04 2.87202381
바이러스성 발암 32 1.928873 0.001285 1.818770798
항원 처리 및 제시 15 0.904159 0.003243 2.401692384
사이토킨-사이토킨 수용체 상호 작용 32 1.928873 0.003274 1.714841038
자가 면역 갑상선 질환 13 0.783605 0.006743 2.403947494
TNF 신호 전달 경로 17 1.024714 0.007928 2.047681458
NOD 유사 수용체 신호 전달 경로 11 0.66305 0.008767 2.578960155
말라리아 10 0.602773 0.009182 2.735260771
화학 발암 15 0.904159 0.009224 2.140638864
약물 대사 - 시토크롬 P450 12 0.723327 0.010317 2.387136673
G15P1에서 하향 조절된 유전자의 KEGG 관련 경로.
용어 계수 % P값 농축 배수
(Fold Enrichment)
축삭돌기의 유도 29 1.564186 2.63E-07 2.96161071
밀착 연접 30 1.618123 3.92E-07 2.843322612
Wnt 신호 전달 경로 30 1.618123 5.38E-07 2.802991794
침샘 분비 21 1.132686 6.87E-07 3.592925845
멜라닌 생성 24 1.294498 8.79E-07 3.193711863
위산 분비 20 1.078749 1.00E-06 3.659461509
줄기 세포의 다능성을 조절하는 신호 전달 경로 29 1.564186 1.13E-06 2.768462185
cGMP-PKG 신호 전달 경로 33 1.779935 1.29E-06 2.542362733
기저 세포암 17 0.916936 1.76E-06 4.071982625
옥시토신 신호 전달 경로 31 1.67206 2.03E-06 2.584784205
TGF-β 신호 전달 경로 21 1.132686 3.68E-06 3.254768119
알도스테론 조절 나트륨 재흡수 14 0.755124 4.23E-06 4.610921502
심근 세포에서의 아드레날린 신호 29 1.564186 6.28E-06 2.54698521
암의 경로 56 3.020496 6.72E-06 1.858305895
cAMP 신호 전달 경로 33 1.779935 2.80E-05 2.206822474
액틴 세포 골격의 조절 34 1.833873 6.18E-05 2.093075181
국소 부착 33 1.779935 7.59E-05 2.100212692
CCL5, CXCL1 및 MCP1에 대한 RNA-SEQ 및 qPCR 결과의 전사 수준에서 PSS에 의해 유도된 배수 차이의 매우 좋은 상관 관계를 가짐을 확인하였다. TCP 또는 G15에 비해 G15P1에서 CCL5 및 CXCL1의 발현이 현저하게 높아 CCL5 및 CXCL1이 추후 연구에 강력한 후보 물질임을 확인하였다(도 8).
8. PSS의 분화 중 세포 기질과 접착 분자 조절
근육 세포 분화에는 세포 접착과 세포-기질간 상호작용이 매우 중요하다. 세포외기질(ECM)과 세포 접착과 연관된 분자에 초점을 둔 PCR array kit를 사용하여(SABiosciences, Qiagen) 분화 2일차에서 G15, G15P1 및 TCP에서 분화된 세포들의 유전자 발현을 비교하였다. 총 90개의 유전자 중 internal control을 제외한 84개의 유전자 중 16개(Adamts1, Adamts2, Adamts5, Adamts8, Cdh1, Cdh2, Cdh3, Itga2, Itgam, Itgax, Lama1, Lama2, MMP15, MMP3, MMP8, Thbs1)는 TCP보다 G15P1에서 2배 이상의 발현 감소를 보였다. 반대로, 비트로넥틴(vitronectin, Vtn), CD44, Cntn1, Entpd1, Fbln1, Itga4, PECAM1, Selp, Tnc 등의 유전자들은 G15P1에서 고도로 상향 조절됨을 확인하였다(도 13).
