KR100417172B1 - 은행엽 엑스를 유효성분으로 하는 혈관신생 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 은행엽 엑스를 유효성분으로 하는 혈관신생 억제제에 관한 것으로, 은행엽 엑스를 혈관신생 억제제로 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 은행엽 엑스는 사람의 혈관내피세포(HUVEC)를 이용한 모세혈관과 같은 관구조 형성 억제실험 및 혈관신생억제 효능을 측정하는 생체내(in vivo) 어세이인 계태자융모요막(CAM) 어세이와 마우스 마트리젤 모델을 이용하여 혈관신생억제 효능을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 은행엽 엑스는 종양억제제, 전이억제제, 혈관신생에 의한 안과질환, 건선 등 혈관신생에 의한 각종 질환의 치료제로 사용할 수 있다.

Description

은행엽 엑스를 유효성분으로 하는 혈관신생 억제제{Angiogenesis inhibitor containing ginkgo biloba extract}

본 발명은 은행엽 엑스를 유효성분으로 하는 혈관신생 억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 말초 혈액순환개선제로 사용되고 있는 은행엽 엑스(Ginkgo biloba extract)가 혈관신생을 억제하는 효능이 있음을 밝혀 혈관신생과 관련된 질환의 치료제로 이용할 수 있는 은행엽 엑스의 용도에 관한 것이다.

은행엽 엑스가 함유하고 있는 성분은 플라보노이드(flavonoid)와 테르펜 락톤(terpene-lactone) 및 알킬 페놀(alkyl-phenol)화합물이다. 그중 은행엽 플라보노이드는 바이플라본 배당체를 말하며 깅고플라본 배당체라고도 하며 현재 말초 혈액순환 개선제로써 사용되고 있다. 은행엽에 다량 함유된 바이플라본 성분은 사이아도피티신(sciadopitysin), 깅제틴(ginkgetin), 이소깅제틴(isoginkgetin), 바이로베틴(b ilobetin), 아멘토플라본(amentoflavone) 등이 있으며, 이들 물질은 항염증, 항알러지 및 항류마티스와 같은 생리 활성이 있다고 밝혀지고 있다.

혈관신생(Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아의 발생(embryonic development)시, 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다.(Folkman and Cotran, Relation of vascular proliferation to tumor growth,Int Rev Exp Pathol16, 207 - 248(1976))

새로운 혈관이 생기는 것은 엄밀한 의미에서 맥관형성(vasculogenesis)과 혈관신생(angiogenesis)으로 나누어진다. 맥관형성은 배발생 초기 장축중배엽에서 분화된 혈도로부터 발생하는 내피세포의 신생으로 정의된다. 단순확산으로는 복잡한 형태를 위해 세포 증식을 빠르게 향상시키는 영양의 요구를 만족시킬 수 없는시점에서 배아의 맥관형성이 시작된다. 혈관신생은 기존 혈관으로부터 내피세포에서 나와 자라는 과정으로, 통상적으로 미세혈관의 말단 정맥 및 후모세혈관을 형성하게 된다.

성인의 경우 혈관내피세포는 상대적으로 잘 분열하지 않으며, 내피 분열 속도는 통상 수개월 내지 수년이다. 그러나 성인의 혈관신생은 호르몬 신호반응, 염증세포에서의 전혈관신생(pro-angiogenesis) 시토킨의 방출, 세포 외부기질에 고립된 혈관 신생 매개체를 방출하는 가수분해성 효소의 활성 결과로서, 또는 혈관신생촉진 인자의 자극 등으로 필요에 따라 유발되어 진다.

혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다.

그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다. 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염등이 있으며, 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환이 있으며 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다.(D'Amato RJ and Adamis AP,Ophthalmol102, 1261-1262, 1995 ; Arbiser JL,J Am Acad Derm34(3):486-497, 1996 ; O'Brien K.D. et al.Circulation93(4):672-682, 1996 ; Hanahan D and Folkman J,Cell86: 353-364, 1996)

비정상적인 혈관신생으로 인한 질병은 상기 여러 가지 질환의 발병이나 진행과정에 깊이 관련되어 있어 이들 질환의 예방 또는 치료를 위하여 혈관생성을 억제하는 물질을 찾아내려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히 암의 경우 암세포의 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 암세포가 혈관신생을 하지 못하거나, 혈관으로 출입을 할 수 없으면 대부분의 암은 직경이 1 내지 2mm 이상을 넘게 자라지 못하고 원발성 위치에 국소화된 채로 남아 있을 것이다.(Folkman and Tyler,Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, 94-103(1977))

혈관신생은 종양에 두 가지 중요한 역할을 하는데, 첫째는 일차 종양과 전이된 이차 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 것이고, 둘째는 종양까지 침투한 신생 모세혈관들이 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 주어 암세포가 온몸에 전이(metastasis)가 되게 한다.

