KR100779610B1

KR100779610B1 - 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논을 함유하는혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용약학조성물

Info

Publication number: KR100779610B1
Application number: KR1020060046746A
Authority: KR
Inventors: 김정애; 이응석
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2005-09-13
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2007-11-28
Also published as: KR20070030653A

Abstract

본 발명은 혈관신생 및 암의 성장을 억제하는 화학식 1로 표시되는 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 (1-furan-2-yl-3-pyridin-2-yl-propenone, FPP-3)을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 융모요막 모델에서의 신생혈관형성 억제 및 암세포 생장 억제 효과가 탁월하며, 비흉선 누드 마우스 종양 모델에서 암의 성장을 억제할 뿐 아니라 암세포의 전이를 억제하여, 암질환 및 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 사용할 수 있다.

Description

1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논을 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition comprising 1-furan-2-yl-3-pyridin-2-yl-propenone for treating or preventing angiogenesis-related disease and cancer disease}

본 발명은 혈관신생억제활성 및 암의 성장 억제 활성을 갖는 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

혈관신생 (angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아 발생 (embryonic development), 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다 (Folkman J et al., Int. Rev . Exp . Pathol ., 16, pp207-248, 1976).

성인의 경우 혈관내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다. 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다.

그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다. 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염 등이 있다. 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환, 알츠하이머 및 비만도 혈관신생과 관련이 있으며, 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다 (D'Amato RJ et al., Ophthalmology, 102(9), pp1261-1262, 1995 ; Arbiser　 JL, J. Am. Acad. Dermatol., 34(3), pp486-497, 1996 ; O'Brien KD et al. Circulation, 93(4), pp672-682, 1996 ; Hanahan D et al., Cell, 86, pp353-364, 1996).

특히 암의 경우 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 종양은 신생혈관을 통하여 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급받으며, 또한 종양까지 침투한 신생 혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어가는 기회를 줌으로써 암세포가 전이 (metastasis) 되도록 한다 (Folkman and Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, pp94-103, 1977; Polverini PJ, Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 6(3), pp230-247, 1995). 암 환자가 사망하는 주원인은 전이이며, 현재 임상에서 사용되는 화학요법이나 면역요법들이 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

염증성 질환의 대표적인 질환인 관절염은 자가면역 이상이 원인이지만, 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 연골이 파괴된다. 즉, 염증을 유도하는 사이토카인의 도움으로 활액세포와 혈관내피세포가 활액강에서 증식을 하여 혈관신생이 진행되면서 연골부에 발생하는 결합조직층인 관절 판누스를 형성하여 쿠션 역할을 하는 연골이 파괴된다 (Koch AE et al., Arthritis. Rheum., 29, pp471-479, 1986; Stupack DG et al., Braz J. Med. Biol. Rcs., 32(5), pp578-581, 1999; Koch AE, Atrhritis . Rheum ., 41(6), pp951-962, 1998).

해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 많은 안과질환도 혈관신생이 원인이 되고 있다 (Jeffrey MI et al., J. Clin . Invest ., 103, pp1231-1236, 1999). 그 대표적인 예로 노인에게 일어나는 퇴화반 (macular degeneration), 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장과 신생혈관에 의한 각막 질환과 같은 질병은 혈관신생이 원인이 되는 질병들이다 (Adamis AP et al., Angiogenesis, 3, pp9-14, 1999). 그 중 당뇨병성 망막증은 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 질병이다.

붉은 반점과 인설의 피부가 특징인 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데 치유되지 않으며 고통과 기형을 수반한다. 정상인 경우 각질세포가 한달에 한번 증식하는데 비해 건선 환자는 적어도 일주일에 한번 증식한다. 이런 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다 (Folkman J, J. Invest . Dermatol ., 59, pp40-48, 1972).

혈관 신생 억제제를 이러한 각종 혈관신생 관련 질환의 치료제로 적용할 수 있으므로, 최근에 혈관신생을 억제시켜서 상기 질환들을 치료하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이와 같은 혈관신생 억제제는 보통 환자에게 장기적으로 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이어야 가장 이상적인 치료제로 사용할 수 있다. 따라서 혈관신생 억제제로서 독성이 미비한 약제의 개발이 요구되어지고 있다.

1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논은 NF-κB 활성을 억제하여 결과적으로 산화질소 (NO, Nitric oxide) 및 종양괴사인자-알파 (TNF-α, Tumor Necrosis Factor-α)의 생성을 억제하여 항염작용을 한다는 리 등 (Lee ES et al., Biol. Pharm. Bull ., 27(5), pp617-620, 2004)의 보고가 있으나, 본 발명의 화합물이 혈관신생억제 및 항암 활성을 가진다는 것에 대해서는 교시되거나 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 본 발명의 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논이 우수한 혈관신생억제 및 암세포 성장 억제 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 (1-furan-2-yl-3-pyridin-2-yl-propenone)을 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는　 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논(1-furan-2-yl-3-pyridin-2-yl-propenone)을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 (1-furan-2-yl-3-pyridin-2-yl-propenone)을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 암질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 혈관신생으로 인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 또는 암의 침윤과 전이가 있다.