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Compositions for inhibiting myogenic differentiation, drug screening system and screening methods for treating muscle wasting <130> DP20170231 <150> KR 10-2017-0077543 <151> 2017-06-19 <160> 54 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M forward primer <400> 1 accggcctgt atgctatcca g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M backward primer <400> 2 aatgtgaggc gggtggaact g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myf5 forward primer <400> 3 ctgctgttct ttcgggacca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myf5 backward primer <400> 4 tattacagcc tgccgggaca 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoG forward primer <400> 5 cctacagacg cccacaatc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoG backward primer <400> 6 cccaggctga cagacaatc 19 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyHC forward primer <400> 7 acgccatcag gctcaagaag aaga 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyHC backward primer <400> 8 tgagtgtcct tgaggatgcc ttgt 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf4 forward primer <400> 9 gccaactacc ctcctttcct g 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf4 backward primer <400> 10 tctttggctt gggctcctc 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPNT forward primer <400> 11 ggccaaacaa gtgcaaatgt c 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPNT backward primer <400> 12 ggtggaagga ctcatcttgg tt 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL5 forward primer <400> 13 gctgctttgc ctacctctcc 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL5 backward primer <400> 14 tcgagtgaca aacacgactg c 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1 forward primer <400> 15 ctgggattca cctcaagaac atc 23 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1 backward primer <400> 16 cagggtcaag gcaagcctc 19 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP1 forward primer <400> 17 tctcactgaa gccagctctc t 21 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP1 backward primer <400> 18 caggcccaga agcatgaca 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hs3st5 forward primer <400> 19 cctcctgtat ctagttgcca ga 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hs3st5 backward primer <400> 20 ccaatgataa tggctttggg ga 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stmn4 forward primer <400> 21 atggaagtca tcgagctgaa ca 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stmn4 backward primer <400> 22 gggaggcatt aaactcaggc a 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nos2 forward primer <400> 23 gcaggtcttt gacgctcgga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nos2 backward primer <400> 24 atggccgacc tgatgttgcc 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1alpha forward primer <400> 25 cgaagactac agttctgcca tt 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1alpha backward primer <400> 26 gacgtttcag aggttctcag ag 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFG1 forward primer <400> 27 ctggaccaga gaccctttgc 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFG1 backward primer <400> 28 ggacggggac ttctgagtct t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3R1 forward primer <400> 29 acaccacggt ttggactatg g 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3R1 backward primer <400> 30 ggctacagta gtgggcttgg 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTOR forward primer <400> 31 accggcacac atttgaagaa g 21 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTOR backward primer <400> 32 ctcgttgagg atcagcaagg 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cav3v forward primer <400> 33 ggatctggaa gctcggatca t 21 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cav3v backward primer <400> 34 tccgcaatca cgtcttcaaa at 22 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2 forward primer <400> 35 tctcactgaa gccagctctc t 21 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2 backward primer <400> 36 caggcccaga agcatgaca 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 37 acggcatgga tctcaaagac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha backward primer <400> 38 gtgggtgagg agcacgtagt 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vitronectin forward primer <400> 39 cccctgaggc cctttttcat a 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vitronectin backward primer <400> 40 caaagctcgt cacactgaca 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP5 forward primer <400> 41 gaaagcacaa tgggtcctcc a 21 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP5 backward primer <400> 42 ctgacgcctg ttccacttct 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AXIN2 forward primer <400> 43 tgactctcct tccagatccc a 21 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AXIN2 backward primer <400> 44 tgcccacact aggctgaca 19 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR4 forward primer <400> 45 agtcctaacc ctccagaaca atcag 25 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR4 backward primer <400> 46 ggtaatatgg ttggcatcta agcg 24 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5 forward primer <400> 47 agccttcaat ccctgcgcct ag 22 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5 backward primer <400> 48 gacagggacg tctgtgagag cattg 25 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO2 forward primer <400> 49 atagaggccg ctgctttg 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO2 backward primer <400> 50 tgccgtgttc tggtttcc 18 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSTN forward primer <400> 51 agtggatcta aatgagggca gt 22 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSTN backward primer <400> 52 gtttccaggc gcagcttac 19 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPS6KB1 forward primer <400> 53 agacacagcg tgcttttact t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPS6KB1 backward primer <400> 54 gtgtgcgtga ctgttccatc a 21

Claims (9)

  1. 메타크릴화된 젤라틴과 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트)[poly {sodium-4-styrensulfonate}, PSS]이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔을 포함하는 근원세포(myoblast)의 분화 억제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하기 위한 것인, 분화 억제용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 메타크릴화된 젤라틴 1 내지 30 %w/v 및 폴리(소디움-4-스티렌설포네이트) 0.1 내지 20 %w/v를 포함하는 것인, 분화 억제용 조성물.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는 근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 소모성 질환의 치료제의 스크리닝 시스템.
  5. 메타크릴화된 젤라틴과 폴리 소디움-4-스티렌설포네이트(poly sodium-4-styrensulfonate, PSS)이 공중합(co-polymerization)된 하이드로겔에서 근원세포를 배양하는 단계;
    후보물질을 처리하고 근원세포를 분화시키는 단계; 및
    상기 후보물질이 처리된 세포에서 근원세포의 분화 또는 근관세포의 형성을 후보물질이 처리되지 않은 대조구 세포와 비교하는 단계를 포함하는,
    근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 후보물질이 처리된 세포 내에서 CXCL1, CCL5, CCL2, TNF-α, Vitronectin, Hs3st5, stmn4, Nos2 및 IL-1α로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준을 후보물질이 처리되지 않은 대조구 세포와 비교하는 더 단계를 포함하는, 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 감소하는 경우, 상기 후보물질을 근육 소모성 질환의 치료제로 선택하는 단계를 더 포함하는, 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 후보물질이 처리된 세포 내에서 klf4, NPNT, LRP5, AXIN2, LGR4, LGR5, IGF1, PIK3R1, mTOR 및 Cav3v 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준을 후보물질이 처리되지 않은 대조구 세포와 비교하는 단계를 더 포함하는, 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현 수준이 대조구 세포의 발현 수준보다 증가하는 경우, 상기 후보물질을 근육 소모성 질환의 치료제로 선택하는 단계를 더 포함하는, 근육 소모성 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법.
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