암 환자 사망의 주원인은 전이이며, 전이란 암세포가 일차 종양피로부터 분리되어 해부학적으로 먼 곳에 있는 조직이나 장기에 착상하여 성장하는 현상이다.(Sugarbaker, Weingard and Rosoman,Cancer Invasion and Metastasis(L.A. Liotta and I.R. Hart ed.) Boston, Nijhoff, 427-465(1982)) 현재 임상에서는 암의 치료성적을 향상시키기 위하여 화학요법이나 면역요법들을 이용하고 있는데, 이러한 치료방법이 일부 종양에서 어느 정도 효과를 거두고는 있지만 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

종양은 혈관신생이 일어나지 않으면 일정 기간동안 휴지 상태로 생존하며, 더 이상은 성장할 수 없게 된다. 그러나 확장하는 종양의 말단이 근접 모세혈관에 접근하면, 확산하는 혈관신생인자가 종양으로부터 방출되어 내피세포를 자극한다. 내피세포는 자극에 의해 성장, 이동하게 되어 모세혈관망을 형성하게 된다. 이러한 혈관형성 이전에서 혈관형성 단계로의 전환은 종양의 지수적 증가를 수반한다. 종양세포는 신생혈관을 순환한다. 내피세포를 직접 활성화시키는 발전성 종양으로 성장시키는 확산성 혈관신생 인자를 생성한다. 이것들은 시토킨을 만들어 대식세포, 비만세포, 호중성 백혈구를 유인하고 활성화시켜 혈관신생을 더욱 증가시키는 인자들을 생성한다. 또한 세포의 기관에 고립된 혈관신생 인자를 방출하는 효소를 생성하여 혈관 신생을 자극시킬 수 있다. 혈관신생에 의해 암조직까지 침투한 혈관을 따라 전이가 일어나므로 혈관신생은 암의 성장과 전이에 필수적이다. (Polverini P.J.,Critical Reviews in Oral Biology, Vol.6, No.3, 230-247(1995)) 따라서 혈관신생을 막으면 암의 성장과 전이를 막을 수 있다.

염증성 질환의 대표적인 질환인 관절염은 자가면역 이상이 원인이지만 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 혈관이 없는 연골이 파괴된다. 이러한 염증을 유도하는 시토킨의 도움으로 활액세포와 혈관내피세포가 활액강에서 증식을 하여 혈관신생이 진행되면서 연골부에 발생하는 결합조직층인 관절판누스를 형성하여 쿠션 역할을 하는 연골이 파괴된다.(Kocb AE,Polverini PJ and Lcibovich SJ, Arth Rheum 29, 471-479(1986); Stupack DG, Storgard CM and Cheresh DA, BrazJ Med Biol Rcs32, 578-581(1999), Koch AE, Atrhritis Rheum 41, 951-962(1998)) 따라서 혈관신생을 억제하면 관절염의 진행을 막을 수 있다.

해마다 전세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 많은 안과질환도 혈관신생이 원인이 되고 있다.(Jeffrey MI and Takayuki A,J Clin Invest103, 1231-1236(1999))

그 대표적인 예로 노인에게 일어나는 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장과 신생혈관에 의한 각막 질환과 같은 질병은 혈관신생이 원인이 되는 질병들이다.(Adamis AP, Aiello LP and D'Amato RA,Angiogenesis3, 9-14(1999)) 그중 당뇨병성 망막증은 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 질병이다.