상기 암질환은 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 용매, 바람직하게는 에탄올에 수산화칼륨, 수산화나트륨 등과 같은 강염기, 바람직하게는 수산화나트륨을 34 ㎎을 10 내지 30 ℃의 온도 및 질소 존재 하에서 녹인 용액 상에서 알데히드 화합물, 바람직하게는 54.85 mM의 2-피리딘카르복스알데히드와 케톤화합물, 바람직하게는 49.86 mM의 2-아세틸퓨란을 10 내지 30℃ 하에서 2 내지 5시간 교반시킨 후, 그 혼합물에 중량비 5 내지 10배의 물을 넣은 후 수가용성 분획물은 디클로로메탄으로 추출하여 수가용성 분획물 및 디클로로메탄 가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 유기층인 디클로로메탄 가용성 분획물은 물 및 포화된 염화나트륨 용매로 세정하여 황산나트륨으로 건조시킨다. 수집된 용매는 감압건조하고 잔사는 실리카겔 칼럼 크로마토크래피(SiO₂column chromatography)를 수행할 수 있으며, 에틸 아세테이트 : n-헥산의 혼합용매, 바람직하게는 에틸 아세테이트: n-헥산의 1: 2의 혼합용매로 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 분리 및 동정할 수 있다.　

상기와 같은 방법으로 수득한 본 발명의 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 화합물은 닭의 융모요막 모델에서 혈관내피성장인자 및 섬유아세포증식인자와 같은 신생혈관형성 유도물질의 처리에 따른 신생혈관형성 증가를 억제하였으며, 융모요막에 암세포를 이식함으로 활성된 신생혈관형성 또한 억제하였으며, 상기 결과에 부합하여 교아종의 부피증대 또한 억제하였으므로, 혈관신생 억제 및 암질환 예방 및 치료를 위한 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 화합물은 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)에 의한 혈관신생을 농도의존적으로 억제하고 HT-1080 인간 섬유아종 세포로 이식된 비흉선 누드 마우스 종양모델에서 종양의 부피증대를 억제하고 HT-1080 인간 섬유아종 세포에서 암세포 이동(migration) 및 암세포 침투(invasion)를 저해하여 암세포 전이를 억제하며, MMP 및 VEGF의 활성 및 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기 공정으로 얻어지는 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 치료 및 예방에 효과적인 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 화합물을 포함하는 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

본 발명의 화합물을 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

또한, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　 또한 그 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 제형예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 제형예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제형예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 1- 퓨란 -2-일-3-피리딘-2-일- 프로페논의 제조

2-피리딘카르복스알데히드(2-pyridinecarboxaldehyde, 5.2 ㎖, 54.85 mM)를 25 ℃의 온도에서 질소 하에서 에탄올에 녹인 34 ㎎의 고체상 수산화나트륨 용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 2-아세틸퓨란 (2-acetylfuran, 5 ㎖, 49.86 mmol)을 25 ℃의 온도 하에서 3 시간동안 교반시킨 후, 그 혼합물에 80 ㎖의 물을 넣은 후,　 120 ㎖의 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)로 추출하고, 유기층은 80 ㎖×2의 물 및 포화된 80 ㎖의 염화나트륨 (NaCl) 용매로 세정하고, 황산나트륨 (Na₂SO₄)으로 건조시켰다. 용매는 감압건조하고, 잔사는 실리카켈 컬럼 크로마토그래피 (정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v) 방법으로 정제하여 3.84 g의 하기 물성치를 갖는 노란색 결정의 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 (수득율 38.7 %)을 수득하였다 (이하, FPP-3이라 명함).　　

TLC(EtOAc: n-Hexane = 1:2, v:v), R_f =0.167

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.70 (ddd, J = 4.8, 1.7, 0.9Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 7.97 (d, J= 15.4Hz, 1 H, -CH=CH-CO), 7.84 (d, J= 15.4Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.75 (dt, J = 7.7, 1.8Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.68 (dd, J = 1.7, 0.7Hz, 1 H, 퓨란 H-5), 7.48 (dt, J = 7.8, 1.2Hz, 1 H, 피리딘 H-3), 7.42 (dd, J = 3.6, 0.7Hz, 1 H, 퓨란 H-3), 7.31 (ddd, J = 7.6, 4.8, 1.1Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 6.61 (dd, J = 3.6, 1.7Hz, 1 H, 퓨란 H-4)

참고예 1. 실험재료 및 시약, 기기 분석

유정란은 영남대학교 부속목장 (경산,한국)에서 구입하여 사용하였으며, 정상 인간 간세포인 Chang 세포, 인간 교아종 (glioblastoma) 세포인 A172 세포, 인간 신경아세포종 (neuroblastoma) 세포인 SK-N-SH, 인간 방광암 (bladder cancer) 세포인 HT-1376 세포, 인간 대장암 세포인 HT-29 세포, 인간 간암세포인 HepG2 세포, 인간 섬유아종 (fibrosacoma) 세포인 HT-1080 세포는 ATCC (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 또한, 인간 제대정맥 내피세포(Human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)는 Clonetics(San Diego, CA)에서 구입하였다.

생후 5주된 비흉선 누드 마우스(athymic nude mice)는 오리엔트사(Orient Co., Ltd, Seoul, Korea)에서 구입하였다.

2-피리딘카르복스알데히드 (2-carboxaldehyde)와 2-아세틸퓨란(2-acetylfuran) 및 코티존 아세테이트 (cortisone acetate)는 알드리치사 (Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 섬유아세포증식인자 (FGF, fibroblast growth factor)는 인비트로젠 (Invitrogen, USA)에서 구입하였으며, 혈관내피성장인자 (VEGF, vascular endothelial growth factor)는 알앤디 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였으며, Tetrac과 XT199는 알바니 약학대학 약학연구소로부터 제공받았으며, 와트만 필터 디스크 (whatman filter disc)는 와트만사(Whatman, UK)로부터 구입하였다.

합성된 물질의 구조 규명에는 Bruker AMX 250 MHz 모델을 사용하여 ¹H-NMR 스펙트라 (spectra)를 얻었으며, 액체크로마토그래피/질량분석기(LC/Mass Spectrometry)는 피니간 LCQ 어드벤티지(Finnigan LCQ Advantage) LC/MS/MS 분광계(spectrometry)를 엑스칼리버(Xcalibur) 프로그램을 이용하여 분석하였다. TLC(Thin-layer chromatography)와 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)는 머크사 (Merck)의 실리카겔 키젤겔 (Silicagel Kieselgel) 60 F₂₅₄ (230 ~ 240 mesh)을 사용하였다.

참고예 2. 세포 배양

사람의 암 세포주로 HT-29 대장암세포, HT-1376 방광암세포, Hep2G 간암세포, SK-N-SH 신경암세포, A172 신경교암세포, HT-1080 섬유아종세포 및 정상간세포 Chang은 미국 타이프 컬처 콜렉션(ATCC, Rockville, MA)에서 구입한 것을 사용하였다. 세포를 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, GIBCO), 200 IU/㎖ 페니실린, 200 (g/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate) 를 포함하는 MEM (powdered Eagle’s minimum essential medium, Sigma Chemical CO.) 배지조건, 37 ℃의 온도, 5 % CO2/ 95 % 공기 조건의 가습 배양기에서 배양하였다. 이때, 배양 배지는 하루걸러 한번씩 교체하여 주었다. 컨플루언트 (confluent)하게 성장시킨 후, 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 트립신 (trypsin) 처리하여 2차 배양 (subculture)하였다.

한편, HUVEC 세포는 0.2%의 젤라틴(gelatin)이 코팅된 플라스크에서 배양되었다. 이 HUVEC 세포는 EBM-2(Endothelial Cell Basal Medium-2, Clonetics, San Diego, CA) 배지에서 배양하였다. 이러한 EBM-2 배지는 우태아혈청(FBS), 하이드로코르티손 (hydrocortisone), hFGF-B(Human Basic Fibroblast Growth Factor), 혈관내피성장인자 (VEGF, vascular endothelial growth factor), R3-IGF-1(human recombinant insulin-like growth factor), 아스코르브산(ascorbic acid), hEGF(human epidermal growth factor), GA-1000 및 헤파린(heparin)을 포함한다. 본 실험예에서는 1번째 계대와 6번째 계대 사이의 HUVEC 세포를 사용하였다.

실험예 1. 닭의 융모요막 분석 ( CAM assay )을 통한 FPP -3의 혈관신생억제효과　　

생체내 시험상 (in vivo)에서의 항혈관신생효과를 확인하기 위하여, CAM (CAM, chorioallantoic membrane) 분석을 실시하였다 (Nguyen M et al., Microvascular Res ., 47, pp31-40, 1994). 닭의 유정란을 온도 37 ℃, 상대습도55 %를 유지해주면서 배양시켜 10일째에 기낭 (air sac) 부위에 피하주사침 (hypodermic needle, 녹십자의료공업, 한국)을 이용하여 첫 번째 작은 구멍을 뚫고, 창 (window)을 낼 유정란의 평평한 부위에 두 번째 구멍을 뚫었다.