허혈의 망막으로부터 성장인자가 방출되어 이런 질병들이 야기된다고 보고 있으며, 우리 몸은 새로운 혈액을 공급함으로서 이런 저산소증에 반응하도록 훈련되어 있다. 눈은 가장 혈관이 없는 조직이므로 혈관이 성장하게 된다는 것은 곧 실명을 의미한다. 눈에서 혈관신생을 자극하는 인자들이 방출되어 혈관신생을 시작하게 된다. 혈관신생에 의한 안과 질환은 적당한 치료제가 없어 현재 스테로이드나 항생제를 사용하다가 더 진행되면 혈관을 소작(cautery)시키거나 광응혈(ph otocoagulation)시키지만 효과가 일시적이며 혈관 증식을 막지 못하므로 재발하게된다. 따라서 혈관신생을 막아야 근본적인 치료를 할 수 있다.

붉은 반점과 인설의 피부가 특징인 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데 치유되지 않으며 고통과 기형을 수반한다. 정상인 경우 각질세포가 한 달에 한번 증식하는데 비해 건선 환자는 적어도 일주일에 한번 증식한다. 이런 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다.(Folkman J,J Invest Dermatol59, 40-48 (1972)) 혈관신생 억제제를 이러한 건선의 새로운 치료제로 적용할 수 있다.

상기에서 언급한 혈관신생으로 인한 질환들 이외에도 혈관신생으로 인하여 각종 질환들이 발생되기 때문에, 혈관신생을 억제시켜서 상기 질환들을 치료하려는 노력이 경주되고 있다. 하지만, 혈관신생 억제제는 보통 환자에게 장기적으로 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이어야 가장 이상적인 치료제로 사용할 수 있다. 따라서 혈관신생을 억제할 수 있는 독성이 미비한 약제의 개발이 요구되는 실정이다.

본 발명은 천연물 약제로서 독성이 적고 경구투여 가능한 혈관신생 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 은행엽 엑스를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 은행엽 엑스가 사람의 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial cell; HUVE세포)의 관형성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 대조군 HUVE 세포를 관찰한 것이고,

도 2는 본 발명의 은행엽 엑스 0.4 ug/ul를 처리한 후 HUVE세포의 관형성을 관찰한 것이고,

도 3은 본 발명의 은행엽 엑스가 마우스 마트리젤 모델에서 혈관신생을 억제시키는 효과를 도시한 것이고,

도 4는 본 발명의 은행엽 엑스가 마우스 마트리젤 모델에 경구로 투여하였을 때 나타나는 혈관신생 억제를 도시한 것이고,

도 5는 본 발명의 은행엽 엑스가 나타내는 혈관신생 억제작용을 계태자 융모요막 어세이로 확인하여 나타낸 사진이다.

본 발명은 은행엽 엑스를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물을제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 현재 말초 혈액순환 개선제로 사용하고 있는 은행엽 엑스가 혈관신생 억제 효과를 가짐을 최초로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 말초 혈액순환 개선제인 은행엽 엑스의 새로운 용도인 혈관신생억제 효능에 관한 것이며, 은행엽 엑스의 혈관신생 억제 효능을 이용하여 혈관신생을 막음으로써 혈관신생에 의한 질환을 치료할 수 있는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 은행엽 엑스를 혈관신생에 의한 질환의 치료제, 예를 들면 항암제, 전이억제제, 혈관종, 혈관섬유종, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름 등의 치료제및 관절염치료제로서 사용할 수 있다는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 은행엽 엑스는 여러 가지 방법으로 추출하거나 또는 구입하여 사용할 수 있다. 은행엽 엑스의 추출방법은 은행잎이나 은행잎 건조분말 등에서 추출하는 통상적인 방법을 실시 할 수 있다. 또한 이미 시판되어지고 있는 은행엽 엑스만 함유한 연질캅셀(부형제를 함유하고 있지 않음)을 사용하는 것도 바람직하며, 더욱 바람직하게는 시중에서 유통되어지는 은행엽 엑스 중 식품의약품안전청고시에 표시된바와 같이 은행엽 엑스 40 mg중 총 깅고플라본 배당체로서 9.6 mg 함유한 것을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 은행엽 엑스의 통상적인 추출방법은 다음과 같다.