첫 번째 구멍인 기낭 부위의 구멍을 통해 공기를 빼냄으로써, 융모요막 (CAM, chorioallantoic membrane)이 유정란의 껍질로부터 분리가 되게 하여 이 부위를 회전연마기 (grinding wheel, Multipro 395JA, Dremel, Mexico)로 절단하여 창을 만들었다. 다음으로, 와트만 필터 디스크 (whatman filter disk #1, whatman사, USA)에 코티존 아세테이트(cortisone acetate) 3 ㎎/㎖을 처리하여 건조시킨 후 섬유아세포증식인자(FGF)는 15 ng/CAM의 농도로, 혈관내피성장인자 (VEGF)는 20 ng/CAM의 농도로 적셔두었다.

만들어 둔 창을 통해 필터 디스크를 혈관 위에 얹고, 본 발명의 실시예 1의 화합물 FPP-3을 디메틸술폭시화물 (DMSO)로 녹여 인산완충용액(PBS)으로 희석하여 농도별 (100 ng, 1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 20㎍)로 처리하였다. 약물처리 3일 뒤, 필터 디스크가 얹힌 CAM 부분을 떼어내어 인산완충용액을 이용하여 씻어준 후, 입체현미경 (Stemi SV6 stereomicroscope, Carl Zeiss, Germany)과 Image-Pro Plus software (Media Cybernetics; Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 이미지를 촬영하여 혈관 가지의 개수를 측정하고 자료를 분석하였다 (표 1 참조).　

Treatment	Branch points ± SEM	% of inhibition ± SEM
PBS	37.0± 8.8

VEGF (20 ng/CAM)	83.0± 13.0
VEGF + FPP-3 (1㎍/CAM)	62.8± 10.2	30.0± 13.6
VEGF + FPP-3 (5㎍/CAM)	52.6± 6.9	34.4± 9.1
VEGF + FPP-3 (10㎍/CAM)	40.8± 9.6	36.3± 12.8

FGF (15 ng/CAM)	72.5± 6.2
FGF + FPP-3 (100 ng/CAM)	45.0± 3.7	41.2± 4.8
FGF + FPP-3 (1㎍/CAM)	44.6± 6.3	41.7± 4.8
FGF + FPP-3 (5㎍/CAM)	37.6± 4.3	50.9± 5.6
FGF + FPP-3 (10㎍/CAM)	31.9± 5.4	58.4± 7.0

표 1에 나타난 바와 같이, 혈관내피성장인자 및 섬유아세포증식인자와 같은 신생혈관형성 유도물질의 처리에 따른 신생혈관형성 증가는 FPP-3의 처리로 그 증가율이 감소됨을 나타냈다.

실험예 2. 암세포를 이식한 닭의 융모요막 모델을 이용한 FPP -3의 혈관신생억제효 과

구의 방법 (Gu JW et al., Cancer , 103(2), pp422-431, 2000)에 따라 배양 10일째의 유정란에 실험예 1과 같은 방법으로 창을 만들고 이 곳을 통하여 C6 교아종 (glioblastoma) 세포를 1×10⁶ 세포수/25 ml을 융모요막 (CAM)에 접종시켰다. 접종 2시간 후 양성대조군으로 XT199와 Tetrac을 각각 10 ㎍/CAM을 처리하였으며, 실시예 1의 FPP-3 화합물을 암세포가 접종된 부위에 농도별 (5, 10 ㎍/CAM)로 처리한 후 다시 7일간 배양하여 종양조직이 형성된 융모요막 부위 전체를 떼어내어 인산완충용액으로 씻어준 후, 입체현미경 (Stemi SV6 stereomicroscope, Carl Zeiss, Germany)과 Image-Pro Plus software (Media Cybernetics; Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 이미지를 촬영하여 혈관 가지의 개수를 측정하고 자료를 분석하였다 (도 1 참조). 또한, 촬영을 마친 후 종양 조직의 무게를 측정하고 RNA 분리 및 형태학적 연구를 위하여 10 % 포르말린 또는 액체질소에 보관하였다.

Treatment	Branch points ± SEM	% of inhibition ± SEM
C6 (1×10⁶cells/ CAM)	187.0± 11.9
C6 + XT199 (10 ㎍)	146.1± 10.3	21.8± 5.5
C6 + Tetrac (10 ㎍)	181.7± 13.1	2.9± 7.0
C6 + FPP-3 (5 ㎍)	111.5± 12.2	40.4± 6.5
C6 + FPP-3 (10 ㎍)	118.3± 11.7	36.8± 6.3

Treatment	Ave. tumor weight (mg) ± SEM	% of inhibition ± SEM
C6 (4 × 10⁶ cells/CAM)	99.0± 7.8
C6 + FPP-3 (5 ㎍)	72.1± 6.7	26.4± 6.8

표 2에 나타난 바와 같이, 암세포가 이식된 융모요막에서 활성된 신생혈관형성은 FPP-3의 처리로 억제되었으며, 상기 결과에 부합하여 표 3에 나타난 바와 같이 교아종의 부피증대 또한 억제하였다.