건조은행엽(푸른잎 또는 노란잎)은 메탄올로 메탄올 조추출물을 수득한 다음 클로로포름 분획하여 수층을 분획한다. 분리한 수층에 에틸아세테이트를 가하여 분획하고 무수망초로 탈수하여 은행엽 조추출물을 수득한다. 또한 은행엽 건조분말은 아세톤에 녹인 후 여러 번 여과하고 여과액에 메칠에칠케톤과 아세톤을 1대 1비율로 가하여 유기용매층을 추출한다. 상기 추출액을 농축하고 에탄올에 녹인 후 여과하여 은행엽 엑스를 수득한다. 본 발명의 은행엽 엑스는 하기 방법으로 추출한 은행엽 엑스 중 플라본 배당체(flavon-glycoside)와 테르펜 락톤(terpene-lactone) 및 알킬 페놀(alkyl-phenol)가 15 중량% 이상인 은행엽 엑스를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 은행엽 엑스의 혈관신생 억제효과는 여러 가지 실험을 통하여 관찰하였다. 실시한 실험은 혈관내피세포를 이용한 관형성 실험(Tube formation assay), 계태자 융모요막 어세이(CAM assay) 및 마우스 마트리젤 어세이(mouse matrigel assay)이다.

먼저 관형성 실험은 생체내 실험(in vivoassay)과 가장 연관성이 높은 시험관내 실험(in vitroassay)으로 사람의 혈관내피세포에 의한 모세혈관과 같은 구조 형성을 관찰 할 수 있는 실험이다. 마트리젤(Matrigel)을 젤화시킨 다음 마트리젤 위에서 혈관내피세포를 배양하면 혈관형성의 한 과정으로 생각할 수 있는 관 형성을 하게 되는데, 이때 은행엽 엑스를 0.4 ug/ul 농도로 처리한 후 관찰하였다.도 1은 대조군세포로 은행엽 엑스를 처리하지 않은 세포이며 도 2는 은행엽 엑스를 0.4 ug/ul 농도로 처리한 세포를 관찰한 것이다. 도 1의 대조군 세포는 관형성이 잘 이루어짐을 볼 수 있었으나 도 2의 은행엽 엑스를 처리한 세포는 관 형성이 강하게 억제되어 튜브를 형성한 세포들이 제대로 형체를 갖추지 못하는 결과를 볼 수 있었다.

또한 본 발명은 은행엽 엑스의 혈관신생 억제효과를 측정하는 일반적인 생체내 실험인 수정란을 이용한 계태자 융모요막 어세이와 혈관신생을 정량적으로 측정할 수 있는 실험인 마우스 마트리젤 어세이를 시행하여 은행엽 엑스가 혈관신생을 억제하는 작용이 있음을 확인하였다. 또한 경구로 투여한 은행엽 엑스가 혈관 신생 억제효과가 있음을 볼 수 있었다.

본 발명의 은행엽 엑스를 포함하는 혈관신생 억제제는 단일제로 사용할 수 있으며 공인된 약리 조성물을 더욱 포함하여 복합제로 제조하여 사용할 수 있다. 또한 은행엽 엑스를 포함하는 혈관신생 억제제는 약리학 적으로 유용한 것으로 알려진 적합한 약학용 희석제를 포함할 수 있다. 상기 희석제로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 복합물을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 은행엽 엑스는 1종 이상이 약학적 허용성 부형제와 함께 약학 조성물로 투여될 수 있다. 인간 환자에게 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물의 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단의 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 자명하다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량 정도는 달성하고자하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는 지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간; 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물(예, 화학요법제)을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA]에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 목적에 적합한 은행엽 엑스의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 은행엽 엑스의 단위 투여량은 5 내지 800 mg이 바람직하며, 40 내지 400 mg이 가장 바람직하다.

또한 환자의 나이와 체중뿐 아니라 혈관신생에 의한 질환의 종류 및 질환의 정도에 따라 용량 및 투여방법이 달라지기는 하나 일반적으로 0.1 내지 200 mg/kg으로 투여할 수 있으며 선택적으로는 1 내지 10 mg/kg을 투여하고 1일 1-3회 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다. 본 발명의 은행엽 엑스를 포함하는 혈관신생 억제제의 비경구 투여는 바람직한 순도하에 약학적 허용성 담체, 즉 사용되는농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 것을 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하는 것이 바람직하다. 특히, 제제는 산화제 및 인체에 유해한 것으로 알려진 기타 다른 화합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 은행엽 엑스를 포함하는 혈관신생 억제제는 은행엽 엑스를 유효성분으로 포함하는 제형은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 주사용, 도포용으로 사용 할 수 있다. 상기 제형은 주사용 형태(용액, 현탁액 또는 유탁액)로 조제하는 것이 바람직하고, 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 수액제, 과립제, 환제 등 경구용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다. 상기 억제제는 은행엽 엑스를 연질캅셀에 부형제없이 충전하거나 미립된 고체 담체 또는 액체 담체 또는 그 양자와 균일하게 충분히 접촉시켜 제조한다. 그 다음, 필요한 경우 생성물을 바람직한 제제로 성형한다. 이러한 담체 부형제의 예로서 전분, 물, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