실험예 3. HUVEC 세포에서 FPP -3의 혈관형성억제효과

HUVEC 세포에서 FPP-3가 혈관형성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 96-웰 플레이트에 HUVEC 세포를 배양시켰다. 여기서 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각 웰에 40㎕의 Matrigel(BD biosciences, Bedford, MA)을 코팅한 다음, 96-웰 플레이트를 37℃에서 30분 동안 보관한 후 사용하였다.

HUVEC 세포는 2%의 우태아혈청을 포함하는 EBM-2(Endothelial Cell Basal Medium-2, Clonetics, San Diego, CA) 배지에 혼탁시켰다. 이러한 HUVEC 세포는 상기matrigel이 코팅된 각 웰에 1×10⁴개의 세포가 주입되도록 하였다. 그 다음으로, 각각 다른 농도의 FPP-3를 각 웰에 첨가하고 7시간 동안 보관하였다. 이렇게 처리된 HUVEC 세포는 역상현미경과 연결된 디지털카메라로 촬영하였고, 그 사진을 도 2a 내지 도 2f에 나타내었다.

도 2a는 대조군(control)으로 FPP-3를 처리하지 않은 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2b는 100nM의 FPP-3를 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2c는 500nM의 FPP-3를 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2d는 1μM의 FPP-3를 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2e는 5μM의 FPP-3를 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2f는 10μM의 FPP-3 를 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이다.

먼저, 도 2a를 참조하면, 대조군(control)에서 많은 혈관이 형성된 것을 관찰할 수 있다. 여기서, FPP-3의 농도를 높일수록 형성되는 혈관의 양이 감소하는 것을 확인 할 수 있다. 이에 따라, FPP-3가 HUVEC 세포의 혈관 형성을 억제한다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 4. 암세포를 이식한 비흉선 누드 마우스 모델을 이용한 FPP -3의 혈관신생억 제효과

생후 5주된 비흉선 누드 마우스(athymic nude mice)는 21±1℃의 온도와 12시간마다 명암주기가 반복되도록 빛이 조절된 환경에서 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 이러한 비흉선 누드 마우스는 적어도 2일 동안 상기와 같은 환경에 둔 다음 실험에 사용하였다. 후술할 동물 실험들은 한국 국립보건원의 윤리적 규정에 맞도록 실행하였다.

배양된 5 ×10⁶개의 HT-1080 세포가 함유된 MEM 배지 100㎕를 비흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사한 후 10일 뒤에 생성된 종양의 부피를 측정하였으며, 그 다음으로 일주일에 2번 간격으로 측정하였다. 캘리퍼스(calipers)를 이용하여 생성된 종양의 작은 직경과 큰 직경을 측정하여 하기 수학식 1을 근거로 종양의 부피를 산출해내었다.

V = 1/2(L×W²)

여기서, V는 종양의 부피를 나타내며, L은 큰 직경, W는 작은 직경을 나타낸다.

상기와 같은 수학식 1을 근거로 비흉선 누드 마우스에 생성된 종양의 부피가 200㎣이 되었을 때부터 매일 비흉선 누드 마우스에 실시예 1의 화합물인 FPP-3를 경구투여한 다음 종양의 부피 변화를 측정하였다. 여기서, 비흉선 누드 마우스 1㎏당 1㎎의 FPP-3를 20일간 투여하였다.

이하, 도 3을 참조하여 설명하도록 한다. 도 3은 비흉선 누드 마우스 모델에서 FPP-3 투여에 따른 종양의 부피 변화를 나타낸 그래프이다.

여기서 가로축은 최초 FPP-3 투여일을 기준으로 경과한 날짜(Days After Drug Treatment)를 나타내며, 세로축은 비흉선 누드 마우스 모델에서 측정한 종양의 부피 증가(Tumor Volume Increase, ㎣)를 나타낸 것이다.

매일 FPP-3를 경구투여한 비흉선 누드 마우스의 실험 결과는 FPP-3로 나타내었고, 같은 조건에서 FPP-3를 경구투여하지 않은 비흉선 누드 마우스의 실험 결과는 대조군(control)으로 나타내었다. 여기서, 실험 오차를 줄이기 위하여 각 군마다 5마리의 비흉선 누드 마우스 모델을 대상으로 실험하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 FPP-3를 매일 투여한 비흉선 누드 마우스의 종양이 대조군(control)의 종양에 비해 그 부피의 증가율이 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

실험예 5. FPP -3의 암세포 이동( migration ) 억제효과

90% 컨플루언트하게 배양된 HT-1080 암세포에 25㎍/㎖의 마이토마이신 C(mitomycin C)을 30분 동안 전처리하였다. 마이토마이신 C를 처리한 후, 배양 플레이트에서 팁을 이용하여 상처를 입혀 1㎜ 폭의 줄이 생기도록 하였다(Mi-Sung Kim et al ., Cancer Research, 63, 5454-5461, 2003).