본 실험에서는 은행엽 엑스를 시중에서 판매하고 있는 은행엽 엑스만 함유한 연질캅셀(부형제를 함유하고 있지 않음)을 구입하여 사용하였다. 은행엽 엑스는 식품의약품안전청고시에 표시된바와 같이 은행엽 엑스 40 mg중 총 깅고플라본 배당체로서 9.6 mg 함유한 것을 사용하였다.

[실험예 1] 은행엽 엑스의 사람 혈관내피세포의 관형성에 미치는 영향

혈관신생에 대한 효과를 간접적으로 알 수 있는 시험관 실험으로서 사람의 혈관내피세포에 의한 모세혈관과 같은 구조 형성에 미치는 영향을 관찰하였다. 관형성(tube formation) 실험을 시행하기 위하여 우선 혈관내피세포인 HUVE 세포(Human Umbilical Vein Endothelial cell)를 얻는 실험을 시행하였다. 즉, 제왕절개수술로 얻은 신선한 사람의 탯줄에서 정맥의 내피세포를 분리한 후 혈관내피세포를 배양하고 배양한 세포는 Ⅷ 인자의 항체를 이용한 세포면역학적 염색으로 HUVE 세포임을 확인하였다. 상기에서 확인된 혈관내피세포를 젤화된 마트리젤 (Matrigel, Collaborative Biomedical Products사에서 시판)상에서 37 ℃, 16 - 18시간 배양하였다. 상기 방법으로 배양한 혈관내피세포를 대조군으로 하고 상기 실시예의 은행엽 엑스를 0.4 ug/ul 농도로 처리하여 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포를 실험예 1로 하여 비교하였다.

도 1은 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포가 망상의 관구조를 형성한 것을 관찰한 것으로 혈관형성의 한 과정이라고 생각되는 망상의 관구조가 생성되고 있음을 알 수 있었다.

도 2는 본 발명의 은행엽 엑스를 0.4 ug/ul 농도로 처리하여 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포를 관찰한 것으로, 망상의 관구조 연결이 끊어지는 것을 볼수 있었다. 마트리젤상에서 형성된 튜브의 면적을 이미지 프로 플러스(Image-Pro Plus, Media Cybernetics사)로 분석하였을 때 하기 표 1에 나타난 바와 같이 은행엽 엑스를 처리한 실험예 1이 처리하지 않은 대조군에 비하여 관 형성이 60 %정도 억제됨을 알 수 있었다.

[표 1]

	관형성 면적	%
대조군	12.75	100
은행엽 엑스 (실험예 1)	5.05	39.6

[실험예 2] 혈관신생을 측정하는 동물실험 (마우스 마트리젤 모델)

혈관신생을 억제하는 것을 정량적으로 측정할 수 있는 동물실험인 마우스 마트리젤 모델(mouse matrigel model)을 이용하여 은행엽 엑스의 혈관신생억제 효과를 측정하였다. 6 내지 8주의 C57BL/6 마우스에 마트리젤 0.4 ml와 혈관신생 유도인자인 염기성 FGF(Fibroblast Growth Factor) 1 내지 100 ng/ml 및 헤파린 20 내지 100 unit/ml을 혼합하여 피하 주사하면 강한 혈관신생을 나타낸다. 3-5일 후 표피를 제거하여 마트리젤을 조심스럽게 분리하여 젤을 회수한 후, 혈액에서 총 헤모글로빈 양을 측정하는 시약인 드랩킨 시약(Drabkin's reagent, Sigma사에서 시판)을 이용하여 헤모글로빈 양을 측정하여 대조군으로 사용하였다. 또한 상기 실시예의 은행엽 엑스 38 ug을 상기의 마트리젤에 섞어 동일하게 실시한 후 측정한 헤모글로빈 함량을 실험예 2로 두어 상기 대조군과 비교하였다. 그 결과, 하기 표 2와 도 3에서 보는 바와 같이 은행엽 엑스를 함유하지 않은 대조군에 비해 은행엽 엑스를 함유한 실험예 2은 헤모글로빈 함량이 매우 낮게 나타나 94% 정도의 혈관신생이 억제됨을 알 수 있었다.