그 후, HBSS(Hanks balanced salt solution)로 배양 플레이트의 HT-1080 세포를 세척한 다음, 시간의 경과에 따른 암세포 이동을 관찰하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 FPP-3의 세포이동 억제효과를 나타내는 사진이다.

도 4에서 가로축은 0, 6, 12, 24시간(Hr)의 경과를 나타낸 것이다. 여기서, 상측의 사진들은 HT-1080 세포에 상기와 같은 처리를 한 다음 세포이동을 관찰한 대조군(control)이며, 하측의 사진들은 대조군과 같은 조건에서 30μM의 FPP-3를 처리한 세포의 이동을 관찰한 것으로, 각각 100배율로 확대한 사진이다.

배양 플레이트에서 배양된 HT-1080 세포에 상처를 입혀 1㎜ 폭의 줄이 생기고, 1㎜폭의 줄 상하측에는 다수의 HT-1080 세포가 배양되고 있는 것을 알 수 있었다(0 hr). 여기서, 6시간, 12시간, 24시간이 경과함에 따라, 대조군에서는 1mm폭의 줄이 없어지고 HT-1080 세포가 1㎜폭의 줄에 이동하여 배양됨을 알 수 있었다. 그러나 FPP-3를 처리한 HT-1080 세포의 경우 24시간 경과 후에도 1㎜폭의 줄에 세포가 거의 이동하지 못한 것을 알 수 있었다. 따라서, FPP-3가 암세포의 이동을 눈에 띄게 억제한다는 것을 알 수 있다.

실험예 6. FPP -3의 암세포 전이 억제 효과

FPP-3의 암세포 전이 억제 효과를 알아보기 위하여, in vitro에서 HT-1080 세포를 이용하여 실험하였다(Mi-Sung Kim et al., Cancer Research, 63, 5454-5461, 2003 Sang-Oh Yoon et al., The journal of Biological chemistry, 276, 20085-20092, 2001; Sonia Zorzet et al., The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 295, 927-933, 2000). 여기서 사용된 배양 플레이트는 다수의 8 mm 크기의 구멍(pore)을 갖는 폴리카보네이트 (polycarbonate) 필터를 포함하는 24웰 플레이트(Corning Costar, Cambridge, MA)를 사용하였다. 이 폴리카보네이트 필터의 하면을 0.5㎎/㎖ 농도의 제1형 콜라겐(type Ⅰ collagen) 20ℓ로 코팅하였으며, 그 상면은 1.5㎎/㎖ 농도의 Matrigel(BD biosciences, Bedford, MA) 20ℓ로 코팅하였다. 여기서, 폴리카보네이트 필터의 하부 영역은 10% FBS를 함유한 배지로 채웠으며, HT-1080 세포는 폴리카보네이트 필터의 상부에 접종하였다. 이렇게 접종된 HT-1080 세포를 37℃에서 18시간동안 배양한 다음 폴리카보네이트 필터의 하면에 침투된 세포를 메탄올(methanol)로 고정(fix)하고, 헤마톡시린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다. 그 결과는 도 5a 내지 도 5d에 나타내었다.

도 5a 내지 도 5d는 FPP-3의 암세포 전이 억제 효과를 확인하기 위하여 폴리카보네이트 필터의 하면을 400배율로 관찰한 현미경 사진으로, 각각 대조군, 10μM FPP-3 처리군, 20μM FPP-3 처리군 및 30μM FPP-3 처리군의 암세포 침투능을 나타낸 사진이다.

여기서, FPP-3를 처리한 경우 대조군에 비해 폴리카보네이트 필터의 하면에 침투한 암세포가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있으며, 이에 따라 FPP-3가 암세포의 전이를 농도의존적으로 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.

실험예 7. 암세포에서 FPP -3의 MMP 분비억제 효과

FPP-3가 암세포에서 MMP(Matrix Metalloproteinase)분비에 미치는 효과를 알기 위하여, 6-웰 플레이트(6-well plate)의 각 웰에 1×10⁶개의 HT-1080세포를 주입하였다. 이렇게 주입된 HT-1080 세포는 12시간동안 10% 우태아혈청(FBS)를 포함하는 MEM배지에 배양시켜 플레이트에 HT-1080 세포가 부착되도록 하였다. 그 다음, 우태아혈청(FBS)을 포함하는 MEM배지를 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 MEM 배지로 세정하였다. 이 HT-1080세포는 다시 혈청이 포함되지 않은 MEM 배지에 24시간동안 배양되었다. 이렇게 24시간동안 HT-1080 세포를 배양한 다음, 6-웰 플레이트에서 상층액을 각각 수득하여 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 수행하였다(Herron et al ., J. Biol . Chem ., 261, 2814-2818, 1986).

젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography) 과정을 간단하게 설명하면, 상기 6-웰 플레이트에서 얻은 상층액을 젤라틴이 포함된 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis) 젤(gel)에서 전기영동하였다. 전기영동을 수행한 후에 SDS를 제거하기 위하여 완충액(50mM Tris-HCl, pH7.5, 100mM NaCl, 2.5% Triton X-100) 에 SDS-PAGE 젤을 두 번 세정하였다. 그 다음으로, SDS-PAGE 젤을 37℃에서 배양완충액(50mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 10mM CaCl₂ _,0.02% NaN₃)에 배양하였다. 이 SDS-PAGE 젤은 0.25% 쿠마시블루 용액(Coomassie brilliant blue R250, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)으로 염색한 다음 탈색(destaining)하였다.

또한, FPP-3가 TPA에 의해 유도된 MMP 활성화에 미치는 영향을 검토하기 위하여 상기와 같이 FPP-3 처리 시, TPA 12 ng/㎖를 같이 처리하였다.

이러한 실험 결과는 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.

도 6a 및 도 6b는 HT-1080 세포에서 FPP-3의 MMP 분비억제 효과를 나타낸 것으로, 도 6a에서 각 레인(lane)은 24시간 동안 각각의 HT-1080세포에 처리한 FPP-3의 농도(μM)에 따른 MMP-2와 MMP-9의 활성을 나타낸 것이다.

여기서, MMP-2와 MMP-9는 SDS-PAGE에 포함된 젤라틴을 분해하는 젤라틴 분해효소의 기능을 갖고 있다. 이에 따라, MMP-2와 MMP-9이 존재하는 곳에서는 밴드(band)를 관찰할 수 있다. 먼저 도 6a를 참조하면, FPP-3를 0μM에서 30μM까지 처리하였을 때, 처리한 FPP-3의 농도가 높아질수록 밴드가 흐려지는 것을 관찰할 수 있다. 이에 따라, 처리하는 FPP-3의 농도가 높아질수록 HT-1080세포에서 분비되는 MMP-2와 MMP-9의 효소 활성이 낮아지는 것을 알 수 있다.

다음으로 도 6b를 참조하면, 첫번째 레인(lane)은 TPA와 FPP-3를 처리하지 않았을 때의 결과이며, 두번째 레인은 TPA 12ng/㎖을 처리하고 FPP-3를 처리하지 않았을 때의 결과이고, 세번째 레인은 TPA 12ng/㎖을 처리하고 FPP-3 20μM을 처리한 결과이고, 네번째 레인은 TPA 12ng/㎖을 처리하고 FPP-3 30μM을 처리한 결과이다. 여기서, 상대적으로 크기가 큰 MMP-9 단백질이 SDS-PAGE 젤의 상측에 존재하며, 그 하측에 MMP-2 단백질의 전구물질인 PRO-MMP-2 단백질과, ACTIVE-MMP-2 단백질이 존재한다.

여기서, MMP-2, MMP-9는 젤라틴 분해효소로서, SDS-PAGE 젤에 포함된 젤라틴을 분해하여 도 6b와 같은 밴드(band)가 형성되도록 한다. TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)의 존재하에서 이러한 MMP-2, MMP-9의 발현이 증가한다. 이에 따라, 첫 번째 레인은 HT-1080세포에 TPA로 자극하지 않았기 때문에, MMP-9와 active-MMP-2에서는 밴드를 거의 관찰할 수 없으며, MMP-2의 전구체인 pro-MMP-2에서는 밴드가 관찰되었다. 두 번째 레인은 HT-1080 세포에 TPA만을 처리한 결과를 나타낸 것으로, MMP-9과 MMP-2에서 진한 밴드를 관찰할 수 있다. 세 번째 및 네 번째 레인은 각각 TPA의 존재하에서 FPP-3를 20μM 및 30μM의 농도로 각각 처리하였을 때의 결과를 나타낸 것으로 FPP-3의 처리 농도가 높아질수록 MMP-2와 MMP-9의 밴드 진하기가 흐려지는 것을 알 수 있다.

이에 따라, FPP-3는 HT-1080세포에서 TPA에 의해 활성화된 MMP-2와 MMP-9의 분비량을 감소시키는 것을 확인할 수 있다.

실험예 8. 암세포에서 FPP -3의 VEGF 분비억제 효과

FPP-3가 암세포에서 VEGF(Vascular endothelial growth factor, 혈관성장인자) 분비에 미치는 효과를 알기 위하여, HT-1080 세포를 대상으로 실험하였다. 이 VEGF는 다양한 종류의 암세포에서 분비되어 혈관신생을 촉진시키는 역할을 하는 사이토카인(cytokine)이다.