[표 2]

	헤모글로빈 함량(g/dL)
대조군	239 ±329
은행엽 엑스(실험예 2)	15.7 ±8.1

또한 실험예의 은행엽 엑스를 마우스에 경구로 투여했을 때에도 혈관신생 억제효과가 있는지를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

C57BL/6 마우스 마리 당 0.4 mg의 은행엽 엑스를 경구투여하고 14시간 후 1 내지 100 ng/ml의 염기성 FGF와 20 내지 100 unit/ml의 헤파린을 함유한 마트리젤 0.4 ml를 C57BL/6 마우스에 피하 주사하였다. 그 다음 상기와 동일한 양의 은행엽 엑스를 경구투여하고 3일 동안 연속하여 하루에 두 번 마리당 0.4 mg의 은행엽 엑스를 경구 투여하였다. 경구투여하기 시작한 지 3일이 지나 마트리젤을 회수하여 헤모글로빈의 양을 측정한 결과 도 4와 하기 표 3에서 보는 바와 같이 은행엽 엑스를 경구투여하지 않은 대조군에 비해 경구 투여한 실험예 2는 헤모글로빈 양이 매우 낮아 본 발명의 은행엽 엑스에 의해 혈관신생이 68 % 억제됨을 알 수 있었다. 따라서 은행엽 엑스는 경구투여로 하였을 때에도 혈관신생억제효과가 있음을 확인 할 수 있었다.

[표 3]

	헤모글로빈 함량(g/dL)
대조군	226 ±229
은행엽 엑스(실험예 2)	72 ±55

[실험예 3] 혈관신생을 측정하는 계태자 융모요막 어세이(CAM assay; Chorioallantoic membrane assay)

수정란을 습도 70 % 이상의 항온항습기에서 3일간 부화시킨 후 알부민을 26게이지(gauge) 주사기로 2 내지 3 ml 정도 뽑아내고 투명 테이프로 봉한 다음, 수정란 중앙부에 드릴로 크기 1 x 1 cm 정도의 윈도우(window)를 만들었다. 60 ug의 은행엽 엑스를 써마녹스 디스크(Thermanox disc)(Miles Scientific에서 시판)에 떨어뜨리고 건조시킨 다음, 윈도우(windows)를 통해 노출된 융모요막(Chorioall antoic membrane)위에 올려놓고 투명테이프로 봉하고, 37 ℃ 항온항습기에서 3일간 부화시켰다. 대조군은 은행엽 엑스 대신에 생리식염수 15 ul을 디스크(disc)위에 떨어뜨리고 건조시켜 같은 방법으로 시행하여 혈관변화를 비교하였다. 요막강내에 분포하는 혈관과 구분하기 위하여 26게이지(gauge) 주사기를 이용하여 지방을 요막강내에 주입하여 요막강 내에 분포한 혈관을 가린 다음 융모요막에 분포한 혈관변화를 비교하였다. 생리식염수를 디스크에 떨어뜨린 대조군(n=20)은 90 %가 모세혈관 형성에 영향을 주지 않았으나, 실험예 3의 은행엽 엑스를 떨어뜨린 것은 도 5에서 관찰한 바와 같이 디스크가 놓인 위치(밝게 보이는 부분)에 계태자 융모요막의 모세혈관 형성이 억제됨을 명확하게 볼 수 있었으며 사용한 수정란(n= 20) 모두 100 % 혈관신생이 억제되었다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 혈관신생 억제제는 은행엽 엑스의 혈관신생 억제 효능을 이용하여 혈관신생을 막음으로써 혈관신생에 의한 질환을 치료할 수 있다.

Claims (5)

1. 5 내지 45 중량%의 깅고플라본 배당체를 함유하는 은행엽 엑스를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,

   상기 암 전이 억제용 조성물은 약리적으로 허용되는 담체를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.
5. 제 1항 또는 제 4항에 있어서,

   상기 은행엽 엑스의 단위 투여량이 5 내지 800 mg인 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.