HT-1080 세포는 24-웰 플레이트(24-well plate)에서 혈청이 존재하지 않는 배지에서 각기 다른 농도의 FPP-3 존재하에 24시간동안 배양되었다. 여기서 대조군(control)으로 사용된 HT-1080 세포에는 FPP-3를 처리하지 않았다. 24시간 동안 HT-1080세포를 배양한 다음, 각 웰에서 상층의 배지만을 수집하였다. 이렇게 수집된 상층액은 세포 외부로 배출된 VEGF 농도를 측정하는데 사용하였다. 여기서, 배출된 VEGF의 농도는 Quantikine human VEGF ELISA kit(R&D system, Minneapolis, MN)를 사용하여 측정하였다. VEGF 농도의 측정 방법은 Quantikine human VEGF ELISA kit의 사용법에 따라 실험하였다.

도 7은 HT-1080 세포에서 FPP-3의 VEGF 분비억제 효과를 나타낸 것으로, 가로축은 FPP-3의 농도(μM)를 나타내며, 세로축은 VEGF의 농도(ng/㎖)를 나타낸 것이다. 여기서, 대조군(control)은 FPP-3를 처리하지 않은 HT-1080 세포의 실험결과를 나타낸 것이다.

도면을 참조하면, 대조군에서 VEGF가 가장 많이 분비된 것을 볼 수 있으며, FPP-3의 농도가 1, 10, 20μM의 농도로 점점 높아짐에 따라 HT-1080 세포에서 분비되는 VEGF의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이에 따라, FPP-3가 암세포인 HT-1080세포에서 분비되는 VEGF의 양을 감소시킨다는 것을 알 수 있다.

실험예 9. FPP -3의 세포독성 실험

세포 생존률을 측정하기 위하여 참고예 2의 각 세포를 4 내지 5일 배양하여 24웰 플레이트에 5×10⁴ 세포/웰의 밀도로 분주하였고, 각 웰의 배지 용량은 1 ㎖로 맞추었다. 그 후 FPP-3를 각각 2, 10, 25, 50, 100, 250 μM 농도로 처리하여 48시간동안 배양한 후, 100㎕의 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide ; 5 g MTT/ℓin H₂O)를 첨가한 후 4시간 더 세포를 배양하였다. 그 후, 각각의 세포가 포함된 웰에 디메틸술폭시화물 (DMSO) 200 ㎕를 첨가하고 환원된 MTT 결정을 용해하기 위하여 피펫으로 혼합하였다. 상대적인 세포 생존률을 540 nm 필터를 가진 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, Menlo Park, CA)로 스캐닝하여 측정하였다 (표 4 참조).

도 8에 나타난 바와 같이, FPP-3 화합물은 여러 종류의 사람 암세포에 대한 독성은 고농도에서만 나타난 반면 저농도에서는 독성을 나타내지 않았다. 또한 표 4에 나타난 바와 같이, 정상세포인 Chang 세포에 대한 독성 농도도 IC₅₀가 50 μM 이상으로 나타나 세포독성은 크지 않았다.

	IC₅₀
Chang	>50
HT29	50
HT-1376	25
A172	25
SK-N-SH	18
HepG2	18
HT-1080	20

하기에 본 발명의 FPP-3 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

FPP-3 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2. 정제의 제조

FPP-3 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

FPP-3 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4. 주사제의 제조

FPP-3 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5. 액제의 제조

FPP-3 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 화합물은 융모요막 모델에서 신생혈관형성을 억제하고 암세포 성장을 억제하며 비흉선 누드 마우스 종양 모델에서 암의 성장을 억제할 뿐 아니라, 암세포에서 암전이를 억제하기 때문에 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로서 이용될 수 있다.

도 1은 C6 교아종 (glioblastoma) 세포에서 FPP-3의 혈관신생 억제효과를 나타낸 것이고,

도 2a 내지 도 2f는 HUVEC 세포에서 FPP-3의 혈관형성 억제효과를 나타낸 것이고,

도 3은 비흉선 누드 마우스 모델에서 FPP-3 투여에 따른 종양의 부피 변화를 나타낸 것이고,

도 4는 HT-1080 세포에서 FPP-3의 암세포 이동 억제효과를 나타낸 것이고,

도 5a 내지 5d는 각각 대조군, 10μM FPP-3 처리군, 20μM FPP-3 처리군 및 30μM FPP-3 처리군의 HT-1080 세포 침투능을 나타낸 것이고,

도 6a 및 도 6b는 HT-1080 세포에서 FPP-3의 MMP 분비억제 효과를 나타낸 것이고,

도 7은 HT-1080 세포에서 FPP-3의 VEGF 분비억제 효과를 나타낸 것이고,

도 8은 FPP-3의 암세포 독성 실험 결과를 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논(1-furan-2-yl-3-pyridin-2-yl-propenone)을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하며,

류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이로 이루어진 군에서 선택된 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.

[화학식 1]
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1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논 (1-furan-2-yl-3-pyridin-2-yl-propenone)을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 3항에 있어서, 암질환은 폐암 또는 자궁경부암에서 선택된 하나 이상의 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.